Summary
Strukturbestämning av makromolekylära komplex med cryoEM har blivit rutin för vissa klasser av proteiner och komplex. Här sammanfattas denna pipeline (provberedning, screening, datainsamling och bearbetning) och läsarna riktas mot ytterligare detaljerade resurser och variabler som kan ändras vid mer utmanande exemplar.
Abstract
Cryo-elektronmikroskopi (cryoEM) är en kraftfull teknik för strukturbestämning av makromolekylära komplex, via enstaka partikelanalys (SPA). Den övergripande processen innebär i) vitrifiera exemplaret i en tunn film som stöds på ett kryoEM-rutnät; ii) Screening av provexemplaret för att bedöma partikelfördelning och iskvalitet, iii) Om gallret är lämpligt, samla in en enda partikeldatauppsättning för analys. och iv) bildbehandling för att ge en EM-densitetskarta. I det här protokollet ges en översikt för vart och ett av dessa steg, med fokus på de variabler som en användare kan ändra under arbetsflödet och felsökning av vanliga problem. I och med att fjärrmikroskopdrift blir standard i många anläggningar kommer variationer på bildprotokoll för att hjälpa användare att effektivt använda och avbilda när den fysiska tillgången till mikroskopet är begränsad att beskrivas.
Introduction
En partikel CryoEM
För att undersöka livet på molekylär nivå måste vi förstå struktur. Många tekniker för att undersöka proteinstruktur finns tillgängliga, såsom NMR, röntgenkristallografi, masspektrometri och elektronmikroskopi (EM). Hittills har de flesta strukturer som deponerats på Protein Databank (PDB) lösts med hjälp av röntgenkristallografi. Men från ~ 2012 och framåt blev kryoelektronmikroskopi (cryoEM) en mainstream-teknik för proteinstrukturbestämning och dess användning ökade dramatiskt. Det totala antalet EM-kartor som deponerades på Electron Microscopy Databank (EMDB) (i december 2020) var 13 421 jämfört med 1 566 år 2012 (figur 1, www.ebi.co.uk). År 2012 var antalet atomkoordinater modellerade i kryoEM-densitetskartor, deponerade på PDB bara 67 men i december 2020 har 2 309 strukturer deponerats hittills, en 35-faldig ökning. Denna underliggande ökning av kvaliteten och kvantiteten av kryoEM-densitetskartor som producerades, ibland kallad "upplösningsrevolutionen"1, orsakades av en sammanslagning av framsteg på flera områden: utveckling av nya kameror för avbildning som kallas direkta elektrondetektorer; Ny programvara. och stabilare mikroskop2,3,4.
Figur 1: Kumulativa inlagor till EMDB från 2012 till december 2020. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Single particle analysis (SPA) är ett kraftfullt verktyg för att generera biologisk insikt i en mängd olika provtyper genom att belysa högupplösta strukturer av isolerade komplex5,6 inklusive virus7,8, membranproteiner9,10, spiralformade sammansättningar11 och andra dynamiska och heterogena makromolekylära komplex12,13, vars storlek varierar beroende på storleksordning (från 39 kDa 14,15 till tiotals megadalton). Här beskrivs ett protokoll för en standardpipeline för cryoEM SPA från exempel till struktur.
Innan detta rörledning påbörjas bör ett renat prov genomgå biokemisk analys för att bedöma dess chanser att lyckas nedströms. Beredning av ett lämpligt prov är utan tvekan det största hindret för SPA, särskilt för övergående och heterogena (både sammansättnings- och konformationella) komplex. Makromolekylära komplexa preparatet bör innehålla så få föroreningar som möjligt, vid tillräcklig koncentration för att ge många partiklar i varje cryoEM-mikrograf och i en buffertkomposition som är väl lämpad för kryoEM-analys. Vissa buffertbeståndsdelar, inklusive sackaros, glycerol och hög (~> 350 mM koncentrationer av salter, beroende på provstorlek, egenskaper och andra buffertbeståndsdelar) kan störa processen för vitrifikation eller minska signal-till-brus-förhållandet i bilder, vilket hindrar strukturbestämning16.
Vanligtvis bör storleksuteslutningskromatografi (SEC) och SDS- PAGE gelanalys användas för att bedöma provrenhet17,18, men cirkulär dichroism, funktionella analyser, SEC i kombination med flervinkelljusspridning och termiska stabilitetsanalyser är alla användbara verktyg för kvalitativ analys av makromolekylära komplexa preparat före kryoEM-analys. Resultaten från dessa biokemiska analyser kan dock ge liten insikt i provets strukturella heterogenitet och dess beteende på ett kryoEM-rutnät. Av denna anledning används negativ fläck EM rutinmässigt som ett snabbt, billigt och kraftfullt verktyg för att bedöma kompositionell och konformationell heterogenitet, och därför ett bra sätt att fastställa vilken elutionsfraktion från en rening som är mest lovande, eller screening av olika buffertkompositioner19,20. När ett lovande prov har identifierats kan vi gå vidare till SPA cryoEM-pipelinen. Negativ fläck överensstämmer inte alltid med de efterföljande resultaten som ses i cryoEM; ibland ser ett prov dåligt ut av negativ fläck men förbättras när det ses i glasaktig is i cryoEM. Däremot ser ibland prover utmärkta ut under negativa fläcksteg men kräver betydande ytterligare optimering när du går vidare till cryoEM. Men i de flesta fall ger negativ fläck ett användbart kvalitetskontrollsteg.
Förglasning
Den hårda miljön i elektronmikroskopets vakuumsystem orsakar både uttorkning och strålningsskador på ofixerade biologiska exemplar21. För att avbilda provet i ett inhemskt tillstånd måste därför det biologiska provet bevaras före avbildning. För renade preparat av makromolekylära komplex är vitrifikation den metod som valts för att möjliggöra dess visualisering genom cryoEM samtidigt som de atomiska detaljerna i komplexet bevaras. Upptäckten av vitrifikation som en metod för provberedning var ett grundläggande framsteg inom elektronmikroskopi av biologiska exemplar, för vilket Dubochet uppmärksammades i Nobelpriset i kemi 2017. Provvitrifiering innebär att skapa ett tunt lager av lösning som innehåller det prov av intresse, vanligtvis tiotals nm tjockt, upphängt på ett kryoEM-rutnätsstöd. Den tunna filmen fryses sedan extremt snabbt i en kryogen som flytande etan vid ~-175 °C. Fryshastigheten är ~106 °C/s, tillräckligt snabb för att amorf eller glasaktig is bildas, vilket suspenderar provet i en tunn, fast film22.
Den första variabeln att tänka på är kryoEM-rutnätsstödet som valts23. Ett EM-rutnät består vanligtvis av en amorf kolfilm med perforeringar (antingen regelbundna eller oregelbundna) över en stödstruktur. Stödstrukturen är vanligtvis ett cirkulärt metallnät med en diameter på 3,05 mm, vanligtvis tillverkad av koppar, men andra metaller som guld eller molybden (som har föredragna termiska expansionsegenskaper24) kan användas. Ibland appliceras ytterligare ett tunt, kontinuerligt stöd över nätet, såsom grafen, grafenoxid eller ett tunt (~ 1-2 nm) amorft kolskikt. Medan standard cryoEM-galler (oftast 400-200 mesh koppar med perforerad (1,2 μm runda hål åtskilda av 1,3 μm (r1,2/1,3), eller 2 μm åtskilda av 2 μm kol (r2/2)) har kolstöd - även om många olika mönster finns tillgängliga) använts i de allra flesta strukturer som rapporterats hittills, har ny nätteknik med förbättrad ledningsförmåga . Utvalda galler utsätts för en behandling för rengöring av glöd-urladdning/plasma för att göra dem hydrofila och mottagliga för provtillämpning26.
