Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Модель метастазов нейробластомы рыбок данио

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62416
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic Cancer Center

Summary

В данной работе представлен метод разработки, характеристики и отслеживания в режиме реального времени метастазирования опухоли в модели нейробластомы рыбок данио, в частности в трансгенной линии рыбок данио с гиперэкспрессией MYCN и LMO1, которая развивает метастазирование спонтанно.

Abstract

Рыбки данио стали важной животной моделью для изучения заболеваний человека, особенно рака. Наряду с надежными трансгенными технологиями и технологиями редактирования генома, применяемыми в моделировании рыбок данио, простота обслуживания, высокая продуктивность и мощная живая визуализация в целом делают рыбок данио ценной модельной системой для изучения метастазов и клеточных и молекулярных основ, лежащих в основе этого процесса in vivo. Первая модель метастазирования нейробластомы рыбок данио (NB) была разработана путем сверхэкспрессии двух онкогенов, MYCN и LMO1, под контролем промотора дофамина-бета-гидроксилазы (dβh). Ко-сверхэкспрессированные MYCN и LMO1 приводили к снижению латентности и усилению пенетрантности нейробластомагенеза, а также ускорению отдаленного метастазирования опухолевых клеток. Эта новая модель достоверно повторяет многие ключевые особенности метастатического НБ человека, включая участие клинически значимых и связанных с метастазами генетических изменений; естественное и спонтанное развитие метастазов in vivo; и сохраненные участки метастазов. Поэтому модель рыбок данио обладает уникальными преимуществами для рассечения сложного процесса метастазирования опухоли in vivo.

Introduction

Рыбки данио широко используются и применяются в нескольких областях исследований, особенно при раке. Эта модель предоставляет множество преимуществ, таких как ее надежное размножение, экономически эффективное поддержание и универсальная визуализация роста опухоли и метастазирования - все это делает рыбок данио мощным инструментом для изучения и исследования клеточных и молекулярных основ опухолевого генеза и метастазирования. Новые методы крупномасштабного картирования генома, трансгенеза, сверхэкспрессии или нокаута генов, трансплантации клеток и химических экранов значительно увеличили мощность модели рыбок данио1. За последние несколько лет было разработано много линий рыбок данио для изучения опухолевого генеза и метастазирования различных видов рака человека, включая, но не ограничиваясь, лейкемией, меланомой, рабдомиосаркомой и гепатоцеллюлярной карциномой2,3,4,5. Кроме того, первая модель нейробластомы рыбок данио (NB) была получена путем сверхэкспрессии MYCN, онкогена, в периферической симпатической нервной системе (PSNS) под контролем промотора дофамина-бета-гидроксилазы (dβh). С помощью этой модели было дополнительно продемонстрировано, что активированный ALK может синергировать с MYCN для ускорения начала опухоли и увеличения пенетрантности опухоли in vivo6.

NB получен из симпатоадреналовой линии клеток нервного гребня и является высокометастатическим раком у детей7. Он ответственен за 10% детских смертей, связанных с раком8. Широко метастазируемый при постановке диагноза, NB может быть клинически представлен как опухоли, в основном происходящие по цепочке симпатических ганглиев и мозгового вещества надпочечников PSNS9,10. Амплификация MYCN обычно связана с плохими исходами у пациентов с NB11,12. Кроме того, LMO1 был идентифицирован как критический ген чувствительности к NB в случаях высокого риска13,14. Исследования показали, что трансгенная коэкспрессия MYCN и LMO1 в PSNS модели рыбок данио не только способствует более раннему началу NB, но и индуцирует широко распространенные метастазы в ткани и органы, которые похожи на участки, обычно наблюдаемые у пациентов с высоким риском NB13. Совсем недавно другой метастатический фенотип NB также наблюдался в более новой модели NB рыбок данио, в которой как MYCN, так и Lin28B, кодирующие РНК-связывающий белок, чрезмерно экспрессируются под контролем промотора dβh16.

Стабильный трансгенный подход у рыбок данио часто используется для изучения того, может ли чрезмерная экспрессия интересующего гена способствовать нормальному развитию и патогенезу заболевания14,15. Этот метод был успешно использован для демонстрации важности нескольких генов и путей к опухолевому NB 6,16,17,18,19,20. В этой статье будет представлено, как была создана трансгенная рыбья линия, которая чрезмерно экспрессирует как MYCN, так и LMO1 в PSNS, и как было продемонстрировано, что сотрудничество этих двух онкогенов ускоряет начало опухолевого NB и метастазирования13. Во-первых, трансгенная линия, которая сверхэкспрессирует EGFP-MYCN под контролем промотора dβh (обозначенная линией MYCN), была разработана путем инъекции конструкции dβh-EGFP-MYCN в одноклеточную стадию эмбрионов AB дикого типа (WT), как описано ранее6,17. Отдельная трансгенная линия, которая сверхэкспрессирует LMO1 в PSNS (обозначенная линией LMO1), была разработана путем коинъекции двух конструкций ДНК, dβh-LMO1 и dβh-mCherry, в эмбрионы WT на стадии одной клетки13. Ранее было продемонстрировано, что коинъекционные двойные конструкции ДНК могут быть коинтегрированы в геном рыбы; поэтому LMO1 и mCherry совместно экспрессируются в клетках PSNS трансгенных животных. Как только введенные эмбрионы F0 достигали половой зрелости, их затем скрещивали с рыбой WT для идентификации положительных рыб с интеграцией трансгенов. Короче говоря, потомство F1 было впервые проверено флуоресцентной микроскопией на экспрессию mCherry в клетках PSNS. Интеграция зародышевой линии LMO1 у mCherry-положительных рыб была дополнительно подтверждена геномной ПЦР и секвенированием. После успешной идентификации каждой трансгенной линии потомство гетерозиготных трансгенных рыб MYCN и LMO1 скрещивалось для получения составной рыбной линии, экспрессирующей как MYCN, так и LMO1 (обозначенный MYCN; Линия LMO1). Опухоленосный MYCN; Рыбу LMO1 контролировали с помощью флуоресцентной микроскопии раз в две недели на предмет наличия метастатических опухолей в областях, удаленных от первичного участка, области межпочечной железы (IRG, эквивалент надпочечников человека)13. Для подтверждения метастазирования опухолей в MYCN; Применены рыбный LMO1, гистологический и иммуногистохимический анализы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы исследования с использованием рыбок данио и ухода за животными были выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами клиники Майо.

