Summary
Dette dokumentet introduserer metoden for å utvikle, karakterisere og spore i sanntid tumormetastase i sebrafiskmodell av nevroblastom, spesielt i den transgene sebrafisklinjen med overekspresjon av MYCN og LMO1, som utvikler metastase spontant.
Abstract
Sebrafisk har dukket opp som en viktig dyremodell for å studere menneskelige sykdommer, spesielt kreft. Sammen med de robuste transgene og genomredigeringsteknologiene som brukes i sebrafiskmodellering, gjør enkel vedlikehold, høy avkastning produktivitet og kraftig levende bildebehandling helt sebrafisken til et verdifullt modellsystem for å studere metastase og cellulære og molekylære baser som ligger til grunn for denne prosessen in vivo. Den første sebrafisk neuroblastom (NB) modellen av metastase ble utviklet ved å overekspressere to oncogenes, MYCN og LMO1, under kontroll av dopamin-beta-hydroksylase (dβh) promotoren. Co-overekspressert MYCN og LMO1 førte til redusert latens og økt penetrans av nevroblastomagenese, samt akselerert fjern metastase av tumorceller. Denne nye modellen gjentar pålitelig mange viktige trekk ved human metastatisk NB, inkludert involvering av klinisk relevante og metastaseringsrelaterte genetiske endringer; naturlig og spontan utvikling av metastase in vivo; og bevarte områder av metastaser. Derfor har sebrafiskmodellen unike fordeler for å dissekere den komplekse prosessen med tumormetastase in vivo.
Introduction
Sebrafisk har blitt mye brukt og anvendt på flere forskningsområder, spesielt i kreft. Denne modellen gir mange fordeler - for eksempel robust reproduksjon, kostnadseffektivt vedlikehold og allsidig visualisering av tumorvekst og metastase - som alle gjør sebrafisk til et kraftig verktøy for å studere og undersøke cellulære og molekylære baser av tumorigenesis og metastase. Nye teknikker for storskala genomkartlegging, transgenese, genovertrykk eller knockout, celletransplantasjon og kjemiske skjermer har enormt forsterket kraften i sebrafiskmodellen1. I løpet av de siste årene har mange sebrafisklinjer blitt utviklet for å studere tumorigenesis og metastase av en rekke menneskelige kreftformer, inkludert, men ikke begrenset til leukemi, melanom, rabdomyosarcoma og hepatocellulært karsinom2,3,4,5. I tillegg ble den første sebrafiskmodellen av nevroblastom (NB) generert ved å overekspressere MYCN, en oncogene, i det perifere sympatiske nervesystemet (PSNS) under kontroll av dopamin-beta-hydroksylase (dβh) promotoren. Med denne modellen ble det videre demonstrert at aktivert ALK kan synergisere med MYCN for å akselerere tumor utbruddet og øke tumorgjennomtrengende in vivo6.
NB er avledet fra den sympodrenale avstamningen av nevrale kamceller, og er en svært metastatisk kreft hos barn7. Det er ansvarlig for 10% av barnekreftrelaterte dødsfall8. Nb er bredt metastasert ved diagnose, og kan presenteres klinisk som svulster som hovedsakelig stammer fra kjeden av det sympatiske gangliaet og binyremedullaen til PSNS9,10. MYCN-forsterkning er ofte forbundet med dårlige utfall hos NB-pasienter11,12. Videre er LMO1 identifisert som et kritisk NB-følsomhetsgen i høyrisikotilfeller13,14. Studier fant at den transgene coexpression av MYCN og LMO1 i PSNS av sebrafiskmodellen ikke bare fremmer tidligere utbrudd av NB, men også induserer utbredt metastase til vev og organer som ligner steder som vanligvis ses hos pasienter med høyrisiko NB13. Svært nylig har en annen metastatisk fenotype av NB også blitt observert i en nyere sebrafiskmodell av NB, der både MYCN og Lin28B, som koder et RNA-bindende protein, er overekspressert under kontroll av dβh-promotoren16.
Den stabile transgene tilnærmingen i sebrafisk brukes ofte til å studere om overekspressering av et gen av interesse kan bidra til normal utvikling og sykdomspatogenese14,15. Denne teknikken har blitt brukt til å demonstrere betydningen av flere gener og veier til NB tumorigenesis6,16,17,18,19,20. Dette dokumentet vil introdusere hvordan den transgene fiskelinjen som overekspresserer både MYCN og LMO1 i PSNS ble opprettet og hvordan det ble demonstrert at samarbeidet mellom disse to oncogenes akselerere utbruddet av NB tumorigenesis og metastase13. For det første ble den transgene linjen som overekspresserer EGFP-MYCN under kontroll av dβh-promotoren (utpekt MYCN-linje) utviklet ved å injisere dβh-EGFP-MYCN-konstruksjonen i encellet stadium av wild-type (WT) AB embryoer, som tidligere beskrevet6,17. En egen transgen linje som overekspresserer LMO1 i PSNS (utpekt LMO1-linje) ble utviklet ved å mynte to DNA-konstruksjoner, dβh-LMO1 og dβh-mCherry, til WT-embryoer på encellet stadium13. Det har tidligere blitt demonstrert at myntede doble DNA-konstruksjoner kan myntes inn i fiskegenomet; Derfor er LMO1 og mCherry coexpressed i PSNS-cellene til de transgene dyrene. Når de injiserte F0-embryoene nådde seksuell modenhet, ble de deretter krysset med WT-fisk for identifisering av positiv fisk med transgene (er) integrasjon. Kort sagt ble F1-avkom først screenet av fluorescerende mikroskopi for mCherry-uttrykk i PSNS-cellene. Bakterieintegrasjonen av LMO1 i mCherry-positiv fisk ble ytterligere bekreftet av genomisk PCR og sekvensering. Etter vellykket identifisering av hver transgeniske linje ble avkommet av heterozygot MYCN og LMO1 transgen fisk interbred for å generere en sammensatt fiskelinje som uttrykker både MYCN og LMO1 (utpekt MYCN; LMO1-linje). Tumorbærende MYCN; LMO1 fisk ble overvåket av fluorescerende mikroskopi to uker for bevis på metastatiske svulster i regionene fjernt til det primære stedet, interrenal kjertel region (IRG, sebrafisk tilsvarende menneskelig binyrene)13. For å bekrefte metastase av svulster i MYCN; LMO1 fisk, histologiske og immunhiistokjemiske analyser ble brukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forskningsmetoder ved bruk av sebrafisk og dyrepleie/vedlikehold ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer ved Mayo Clinic.