Efter glödurladdning är nästa steg tunnfilmsbildning. Denna tunna film bildas oftast med filterpapper för att avlägsna överflödig vätska från gallret. Även om detta kan utföras manuellt finns ett antal dykfrysningsanordningar kommersiellt tillgängliga, inklusive Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) och CP3 (Gatan). Med dessa enheter appliceras ~3-5 μL prov i lösning på EM-nätet, följt av att man blottar bort överflödig lösning med filterpapper. Gallret, med en tunn film upphängd över sig, kastas sedan i flytande etan som kyls av flytande kväve (LN2) till ~-175 °C. När gallret har frusits hålls det vid en temperatur under devitrifieringspunkten (-137 °C) före och under avbildningen.
Screening och datainsamling av prov
Efter vitrifikation av ett kryoEM-rutnät är nästa steg att screena rutnätet för att bedöma dess kvalitet och avgöra om rutnätet är lämpligt för att gå vidare till högupplöst datainsamling. Ett idealiskt kryoEM-galler har glasaktig is (i motsats till kristallin is) med istjockleken precis tillräcklig för att rymma den längsta dimensionen av provet, vilket säkerställer att den omgivande isen bidrar med så lite ljud till den resulterande bilden som möjligt. Partiklarna i isen ska ha en storlek och (om känd) form som överensstämmer med biokemin, och helst vara monodisperse med en slumpmässig fördelning av partikelorienteringar. Slutligen bör nätet ha tillräckligt med områden av tillräcklig kvalitet för att uppfylla önskad datainsamlingslängd. Beroende på exemplaret kan detta ta många iterationer av vitrifikation och screening tills optimala galler produceras. Både lyckligtvis och tyvärr finns det ett stort antal variabler som kan testas empiriskt för att ändra partikelfördelningen på kryoEM-rutnät (granskas 16,27). I detta manuskript visas representativa resultat för ett membranproteinprojekt10.
När ett lämpligt rutnät har identifierats kan datainsamlingen fortsätta. Flera modeller av kryotransitiva elektronmikroskop för biologiska exemplar är optimerade för att samla in högupplösta data på ett automatiserat sätt. Vanligtvis samlas data in på 300 kV- eller 200 kV-system. Automatiserad datainsamling kan uppnås med hjälp av programvara som EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 och SerialEM31,32. En automatiserad datainsamling med moderna detektorer resulterar vanligtvis i terabyte (TB) rådata under en 24-timmarsperiod (genomsnittliga datamängder är ~ 4 TB i storlek).
På grund av covid-19-restriktionerna på stora delar av världen (i skrivande stund december 2020) har många mikroskopianläggningar flyttat till att erbjuda fjärråtkomst. När näten har laddats in i en mikroskops autoloader kan datainsamlingen utföras på distans.
Bildbehandling och modellbyggnad
Om en datainsamlingssession vanligtvis kan vara 0,5-4 dagar kan efterföljande bildbehandling ta många veckor och månader, beroende på tillgängligheten av datorresurser. Det är standard för inledande bildbehandlingssteg, nämligen uppskattning av rörelsekorrigering och kontrastöverföringsfunktion (CTF) som ska äga rum "i farten" 33,34. För bearbetning nedströms finns det en mängd programvarusviter tillgängliga. Partiklar "plockas" och extraheras från mikrografer35,36. När partiklarna har extraherats skulle ett standardprotokoll vara att bearbeta partiklarna genom flera omgångar av klassificering (i båda dimensionerna (2D) och tre dimensioner (3D) och/eller fokuserade på specifika områden av intresse) för att nå en homogen delmängd av partiklar. Denna homogena delmängd av partiklarna beräknas sedan tillsammans för att producera en 3D-rekonstruktion. Vid denna tidpunkt korrigeras ofta data ytterligare för att producera högsta möjliga kvalitetskarta, till exempel genom CTF-förfining, förvrängningskorrigeringar37 och Bayesian polering38 . Resultatet av denna bildbehandling är en 3D cryoEM karta över det biologiska exemplaret av intresse. Upplösningsområdet som uppnås i ett "standard" automatiserat enpartikelexperiment från ett rutnät av tillräcklig kvalitet, med data som samlas in på ett 300 kV mikroskopsystem är vanligtvis mellan 10 Å och 2 Å beroende på proteinkomplexets storlek och flexibilitet. Med ett idealiskt exemplar har upplösningar på ~1,2 Å nu uppnåtts med hjälp av SPA-arbetsflöden5. Även om detta protokoll beskriver steg mot att få en EM-densitetskarta, kan den när den är i handen tolkas ytterligare genom montering och raffinering av en proteinmodell (om upplösningen är < 3,5 Å) eller bygga de novo39. Data som är associerade med experiment för strukturbestämning kan deponeras i offentliga online-databaser, inklusive EM-densitetskartor (Electron Microscopy Data Bank)40, resulterande atomkoordinater (Protein Data Bank)41 och råa datamängder (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
I detta protokoll används det yttre membranproteinkomplexet RagAB (~ 340 kDa) från Porphyromonas gingivalis som ett exempel makromolekylärt komplex10 (EMPIAR-10543). För dem som är nya inom cryoEM är stöd för prover via denna pipeline från exempel till struktur tillgängligt, föremål för inbördes granskning, genom finansierade åtkomst system som iNEXT Discovery och Instruct.
Protocol
1. Rutnät Vitrifiering
OBS: För alla steg i steg 1 och 2, se till att alla verktyg är rena, torra och vid rumstemperatur innan du kyler dem till LN2-temperatur , med hjälp av nydekanterad LN2 för att minska isföroreningen. Om möjligt, arbeta i en fuktstyrd miljö med < 20% relativ luftfuktighet. Se till att lämplig personlig skyddsutrustning och H&S-dokumentation finns på plats innan arbetet börjar.
- Se till att provet är klart för provberedning.
- Välj lämpliga kryoEM-galler och se till att dessa har blivit hydrofila med hjälp av glödurladdning eller plasmabehandling. En mängd olika system och variationer i protokollet finns tillgängliga men alla innebär att placera gallren i ett glödurladdnings- / plasmarengöringssystem och köra ett program som pumpar kammaren till önskad vakuumnivå innan en specifik gasblandning / kemisk ånga eller luft introduceras i systemet. En elektrisk ström passerar genom systemet, joniserar gaspartiklarna och inducerar ytan på näten att göras mer hydrofil.
- Starta dykfrysningsanordningen för nätvitrifiering genom att slå på systemet med strömbrytaren på baksidan och vänta tills pekskärmen laddas.
- Använd den medföljande pennan eller fingrarna, i Konsolen, ställ in önskad arbetstemperatur i kammaren (tillgängligt intervall är 4-60 °C, rekommenderas för de flesta makromolekyler 4-6 °C).
- Fyll luftfuktaren med 50 ml labbvatten av typ II med en spruta, via gummislangen längst ner på luftfuktaren. Se till att ta bort eventuell instängd luft i sprutan innan du fyller på den. Var försiktig så att luftfuktaren inte överfylls eller att vatten kommer att utstråla i kammaren. När luftfuktaren är fylld, dra tillbaka sprutan kolv med 5-10 ml för att skapa en vakuumförsegling.
- I Konsol ställer du in önskad relativ luftfuktighet för kammaren (tillgängligt intervall är 0-100%, luftfuktighet på 95-100% används vanligtvis). Låt luftfuktigheten vara "av" tills omedelbart före gallertillverkning så att kammaren inte blir för våt.
- Få doppfrysningsanordningens pincett och filtrera papperspappersskuret till rätt storlek för att passa på dynorna, antingen köpta eller med en stämpel för att skära en bländare av lämplig storlek.
- Förbered kryogen för doppfrysning.