1. Подготовка и микроинъекция трансгенных конструкций для разработки трансгенной линии рыбок данио LMO1 с гиперэкспрессией в PSNS

  1. Для разработки входного клона LMO1-pDONR221 амплифицируйте кодирующую область человеческого LMO1 из кДНК, полученной из клеточной линии человека с помощью ПЦР.
    1. Сделайте реакцию 25 мкл, как подробно описано здесь: 2,5 мкл 10x стандартного реакционного буфера Taq , 0,125 мкл ДНК-полимеразы Taq , 0,5 мкл 10 мМ дНТФ, 2 мкл шаблона кДНК, 0,5 мкл 10 мкМ прямого праймера LMO1 ATTB1, 0,5 мкл обратного праймера LMO1 ATTB2 и 18,875 мкл воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте прямую грунтовку LMO1 ATTB1: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' и обратная LMO1 ATTB2 грунтовка: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACTACT
      ГААКТТГГАТТХАААГГТ-3'
    2. Усиление с помощью следующей программы: 1 цикл 94 °C, 2 мин; затем 30 циклов (94 °C, 30 с, 55 °C, 30 с, 72 °C, 1 мин) и 72 °C, 7 мин.
  2. Клонирование продукта ПЦР LMO1 в донорский вектор шлюза pDONR221 с помощью реакции рекомбиназы АД6,13 (фрагмент ПЦР + донорский вектор = входной клон).
    1. Для реакции 10 мкл смешайте 1 мкл очищенного продукта ПЦР LMO1 (150 нг/мкл), 1 мкл (150 нг/мкл) донорского вектора pDONR221 и 6 мкл буфера TE (рН 8,0) с 2 мкл ферментной смеси ВР, инкубировать в течение 1 ч при 25 °C и преобразовать в ТОП10 компетентных E. coli с использованием протокола производителя.
    2. Затем выкладываем 50-200 мкл из флакона для трансформации на агаровую пластину Лурия Бульона (LB), содержащую 50 мкг/мл канамицина, и инкубируем при 37 °C в течение ночи.
    3. Отбор клонов путем инокуляции одной колонии в 2-5 мл LB с 50 мкг/мл канамицина и культивирования в течение ночи (16-18 ч) при 37 °C.
    4. Используйте 2 мл ночной бактериальной культуры для выделения плазмиды в соответствии с протоколом производителя. Чтобы проверить плазмиду LMO1, отправьте образец плазмиды для секвенирования с помощью праймера M13-F (5-GTAAAACGACGGCCAG-3').
  3. Чтобы получить входной клон dβh-pDONRP4-P1R, получите продукт ПЦР dβh6,13 путем амплификации промоторной области 5,2 КБ с использованием клона CH211-270H11 BAC в качестве шаблона для получения реакции 20 мкл, как описано ранее на этапе 1.1.1. Используйте следующие параметры программы ПЦР: 94 °C, 2 мин; 10 циклов 94 °C, 15 с, 50 °C, 30 с, 68 °C, 8 мин; 30 циклов 94 °C, 15 с, 53 °C, 30 с, 68 °C, 8 мин; 68 °C, 4 мин (с прямой грунтовкой 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
    CCCCTTTTTAGG-3' и обратная грунтовка 5'-GGGGACTGCTTTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTG
    TCGTCTTTTGA-3').
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за длинных шаблонов ДНК на этом этапе обеспечьте использование соответствующей системы ПЦР для точной амплификации ПЦР.
  4. Клонирование продукта ПЦР dβh в донорский вектор шлюза pDONRP4-P1R с помощью реакции рекомбиназы BP6,13 (фрагмент ПЦР + вектор донора = входной клон).
    1. Смешайте 1 мкл очищенного продукта ПЦР dβh (172 нг/ул), 1 мкл (150 нг/мкл) донорского вектора pDONRP4-P1R и 6 мкл буфера TE (рН 8,0) с 2 мкл ферментной смеси BP в общей сложности 10 мкл реакции, инкубировать в течение 1 ч при 25 °C.
    2. Преобразование в ТОП10 компетентных E. coli по протоколу производителя. Выделяют плазмиду, как описано на этапах 1.2.2-1.2.4, и проверяют плазмиду путем секвенирования с помощью праймеров M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') и M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3').
  5. Создайте конструкцию выражения dβh:LMO1 .
    1. Объедините 1 мкл каждого входного клона (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 и p3E-polyA11) (по 20 фмоле), 1 мкл (60 нг/мкл) модифицированного вектора назначения с сайтами распознавания I-SceI и 4 мкл буфера TE (рН 8,0), содержащего 2 мкл смеси ферментов LR-рекомбиназы. Инкубировать эту смесь в течение 1 ч при 25 °C.
    2. Следуя протоколу производителя, преобразуйте бактерии в химически компетентную кишечную палочку TOP10. Изолируйте плазмиду, как описано на этапах 1.2.2-1.2.4, и проверьте плазмиду путем секвенирования с помощью праймеров DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3') и LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3').
  6. Сгенерируйте конструкцию ДНК dβh:mCherry с помощью шлюзовой системы, объединив входные клоны промотора dβh объемом 5,2 кб, pME-mCherry и p3E-polyA в модифицированный вектор назначения, содержащий сайты распознавания I-SceI, как упоминалось ранее на шаге 1.5.16. Изолируйте плазмиду, как описано на этапах 1.2.2-1.2.4, и проверьте плазмиду путем секвенирования с помощью прямого праймера DBH (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3').
  7. Линеаризуйте конструкцию ДНК dβh:LMO1 и днк-конструкцию dβh:mCherry (в соотношении 3:1 соответственно) в общей сложности 15 мкл реакционного объема с 1 мкл фермента I-SceI (5 ЕД/мкл) и 0,75 мкл буфера (10x) и инкубируйте при комнатной температуре в течение как минимум 4 ч или на ночь. Убедитесь, что концентрация ДНК не превышает 750 нг в реакции.
  8. На следующий день и после линеаризации конструкций добавляют 0,5 мкл свежего фермента I-SceI (5 ЕД/мкл) и 0,5 мкл 0,5% фенол-красного в 5 мкл общей смеси ДНК с предыдущей стадии 1,7. Микроинъецировать общий раствор (50-80 пг линеаризированной ДНК) в одноклеточные эмбрионы AB дикого типа (и до 500 эмбрионов) с использованием стеклянной микропипетки диаметром 1,0 мм, как описано ранее17. Храните оставшуюся смесь ДНК при -20 °C для будущих инъекций.