1. Forberedelse og mikroinjeksjon av transgene konstruksjoner for utvikling av LMO1 transgen sebrafisk linje med overekspression i PSNS
- For å utvikle LMO1-pDONR221-klonen , forsterker du kodeområdet til human LMO1 fra cDNA oppnådd fra menneskelig cellelinje ved hjelp av PCR.
- Gjør en 25 μL reaksjon som beskrevet her: 2,5 μL 10x standard Taq Reaksjonsbuffer, 0,125 μL Taq DNA Polymerase, 0,5 μL 10 mM dNTPer, 2 μL cDNA-mal, 0,5 μL 10 μM fremover LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL μM omvendt LMO1 ATTB2 primer og 18,875 μL vann.
MERK: Bruk fremover LMO1 ATTB1 primer: 5'-GGGGACAAGTTTTGTACAAAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' og omvendt LMO1 ATTB2 primer: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
GAACTTGGGATTCAAAGGT-3' - Forsterk ved hjelp av følgende program: 1 syklus på 94 °C, 2 min; etterfulgt av 30 sykluser av (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 min) og 72 °C, 7 min.
- Gjør en 25 μL reaksjon som beskrevet her: 2,5 μL 10x standard Taq Reaksjonsbuffer, 0,125 μL Taq DNA Polymerase, 0,5 μL 10 mM dNTPer, 2 μL cDNA-mal, 0,5 μL 10 μM fremover LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL μM omvendt LMO1 ATTB2 primer og 18,875 μL vann.
- Klone LMO1 PCR produkt inn i pDONR221 gateway donor vektor av BP rekombinere reaksjon6,13 (PCR fragment + Donor vektor = Entry Clone).
- For en 10 μL reaksjon, bland 1 μL renset LMO1 PCR-produkt (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) pDONR221 donorvektor, og 6 μL TE-buffer (pH 8.0) med 2 μL BP enzymblanding, inkuberes i 1 time ved 25 °C, og forvandles til TOP10 kompetent E. coli ved hjelp av produsentens protokoll.
- Deretter sprer du 50-200 μL fra transformasjonshettegenalet på en Luria Broth (LB) agarplate som inneholder 50 μg/ml kanamycin og inkuberer ved 37 °C over natten.
- Velg kloner ved å inokulere en enkelt koloni i 2-5 ml LB med 50 μg/ml kanamycin og dyrking over natten (16-18 t) ved 37 °C.
- Bruk 2 ml over natten bakteriekultur for plasmid isolasjon i henhold til produsentens protokoll. For å bekrefte LMO1-plasmiden, send plasmidprøve ut for sekvensering med M13-F primer (5- GTAAAACGACGGCCAG-3').
- Hvis du vil generere en dβh-pDONRP4-P1R-inngangsklone, må du skaffe dβh PCR-produktet6,13 ved å forsterke den promotoriske regionen på 5,2 kb ved hjelp av CH211-270H11 BAC-klonen som mal for å forberede en 20 μL-reaksjon som tidligere beskrevet i trinn 1.1.1. Bruk følgende PCR-programparametere: 94 °C, 2 min; 10 sykluser på 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 30 sykluser på 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 68 °C, 4 min (med foroverprimer 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
CCCCTTTTTAGG-3' og reversprimer 5'-GGGGACTGCTTTTTTTTACAAACTTGTGTGCTTTG
TCGTCTTTTGA-3').
MERK: På grunn av de lange DNA-malene i dette trinnet, sikre bruk av et passende PCR-system for nøyaktig PCR-forsterkning. - Klone dβh PCR produkt inn i pDONRP4-P1R gateway donor vektor av BP rekombinere reaksjon6,13 (PCR fragment + Donor vektor = Entry Clone).
- Bland 1 μL renset dβh PCR-produkt (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) pDONRP4-P1R donorvektor, og 6 μL TE-buffer (pH 8,0) med 2 μL BP enzymblanding i totalt 10 μL reaksjon, inkuberes i 1 time ved 25 °C.
- Transformer til TOP10 kompetent E. coli i henhold til produsentens protokoll. Isoler plasmidet som beskrevet i trinn 1.2.2-1.2.4 og bekreft plasmid ved sekvensering med M13-F (5'-GTAAAACGCGACGGCCAG-3') og M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') primere.
- Generer uttrykkskonstruksjonen dβh:LMO1 .
- Kombiner 1 μL av hver inngangsklone (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 og p3E-polyA11) (20 fmole hver), 1 μL (60 ng/μL) modifisert destinasjonsvektor med I-SceI-anerkjennelsessteder og 4 μL TE-buffer (pH 8,0) som inneholder 2 μL av LR-rekombininase enzymblandingen. Inkuber denne blandingen i 1 time ved 25 °C.
- Mens du følger produsentens protokoll, transformer bakterier til kjemisk kompetent TOP10 E. coli. Isoler plasmid som beskrevet i trinn 1.2.2-1.2.4 og verifiser plasmid ved sekvensering med DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3') og LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3') primere.
- Generer dβh:mCherry DNA-konstruksjon med et gateway-system ved å kombinere inngangskloner av en 5,2 kb dβh-promotor, pME-mCherry og p3E-polyA i de modifiserte destinasjonsvektorene som inneholder I-SceI-anerkjennelsessteder som nevnt tidligere i trinn 1.5.16. Isoler plasmid som beskrevet i trinn 1.2.2-1.2.4 og verifiser plasmid ved sekvensering med DBH Forward primer (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3').
- Lineariser dβh:LMO1 DNA-konstruksjon og dβh:mCherry DNA-konstruksjon (med henholdsvis 3:1-forhold) i totalt 15 μL reaksjonsvolum med 1 μL I-SceI-enzym (5 U/μL) og 0,75 μL buffer (10x), og inkuber ved romtemperatur i minst 4 timer eller over natten. Sørg for at DNA-konsentrasjonen ikke overstiger 750 ng i reaksjon.
- Neste dag og etter linearisering av konstruksjoner, tilsett 0,5 μL friskt I-SceI-enzym (5 U / μL) og 0,5 μL 0,5% fenolrødt til 5 μL total DNA-blanding fra forrige trinn på 1,7. Mikroinjekt den totale løsningen (på 50-80 pg linearisert DNA) i encellet wild-type AB embryoer (og så mange som 500 embryoer) ved hjelp av 1,0 mm diameter glassmikropipette nål som tidligere beskrevet17. Oppbevar den gjenværende DNA-blandingen ved -20 °C for fremtidige injeksjoner.