- Placera metallkartongskåphållaren, kryogenkoppen och metallspindelns ben i kylvätskebehållaren.
- Kyl ner behållaren genom att fylla den yttre kammaren med LN2. Håll den yttre kammaren påsatt för att täcka toppen av kryogallerboxhållaren. Tillsätt ~ 1 cm extra LN2 till kryogenkoppen för att hjälpa till att balansera systemet till LN2-temperatur .
OBS: Anti-föroreningsringen kan användas för att begränsa fuktig luftkondensering runt kryokoppen och leda till kryokylning/etanförorening. Detta krävs i allmänhet inte i en fuktstyrd miljö. Om du använder antikontamineringsringen, var försiktig så att du inte fyller behållaren för mycket med LN2 , annars kan den spilla när ringen pressas in i behållaren senare i processen. - Vänta 3-5 min för att observera kokningen av spindelbenen och vänta sedan ytterligare 3 minuter för att säkerställa att kryogenkoppen är tillräckligt kall för att kondensera vitrifikationsmediet.
- Kondensera kryogenen (flytande etan) i kryogenkoppen.
- Ta etancylinderröret med tunna slangar och ett munstycke för att dispensera gasen. En P200 pipettspets med öppningen öppen genom att skära av själva spetsen med ett rakblad är idealisk här. En bredare öppning behövs för att förhindra att etan stelnar vid spetsen och blockerar gasflödet.
- Se till att kryogenkoppen inte innehåller någon återstående LN2, ta etangasmunstycket och placera det i kryogenkoppen. Använd gascylindrigaregulatorn och starta ett lågt flöde och dosera kryogengas i kryogenkoppen för att kondensera gasen. Håll spetsen från vilken gasen strömmar direkt tryckt mot kryogenkoppens vägg men flytta den försiktigt fram och tillbaka i en knackande rörelse mot ytan. Reglera gasflödet så att ett lågt, jämnt flöde kan börja kondensera/kondensera på ett kontrollerat sätt i kryogenkoppen.
- Fyll koppen strax under silverspindelkanten och stoppa gasflödet och ta sedan bort gasledningen försiktigt för att undvika att förorena den omgivande LN2 med etan.
- Fyll på kylvätskebehållaren med LN2 och var mycket försiktig så att du inte spiller ut någon i den flytande etanen.
- Lämna spindlarnas ben på plats i ~ 3-5 min för att säkerställa att den flytande etan är ekvilibrerad till en tillräckligt kall temperatur. Kryogenen börjar se grumlig/något ogenomskinlig ut. Detta indikerar att det är nära sin fryspunkt. I detta skede, använd pincett för att ta bort spindeln. Så länge LN2 hålls i behållaren kring kryogenkoppen kommer etan nu att förbli flytande och lämplig för vitrifikation i 1-2 timmar. Sträva dock efter att slutföra proceduren så snabbt som möjligt, särskilt i rum som inte är fuktkontrollerade, för att minska isföroreningen.
OBS: Om spindeln verkar vara "fast på", använd ett metallföremål som en mutter och håll mot spindelns ben för att värma upp dem något och ta sedan bort benen.
- Förbered dykfrysningsanordningen och tillbehör för provvitrifiering.
- Lägg till gallerförvaringslådor till metallkartongboxhållaren och under hela proceduren se till att LN2 hålls påslagen upp till strax över nivån på rutnätslådorna (vanligtvis var ~ 5 min).
- På skärmen för dykfrysningsanordningen, i rutan Processparametrar , mata in de valda parametrarna inklusive: blottid (den tid som dykfrysningsanordningens kuddar kommer att samlas), kraft (avståndet mellan blottingkuddarna från gallret, vilket ändrar lutningen på isbildning) och totalt (antal gånger blottingkuddarna kommer in för att möta). Välj dessa parametrar baserat på den enskilda dykfrysningsanordningen och makromolekylens beteende. Typiska värden är en fläckkraft mellan 0 och 5, fläcktid från 1-6 s och en fläck totalt 1. Typisk väntetid (tid mellan att initiera fläcken och fläckens början) och dräneringstiden (tid efter blottning före fallande) är 0-2 s.
OBS: Beroende på användarinställningar kan ytterligare alternativ i avsnittet Alternativ, Diverse väljas, inklusive Använd fotpedal för att gå vidare till nästa steg på varje tryck, Hoppa över rutnätsöverföring (hoppar över det sista steget där pincettarmen höjs något), stänga av luftfuktigheten under processen (medan provet appliceras, stoppar aktiv befuktning av kammaren vilket kan göra det svårare att se rutnätet) och Autoraise Ethanelift (kombinerar steget av pincett som lyfts in i kammaren och höjer kylvätskebehållaren - hoppar Höj etanbehållarens steg). Här är alla dessa alternativ aktiverade. - Placera kylvätskebehållaren ordentligt på den rörliga plattformsarmen under kammaren
- Sätt in färskt blottingpapper på varje blotterarm och se till att plastringklämmorna är säkrade. Varje filterpapper tillåter 16 fläckar (armarna roterar blottingpapper). Tryck på knappen Återställ blot-papper i avsnittet Kontroller .
- Kör 1 hel cykel av dykfrysningsanordningens vitrifikationsprocess för att säkerställa att varje rörlig del beter sig som förväntat.
- Tryck (eller använd fotpedalen) för att placera nytt rutnät, sedan Starta processen och sedan Bearbeta sedan Fortsätt. I detta skede, titta för att se till att blottingarmarna kontaktar varandra som förväntat.
- Slå på luftfuktaren. Vattenånga kommer att produceras (så länge den inställda luftfuktigheten är högre än för närvarande i kammaren).
- Det intressanta exemplaret kan nu för vitrifieras. Använd fotpedalen eller Placera nytt galler så kommer stången att falla ut ur kammaren så att pincetterna kan fästas i fästet.
- Använd doppfrysningsanordningens pincett, plocka upp önskat glödurladdnings-/plasmarengjort kryoEM-galler och var noga med att notera vilken sida som är rätt sida som ska användas för provtillämpning enligt nättillverkaren. Lyft upp gallret vid fälgen, var noga med att undvika överdriven / onödig kontakt med pincetterna eftersom detta kommer att skada stödet. Säkra gallret i pincetterna genom att flytta det svarta klippet ner till pincettens rygg. Rutnätet måste hållas säkert, men klämman bör inte vara för långt ner eftersom det kommer att kontakta blottingkuddarna, vilket leder till irreproduktiv blotting och senare måste pincetterna hållas under denna punkt när du släpper klippet.
- Placera doppfrysningsanordningens pincett som håller kryoEM-gallret på den pneumatiska armen med rätt sida vänd mot din dominerande hand. Utformningen av doppfrysningsanordningens pincett och kammare är sådan att provet kan appliceras antingen genom kammarens högra eller vänstra sida, beroende på användarens handenhet.
OBS: Att applicera provet på olika sidor med samma blottingparametrar resulterar sällan i jämförbara resultat, så vänsterhänta forskare kan behöva justera sina blottingparametrar oberoende av sina högerhänta kollegor. - Tryckstartsprocessen och gallret som hålls i pincetterna kommer att tas in i kammaren och kylvätskebehållaren kommer att höjas.
- Tryckprocessen och pincetterna flyttar gallret till den position där en pipett kan användas för att applicera provet på gallret. Öppna sidoporten mot rätt sida av gallret och applicera prov genom pipettering, se till att pipettspetsen inte vidrör gallret eftersom det kan leda till skador på gallerstödet/böjningen av gallret, men dosera vätskan tillräckligt nära så att droppen dispenserar på gallret. Vanligtvis appliceras 3-5 μL.