2. Скрининг и проверка трансгенной рыбьей линии LMO1 на зародышевую линию передачи LMO1 и mCherry

  1. Через 3-4 дня после оплодотворения (dpf) обезболивают введенные эмбрионы 0,02% трикаина и проверяют их на флуоресцентную экспрессию вишни, которая присутствует в любом месте по всему телу рыбы из-за мозаичного трансгенеза. Перенесите эмбрионы вишню в чашку Петри со свежей яичной водой и поднимите эмбрионы до половой зрелости в соответствии с книгой рыбок данио21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте, что соотношение положительных рыб будет варьироваться в зависимости от знаний и опыта исследовательского персонала. Например, начинающие любители могут иметь низкий коэффициент интеграции 10%, по сравнению с экспертом ≥50%.
  2. Чтобы определить рыбу-основателя с трансгенами dβh:LMO1 и dβh:mCherry , интегрированными в половые клетки, перекрестите одиночные пары введенных mCherry-положительных F0 половозрелых рыб с предыдущей стадии (2.1) с рыбой WT AB. Скрининг поколения F1 на наличие эмбрионов mCherry-положительных при 3-4 dpf.
  3. Чтобы подтвердить, что мвихер-положительные рыбы несут трансген LMO1 , выделяют гДНК из F1 mCherry-положительного одиночного эмбриона с помощью буфера экстракции гДНК, который содержит: 12,5 мкл 4x лизисного буфера (500 мкл 1 M Tris с рН 8,4, 2,5 мл 1 М хлорида калия и 47 мл очищенной воды), 35 мкл очищенной воды, и 2,5 мкл протеиназы К при 10 мг/мл. Инкубируйте образец в течение 16 ч при 55 °C, затем 10 мин при 98 °C.
  4. Используйте экстрагированную гДНК (2 мкл) в качестве шаблона для генотипирования ПЦР с праймерами: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' и LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3', и следующей программой ПЦР: 1 цикл 94 °C, 10 мин; 35 циклов (94 °C для 30 с, 60 °C для 30 с; 68 °C, 30 с); и 68 °C в течение 7 мин. Подтвердите усиление фрагмента 182 bp путем секвенирования.
  5. После подтверждения генотипа поднимите оставшиеся эмбрионы F1 до зрелости в соответствии со стандартными рекомендациями книги о рыбках данио21. Зажим и генотип их в возрасте 2-3 месяцев с использованием шагов 2.3-2.4 из протокола выше для дальнейшего подтверждения интеграции трансгена LMO1 в рыбу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: LMO1-положительная рыба F1 будет стабильной трансгенной рыбой [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (обозначенной как линия LMO1 ).
  6. Разводят F1 LMO1 стабильных трансгенных рыб с WT рыбой и повторяют по мере необходимости для размножения этой линии.

3. Пересечение трансгенных линий LMO1 и MYCN для создания метастатической модели

  1. После того, как трансгенная линия рыбок данио LMO1 получена, скрещивайтесь с линией MYCN6,17 для развития гетерозиготной трансгенной рыбной линии, чрезмерно экспрессирующей как MYCN, так и LMO1.
  2. При 1 dpf отсортируйте потомство ауткросса для экспрессии EGFP с помощью стереоскопического флуоресцентного микроскопа, который представлен в виде EGFP-положительных точек в области заднего мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, если не все эмбрионы отсортированы по MYCN при 1 dpf, поднимите эмбрионы до зрелого возраста и генотипа путем обрезки плавников и использования ранее заявленных руководящих принципов из шагов 2.3-2.4 для выделения гДНК и генотипирования ПЦР с праймерами: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', и следующая программа со стандартной полимеразой Taq : 1 цикл 94 °C в течение 3 мин, 35 циклов (94 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с и 68 °C в течение 3 мин) и 68 °C в течение 7 мин с ожидаемым размером ампликона 145 bp.
  3. После сортировки по EGFP при 1 dpf изолируйте просеянные эмбрионы в отдельные чашки Петри и пометьте чашки как: MYCN+ (EGFP-положительный) или MYCN- (EGFP-отрицательный).
  4. При 3-4 dpf визуализируйте и сортируйте эмбрионы обеих групп (шаг 3.3) для экспрессии LMO1 с помощью стереоскопического флуоресцентного микроскопа. Ищите экспрессию красного флуоресцентного белка в виде пятен как в верхнем шейном ганглии, так и в не-PSNS дофаминергических нейронных клетках в области головы, особенно в продолговатом мозге заднего мозга6,13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скрининг на вишню / LMO1 до того, как эмбрионы достигнут 5 dpf, потому что заполненные воздухом плавательные пузыри полностью развиваются к тому времени и заставят эмбрионы плавать, что приведет к трудной микроскопической фокусировке клеток PSNS во время процесса сортировки.
  5. Как только сортировка будет завершена, изолируйте отсортированную рыбу на четыре группы разных генотипов и пометьте, как показано ниже. Выращивайте отсортированную рыбу в одинаковых условиях согласно стандартным протоколам из книги «Рыбки данио»21.
    1. Только MYCN (EGFP-положительный),
    2. Только LMO1 (мВечерри-положительный),
    3. МИКН; LMO1 (EGFP и mCherry двойной положительный),
    4. WT (EGFP и mCherry двойной отрицательный).

4. Визуализация опухолевой нагрузки в трансгенных линиях рыбок данио

  1. Через 4 недели после оплодотворения (wpf) обезболить отсортированную рыбу со стадии 3,5 0,02% трикаином в чашке Петри.
  2. Визуализируйте опухоли с помощью стереоскопического флуоресцентного микроскопа, осторожно переворачивая рыб металлическим шпателем на обе боковые стороны, чтобы увидеть опухоль. Ожидайте, что опухоли будут представлять собой одиночные EGFP-, одиночные mCherry- или двойные EGFP-и-mCherry-положительные массы, которые возникают из области межпочечной железы (около головы и почки).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что первоначальное начало опухоли обычно представлено более яркой и большей флуоресцентной положительной массой на одной стороне межпочечной железы, поэтому крайне важно визуализировать обе стороны рыб, чтобы избежать пропуска раннего начала опухоли.
  3. После идентификации возможной опухоленосной рыбы выделите рыбу в отдельный аквариум с соответствующими метками, которые включают дату рождения, дату скрининга опухоли и генотип.
  4. При 6 wpf повторите предыдущие шаги 4.1-4.3 для скрининга опухоленосных рыб и неопухолевых рыб снова, чтобы подтвердить наличие опухолей для ранее проверенных опухоленосных рыб или идентифицировать новых возможных опухоленосных рыб, соответственно. Ищите устойчивый или увеличенный размер флуоресцентно-положительной массы у подтвержденных опухоленосных рыб.
  5. После выявления опухоленосных рыб два раза в неделю контролируйте их за доказательствами миграции опухолевых клеток, которая представляет собой крошечные EGFP- и / или вишнеобразные опухолевые массы, удаленные от первичного места опухолевого генеза (межпочечной области железы). Выделите этих рыб в отдельные резервуары по мере необходимости и нанесите соответствующую маркировку, чтобы указать на возможные метастазы.
  6. Для дальнейшего подтверждения метастазирования продолжайте отслеживать этих рыб регулярно (каждые две недели) до тех пор, пока отдаленные флуоресцентно-положительные опухолевые массы не покажут явно увеличенные размеры, что указывает на рост опухолей в метастатических участках.