2. Screen og verifiser LMO1 transgen fiskelinje for bakterieoverføring av LMO1 og mCherry
- Ved 3-4 dager etter befruktning (dpf), bedøvelse injiserte embryoer med 0,02% trikain og screen dem for fluorescerende mCherry uttrykk, som presenterer hvor som helst i hele fiskekroppen på grunn av mosaikktransgenesen. Overfør mCherry-positive embryoer til en Petri-tallerken med friskt eggvann og øk embryoer til seksuell modenhet i samsvar med sebrafiskboken21.
MERK: Forvent at forholdet mellom positiv fisk varierer avhengig av forskningspersonellets kompetanse og erfaring. For eksempel kan begynnende amatører ha en lav integrasjonsrate på 10%, sammenlignet med en ekspert på ≥50%. - For å bestemme grunnleggerfisken med dβh:LMO1 og dβh:mCherry transgenes integrert i bakterieceller, outcross enkeltpar injisert mCherry-positiv F0 seksuelt modnet fisk fra forrige trinn (2.1) med WT AB fisk. Screen F1 generasjon for mCherry-positive embryoer på 3-4 dpf.
- For å bekrefte at den mCherry-positive fisken bærer LMO1-transgene , isolere gDNA fra F1 mCherry-positive enkeltembryo ved hjelp av gDNA-ekstraksjonsbufferen, som inneholder: 12,5 μL 4x lysisbuffer (500 μL 1 M Tris med pH på 8,4, 2,5 ml 1 M kaliumklorid og 47 ml renset vann), 35 μl renset vann, renset vann, 35 μl renset vann, renset vann og 2,5 μL proteinase K ved 10 mg/ml. Inkuber prøven i 16 timer ved 55 °C, etterfulgt av 10 min ved 98 °C.
- Bruk den ekstraherte gDNA (2 μL) som mal for genotyping PCR med primere: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' og LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGCAGCTTG -3', og følgende PCR-program: 1 syklus på 94 °C, 10 min; 35 sykluser av (94 °C i 30 s, 60 °C i 30 s; 68 °C, 30 s); og 68 °C i 7 min. Bekreft det forsterkede fragmentet på 182 bp ved sekvensering.
- Etter bekreftelse av genotypen, hev de resterende mCherry-positive F1-embryoene til modenhet i samsvar med standardretningslinjene i sebrafiskboken21. Fin klips og genotype dem ved 2-3 måneders alder ved hjelp av trinn 2.3-2.4 fra protokollen ovenfor for ytterligere å bekrefte integrasjonen av LMO1-transgene i fisken.
MERK: Den LMO1-positive F1 fisken vil være den stabile transgene fisken [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (angitt som LMO1-linje ). - Ras F1 LMO1 stabil transgen fisk med WT fisk og gjenta etter behov for å forplante denne linjen.
3. Outcross av LMO1 og MYCN transgene linjer for å lage metastatisk modell
- Når LMO1 transgen sebrafisklinjen er generert, interbreed med MYCN linje6,17 for å utvikle heterozygot transgen fisk linje overekspresserende både MYCN og LMO1.
- Ved 1 dpf sorterer du avkommet til outcross for EGFP-uttrykk med stereoskopisk fluorescensmikroskop, som presenterer som EGFP-positive punkter i hindbrainområdet.
MERK: Alternativt, hvis ikke alle embryoer er sortert for MYCN ved 1 dpf, heve embryoer til voksen alder og genotype ved fin klipping og bruke tidligere uttalt retningslinjer fra trinn 2.3-2.4 for gDNA isolasjon og PCR genotyping, med primere: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', og følgende program med standard Taq polymerase: 1 syklus på 94 °C i 3 min, 35 sykluser (94 °C i 30 s, 60 °C i 30 s og 68 °C i 3 minutter) og 68 °C i 7 minutter med forventet amplikonstørrelse på 145 bp. - Etter sortering for EGFP ved 1 dpf, isoler skjermede embryoer i separate Petri-retter og etikettretter som: MYCN + (EGFP-positiv) eller MYCN- (EGFP-negativ).
- Ved 3-4 dpf visualiserer og sorterer du embryoer fra begge gruppene (trinn 3.3) for LMO1-uttrykk med et stereoskopisk fluorescensmikroskop. Se etter rødt fluorescerende proteinuttrykk som flekker i både den overlegne cervical ganglion og ikke-PSNS dopaminerge nevronceller i hoderegionen, spesielt i oblongata medulla i hindbrain6,13.
MERK: Skjerm for mCherry/LMO1 før embryoer når 5 dpf, fordi luftfylte svømmeblærer utvikler seg fullt ut da og vil føre til at embryoene flyter, noe som resulterer i vanskelig mikroskopisk fokusering av PSNS-cellene under sorteringsprosessen. - Når sorteringen er fullført, isolerer du sortert fisk i fire grupper av forskjellige genotyper og merker som nedenfor. Løft den sorterte fisken i identiske forhold i henhold til standardprotokollene fra sebrafiskboken21.
- BARE MYCN (EGFP-positiv),
- Bare LMO1 (mCherry-positiv),
- MYCN; LMO1 (EGFP og mCherry dobbel positiv),
- WT (EGFP og mCherry dobbelt negativ).
4. Visualisering av tumorbyrde i transgene sebrafisklinjer
- Ved 4 uker etter befruktning (wpf) bedøves sortert fisk fra trinn 3,5 med 0,02% trikain i en petriskål.
- Visualiser svulster med et stereoskopisk fluorescensmikroskop ved å forsiktig snu fisk med en metallspatel på begge sidesidene for å se svulst. Forvent at svulster presenterer som enkle EGFP-, single mCherry-, eller doble EGFP-og-mCherry-positive masser som oppstår fra interrenalkjertelområdet (nær hode og nyre).
MERK: Det er mulig at den første tumor utbruddet vanligvis presenteres med en lysere og større fluorescens positiv masse på den ene siden av interrenal kjertelen, og derfor er det viktig å visualisere begge sider av fisken for å unngå å gå glipp av tidlig tumor utbrudd. - Etter identifisering av mulig tumorbærende fisk, isoler fisk i en egen tank med passende etiketter, som inkluderer fødselsdato, dato når svulst screenet og genotype.
- Ved 6 wpf gjentar du tidligere trinn 4.1-4.3 for å screene tumorbærende fisk og ikke-tumorbærende fisk igjen for å bekrefte tilstedeværelsen av svulster for tidligere screenet tumorbærende fisk eller identifisere henholdsvis ny mulig tumorbærende fisk. Se etter vedvarende eller økt størrelse på fluorescenspositiv masse i bekreftet tumorbærende fisk.