- Tryck på Fortsätt och användarens fördefinierade parametrar kommer att fläcka gallret och sedan doppa pincetterna med galler monterat i kylvätskekoppen för provvitrifiering. Pincett kommer att sjunka i samband med att armen håller kylvätskebehållaren och kylvätskan, vilket håller gallret nedsänkt i kryogenen.
- Överför gallret från kryogenkoppen till gallerförvaringslådan nedsänkt i LN2.
- Lossa pincetterna från pincettarmen och var mycket försiktig så att du inte kontaktar det vitrifierade gallret med sidorna av kryogenkoppen. Justera greppet så att pincetterna hålls bekvämt. Så snabbt och försiktigt som möjligt, flytta gallret från kryogenen till LN2. Håll pincetterna stängda med fingrarna med ena handen och med den andra handen, skjut det svarta klippet uppåt ur vägen och håll pincetterna stängda. Justera greppet och manipulera gallret i rutnätets förvaringslåda.
- Upprepa steg 1.10-1.19 tills alla rutnät har gjorts (en typisk session innebär att du skapar 4-12 rutnät). Förvara alla nätlagringslådor som innehåller galler i LN2-dewar till nästa steg.
2. Urklippsgaller för lastning i ett autoloadermikroskop
- Klipp rutnät i autogrid-sammansättning enligt protokollet som tidigare beskrivits 28.
3. Säkra fjärrinloggning till mikroskop
OBS: Med COVID-19-kontroller i skrivande stund, men också med miljöhänsyn i samband med internationella resor, har fler mikroskopianläggningar erbjudit tjänster där användaren arbetar på distans. Implementeringsmetoden för detta kommer att variera beroende på den lokala IT-konfigurationen för varje anläggning och behoven hos dess interna och externa användargrupp. Här beskrivs processen för fjärråtkomst till cryoEMs på eBIC och styra mikroskopet via EPU-programvara.
- Logga in på kryoEM: s. Fjärrinloggning förmedlas via NoMachine-programvaran för att komma åt mikroskopstödsdatorn och är konfigurerad för att endast tillåta åtkomst till användare som är registrerade vid ett besök via användarnas FedID-inloggningsuppgifter. Åtkomsten förblir endast aktiv under sessionens varaktighet.
- Öppna NoMachine och starta en ny NX-anslutning för att nx-cloud.diamond.ac.uk med lösenordsautentisering.
- Öppna anslutningen och logga in med användarnamnet fedid@fed.cclrc.ac.uk och FedID-lösenord. Dubbelklicka på ikonen som motsvarar relevant mikroskop från de tillgängliga alternativen för att öppna en anslutning till den relevanta supportdatorn.
- Ange användarnamn clrc\FedID och lösenord på inloggningsskärmen i Windows.
- Öppna TeamViewer-programvaran från skrivbordsikonen och anslut till PartnerID: TEM med det angivna lösenordet. Detta upprättar anslutningen från supportdatorn till TEM-datorn. Knappen Nästa bildskärm i menyfliksområdet TeamViewer kan användas för att växla mellan mikroskopgränssnittet och EPU-fönstret.
- Mikroskopfunktioner kan sedan styras av användare direkt via EPU-gränssnittet.
4. Lastning av prover i ett autoloadermikroskop och screening för is- och provkvalitet
OBS: I det här avsnittet används ett mikroskop med en autoloader och EPU-programvara för provscreening, men detta kan uppnås med hjälp av annan programvara och ett sidoinmatningssystem och cryoEMs från andra tillverkare.
- Ladda klippta rutnät i mikroskopets autoladdare som tidigare beskrivits28.
- På fliken Autoloader i mikroskopgränssnittet flikar du ut dialogrutan Alternativ med hjälp av pilen och trycker på knappen Lager . Detta kommer att kontrollera varje position i kassetten sekventiellt för att avgöra om det finns en patron. Upptagna slitsar kommer att märkas i blått. Om alla upptagna platser har mappats trycker du på knappen Lager igen för att stoppa efter den aktuella positionen, annars lämnar du igång tills alla upptagna platser har mappats. Märk alla upptagna platser med exempelinformationen i de medföljande rutorna.
- Markera rutnätet som ska överföras till mikroskopkolumnen och klicka på Läs in. Kortplatsetiketten förvandlas från blått till gult när rutnätet har laddats in på scenen. Fortsätt att avskärma rutnäten.
- Öppna EPU-programvaran. På sidan Förberedelse väljer du Förvärvsoptik och inställningar och väljer sedan Atlasförinställningen på den nedrullningsbara menyn. Välj lämpliga förinställningar för strålinställning (t.ex. 64x nominell mag, dekorstorlek 5, Microprobe, med ett belyst område i parallellområdet för Falcon-detektor - för ytterligare information om att välja förinställningar för balkinställning se28). Tryck på Set för att trycka parametrarna till mikroskopet.
- Tryck på Öppna pelarventiler och sätt in FluScreen. Kontrollera att en stråle är synlig och tillräckligt spridd och centrerad för att täcka detektorn. Om det behövs navigerar du till en tunnare del av rutnätet med styrspaks- eller scenmenyn för att styra stegrörelserna i X och Y.
- Lyft FluScreen och ta en bild med knappen Förhandsgranska i EPU. Baserat på den förvärvade bilden kan dosen ökas genom att flytta till ett lägre antal spotstorlek, och vice versa.
- Gå till Atlas-sidan i EPU och tryck på Ny session. Välj MRC-bildformat och ange ett lämpligt mappnamn och en lämplig plats för att spara visningssessionen och klicka sedan på Verkställ.
- Välj Screening i menyn till vänster. Markera kryssrutorna bredvid varje rutnät för att få ett atlasmontage förvärvat. Starta screeningsessionen i EPU. En atlas kommer att förvärvas för varje kontrollerat rutnät, med ett antal tillgängliga rutnätsrutor listade när de är klara. Varje atlas kan ses genom att markera den på screeningsidan, komplett med ett pålägg som visar rutnätsrutor med en liknande förväntad istjocklek grupperad efter färg.
- När du är klar bör du granska de insamlade atlaserna och identifiera de galler som är lämpliga för att bedöma provkvaliteten vid högre förstoringar (dvs. de med ett lämpligt antal rutnätsrutor som varken är torra eller skymda av tjock is). Markera det valda rutnätet på EPU-screeningmenyn och klicka på Läs in exempel.
- Använd förinställningarna för strålinställning (se 28 för förklaring av de förinställningar för balkinställning som önskas för varje steg) och förhandsgranskningsfunktionen för att undersöka önskade rutnätsrutor mer i detalj.
- På Atlas-visningsmenyn väljer du rutnätet som för närvarande är inläst och flyttar scenen till en rutnätsruta som innehåller fyllda hål genom att högerklicka över önskad plats på rutnätsbilden och välja flytta till rutnätsrutan.
- Gå tillbaka till EPU, preparation-sidan och välj gridsquare-förinställningen .
- Öppna sidan EPU, Auto Functions och kör Auto-eucentric by stage tilt med GridSquare-förinställningen för att flytta provet till eucentrisk höjd.
OBS: Auto-eucentrisk med balklutning finns också tillgänglig, vilket är snabbare men vanligtvis mindre exakt än auto-eucentrisk av steglutning. - Ta en ny GridSquare Preview-bild i EPU, Preparation. Observera de olika grå värdena över olika hål som indikerar olika istjocklekar. Flytta scenen över ett hål med högerklick > flytta här. Välj förinställningen Hål/Eucent höjd och Förhandsgranska.
OBS: Beroende på molekylvikten och formen på den partikel som är av intresse kan det vara möjligt att identifiera den vid hål/eucentrisk höjdförstoring. - Välj förinställd datainsamling och ställ in en förstoring som gör det enkelt att identifiera partiklarna (motsvarande en objektprovtagning på allmänt <2 Å/pixel). Ställ in defokusförskjutningen på ~-3 till -5 μm med en exponeringselektrondos på ~40-80 e-/ Å2.