5. Обработка тканей и парафиновое сечение опухоленосных рыб

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот этап для характеристики спонтанно развившихся первичных и/или метастатических опухолей при MYCN и MYCN; LMO1 трансгенная рыба.

  1. После идентификации и проверки рыб, несущих опухоль, принесите в жертву рыбу со стадии 4,6 в чашку Петри, погружая рыбу в 0,02% трикаина, чтобы сначала обезболить, а затем увеличивая дозировку трикаина, пока рыба больше не дышит. Разрежьте рыбу на две части - с одним куском, содержащим голову и часть средней части тела (включая опухоль), и еще одним куском с остальной частью средней части рыбы и хвостом.
  2. Зафиксируйте обе секции рыбы 4% параформальдегидом (PFA) в 1x PBS в течение 1 ч при комнатной температуре на коромысле. Для повышения эффективности фиксации замените буфер свежим 4% PFA, чтобы эффективно и быстро увеличить проникновение во внутренние органы. Оставьте рыбу со свежим фиксирующим буфером на коромысле при 4 °C на ночь или на 48 ч.
    ВНИМАНИЕ: PFA токсичен. Поскольку предупредительные процедуры и правильная утилизация реагента зависят от правил вашего учреждения, обратитесь за надлежащими рекомендациями перед использованием и утилизацией реагента.
  3. Перед обработкой поместите образец (образцы) в 100% раствор быстрого декальцификатора в течение 15-20 мин при комнатной температуре. Обязательно используйте неметаллический контейнер и проверяйте образец (образцы) на протяжении всей инкубации, чтобы предотвратить чрезмерное декальцификацию. Если ткань образца выглядит сильно деградированной, поместите образец в воду или при температуре 4 °C, чтобы замедлить процесс декальцификации.
  4. После фиксации и декальцинации промывайте образец (образцы) рыбы проточной водопроводной водой в течение 1 ч и поместите его в кассету (кассеты) процессора. Если имеется более одного образца, разделите каждый из них на отдельную кассету.
  5. Обезвоживать и готовить ткань к встраиванию парафина путем помещения кассеты с рыбой в тканевой процессор, где образец (образцы) погружают в различные растворы, соответственно, следующим образом: 70% этанол (60 мин, 40 °C), 85% этанол (50 мин, 40 °C), 95% этанол (40 мин, 40 °C) дважды, 100% этанол (30 мин, 40 °C), другой свежий раствор 100% этанола (50 мин, 40 °C) дважды, ксилол (30 мин, 40 °C), еще один свежий раствор ксилола (50 мин, 40 °C), еще один свежий ксилол (50 мин, 45 °C), парафин (30 мин, 45 °C), парафин (20 мин, 58 °C) три раза.
  6. После того, как ткань обработана, выгрузите кассету (кассеты) из процессорной машины, сохраняя организацию каждой кассеты и предотвращая смешивание образцов рыбы.
  7. Выберите форму подходящего размера в зависимости от размера рыбы, убедившись, что форма будет соответствовать всей кассете с образцом рыбы. Закройте дно формы жидким парафином при температуре 60 °C.
  8. Немедленно поместите кассету с рыбой поверх плесени (убедившись, что рыба уложена на ее плоскую боковую сторону для сагиттальных секций) с жидким парафином и закончите наполнение парафином в верхнюю часть формы, чтобы полностью встроить рыбу.
  9. Поместите готовую форму на холодную пластину рассеченного микротома до тех пор, пока парафин не затвердеет.
  10. Как только парафиновый блок станет твердым, о чем можно судить, визуально наблюдая за более высокой непрозрачностью и твердым прикосновением к блоку, аккуратно извлеките блок из формы. Осторожно соскоблите лишний парафин со сторон кассеты.
  11. Разделите парафиновый рыбный блок сагиттально на 4 микрона на микротоме и плавайте секции на теплой водяной бане при 40 °C, содержащей дистиллированную воду.
  12. Осторожно переложите секции на положительно заряженные слайды и выпекайте в духовке при 60 °C в течение 30 минут перед окрашиванием, прежде чем перейти к шагу 6, 7 или 8.

6. Окрашивание гематоксилина и эозина (H&E) парафиновых срезов для обзора патологии

  1. Поместите слайды, содержащие парафиновые секции из шага 5.12, в держатель слайдов. Внутри химической вытяжки депарафинизируйте ксилолом 3 раза по 5 мин каждый. Выбрасывайте раствор после каждого использования.
  2. Регидратировать срезы со 100% этанолом в течение 3 мин, и повторить дважды со свежим 100% этанолом. Замените 100% этанол на 95% этанол в течение 3 мин, а затем 80% этанол в течение 3 мин.
  3. Промыть секции дистиллированной водой в течение 5 мин. Пока секции моются в воде, обязательно удалите окисленные частицы из гематоксилина путем фильтрации или обезжиривания поверхности гематоксилина безворсовой салфеткой.
  4. Промокните лишнюю воду из держателя слайда безворсовыми салфетками профессионального класса и окрашивайте горки в 50% гематоксилин (разбавление 1: 1 дистиллированной водой) в течение 2-5 минут в зависимости от желаемых предпочтений окрашивания и порчи реагентов. Откажитесь от гематоксилина, когда цвет раствора изменится с сливового на сине-коричневый или когда время окрашивания станет чрезмерным. Промойте горки проточной водопроводной водой в течение 20 минут.
  5. Обесцвечивайте срезы 1% кислым этанолом (3,3 мл соляной кислоты с 50 мл 70% этанола), быстро погружая слайды несколько раз. Горки можно опускать до 3 с, но чем дольше опускаются горки, тем легче становятся секции.
  6. Промойте горки в водопроводной воде дважды по 1 мин каждая и один раз деионизированной водой. Как вариант, горки можно оставить на ночь на этом этапе, замачивая в воде.
  7. Погружайте срезы в 1,36% раствор карбоната лития (47 г карбоната лития, 3500 мл воды) на 3 с. Убедитесь, что вы не чрезмерно инкубируете срезы, так как чем дольше время в растворе карбоната лития, тем больше вероятность того, что ткань будет плавать.
  8. Промойте секции в водопроводной воде в течение 5 минут и промойте лишнюю воду из держателя слайда безворсовыми салфетками профессионального класса.
  9. Размазывайте слайды 100% готовым к употреблению эозином в течение 15-30 с и немедленно обезвоживайте 95% этанолом дважды по 5 мин каждый. Заменить 100% этанолом дважды по 5 мин каждый, отбрасывая растворы после каждого использования.
  10. Очистите срезы в ксилоле в течение 15 мин и повторите дважды в общей сложности 3 раза. Опционально, горки можно оставить в ксилоле на ночь при комнатной температуре, чтобы лучше очистить избыток воды.
  11. Дайте слайдам высохнуть на воздухе в химическом вытяжном шкафу, а затем установите крышку с помощью монтажной среды для герметизации образца ткани.
  12. Визуализируйте и изобразите окрашенные участки тканей под микроскопией. Тщательно исследуйте опухоли в первичном месте (область межпочечной железы в головной почке) и отдаленные спорадические метастазы в других тканях и органах рыбы. Разошлите окрашенные слайды для участков тканей, которые будут рассмотрены патологоанатомами. Основываясь на патологических особенностях модели рыбы, сходных с нейробластомой человека, следует ожидать опухоли, возникшие только в MYCN или MYCN; Рыба LMO1 будет впервые диагностирована как нейробластома патологоанатомами.