- Etter å ha identifisert tumorbærende fisk, overvåk dem to ganger i uken for bevis på tumorcellemigrasjon, som presenterer som små EGFP- og / eller mCherry-positive tumormasser langt fra det primære stedet for tumorgenese (interrenal kjertelregion). Isoler disse fiskene i separate tanker etter behov og merk på riktig måte for å indikere mulig metastase.
- For ytterligere å bekrefte metastase, fortsett å spore disse fiskene regelmessig (hver annen uke) til de fjerne fluorescenspositive tumormassene viser klart økt størrelse, noe som indikerer vekst av svulster i metastatiske steder.
5. Vevsbehandling og parafinseksjon av tumorbærende fisk
MERK: Utfør dette trinnet for å karakterisere de spontant utviklede primære og/ eller metastatiske svulstene i MYCN og MYCN; LMO1 transgen fisk.
- Etter identifisering og verifisering av tumorbærende fisk, ofre fisk fra trinn 4,6 i en Petri-tallerken ved å nedsenke fisk i 0,02% trikain for å bedøve først og deretter øke trikaindosen til fisken ikke lenger er respirerende. Klipp fisken i to stykker - med ett stykke som inneholder hodet og en del av kroppens midtseksjon (inkludert svulst), og et annet stykke med resten av fiskens midtre seksjon og hale.
- Fest begge fiskeseksjonene med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 1 time ved romtemperatur på en rocker. For å forbedre fikseringseffektiviteten, erstatt bufferen med fersk 4% PFA for å øke penetransen til de indre organene effektivt og raskt. La fisk med fersk festebuffer stå på en vippe ved 4 °C over natten eller i 48 timer.
FORSIKTIG: PFA er giftig. Siden forholdsregler og riktig avhending av reagens avhenger av institusjonens forskrifter, må du søke riktige retningslinjer før bruk og avhending av reagens. - Før behandlingen, plasser prøver i 100% rask avkalkingsløsning i 15-20 min ved romtemperatur. Sørg for å bruke en ikke-metal beholder og for å sjekke prøver gjennom inkubasjon for å forhindre overkalking. Hvis prøvevevet ser sterkt degradert ut, plasser prøven i vann eller ved 4 °C for å redusere avkalkingsprosessen.
- Når den er fast og avkalket, vask fiskeprøve(r) med rennende vann fra springen i 1 time og plasser den i prosessorkassetten(e). Hvis det er mer enn én prøve, skiller du hver av dem i sin egen kassett.
- Dehydrere og forberede vevet til parafininnbygging ved å plassere kassett(er) med fisk i vevsprosessoren der prøven(e) er nedsenket i ulike løsninger, henholdsvis: 70% etanol (60 min, 40 °C), 85 % etanol (50 min, 40 °C), 95 % etanol (40 min, 40 °C) to ganger, 100 % etanol (30 min, 40 °C), en annen fersk løsning på 100 % etanol (50 min, 40 °C) to ganger, xylen (30 min, 40 °C), en annen frisk oppløsning av xylen (50 min, 40 °C), en annen frisk xylen (50 min, 45 °C), parafin (30 min, 45 °C), parafin (20 min, 58 °C) tre ganger.
- Etter at vevet er behandlet, fjern kassetten(e) fra prosessormaskinen samtidig som du opprettholder organiseringen av hver kassett og sørger for å forhindre blanding av fiskeprøvene.
- Velg riktig størrelse mugg basert på fiskens størrelse, og sørg for at formen passer til hele kassetten med fiskeprøven. Dekk bunnen av formen med flytende paraffin ved 60 °C.
- Legg straks kassetten med fisken på toppen av formen (sørg for at fisken legges på sin flate side for sagittale seksjoner) med flytende parafin, og avslutt fyllingen med paraffin til toppen av formen for å legge inn fisken helt.
- Plasser den ferdige formen på den kalde platen på seksjonsmikrotomen til parafinen er herdet.
- Når parafinblokken er hard, som kan bedømmes ved å visuelt observere høyere opasitet og en fast berøring til blokken, fjern forsiktig blokken fra formen. Skrap forsiktig av overflødig paraffin fra sidene av kassetten.
- Del den parafinin innebygde fiskeblokken sagittalt ved 4 mikron på mikrotommen og flyt seksjonene på et varmt vannbad ved 40 °C som inneholder destillert vann.
- Overfør delene forsiktig til positivt ladede sklier og stek i ovnen ved 60 °C i 30 minutter før farging før du går videre til enten trinn 6, 7 eller 8.
6. Hematoksylin og eosin (H&E) farging av parafin seksjoner for patologi gjennomgang
- Plasser lysbilder som inneholder parafinseksjoner fra trinn 5.12, i en skyveholder. Inne i en kjemisk avtrekkshette, deparaffiner med xylen 3 ganger, 5 min hver. Kast oppløsningen etter hver bruk.
- Rehydrer seksjoner med 100% etanol i 3 min, og gjenta to ganger med frisk 100% etanol. Bytt ut 100% etanol med 95% etanol i 3 min og deretter 80% etanol i 3 min.
- Skyll seksjoner med destillert vann i 5 min. Mens seksjonene vasker i vann, må du sørge for å fjerne oksiderte partikler fra hematoksylin ved enten filtrering eller skimming overflate av hematoksylin med en lofri klut.
- Flekk overflødig vann fra glideholderen med lofrie profesjonelle våtservietter, og flekksklier i 50% hematoksylin (1:1 fortynning med destillert vann) i 2-5 min avhengig av ønsket fargepreferanse og reagensforringelse. Kast hematoksylin når oppløsningsfargen skifter fra plomme til blå/brun eller når fargingstiden blir for høy. Skyll lysbildene med rennende vann fra springen i 20 min.
- Decolorize seksjonene i 1% syre etanol (3,3 ml saltsyre med 50 ml 70% etanol) ved raskt å dyppe lysbildene flere ganger. Lysbilder kan dyppes opp til 3 s, men jo lenger lysbildene dyppes, jo lettere blir seksjonene.
- Skyll lysbildene i vann fra springen to ganger i 1 min hver, og en gang med deionisert vann. Som et alternativ kan lysbilder stå over natten på dette stadiet, suge i vann.
- Senk seksjonene ned i 1,36 % litiumkarbonatløsning (47 g litiumkarbonat, 3500 ml vann) i 3 s. Pass på at du ikke over inkuberer seksjonene siden jo lengre tid i litiumkarbonatoppløsningen er, jo mer sannsynlig er det at vevet flyter.
- Skyll seksjonene i vann fra springen i 5 min, og flekk overflødig vann fra glideholderen med lofrie profesjonelle våtservietter.