- Iterera genom steg i 4.4 för att bedöma en rad istjocklekar för partikelfördelning, orientering och förorening över nätet. Partikelfördelningen kan variera nära kanterna kontra hålets mitt och därför är det viktigt att undersöka olika platser med hålet.
- Visa alla rutnät som visar löfte från atlaser som att ha tillräckligt med rutnätsrutor. Håll antingen dessa i mikroskopet och fortsätt till datainsamling med hjälp av EPU, eller lossa proverna från mikroskopet och lagra under LN2 tills datainsamlingen är planerad.
5. Insamling av engångspartikel cryoEM -data (med fokus på fjärrdrift)
OBS: Ett detaljerat protokoll för datainsamling med EPU beskrivs i tillverkarens handbok och på andra håll28. Här markeras ändringar av detta protokoll för fjärrdrift (nämligen att minska användningen av handpanelerna för att utföra uppgifter och använda programvarubaserade alternativ).
- Om inte en redan har samlats in under sessionen, samla in en Atlas för rutnätet.
- Definiera var och en av förinställningarna för strålinställning enligt projektets experimentella behov.
- Utför bildskiftskalibreringar28.
- Konfigurera EPU-sessionen.
- I EPU väljer du EPU-sida och sedan Session Setup, väljer Ny session och sedan Ny från inställningar.
- Välj Ny session ett popup-fönster visas som ett alternativ för att använda tidigare inställningar. Ja läser automatiskt in inställningarna från den tidigare EPU-funktionen (dvs. provbärare, defokuseringsområde, autofokusinställningar, rutnätstyp) i den aktuella EPU-sessionen. Om du väljer Ny från inställningar kan användaren välja en fil med sparade inställningar (dvs. defokusintervall, autofokusinställningar, rutnätstyp) och den här informationen kommer att förinstalleras till EPU.
- Fyll i sessionsnamnet med något informativt. Den lokala anläggningen kan föreslå en namnkonvention.
- Välj Manuell i Text.
- För förvärvsläge väljer du exakt hålcentering eller snabbare förvärv.
- Välj önskat format i bildformat .
- Välj en lämplig lagringsmapp så skapar EPU en katalog med sessionsnamnet.
- Välj lämplig provbärare enligt vilken rutnätstyp och hålavstånd som används (t.ex. Quantifoil 1.2/1.3) och tryck på Applicera. Det här protokollet beskriver processen för att generera en mall för en vanlig matris med hål
- Välj en första rutnätsruta och ange en förvärvsmall.
- Om alla rutor är gröna klickar du på Avmarkera längst upp till vänster.
- Öppna paneler (högerklicka > öppna panelen). Markera en ruta (högerklicka > lägg till, högerklicka > Flytta steg till rutnätsruta).
- Gå till Val av hål och tryck på Auto Eucentric. Vänta tills detta är klart och en Grid Square-bild har tagits. Om autofunktionen misslyckas kan det bero på att höjden är betydligt av. I så fall kan den justeras manuellt med Hjälp av FluScreen vid Grid Square förstoring.
- Mät hålstorleken. Flytta och justera de gula cirklarna så att de är över hålen med rätt storlek och avstånd.
- Tryck på Hitta hål. Kontrollera att hålen har hittats korrekt. Om inte ändra hålstorleken och hitta hål igen. Upprepa detta tills det hittar hålet korrekt. Om det konsekvent misslyckas bör du överväga att flytta till ett lägre tal (ljusare) dekorstorlek vid rutnätets kvadratiska förstoring.
- Använd filterens histogram för iskvalitet till höger för att justera hålvalet. Detta kan vara användbart för att utesluta områden med tjock is och tunn is. Detta kommer att kommas ihåg för framtida rutnätsrutor som valts under den här sessionen.
- Optimera val av hål med verktygen i Välj-menyn högst upp. Klicka till exempel på Ta bort hål nära rutnätsfältet.
- Gå till Malldefinition och tryck på Hämta.
- Klicka på Sök och mitthål. Det kommer nu att finnas en bild av ett hål med en gul cirkel runt hålet.
OBS: Om det kämpar för att hitta hålet, sätt in den objektiva bländaren. Om hålet fortfarande inte kan hittas kan du försöka öka exponeringstiden för hålet/den eucentriska höjdförinställningen eller öka defokuseringen för den här förinställningen eller kasta bilden. En stor defokusändring kan ändra justeringen för bildskift. - Ändra fördröjningen efter stegförskjutningen och fördröjningen efter bildförskjutningstiderna till 1-5 s.
- Kontrollera maximalt bildförskjutningsvärde (om alternativet är tillgängligt) är som önskat. Om avvikelsefri bildförskjutningssamling används definieras det här värdet i EPU-konfigurationsfilen, annars är 5 μm ett standardvärde.
- Klicka på Lägg till förvärvsområde och klicka sedan var som helst på bilden. Flytta förvärvsområdet till önskad plats (dvs. vid kanten av ett hål) så att förvärvsområden inte dubbelt exponeras med strålen (torget i den gröna cirkeln representerar detektorområdet, den gröna cirkeln är stråldiametern).
- Lägg till defokusområdet längst upp till höger. Lägg sedan till andra förvärvsområden. En typisk defokuslista för ett membranproteinprojekt är -0,8 till -3 μm defokus.
- Klicka på Lägg till autofokusområde och klicka var som helst på bilden. Flytta autofokusområdet till kolet som omger ett hål. Standardpraxis är att autofokusera efter orientering när du använder AFIS, eller var 5-15 μm, beroende på z-höjdvariationen över torget.
- Klicka på Lägg till driftmätningsområde, driftmätning som utförs en gång per rutnätsruta, med en angiven tröskel på 0,05 nm/s är en standardinställning. Driftmätningsområdet kan (och det är en bra idé att) överlappa direkt med autofokusområdet. Se till att varken drift- eller autofokusområde överlappar ett förvärvsområde.
Mallen kan kontrolleras med hjälp av mallkörningsfunktionen. Detta är en bra idé för att se om förvärvsområden behöver flyttas (t.ex. för mycket/för lite kol i bilder), men är inte nödvändigt. - Gå tillbaka till Square-markeringen och välj rutorna för förvärv i rutnätet. Använd antalet förvärvsområden och förväntad datainsamlingsgrad (från anläggning baserad på detektorer och experimentellt inrättande) för att förutsäga hur många förvärvsområden som krävs.
- När alla önskade rutor är markerade trycker du på Förbered alla rutor.
- När varje ruta har samlats in navigerar du mellan rutnätsrutorna och finjusterar hålen med markeringsborsten.
- Flytta till en scenplats över prov och använd automatiska funktioner för att ställa in eucentrisk höjd. Utför mikroskopjusteringar som tidigare beskrivits28, men istället för att utföra komafri justering och korrigera för objektiv astigmatism manuellt, använd justeringsverktyg i programvaran. Ställ kortfattat in anskaffningsbalkförhållanden, se till att objektiv bländare (OA) avlägsnas och scenen placeras över ett balkstabilt område av prov på eucentrisk höjd. Utför komafri justering inom de automatiska funktionerna innan du sätter in och centrerar OA och korrigerar objektivet astigmatism med EPU. Se till att båda inriktningarna konvergerar på lämpliga värden (<150 nm koma och nära noll astigmatism.
- Innan du startar den automatiska förvärvskörningen, se till att turbopumpen för automatisk lastladdare är avstängd och att målöppningen sätts in.
- I Automatiserat förvärv trycker du på Start run för att påbörja automatiserat datainsamling.