7. Иммуногистохимический анализ (IHC) с антителами против NB-маркера и сверхэкспрессированных трансгенов для дальнейшего подтверждения распространения опухолей и их свойство симпатоадреналовой линии

  1. Окрашивание с полностью автоматической системой окрашивания
    1. Чтобы лучше сравнить результат IHC с результатом окрашивания H&E, выберите соседние слайды из шага 5.12 для окрашивания IHC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя автоматизированная система окрашивания обеспечивает более быстрые и менее трудоемкие результаты, ручной протокол окрашивания IHC может быть использован в отсутствие такового, ссылаясь на этапы подраздела 7.2.
    2. Разбавить первичное антитело против тирозингидроксилазы (TH) (1:500), маркера нейробластомы, на основе желаемой концентрации и общего количества, необходимого с помощью соответствующего разбавителя первичных антител автоматизированной системы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные концентрации антител могут варьироваться в зависимости от антитела и ткани.
    3. Поскольку автоматизированная система использует бортовой теплоиндуцированный забор антигена с раствором эпитопного извлечения в течение 20 мин и соответствующим реагентом системы обнаружения, убедитесь, что параметры для машины установлены следующим образом: Блокировка пероксидазы, 5 мин; Первичное антитело с желаемой концентрацией, 15 мин; биотинилированное анти-кроличье вторичное антитело IgG (1:500), 8 мин; Стрептавидин HRP, 8 мин; смешанный DAB интенсивный субстрат, 5 мин; и гематоксилин, 5 мин.
    4. Как только настройки будут установлены, поместите лоток антител в устройство. Настройте слайды, создав новый корпус, который будет помечать слайды. Теперь машина загружена и готова к работе (депарафинизация, окрашивание и контрокрашивание).
    5. После того, как слайды депарафинированы, окрашены и окрашены с помощью автоматизированной машины, обезвоживайте слайды в градиентах этанола 70%, 95% и 100% в течение 5 минут каждый. Снова погрузите слайды секций в 100% свежий этанол на 5 мин.
    6. Очистите участки в ксилоле в течение 5 мин, дважды или оставьте слайды в ксилоле на ночь, чтобы лучше очистить избыток воды.
    7. Дайте слайдам высохнуть на воздухе в химическом вытяжном шкафу, а затем установите крышку с помощью монтажной среды. Визуализируйте и изобразите окрашенные участки тканей с помощью микроскопии.
    8. Чтобы твердо подтвердить метастазирование в модели рыбы, сравните слайды, окрашенные антителами против маркера нейробластомы с этапа 7, с теми, которые окрашены H & E из шага 6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте увидеть положительное окрашивание для маркера нейробластомы, TH, во всех опухолевых клетках, идентифицированных окрашиванием H & E. Также не следует ожидать положительного окрашивания для TH в соседних тканях, где метастатические опухоли были идентифицированы в LMO1; Рыба MYCN . Убедитесь, что выбраны контрольные WT и MYCN-только рыбы, которые имеют возраст, аналогичный MYCN; LMO1 рыбы для этого анализа, чтобы исключить возможность того, что метастатические опухоли являются мультифокальными первичными опухолями.
  2. Ручное окрашивание без автоматизированной системы окрашивания IHC
    1. После того, как слайды запечены, выберите соседние слайды из шага 5.12, чтобы обеспечить лучшее сравнение между окрашиванием H&E и IHC для депарафинизации. Внутри химического вытяжного шкафа депаракс и регидратация слайдов ксилолом, используя предыдущие шаги 6.1 и 6.2. соответственно.
    2. После депараффифинизации и регидратации замочите слайды в эндогенном растворе, блокирующем перекись (1x PBS, содержащий 0,1% азида натрия и 0,3% перекиси водорода) в течение 5 мин при комнатной температуре. Вымойте слайды в свежем 1x PBS в течение 3 минут и повторите дважды в общей сложности 3 раза.
      ВНИМАНИЕ: Азид натрия остро токсичен. Обеспечьте практику предупредительных процедур и надлежащую утилизацию реагентов в зависимости от правил вашего учреждения.
    3. Получают антиген путем инкубации слайдов в растворе с протеиназой К (1:500 в 1x PBS) в течение 10 мин при комнатной температуре. Мойте слайды 3 раза по 1 pBS в течение 3 минут каждый.
    4. Блокируйте слайды путем инкубации с 5% козьей сывороткой в 1x PBS в течение 30 мин при комнатной температуре на коромысле. Мойте слайды свежим 1x PBS дважды по 3 мин каждая.
    5. Добавьте 4 капли блокирующего раствора Авидина непосредственно на слайд и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре. После промывки горок свежим 1x PBS дважды по 3 мин каждый, добавьте 4 капли раствора для блокировки биотина и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин.
    6. После блокирования слайдов инкубируют в первичном антителе тирозингидроксилазы (TH) (1:500) в течение 45-60 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание с дополнительными антителами против трансгенов и других соответствующих маркеров для решения физиологии и активности первичной опухоли и других метастатических участков. Оптимальные концентрации антител могут варьироваться в зависимости от антитела и ткани.
    7. Мойте слайды свежим 1x PBS в течение 3 минут, повторяя дважды в общей сложности 3 раза.
    8. Инкубировать слайды во вторичном антителе биотинилированного анти-кролика IgG вторичного антитела (1:500), разведенного в блокирующем растворе в течение 45-60 мин при комнатной температуре. Повторите предыдущий шаг стирки 7.2.7.
    9. Добавьте HRP конъюгированный авидин (1:300 в 1x PBS) и инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре. Вымойте слайды 3 раза свежим 1x PBS в течение 5 минут каждый.
    10. Приготовьте раствор 3,3'-диаминобензидина (DAB) (2,5 мл дистиллированной воды, 1 капля буфера комплекта, 1 капля перекиси водорода и 2 капли DAB из комплекта) и поместите капли DAB непосредственно на слайды возле микроскопа. После добавления DAB понаблюдайте за реакцией изменения цвета на слайдах под микроскопом. Как только желаемая интенсивность окрашивания достигнута, остановите реакцию, поместив секции слайдов в холодную дистиллированную воду.
    11. Увлажняйте горки свежим 50% гематоксилином, погружая или погружая образцы на несколько коротких секунд и помещая обратно в дистиллированную воду. Повторите по желанию, но, как правило, одного раза должно быть достаточно, так как участки тканей тонкие.
    12. Обезвоживать образцы тканей на слайдах в градиенте алкоголя, как описано ранее на этапе 7.1.5, и продолжить прохождение оставшихся этапов (с последней стадией как 7.1.8) для завершения анализа IHC.