- Motvirke lysbildene i 100% klar til bruk eosin i 15-30 s, og umiddelbart dehydrere med 95% etanol to ganger i 5 min hver. Bytt ut med 100% etanol to ganger i 5 minutter hver, og kast løsningene etter hver bruk.
- Fjern seksjonene i xylen i 15 min og gjenta to ganger for 3 ganger totalt. Eventuelt kan lysbildene stå i xylen over natten ved romtemperatur for bedre å fjerne overflødig vann.
- La skliene lufttørke i den kjemiske avtrekkshetten, og monter deretter en dekselglidning ved hjelp av monteringsmedium for å forsegle vevsprøven.
- Visualiser og bilde de fargede vevsdelene under mikroskopi. Undersøk nøye svulstene på det primære stedet (interrenalkjertelområdet i hode nyre) og de fjerne sporadiske metastasene i andre vev og organer av fisken. Send ut fargede lysbilder for vevsseksjoner som skal gjennomgås av patologer. Basert på fiskemodellens lignende patologiske egenskaper som humant nevroblastom, forvent svulstene som oppsto i MYCN-only eller MYCN; LMO1 fisk som først skal diagnostiseres som nevroblastom av patologer.
7. Immunhiistokjemisk analyse (IHC) med antistoffer mot NB-markør og overekspresserte transgenes for ytterligere å bekrefte spredningen av svulst og deres symkkeriale avstamning eiendom
- Farging med helautomatisk fargingssystem
- Hvis du vil sammenligne IHC-resultatet bedre med H&E-flekker, velger du tilstøtende lysbilder fra trinn 5.12 for IHC-farging.
MERK: Selv om et automatisert fargingssystem gir raskere og mindre arbeidskrevende resultater, kan en manuell protokoll for IHC-farging brukes i fravær av slike ved å referere til trinn i ledd 7.2. - Fortynn det primære antistoffet mot tyrosinhydroksylase (TH) (1:500), en nevroblastommarkør, basert på ønsket konsentrasjon og total mengde som trengs med det automatiserte systemets tilsvarende Primære Antistoffdluens.
MERK: Optimale antistoffkonsentrasjoner kan variere avhengig av antistoff og vev. - Siden det automatiserte systemet bruker innebygd varmeindusert antigengjenvinning med epitopgjenvinningsløsning i 20 minutter og systemets tilsvarende deteksjonsreagens, må du sørge for at parametrene for maskinen er satt som: Peroxidase Blocking, 5 min; Primært antistoff med ønsket konsentrasjon, 15 min; biotinylert antikanin IgG sekundært antistoff (1:500), 8 min; Streptavidin HRP, 8 min; blandet DAB intens substrat, 5 min; og Hematoksylin, 5 min.
- Når innstillingene er stilt inn, plasserer du antistoffbrettet i maskinen. Konfigurer lysbildene ved å opprette en ny sak, som vil merke lysbildene. Maskinen er nå lastet og klar til bruk (dewaxing, farging og motspikning).
- Når lysbildene er dewaxed, farget og motarbeidet ved hjelp av den automatiserte maskinen, dehydrer lysbildene i etanol gradienter på 70%, 95% og 100% i 5 min hver. Senk lysbildene av seksjoner i 100% frisk etanol igjen i 5 min.
- Fjern seksjonene i xylen i 5 min, to ganger, eller la lysbilder stå i xylen over natten for bedre å fjerne overflødig vann.
- La skliene lufttørke i den kjemiske avtrekkshetten, og monter deretter en dekselglidning ved hjelp av et monteringsmedium. Visualiser og bilde de fargede vevsdelene med mikroskopi.
- For å bekrefte metastase i fiskemodellen, sammenlign lysbildene farget med antistoffer mot nevroblastommarkør fra trinn 7 til de som er farget av H&E fra trinn 6.
MERK: Forvent å se positiv farging for nevroblastommarkør, TH, i alle tumorceller identifisert av H&E-farging. Forvent heller ingen positiv farging for TH i tilstøtende vev der de metastatiske svulstene ble identifisert i LMO1; MYCN fisk. Sørg for å velge kontroll WT og MYCN-bare fisk som er av samme alder som MYCN; LMO1 fisk for denne analysen for å utelukke muligheten for at de metastatiske svulstene er multifokale primære svulster.
- Hvis du vil sammenligne IHC-resultatet bedre med H&E-flekker, velger du tilstøtende lysbilder fra trinn 5.12 for IHC-farging.
- Manuelt farging uten automatisert IHC-fargingssystem
- Når lysbildene er bakt, velger du tilstøtende lysbilder fra trinn 5.12 for å gi bedre sammenligning mellom H&E- og IHC-farging for å deparaffinere. Inne i en kjemisk avtrekkshette, dewax og rehydrere lysbildene med xylen ved hjelp av tidligere trinn 6.1 og 6.2., henholdsvis.
- Etter deparaffinering og rehydrering, suge lysbilder i endogen peroksid blokkering løsning (1x PBS som inneholder 0,1% natriumazid og 0,3% hydrogenperoksid) i 5 min ved romtemperatur. Vask lysbilder i frisk 1x PBS i 3 min og gjenta to ganger i totalt 3 ganger.
FORSIKTIG: Natriumazid er akutt giftig. Sørg for å praktisere forholdsregler og riktig avhending av reagens avhengig av institusjonens forskrifter. - Hent antigen ved å inkubere lysbilder i oppløsning med proteinase K (1:500 i 1x PBS) i 10 min ved romtemperatur. Vask lysbildene 3 ganger med 1x PBS i 3 min hver.
- Blokker lysbilder ved å inkubere med 5% geitserum i 1x PBS i 30 min ved romtemperatur på rocker. Vask lysbilder med frisk 1x PBS to ganger i 3 min hver.
- Tilsett 4 dråper Avidin blokkeringsløsning direkte på lysbildet og inkuber i 15 min ved romtemperatur. Etter å ha vasket lysbilder med frisk 1x PBS to ganger i 3 minutter hver, tilsett 4 dråper Biotin blokkeringsløsning og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.
- Etter blokkering av lysbilder, inkubere i primær antistoff av tyrosinhydroksylase (TH) (1:500) i 45-60 min ved romtemperatur, eller over natten ved 4 °C.
MERK: Flekk med ekstra antistoffer mot transgenes og andre relevante markører for å adressere fysiologi og aktivitet av primærsvulst og andre metastatiske steder. Optimale antistoffkonsentrasjoner kan variere avhengig av antistoff og vev. - Vask lysbilder med frisk 1x PBS i 3 min, gjenta to ganger med totalt 3 ganger.