6. Bildbehandling för att ge EM-densitetskarta
OBS: Majoriteten av cryoEM-anläggningarna erbjuder förbehandling av mikrograffilmer "i farten". Det finns ett brett utbud av programvarupaket och tillvägagångssätt tillgängliga för detta, inklusive RELION-rörledningar28,33, cryoSPARC43, Scipion34 och WarpEM44. En RELION-baserad pipeline beskrivs här och det antas att användaren har flyttat mikrograffilmerna till en lämplig lagringsplats med tillgång till datorresurser. En översikt över processen och representativa resultat för ett membranproteinprojekt tillhandahålls, en detaljerad beskrivning och steg för steg handledning finns på RELION hemsida: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion.
- Utför "on the fly" analys av micrograph motion correction och CTF uppskattning. Starta RELION i projektkatalogen. Schemalägg import-, rörelsekorrigerings- och CTF-uppskattningsjobb så att de är samtidiga med datainsamling och överföring. Ett mikrografanalysskript28 ger visuell feedback i realtid om astigmatism och uppskattade defokusvärden (se representativa resultat).
- Plocka partiklar från förbehandlade mikrografer. Det finns ett antal automatiserade partikelplockningsprogrampaket att välja mellan. Referensfria och mallbaserade plockalternativ finns tillgängliga på fliken Automatisk plockning på RELION37. Andra program kan användas för olika steg, till exempel använda crYOLO för partikelplockning35.
- Extrahera partiklar från CTF-korrigerade mikrografer.
OBS: För att minska den beräkningstid som krävs för tidig "rensning", bearbetningssteg, nedskala/bina partiklarna vid extraktion. Information om hur du kör extrakt jobbet finns i RELION 3.1 självstudien. För detta projekt binneds partiklar ursprungligen av en faktor 2. - Utför medelvärdet av 2D-klass. Klassificering av 100-200 klasser fungerar bra för de flesta datamängder som innehåller ≥ 100 000 partiklar. Det rekommenderas inte att använda många fler än 200 klasser eller färre än 50 klasser, även där datamängder är små om inte exemplet har hög symmetri (dvs. icosahedral virus) i vilket fall färre än 50 klasser fortfarande kan ge ett bra resultat. Ställ in maskdiametern tillräckligt stor för att rymma partikelns längsta dimension, men tillräckligt tät för att utesluta angränsande partiklar (detta kan kräva viss försök och fel).
- Välj bra klasser (dvs. de med strukturdetaljer) med hjälp av delmängdsvalsjobbet. Exempel på bra och dåliga 2D-klassgenomsnitt finns i avsnittet representativa resultat.
- Generera en första model de novo från data med hjälp av 3D-start modelljobbet i RELION.
OBS: Mindre rena partikelstackar kan dra nytta av multi-reference ab initio SGD (stokastisk gradient nedstigning) förfining eftersom detta ger en ytterligare möjlighet att sikta ut skräp / suboptimala partiklar. Välj en maskdiameter som rymmer den intressanta partikeln och lämna standardvärdena för fält på fliken "SGD" eftersom dessa rutinmässigt fungerar bra. Se till att den ursprungliga modellen ser rimlig ut i Chimera (eller ett annat lämpligt visualiseringsprogram) (se representativa resultat). - Utför 3D-klassificering för att åtgärda heterogenitet i data med hjälp av utdata från steg 6.6 som referensmodell. Utvärdera de resulterande kartorna i Chimera. Bearbeta partikelstaplar som motsvarar unika konformationstillstånd oberoende av varandra. Använd delmängdsvalsjobbet för att välja en klass/klasser av intresse och generera particles.star-filer för de associerade partikelstackarna.
- Kör automatisk förfining av 3D. Använd medelvärdena för 3D-klassen som erhållits i föregående steg som referenser för förfining av motsvarande partikelstackar. Om upplösningen av förfiningen närmar sig Nyquist-gränsen för data, extrahera partiklarna utan nedskalning. Upprepa 3D-jobbet för automatisk raffinering med den obinerade partikelstacken efter återutvinningen. I detta fall måste 3D-referensmodellerna skalas om så att pixel- och lådstorlekarna överensstämmer med pixel- och lådstorlekarna för de återutextrade partikelbilderna. Använd kommandoradsverktyget relion_image_handler för att utföra den här åtgärden.
- Använd symmetri i förfining om det är lämpligt. Om en rekonstruerad karta har symmetri justerar du kartan på lämplig symmetriaxel med hjälp av kommandoradsverktyget relion_align_symmetry. Använd den resulterande justerade kartan som referens i ett nytt 3D-jobb för automatisk förfining med lämplig symmetrioperator som anges på referensfliken.
- Vässa kartor från 3D-automatisk förfining. Detta görs med hjälp av efterbearbetningsjobbet i RELION, men först måste en lämplig mask skapas från den förfinade kartan. Stegen för att skapa masker och efterbearbetning beskrivs i RELION-självstudien (se även representativa resultat).
OBS: Upplösningen av många rekonstruktioner kan förbättras ytterligare med hjälp av Bayesian polering och CTF förfining funktioner i RELION. Använd CTF-förfiningsarbetstypen för att uppskatta och korrigera för högre orderavvikelser (balklutning, trefoil avvikelser och 4: e ordningens avvikelser) och, som separata jobb, anisotropisk förstoring och defokus per partikel. Därefter använder du det bayesiska poleringsjobbet (tränat eller med standardvärden) för att hantera strålinducerad rörelse per partikel. Som tas upp i RELION 3.1-handledningen kommer dessa jobb sannolikt att dra nytta av ett iterativt tillvägagångssätt (CTF-förfining → Bayesian polering → 3D auto-förfining → efterbehandling → ... slinga) eftersom båda drar nytta av modeller med högre upplösning. - Korrigera handligheten på EM-densitetskartor vid behov. Undersök kartorna för att avgöra om handheten är korrekt antingen genom att försöka passa en befintlig atommodell eller bedöma de alfa spiralformade regionernas handlighet. Vänd vid behov kartan längs z-axeln i UCSF Chimera45 med kommandot "vop zflip".
Representative Results
Vid screening kan rutnät kasseras i atlasstadiet, där funktioner som löses vid låg förstoring markerar rutnätet som inte lämpligt för datainsamling. Till exempel om ett galler har utsatts för betydande mekanisk skada med de flesta rutnätsrutor brutna (figur 2A), eller där gallret verkar vara "torrt", utan glaskroppsis (figur 2B). Sådana rutnät är vanligtvis identifierbara eftersom kanterna på rutnätsrutorna verkar skarpa och distinkta. Över de flesta galler som tillverkas med hjälp av dykfrysningsanordningen observeras en isgradient (figur 2C,D). Partikelfördelningen, beroende på vilket prov som är av intresse, kan variera dramatiskt med istjocklek och därför rekommenderas screening av en rad rutrutor för att bedöma partikelfördelningen. Verktyg har implementerats inom EPU-programvaran under atlasscreeningssteget för att hjälpa användaren att identifiera rutnätsrutor med liknande eller annan istjocklek, vilket kan vara särskilt användbart för användare som är nya för att undersöka kryoEM-nät (figur 2E, F).