8. Picrosirius красное окрашивание парафиновых слайдов для накопления коллагена в опухолях как исследование механизма

  1. Повторите шаги 6.1-6.3, чтобы очистить, увлажнить и промыть парафиновые секции на слайдах.
  2. После смачивания лишней воды из держателя горки безворсовыми салфетками профессионального класса окрашивают в 50% гематоксилин в течение 10 мин. Промойте горки проточной водопроводной водой в течение 10 минут.
  3. Переложить горки в Picrosirius Red и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч.
  4. Промыть горки в подкисленной воде (5 мл ледниковой уксусной кислоты в 1 л водопроводной или дистиллированной воды) дважды, инкубируя в течение 5 мин на шейкере.
  5. Сначала отфильтруйте большую часть воды с горок, а затем физически встряхните и промокайте участки на горках, чтобы удалить как можно больше воды.
  6. Быстро поместите слайды в три смены 100% этанола для обезвоживания парафиновых секций.
  7. Повторите шаги 6.10 и 6.11, чтобы очистить слайды в ксилоле и смонтировать образец. Далее изображение с помощью составного микроскопа, который оснащен камерой.
  8. Используя ImageJ, подсчитайте красноположительные коллагеновые волокна picrosirius по крайней мере в трех случайных полях для каждого участка. Сравните слайды MYCN и MYCN; Секции рыбы LMO1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы определить, взаимодействует ли LMO1 с MYCN для воздействия на патогенез NB, трансгенные конструкции, которые управляют экспрессией LMO1 (dβh: LMO1 и dβh: mCherry) или MYCN (dβh: EGFP-MYCN) в клетках PSNS под контролем промотора dβh, были введены эмбрионам рыбок данио13. Как показано на рисунке 1А, после разработки стабильных трансгенных линий и проверки их генотипов были скрещивались гетерозиготные рыбы MYCN и LMO1. Их потомство было отсортировано по выражению MYCN (EGFP+) или LMO1 (mCherry+) при 1 dpf или 3-4 dpf соответственно. Было показано, что гиперэкспрессия MYCN подавляет развитие PSNS6. Таким образом, экспрессия EGFP-MYCN более заметна в не-PSNS дофаминергических нейронных клетках при 1 dpf6, таких как черепные ганглии (CA), арокассоциированные катехоламинергические нейроны (AAC) и продолговатый мозг (MO). Из-за нестабильности белка EGFP-MYCN сигнал EGFP становится тусклее через 2 дня. Напротив, экспрессия mCherry заметна в обеих клетках PSNS, таких как верхний шейный ганглий и не-PSNS дофаминергические нейрональные клетки, которые включают CA, AAC и MO, начиная с 3 dpf и далее6. Следовательно, потомство спаривания MYCN и LMO1 сортируется по 1 dpf для MYCN (EGFP+) и по 3 dpf для LMO1 (mCherry+). Отсортированные рыбы были разделены на различные генотипические группы следующим образом: i) MYCN, ii) LMO1, iii) MYCN; LMO1 и iv) WT и выращиваются в одинаковых условиях. Начиная с 4 wpf, потомство проверялось два раза в неделю на наличие опухолей с помощью флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные положительные опухолевые массы были обнаружены в тканях и органах, удаленных от первичного опухолевого участка у соединения трансгенной рыбы с гиперэкспрессией как MYCN, так и LMO1, но не у трансгенной рыбы с экспрессией только MYCN (рисунок 1B).

Для дальнейшей верификации метастазирования у этих трансгенных животных, опухоленосящих MYCN и MYCN; Трансгенные рыбы LMO1 в возрасте от 5 до 9 месяцев подвергались парафиновому сечению и иммуногистохимическому анализу антителом против маркера нейробластомы TH. Репрезентативные результаты для MYCN; Рыба LMO1 представлена на рисунке 2. H&E окрашивание сагиттальных срезов показало, что первичная опухоль возникла из области межпочечной железы, эквивалента рыбки данио надпочечников человека, которая является наиболее распространенным местом первичного заболевания у пациента с нейробластомой12,22 (рисунки 2A,B). Состоящая из крошечных, недифференцированных и круглых раковых клеток с гиперхроматическими ядрами, опухоль часто образовывала слои, которые были гистологически похожи на нейробластомы человека, как описано ранее6 (рисунки 2A, B). В соответствии с наблюдением с помощью флуоресцентной микроскопии (рисунок 1B), широко распространенные опухолевые массы, удаленные от межпочечной железы, были обнаружены в нескольких областях, в том числе: дистальная часть почки (первичная взрослая кроветворная ниша рыбок данио и сопоставимая с костным мозгом млекопитающих23) (рисунок 2A, C), орбита (фиг.2A,D), жабры (аналог легкого млекопитающего24) (рисунки 2A, E), селезенка (аналог лимфатического узла млекопитающего25) (фиг.2A и 2F) и внутренняя стенка предсердной камеры сердца (фиг.2G). Многие из этих метастазов повторяют общие участки метастазов, наблюдаемые у пациентов с нейробластомой высокого риска, которые включают костный мозг, лимфатический узел, область орбиты и легкие13,23,24,25. Дальнейшая иммуногистохимия с антителом против TH подтвердила линию нейробластов PSNS опухолевых клеток при первичной опухоли и всех метастатических участках (рисунки 2H-M).