- Inkuber lysbilder i sekundært antistoff av biotinylert anti-kanin IgG sekundært antistoff (1:500) fortynnet i blokkeringsløsning i 45-60 min ved romtemperatur. Gjenta forrige vasketrinn 7.2.7.
- Tilsett HRP-konjugert Avidin (1:300 i 1x PBS), og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur. Vask lysbilder 3 ganger med frisk 1x PBS i 5 min hver.
- Forbered 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) løsning (2,5 ml destillert vann, 1 dråpe kit buffer, 1 dråpe hydrogenperoksid og 2 dråper DAB fra settet), og legg dråper DAB direkte på lysbilder nær et mikroskop. Etter å ha lagt til DAB, observere fargeendringsreaksjonen på lysbildene under mikroskop. Når ønsket fargeintensitet er nådd, stopp reaksjonen ved å plassere glideseksjoner i kaldt destillert vann.
- Motvirke lysbildene med frisk 50% hematoksylin ved å senke eller dyppe prøver i noen få korte sekunder og plassere tilbake i destillert vann. Gjenta som ønsket, men normalt bør en gang være nok siden vevsseksjonene er tynne.
- Dehydrer vevsprøver på lysbilder i alkoholgradient som tidligere beskrevet i trinn 7.1.5 og fortsett gjennom de resterende trinnene (med det siste trinnet som 7.1.8) for å fullføre IHC-analysen.
8. Picrosirius rød farging av parafin lysbilder for kollagen akkumulering i svulster som mekanisme studie
- Gjenta trinn 6.1-6.3 for å dewax, hydrere og vaske parafinseksjoner på lysbilder.
- Etter blotting overflødig vann fra lysbildeholderen med profesjonell kvalitet lofrie kluter, flekk i 50% hematoksylin i 10 min. Skyll lysbildene med rennende vann fra springen i 10 min.
- Overfør lysbildene til Picrosirius Red og inkuber ved romtemperatur i 1 time.
- Vask lysbildene i surgjort vann (5 ml issyre i 1 L kran eller destillert vann) to ganger, inkuber i 5 min på shaker.
- Dekanter det meste av vannet fra lysbilder først før fysisk risting og blotting seksjoner på lysbilder for å fjerne så mye vann som mulig.
- Plasser raskt lysbilder i tre endringer på 100% etanol for å dehydrere parafinseksjoner.
- Gjenta trinn 6.10 og 6.11 for å fjerne lysbilder i xylen og montere prøve. Deretter bilde med sammensatt mikroskop som er utstyrt med et kamera.
- Bruk ImageJ til å telle picrosirius rødpositive kollagenfibre i minst tre tilfeldige felt for hver seksjon. Sammenlign mellom lysbilder av MYCN og MYCN; LMO1 fiskeseksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å avgjøre om LMO1 synergiserer med MYCN for å påvirke NB-patogenese, ble transgene konstruksjoner som driver uttrykk for enten LMO1 (dβh:LMO1 og dβh:mCherry) eller MYCN (dβh:EGFP-MYCN) i PSNS-cellene under kontroll av dβh-promotoren injisert i sebrafiskembryoer13. Som illustrert i figur 1A, etter utviklingen av stabile transgene linjer og validering av deres genotyper, ble heterozygot MYCN- og LMO1-fisk interbred. Deres avkom ble sortert for MYCN (EGFP +) eller LMO1 (mCherry +) uttrykk ved henholdsvis 1 dpf eller 3-4 dpf. MYCN-overekspressering har vist seg å undertrykke PSNS-utvikling6. Dermed er EGFP-MYCN-uttrykket mer fremtredende i de ikke-PSNS dopaminerge nevroncellene ved 1 dpf6, for eksempel kranial ganglia (CA), erke-assosierte katekolaminerge nevroner (AAC) og medulla oblongata (MO). På grunn av ustabiliteten til EGFP-MYCN-proteinet blir EGFP-signalet dimmere etter 2 dager. I kontrast er mCherry-uttrykket fremtredende i både PSNS-celler, for eksempel overlegen cervical ganglion og ikke-PSNS dopaminerge nevronceller, som inkluderer CA, AAC og MO, fra 3 dpf og videre6. Derfor sorteres avkom av MYCN og LMO1 parring ved 1 dpf for MYCN (EGFP +) og ved 3 dpf for LMO1 (mCherry +). Den sorterte fisken ble delt inn i forskjellige genotypiske grupper, som følger: i) MYCN, ii) LMO1, iii) MYCN; LMO1 og iv) WT, og hevet under de samme forholdene. Fra og med 4 wpf ble avkomene vist to uker for bevis på svulster ved fluorescerende mikroskopi. Fluorescerende positive tumormasser ble påvist i vev og organer fjernt fra det primære tumorstedet i den sammensatte transgene fisken med overtrykk av både MYCN og LMO1, men ikke i den transgene fisken med uttrykk for MYCN alene (figur 1B).
For ytterligere å verifisere metastasen hos disse transgene dyrene, tumorbærende MYCN og MYCN; LMO1 transgen fisk ved 5 til 9 måneders alder ble utsatt for parafinseksjonering og immunhiistokjemiske analyser med et antistoff mot nevroblastommarkøren, TH. Representantresultatene for et MYCN; LMO1 fisk presenteres i figur 2. H&E-farging av sagittalseksjonene viste at den primære svulsten oppsto fra interrenalkjertelregionen, sebrafiskekvivalenten til den menneskelige binyrene, som er det vanligste stedet for primærsykdom hos nevroblastompasient12,22 (figur 2A,B). Svulsten består av små, uavklarte og runde kreftceller med hyperkromatiske kjerner, og dannet ofte lag som var histologisk lik de menneskelige nevroblastomene som beskrevet tidligere6 (figur 2A, B). I samsvar med observasjonen ved fluorescerende mikroskopi (figur 1B) ble det påvist utbredte tumormasser fjernt fra inter-nyrekjertelen i flere regioner, inkludert: distal del av nyrene (den primære voksne hematopoietiske nisjen til sebrafisk og sammenlignbar med pattedyrbenmargen23) (figur 2A,C), bane (figur 2A,D), gjelle (analog med pattedyrets lunge24) (figur 2A, 2A, bane (figur 2A,D), gjelle (analog med pattedyrets lunge24) (figur 2A, 2A, bane)(figur 2A, D), gjelle (analog med pattedyrets lunge24) (Figur 2A, C), bane (figur 2A,D), gjelle (analog med pattedyrets lunge24) (Figur 2A, C), bane (figur 2A,D), gjelle (analog med pattedyrets lunge24) (Figur 2A, C), bane (figur 2A,D), gjelle (analog med pattedyrets lunge24) (Figur 2A, C), bane (figur 2A,D), gjelle (analog med pattedyrets lunge24) (Figur 2A, C), bane (figur 2A,D), gjelle (analog med pattedyrets lunge24) (Figur 2A, C), E), milt (analogt med pattedyrets lymfeknuter25) (figur 2A og 2F) og indre vegg av atriekammer i hjertet (figur 2G). Mange av disse metastasene rekapitulerer de vanlige stedene for metastaser sett hos pasienter med høyrisiko nevroblastom, som inkluderer benmarg, lymfeknute, baneregion og lunge13,23,24,25. Ytterligere immunohistokjemi med antistoffet mot TH bekreftet PSNS nevroblasslinje av tumorceller ved primærsvulsten og alle metastatiske steder (figur 2H-M).