Bild 2: Exempel på "atlasmontage" med låg förstoring från screeningsessioner. A) Ett galler som har lidit betydande skador med de flesta rutnätsrutor trasiga - olämpliga för insamling. B) Ett torrt galler utan glasaktig is - olämpligt för uppsamling. C) Ett rutnät som visar en isgradient med ~ 50% av rutnätet användbart. D) En isgradient med ~ 33% av gallret användbart. Både C och D är lämpliga för datainsamling om de användbara rutorna har en istjocklek som är lämplig för insamling, och det finns tillräckligt med förvärvsområden för att uppfylla den minsta varaktigheten för en insamling (t.ex. 24 h) E) Ett exempelatlas med istjocklekar. F) Samma atlas presenteras i E men med rutnätsrutor kategoriserade och färgade av EPU-programvara enligt istjocklek. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Vid screening av partikelfördelning, se till att bildparametrar, såsom förstoring och total elektrondos, liknar dem som förväntas användas vid datainsamling för att ge en korrekt bild av förväntade resultat. Under screeningen är en idealisk partikelfördelning monodispers med en rad synliga partikelorienteringar (beroende på provet och befintlig kunskap om partikelns morfologi kan detta vara utmanande att fastställa) (figur 3A). Isen ska vara så tunn som möjligt samtidigt som den rymmer partiklarnas största dimension, om isen är för tunn kan den smälta när den belyses med elektronstrålen. Detta orsakar överdriven rörelse i mikrografen, och områden som visar denna egenskap bör undvikas (figur 3B). Av kollektiv erfarenhet observeras denna effekt oftast när det finns tvättmedel i bufferten. Detta kan resultera i mycket tunn is i mitten av hålet och därför kan partiklar fysiskt uteslutas och tvingas mot kanten. Den här effekten observeras i figur 3C, men i det här fallet är det inte ett extremt exempel och dessa bilder skulle fortfarande användbart bidra till en data uppsättning. Slutligen måste isen vara glasaktig; exkludera områden i rutnätet (eller rutnäten) där majoriteten eller alla bilder som tagits visar kristallin is (figur 3D) från datainsamling. Ofta observeras icke-glasaktig is vid kanten av gallerrutor. Läsare hänvisas till detaljerade recensioner av variablerna som kan ändras under gallervitrifiering16 och beskrivningar av partikelbeteende i tunnfilmsmiljön46,47 för ytterligare information.
Figur 3: Representativa mikrografer som visar olika partikelfördelningar. A) En "idealisk" fördelning av monodisperspartiklar som antar en rad olika inriktningar. B) Alltför tunn is i mitten av hålet som den deformerar vid exponering för elektronstrålen och orsakar överdriven rörelse i mikrografen. Denna effekt observeras oftast när tvättmedel finns i bufferten C) Där isen är tunnare i mitten av hålet utesluter detta fysiskt partiklar från mitten, vilket orsakar trängsel av partiklar mot hålkanten. I det här fallet är det inte tillräckligt extremt för att förhindra att dessa bilder är användbara, men det tyder på att det är värt att undersöka något tjockare områden. D) Is är inte glasaktigt, data bör inte samlas in på områden som ser ut som detta exempel mikrograf. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bildbehandling i farten kan hjälpa till att plocka upp fel och problem med datainsamling och rekommenderas därför alltid där det är möjligt. Överdriven rörelse inom mikrografer kan till exempel indikera att autoloader turbopumpen är aktiv, eller data samlas in på en sprucken rutnätsruta där is rör sig avsevärt i elektronstrålen, vilket indikerar att rutnätsrutan ska hoppas över. I farten kan CTF-uppskattning avslöja omständigheter där en positiv fokuspunkt (snarare än defokus) tillämpas (där CTF-uppskattningsprogram och parametrar för att hitta dessa punkter används) och bestämma fasförskjutningen där en Volta-fasplatta48 används. I farten innehåller bildbehandlingspipelines ofta en grafisk sammanfattning av uppgifterna (figur 4A) för att göra det lättare för användare att snabbt bedöma mikrografkvaliteten och avgöra om ändringar av datainsamling krävs.
Val av partiklar från mikrografer, samtidigt som man undviker "falska positiva" som förorening eller rutnätsstödfilmen kan kräva optimering. Partikelplockare som crYOLO fungerar dock ofta tillräckligt bra med standardparametrar för ett "första pass" av data (figur 4B), vilket möjliggör progression till 2D-klassgenom genomsnitt där det kan vara lättare att bedöma datakvaliteten och sannolikheten för framgång nedströms. För de flesta projekt bör 2D-klassificering av ~ > 10k partiklar börja avslöja klasser som har sekundära strukturdetaljer. För att gå vidare till 3D bör 2D-klassificeringssteget vanligtvis avslöja klasser som representerar en rad partikelorienteringar. Om en föredragen orientering avslöjas kan fler iterationer av provberedning16 eller ytterligare datainsamling med provet lutat49. Alla klasser som visar sekundär strukturdetaljer bör väljas för att gå vidare till 3D-analys, medan skräppartiklar kasseras (figur 4C).
Bild 4: Inledande bildbehandlingssteg. A) Utdata från ett "on the fly"-bildbehandlingsskript. B) Exempel mikrograf (vänster) med lämpligt autoplockade partiklar identifierade med hjälp av crYOLO general modell (höger, med partiklar avgränsade av röda rutor) Skalstänger (vit) är 50 nm. C) Resultat från 2D-klassificering som visar klasser som kasserades i den röda rutan och klasser från vilka partiklar valdes ut för vidare bearbetning i grönt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
En liten delmängd av partiklar kan användas för att generera en första modell (figur 5A). Den här första modellen kan sedan användas som startmodell i 3D-klassificering och förfining. När det gäller RagAB innehöll datauppsättningen tre distinkta konformer som kan separeras under 3D-klassificeringen (figur 5B). Partiklar som bidrar till var och en av dessa klasser kan sedan behandlas självständigt och användas för att förfina en EM-densitetskarta som sedan kan bli föremål för ytterligare tolkning och modellbyggnad.
Bild 5: Generera 3D EM densitetskarta. A) Typisk initial modell som genereras med RELION. B) 3D-klassificering över 5 klasser som visar separation av partiklar i tre distinkta konformationstillstånd: öppen (grön), öppen (blå), sluten (lila). C) Process för att skapa masker. Kartan från 3D-förfining (vänster) ska visualiseras i chimera. Volymvisaren kan sedan användas för att identifiera det lägsta tröskelvärdet vid vilket kartan är fri från osammanhängande, bullrig densitet (mitten). Det här tröskelvärdet matas in som det ursprungliga tröskelvärdet för binarisering i jobbet för att skapa RELION-mask. Ett exempel på maskutdata visas i grått (höger). D) Högupplöst EM-densitetskarta över det öppna slutna tillståndet i RagAB (EMD-10245), filtrerat och färgat efter lokal upplösning (Å). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
I detta protokoll har vi beskrivit en grundläggande pipeline som är tillämplig på exemplar som är mottagliga för rutinmässiga SPA. Även om denna filterpapper blottningsmetod för tunnfilmsbildning och vitrifikation utan tvekan är framgångsrik med tanke på dess användning i de allra flesta SPA-projekt hittills, kommer det med ett antal nackdelar. Dessa inkluderar provsvinn, de långsamma tidsskalor (sekunder) som krävs för att bilda den tunna filmen och frysa provet, rapporterad irreproduktivitet27 och rapporterade negativa effekter av att använda filterpapper för att utplåna överflödig vätska50. Nyligen har ny teknik utvecklats för att förbättra reproducerbarheten av tunnfilmsproduktion51,52. Annan teknik har utvecklats som minskar tiden mellan provtillämpning och vitrifikation53,54,55. Även om filterpappersbaserade metoder för tunnfilmsbildning fortfarande är den mest allestädes närvarande metoden för SPA cryoEM-provberedning i skrivande stund, kan dessa nya tekniker medföra en rad fördelar när det gäller effektivitet och reproducerbarhet av nätvitrifiering, samt skapa nya möjligheter att få in ytterligare experimentella dimensioner, såsom tidsupplösning och snabb blandning före vitrifikation.