В попытке лучше понять механизмы, лежащие в основе синергии между MYCN и LMO1 в ускорении метастатического распространения опухоли, было обнаружено, что уровни экспрессии панели генов, участвующих во взаимодействии опухолевой клетки с внеклеточным матриксом, были значительно повышены в опухолях рыб с гиперэкспрессией как MYCN, так и LMO113. Чтобы изучить, действительно ли внеклеточный матрикс был затронут измененной экспрессией генов в LMO1-сверхэкспрессирующих опухолях, что привело к усилению распространения или миграции опухоли, парафиновые срезы только из MYCN и MYCN; Опухоли LMO1 были окрашены Picrosirius red (PSR), высокоселективным окрашиванием для коллагеновых волокон, для оценки отложений коллагена и жесткости внеклеточного матрикса (ECM)26,27. Как показано на рисунке 3A-E, в MYCN были значительно увеличены количества и увеличена толщина окрашенных PSR коллагеновых волокон; Опухоли LMO1, по сравнению с опухолями, экспрессирующими только MYCN. Вместе эти результаты демонстрируют, что сверхэкспрессия LMO1 может реконструировать ECM опухоли, чтобы увеличить ее жесткость и, следовательно, облегчить распространение опухолевых клеток.

Figure 1
Рисунок 1: Иллюстрация скринингового анализа опухоли на потомство от разведения трансгенных линий рыбок данио MYCN и LMO1 . (A) Схематическая иллюстрация сортировки и скрининга опухолей MYCN и/или LMO1-сверхэкспрессирующих стабильных трансгенных рыб для исследования нейробластомы. Верхние панели: Репрезентативные снимки эмбрионов EGFP-MYCN+ через 1 день после оплодотворения (dpf) (дорсальный вид слева и боковой вид справа). Нижние панели: Репрезентативные изображения эмбрионов mCherry-LMO1+ при 3 dpf (боковой вид слева и вентральный вид справа). AAC, архиассоциированные катехоламинергические нейроны; СА, черепные ганглии; и МО, продолговатый мозг. Шкала, 100 мкм. Созданный с BioRender.com (B) Коэкспрессия LMO1 и MYCN способствует метастазированию нейробластомы. Слева: тренсгенные рыбы, чрезмерно экспрессирующие MYCN в одиночку (MYCN) с EGFP-экспрессирующей опухолью (белая стрелка) в возрасте 36 месяцев. Справа: трансгенные рыбы, чрезмерно экспрессирующие как MYCN , так и LMO1 (MYCN; LMO1) с вишнеобразной опухолевой массой на первичном участке (IRG, белая стрелка) и множественными метастатическими участками (твердые наконечники стрел) в возрасте 36 месяцев. Шкала, 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Ко-сверхэкспрессия MYCN и LMO1 способствует отдаленным метастазам нейробластомы в трансгенной модели рыбок данио. (А-Г) H&E-окрашенные сагиттальные участки MYCN; LMO1 трансгенная рыба в возрасте 6 месяцев. (Н-М) Увеличенные виды иммуногистохимических анализов MYCN; Трансгенные рыбы LMO1 в сагиттальных срезах тканей с использованием антитела к тирозингидроксилазе (TH). Белая рамка очерчивает межпочечный сальник (b, h) с увеличенным видом на панелях B и H. Диссеминированные опухолевые клетки были обнаружены в костном мозге почек (c, i, C и I с твердыми черными наконечниками стрел), склерах глаза (d, j, D и J с черными очерченными и белыми заполненными открытыми стрелками), жабрах (e, k, E и K с черными очерченными и белыми заполненными открытыми наконечниками стрел), селезенке (f, l, F и L со сплошными черными стрелками); и камера сердца (G и M с черными очерченными и белыми заполненными двойными наконечниками стрел). Шкала стержней, 100 мкм (A) и 50 мкм (B-M). Эта цифра была изменена из Zhu, S. et al. LMO1 синергизирует с MYCN для содействия инициации и метастазированию нейробластомы. Раковая клетка. 32, 310-323 (2017)13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Повышенная экспрессия LMO1 способствует отложению коллагена и жесткости ECM, что приводит к облегчению диссеминации опухолевых клеток в моделях рыбок данио. (А-Д) Репрезентативная световая микроскопия изображений коллагеновых волокон, окрашенных Picrosirius red (PSR) только в MYCN (A,B) или MYCN; LMO1 (C,D) трансгенные рыбки данио. (B) и (D) увеличиваются из коробочных областей (A) и (C) с использованием стрелок (A и B) и наконечников стрелок (C и D) для обозначения PSR-положительных коллагеновых волокон соответственно. Шкала стержней, 100 мкм (A и C) и 50 мкм (B и D). (E) Количественная оценка окрашенных PSR областей на опухолевых участках только MYCN или MYCN; LMO1 трансгенная рыба. Результаты были нормализованы до среднего значения окрашенных PSR областей в опухолях только MYCN. Статистические данные, представленные в качестве среднего ± УР трех только MYCN или трех MYCN; опухоли LMO1; p = 0,02 по двуххвостому t-тесту. Эта цифра была изменена из Zhu, S. et al. LMO1 синергизирует с MYCN для содействия инициации и метастазированию нейробластомы. Раковая клетка. 32, 310-323 (2017)13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Рыбки данио широко использовались в исследованиях в течение последних нескольких десятилетий, особенно в исследованиях рака, по очевидным причинам, таким как простота обслуживания, надежное размножение и явные преимущества для визуализации in vivo1,28. Моделью рыбок данио можно легко манипулировать эмбрионально из-за их внешнего оплодотворения и развития, что хорошо дополняет модельные организмы млекопитающих, такие как крысы и мыши, для крупномасштабных генетических исследований1,2,3. Более того, геном рыбки данио имеет высокоуровневое сходство с геномом человека. Сравнивая подробные аннотации генома рыбки данио с эталонным геномом человека, было показано, что около 70% человеческих генов получают ортолог рыбок данио29. Кроме того, другие виды использования рыбок данио в исследованиях были распространены на открытие лекарств и аватары пациентов для индивидуальной терапии рака30,31. Накопленные исследования показали, что опухоли, индуцированные у рыбок данио, похожи на опухоли человека на гистологическом и молекулярном уровнях, что может помочь в рассечении инициации, прогрессирования и гетерогенности опухоли32,33. Вместе рыбки данио демонстрируют огромный потенциал в качестве ценной животной модели, которая может быть использована для изучения метастазирования и выяснения возможных онкогенных путей, участвующих в патогенезе заболевания.