I et forsøk på å bedre forstå mekanismene som ligger til grunn for synergien mellom MYCN og LMO1 i akselererende tumormetastatisk spredning, ble det oppdaget at uttrykksnivåene til et panel av gener involvert i tumorcelle til ekstracellulær matriseinteraksjon var betydelig forhøyet i fiskesvulstene med overekspressering av både MYCN og LMO113. For å undersøke om den ekstracellulære matrisen faktisk ble påvirket av det endrede genuttrykket i LMO1-overekspresserende svulster som førte til forbedret tumorformidling eller migrasjon, parafinseksjonene fra MYCN-only og MYCN; LMO1 svulster ble farget med Picrosirius rød (PSR), en svært selektiv flekk for kollagenfibre, for å vurdere kollagenavsetning og ekstracellulær matrise (ECM) stivhet26,27. Som vist i figur 3A-E var det betydelig forsterkede mengder og økt tykkelse på PSR-fargede kollagenfibre som finnes i MYCN; LMO1 svulster, sammenlignet med svulstene som bare uttrykker MYCN alene. Sammen viser disse resultatene at overekspressjonen av LMO1 kan ombygge svulsten ECM for å øke stivheten, og derfor legge til rette for tumorcelleformidling.
Figur 1: Illustrasjon av tumorscreeningsanalysen på avkom fra avl av MYCN - og LMO1-transgene sebrafisklinjer. (A) Skjematisk illustrasjon av sortering og tumorscreening av MYCN og/eller LMO1-overekspresserende stabil transgen fisk for nevroblastomstudie. Øvre paneler: Representative bilder av EGFP-MYCN+ embryoer ved 1 dags postfertilisering (dpf) (dorsal visning til venstre og sidevisning til høyre). Nedre paneler: Representative bilder av mCherry-LMO1+ embryoer ved 3 dpf (lateral visning til venstre og ventral utsikt til høyre). AAC, erke-assosierte katekolaminerge nevroner; CA, kranial ganglia; og MO, medulla oblongata. Skalastang, 100 μm. Opprettet med BioRender.com (B) Coexpression av LMO1 og MYCN fremmer neuroblastommetastase. Venstre: Transgen fisk som overekspresserer MYCN alene (MYCN) med EGFP-uttrykkende svulst (hvit pil) ved 36 måneders alder. Høyre: Transgen fisk som overekspresserer både MYCN og LMO1 (MYCN; LMO1) med en mCherry-positiv tumormasse på primærstedet (IRG, hvit pil) og flere metastatiske steder (solide pilspisser) ved 36 måneders alder. Skalastang, 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Co-overekspression av MYCN og LMO1 fremmer fjerne metastaser av nevroblastom i transgen sebrafiskmodell. (A-G) H&E-fargede sagittale deler av MYCN; LMO1 transgen fisk mens du er 6 måneder gammel. (H-M) Forstørrede syn på immunhiistokjemiske analyser av MYCN; LMO1 transgen fisk i sagittal vev seksjoner, ved hjelp av tyrosin hydroksylase (TH) antistoff. Hvit boks skisserer interrenal kjertelen (b, h), med forstørret visning i panel B og H. Spredte tumorceller ble funnet i nyremarg (c, i, C og jeg med solide svarte pilspisser), øyets sklerra (d, j, D og J med svarte omrissede og hvite fylte åpne piler), gjellen (e, k, E og K med svarte omrissede og hvite fylte åpne pilspisser), milten (f, l, F og L med solide svarte piler), og hjertekammeret (G og M med svarte omrissede og hvite fylte doble pilspisser). Skalastenger, 100 μm (A) og 50 μm (B-M). Denne figuren er modifisert fra Zhu, S. et al. LMO1 Synergizes med MYCN for å fremme neuroblastom initiering og metastase. Kreftcellen. 32, 310-323 (2017)13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Økt LMO1-uttrykk fremmer kollagenavsetning og ECM-stivhet som fører til tilrettelagt tumorcelleformidling i sebrafiskmodeller. (A-D) Representative lysmikroskopibilder av kollagenfibre farget av Picrosirius rød (PSR) i MYCN bare (A, B) eller MYCN; LMO1 (C,D) transgen sebrafisk. (B) og (D) forstørres fra de innkapslede områdene i (A) og (C), ved hjelp av piler (A og B) og pilspisser (C og D) for å indikere henholdsvis PSR-positive kollagenfibre. Skalastenger, 100 μm (A og C) og 50 μm (B og D). (E) Kvantifisering av PSR-fargede områder på tumorseksjoner av MYCN bare eller MYCN; LMO1 transgen fisk. Resultatene ble normalisert til gjennomsnittet av PSR-fargede områder i MYCN-bare svulster. Statistikken presenterer som gjennomsnittlig ± SD på tre MYCN-only eller tre MYCN; LMO1 svulster; p = 0,02 ved tosidet t-test. Denne figuren er modifisert fra Zhu, S. et al. LMO1 Synergizes med MYCN for å fremme neuroblastom initiering og metastase. Kreftcellen. 32, 310-323 (2017)13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebrafisk har blitt ofte brukt i forskning de siste tiårene, spesielt i kreftforskning, av åpenbare grunner, for eksempel enkel vedlikehold, robust reproduksjon og klare fordeler for in vivo-avbildning1,28. Sebrafiskmodellen kan lett manipuleres embryonalt på grunn av deres eksterne befruktning og utvikling, som utfyller godt til pattedyrmodellorganismer, som rotter og mus, for store genetiske studier1,2,3. Videre har sebrafiskgenomet likheter på høyt nivå med det menneskelige genomet. Ved å sammenligne de detaljerte merknadene fra sebrafiskgenomet med det menneskelige referansegenomet, har omtrent 70% av menneskelige gener vist seg å oppnå en sebrafisk orthologue29. I tillegg er annen bruk av sebrafisk i forskning utvidet til legemiddeloppdagelse og pasientavatarer for individualisert kreftbehandling30,31. Akkumulerende studier har vist at svulster indusert i sebrafisk ligner menneskelige svulster på histologiske og molekylære nivåer, noe som kan bidra til disseksjon av tumorinitiering, progresjon og heterogenitet32,33. Sammen viser sebrafisken et enormt potensial som en verdifull dyremodell som kan brukes til å studere metastase og belyse mulige onkogene veier involvert i sykdomspatogenese.