Processen med nätscreening för de flesta användare är för närvarande en kvalitativ process som innebär förvärv av atlaser med låg förstoring följt av att ta bilder med hög förstoring över nätet för att bedöma partikelfördelningen. Även om detta är ett tillräckligt robust tillvägagångssätt för vissa typer av prov, kan det vara svårt att bedöma med ögat om provet verkligen är vad forskaren hoppas kunna avbilda eller har en föredragen orientering, till exempel med små (<200 kDa) prover eller där den lågupplösta morfologin gör det svårt att identifiera med ögat om det finns en rad partikelfördelningar. För vissa projekt är det omöjligt att avgöra om exemplaret är som önskat, till exempel var en ligand är bunden eller var provet screenas för att bedöma om en liten (t.ex. 10 kDa) underenhet fortfarande finns i samband med ett komplex. För dessa projekt skulle helautomatiska pipelines för dataanalys i kombination med en "kort" 0,5- 1-h-samlingar, som kan fortsätta genom bildbehandlingssteg till 2D-klassificering eller till och med 3D-klassificering och förfining, hjälpa till att effektivt avgöra om en längre samling är berättigad. Dessa rörledningar är fortfarande under utveckling och är inte allmänt genomförda för närvarande, men de har potential att förbättra effektiviteten i cryoEM-nätscreening, särskilt för utmanande exemplar.
Förbättringar av direkta elektrondetektorer, liksom modifieringar inom mikroskopi i kombination med framsteg inom bildbehandling såsom insamling av bildskiftsdata, har ökat genomströmningen och kvaliteten på de bilder som produceras vid datainsamling. Denna ökning av den datahastighet som samlas in belyser behovet av noggrann screening av kryoEM-nät innan många TB data förvärvas.
CryoEM SPA har blivit en verkligt mainstream strukturell biologi teknik, och i många fall "gå till" strategi för vissa klasser av exemplar, såsom heterogena och labila makromolekylära komplex. Protokollet här beskriver en grundläggande översikt över SPA-pipelinen, men varje avsnitt som behandlas här (nätvitrifiering och screening, cryoEM och bildbehandling) är ett ämne i sig och värt att utforska under utvecklingen av ett SPA-projekt. I takt med att provberednings- och mikroskopitekniken utvecklas och nya algoritmer och metoder för bildbehandling kommer online kommer SPA att fortsätta att utvecklas som en pipeline, vilket hjälper forskare att få insikt i komplexa biologiska system.
Disclosures
Inga intressekonflikter rapporteras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av iNEXT-Discovery (Grant 871037) som finansierades av Europeiska kommissionens Horisont 2020-program. J B. R. White finansieras av Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). FEI Titan Krios mikroskop finansierades av University of Leeds (UoL ABSL award) och Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Vi tackar M Iadanza för användningen av hans mikrografanalysskript. Vi bekräftar Diamond Light Source för åtkomst och stöd till kryo-EM-anläggningarna vid Storbritanniens nationella Electron Bio-imaging Centre (eBIC) som finansieras av Wellcome Trust, MRC och BBRSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt tweezers | Agar Scientific | AGT5022 | |
| Cryo EM round storage box | Agar Scientific | AGG3736 | |
| CryoEM autogrid boxes | ThermoFisher Scientific | 1084591 | |
| CryoEM grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Ethane gas | Boc | 270595-F | |
| LN2 foam dewar | Agar Scientific | AG81760-500 | |
| LN2 storage dewar | Worthington industries | HC 34 | |
| Pipette | Gilson | 10082012 | |
| Pipette tips | Star labs | s1111-1706 | |
| Syringe | BD | BD 300869 | |
| Type II lab water | Suez | select fusion | |
| Vitrobot | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Vitrobot styrophome container assembly | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot tweesers | ThermoFisher Scientific | 72882-D | |
| Software | |||
| EPU | ThermoFisher Scientific | 2.8.1.10REL | |
| TEM server | ThermoFisher Scientific | 6.15.3.22415REL | |
| Tia | ThermoFisher Scientific | 5.0.0.2896REL | |
| Titan krios microscope | ThermoFisher Scientific | Titan Krios G2 |
References
- Kuehlbrandt, W.
- McMullan, G., Faruqi, A. R., Henderson, R.
- Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: the nuts and bolts. Current Opinion in Structural Biology. , (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. , (2020).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. , (2020).
- Conley, M. J., et al. Calicivirus VP2 forms a portal-like assembly following receptor engagement. Nature. 565 (7739), 377-381 (2019).
- Hesketh, E. L., et al. The 3.3 Å structure of a plant geminivirus using cryo-EM. Nature communications. 9 (1), 2369 (2018).
- Malone, L. A., et al. Cryo-EM structure of the spinach cytochrome b6 f complex at 3.6 A resolution. Nature. 575 (7783), 535-539 (2019).
- Madej, M., et al. Structural and functional insights into oligopeptide acquisition by the RagAB transporter from Porphyromonas gingivalis. Nature Microbiology. , (2020).
- Gallardo, R., et al. Fibril structures of diabetes-related amylin variants reveal a basis for surface-templated assembly. Nature Structural and Molecular Biology. , (2020).
- Scarff, C., et al.
- Scarff, C. A., et al. Structure of the protective nematode protease complex H-gal-GP and its conservation across roundworm parasites. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008465 (2020).
- Wu, M., Lander, G. C. How low can we go? Structure determination of small biological complexes using single-particle cryo-EM. Current Opinion in Structural Biology. , (2020).
- Khoshouei, M., Radjainia, M., Baumeister, W., Danev, R. Cryo-EM structure of haemoglobin at 3.2 Å determined with the Volta phase plate. Nature Communications. , (2017).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 74, Pt 6 560-571 (2018).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological procedures online. 6, 23-34 (2004).
- Baker, L. A., Rubinstein, J. L.
- Dubochet, J., et al.
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. , (2019).
- Sgro, G. G., Biosciences, T. R. D. C. F. 2018 Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. researchgate.net. , Available from: http://www.researchgate.net/profile/Tiago_Costa12/publication/326710861_Cryo-EM_Grid_Preparation_of_Membrane_Protein_Samples_for_Single_Particle_Analysis/links_EM-Grid-Preparation-of-Membrane-Protein-Samples-for-Single-Parti (2018).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with sub-1 Å specimen movement. Science. , (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in Enzymology. , (2016).
- Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. , (2009).
- Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. , (2003).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. , (2019).
- Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 73, Pt 6 496-502 (2017).
- Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Wagner, T., et al. SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM. Communications biology. 2 (1), 213-218 (2019).
- Bepler, T., et al. TOPAZ: A Positive-Unlabeled Convolutional Neural Network CryoEM Particle Picker that can Pick Any Size and Shape Particle. Microscopy and Microanalysis. , (2019).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 163 (2018).
- Zivanov, J., Nakane, T., Scheres, S. H. W. A Bayesian approach to beam-induced motion correction in cryo-EM single-particle analysis. IUCrJ. , (2019).
- Cianfrocco, M. A., Kellogg, E. H. What Could Go Wrong? A Practical Guide to Single-Particle Cryo-EM: From Biochemistry to Atomic Models. Journal of Chemical Information and Modeling. , (2020).
- Tagari, M., Newman, R., Chagoyen, M., Carazo, J. M., Henrick, K. New electron microscopy database and deposition system. Trends in Biochemical Sciences. , (2002).
- Berman, H. M., et al.
- Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: A public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. , (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. , (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. , (2019).
- Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for Speed: Examining Protein Behavior during CryoEM Grid Preparation at Different Timescales. Structure. , (2020).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 32 (2018).
- Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Zi Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EMthrough tilting. Nature Methods. , (2017).
- Armstrong, M., Han, B. -G., Gomez, S., Turner, J., Fletcher, D. A., Glaeser, R. M. Microscale Fluid Behavior during Cryo-EM Sample Blotting. Biophysical Journal. 118 (3), 708-719 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. , (2017).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 75, Pt 12 1063-1070 (2019).
- Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. bioRxiv. , (2020).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: From sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2020).