Ved hjelp av den transgene sebrafiskmodellen med overekspresjon av både LMO1 og MYCN er samarbeidet mellom disse to onkogene i NB tumorigenesis og metastase tydelig demonstrert. Med dagens tilgjengelighet av kraftige live bildeteknikker, kan tumorskjermer enkelt utføres to ganger i uken, og metastase kan spores over tid. Den utbredte metastase kan også bekreftes ytterligere ved paraffinseksjon og antistofffarging. Påfallende oppdaget metastasene i MYCN; LMO1 sebrafisk korrelerer godt med de vanlige metastaseringsstedene sett i høyrisiko NB-tilfeller, for eksempel i benmarg, lymfeknuter, bane og lung34,35, og støtter videre sebrafisk som en gjennomførbar og gunstig modell for metastasestudie.
Videre, på grunn av relativt liten kroppsstørrelse, kan hele sebrafisken seksjoneres helt, noe som er enda en klar fordel med denne modellen, noe som tillater grundig karakterisering av den primære svulsten sammen med metastasene i andre regioner i kroppen. Picrosirius rød farging av tumor seksjoner har tydelig fremhevet kollagen nettverk i fisk svulster og demonstrerer økt stivhet av ekstracellulær matrise i svulster med LMO1 overekspression. Selv om denne teknikken ikke er unik for sebrafisk, kan anvendelsen sammen med høygjennomstrømningssammensetningen på sebrafiskembryoer som er genetisk modifisert eller transplantert med tumorceller, gi et nytt middel til screening for effektive forbindelser som kan målrette ekstracellulær matriseoppussing, noe som er en kritisk prosess involvert i tumorcellemetastase.
Stabile transgene sebrafiskmodeller er svært nyttige for oss å forstå kandidatens bidrag til tumorutvikling i vivo, selv om det kan være utfordrende og arbeidskrevende å utvikle disse linjene. Å skape en stabil transgen linje krever lang tid siden flere generasjoner må anskaffes før linjeutbredelse. Videre kan det være kjedelig å forplante disse linjene, og strategiske parringsplaner kan være nødvendig. For eksempel reduseres produktiviteten til en MYCN-transgen fisk ofte markert når svulsten har utviklet seg, og homozygot MYCN-transgen fisk overlever ikke godt inn i voksen alder. Derfor, for bedre å opprettholde MYCN transgen fisk linje, anbefales det å outcross den heterozygote ikke-tumorbærende MYCN transgene fisk i yngre alder med WT eller andre genetisk konstruerte fiskelinjer, for eksempel LMO1 transgen fisk linje. For å overvinne utfordringene med å utvikle og opprettholde stabile transgene fiskelinjer, kan mosaikk forbigående transgenese være en alternativ tilnærming til raskt og effektivt å vurdere bidraget av et enkelt gen eller en kombinasjon av gener til tumorinitiering og progresjon i primært injisert fisk. I tillegg kan mosaikkmønsteret for transgene integrasjon i den primære injiserte fisken bedre etterligne sykdomspatogenesen, spesielt de som er indusert av somatiske hendelser36.
Men som alle andre dyremodeller som brukes i forskning for å studere kreft, har sebrafisken også sine ulemper. For eksempel forblir antistoffer spesielt mot sebrafiskproteiner i stor grad underutviklet, selv om flere antistoffer mot nevroblastommarkørgener - som tyrosinhydroksylase, synaptofysin og HuC-fungerer heldigvis bra i sebrafisk6,13. For å bekjempe dette problemet har mange leverandører begynt å teste produktene sine og forutsi potensialet i antistoffene sine i kryssreagerende med sebrafiskproteiner. Mer informasjon om validerte antistoffer finnes også i sebrafiskinformasjonsnettverket (ZFIN). Med denne innsatsen vil flere og flere antistoffer som spesifikt kan oppdage sebrafiskproteiner snart bli tilgjengelige for sebrafisksamfunnet. En annen utfordring med å bruke sebrafisk som en genetisk modell for å dissekere samspillet mellom komplekse signalveier i NB-patogenese er det delvis dupliserte genomet. Slike genomduplisering, som skjedde i den naturlige opphav av sebrafisk37,38, kan ofte føre til mer enn en variant av sebrafisk homologer til mennesker. Dette kan føre til en utviklet gevinst av nye genfunksjoner eller unike uttrykksmønstre i dyremodellen39. Derfor, når man studerer gener med potensielle roller i tumorundertrykking, kan det være nødvendig for flere alleler av de dupliserte genene å bli slått ut samtidig for å demonstrere deres tumorundertrykkingsfunksjon, noe som kan være en potensielt tidkrevende og en teknisk utfordrende bestrebelse.
Likevel kan den transgene sebrafiskmodellen trofast rekapitulere alle stadier av tumormetastase in vivo, og har klare fordeler for genetisk analyse og sanntidsavbildning av tumorformidling. Dette modellsystemet tilbyr derfor et unikt verktøy for oss å ta opp mange skremmende spørsmål i feltet, for eksempel hva de molekylære og cellulære hendelsene som ligger til grunn for multistep-prosessen med tumorformidling og metastase in vivo er, når NB-cellene sprer seg fra primære svulster, og hvordan tumormikromiljøet bidrar til NB-metastase. Med robustheten av sebrafisk for legemiddelscreening og testing, vil fiskemodellen også gi et verdifullt middel for evaluering av effekt av nye midler og inhibitorer for å forhindre eller behandle metastatisk NB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd R01 CA240323 (S.Z.) fra National Cancer Institute; et tilskudd W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) fra USAs forsvarsdepartement (DoD); en V Scholar-pris fra V Foundation for Cancer Research (S.Z.) og et plattformstipend fra Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); og støtter fra Mayo Clinic Cancer Center og Center for Individualized Medicine (S.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
References
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
- Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
- Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
- Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
- Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), London, England. 2106-2120 (2007).
- Park, J. R., et al. Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
- Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
- Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
- Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
- Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
- Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
- Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
- Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
- Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
- Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
- Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
- Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
- Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
- Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
- Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
- Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), London, England. 466-470 (2006).
- Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
- Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), New York, N.Y. 1711-1714 (1998).
- Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
- Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).