Используя трансгенную модель рыбок данио с гиперэкспрессией как LMO1, так и MYCN, было четко продемонстрировано сотрудничество между этими двумя онкогенами в опухолевом генезе и метастазировании NB. Благодаря сегодняшней доступности мощных методов визуализации в реальном времени, скрининг опухолей может быть легко выполнен раз в две недели, а метастазы могут быть прослежены с течением времени. Широко распространенные метастазы также могут быть дополнительно подтверждены разделением парафина и окрашиванием антителами. Поразительно, что метастазы обнаруживаются в MYCN; Рыбки данио LMO1 хорошо коррелируют с общими участками метастазирования, наблюдаемыми в случаях высокого риска NB, таких как костный мозг, лимфатические узлы, орбита и легкие34,35, что дополнительно поддерживает рыбок данио в качестве осуществимой и полезной модели для исследования метастазов.

Более того, из-за относительно небольших размеров тела вся рыбка данио может быть разделена, хотя и полностью, что является еще одним явным преимуществом этой модели, позволяющим тщательно охарактеризовать первичную опухоль вместе с метастазами в других областях тела. Пикрозирусное красное окрашивание участков опухоли четко выделило коллагеновые сети в опухолях рыб и демонстрирует повышенную жесткость внеклеточного матрикса в опухолях с гиперэкспрессией LMO1 . Хотя этот метод не является уникальным для рыбок данио, его применение вместе с высокопроизводительным комплексным скринингом эмбрионов рыбок данио, которые генетически модифицированы или пересажены опухолевыми клетками, может обеспечить новое средство скрининга эффективных соединений, которые могут быть нацелены на ремоделирование внеклеточного матрикса, что является критическим процессом, участвующим в метастазировании опухолевых клеток.

Стабильные трансгенные модели рыбок данио очень полезны для нас, чтобы понять вклад онкогенов-кандидатов в развитие опухоли in vivo, хотя разработка этих линий может быть сложной и трудоемкой. Создание стабильной трансгенной линии требует длительного периода времени, так как перед распространением линии должно быть приобретено несколько поколений. Кроме того, распространение этих линий может быть утомительным, и могут потребоваться стратегические планы спаривания. Например, продуктивность трансгенной рыбы MYCN часто заметно снижается после развития опухоли, а гомозиготные трансгенные рыбы MYCN плохо выживают во взрослом возрасте. Поэтому, чтобы лучше поддерживать трансгенную рыбную линию MYCN , рекомендуется пересекать гетерозиготную неопухолевую трансгенную рыбу MYCN в более молодом возрасте с WT или другими генетически модифицированными рыбными линиями, такими как трансгенная рыбная линия LMO1 . Чтобы преодолеть проблемы в разработке и поддержании стабильных трансгенных рыбьих линий, мозаичный переходный трансгенез может быть альтернативным подходом для быстрой и эффективной оценки вклада одного гена или комбинации генов в инициацию и прогрессирование опухоли у преимущественно инъекционных рыб. Кроме того, мозаичная картина интеграции трансгенов у первично вводимых рыб может лучше имитировать патогенез заболевания, особенно вызванный соматическими событиями36.

Однако, как и любая другая животная модель, используемая в исследованиях для изучения рака, рыбка данио также имеет свои недостатки. Например, антитела, особенно против белков рыбок данио, остаются в значительной степени недоразвитыми, хотя несколько антител против генов-маркеров нейробластомы, таких как тирозингидроксилаза, синаптофизин и HuC, к счастью, хорошо работают у рыбок данио6,13. Чтобы бороться с этой проблемой, многие поставщики начали тестировать свои продукты и прогнозировать потенциал своих антител в перекрестной реакции с белками рыбок данио. Более подробную информацию о проверенных антителах также можно найти в информационной сети рыбок данио (ZFIN). Благодаря этим усилиям все больше и больше антител, которые могут специфически обнаруживать белки рыбок данио, скоро станут доступными для сообщества рыбок данио. Еще одной проблемой использования рыбок данио в качестве генетической модели для препарирования взаимодействия сложных сигнальных путей в патогенезе NB является ее частично дублированный геном. Такое дупликация генома, которая произошла в естественной родословной рыбок данио37,38, часто может привести к более чем одному варианту гомологов рыбок данио для человека. Это может привести к эволюционировавшему приобретению новых функций генов или уникальных паттернов экспрессии в животной модели39. Поэтому при изучении генов с потенциальной ролью в подавлении опухоли может потребоваться одновременно выбить несколько аллелей дублированных генов, чтобы продемонстрировать их функцию подавления опухоли, что может быть потенциально трудоемким и технически сложным делом.

Тем не менее, трансгенная модель рыбок данио может точно повторять все стадии метастазирования опухоли in vivo и обладает явными преимуществами для генетического анализа и визуализации диссеминации опухоли в режиме реального времени. Таким образом, эта модельная система предлагает нам уникальный инструмент для решения многих сложных вопросов в этой области, таких как молекулярные и клеточные события, лежащие в основе многоступенчатого процесса распространения опухоли и метастазирования in vivo , когда клетки NB распространяются из первичных опухолей и как микроокружение опухоли способствует метастазированию NB. Благодаря надежности рыбок данио для скрининга и тестирования лекарств, модель рыбы также обеспечит ценное средство для оценки эффективности новых агентов и ингибиторов для профилактики или лечения метастатического NB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом R01 CA240323 (S.Z.) от Национального института рака; грант W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) от Министерства обороны США (DOD); награда V Scholar от V Фонда исследований рака (S.Z.) и грант платформы от Центра биомедицинских открытий Майо (S.Z.); и поддержка со стороны Онкологического центра клиники Майо и Центра индивидуализированной медицины (S.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit Vector SK-4100
Acetic Acid Fisher Scientific / Acros Organic 64-19-7
Agarose GP2 Midwest Scientific 009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody Pel-Freez P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit Vector SP-2001
BOND Intense R Detection Leica Biosystems DS9263
BOND primary antibody diluent Leica Biosystems Newcastle, Ltd. AR9352
BOND-MAX IHC instrument Leica Biosystems Newcastle, Ltd. N/A fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone BACPAC resources center (BRFC) N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera Olympus AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) Richard-Allan Scientific 8312-4
Eosin Leica 3801601 ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol Carolina 86-1263
Expand Long Template PCR System Roche Applied Science, IN 11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) Dako E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC HHS-32-1L
HRP Avidin D Vector A-2004
Hydrochloric Acid Aqua Solutions 4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3% Fisher Scientific H324-500
I-SceI enzyme New England Biolabs, MA R0694L
Kanamycin sulfate Teknova, Inc. K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 34133
Lithium Carbonate Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC 554-13-2
Microtome for sectioning Leica Biosystems RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404006
p3E-polyA  Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah N/A a generous gift
(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax Surgipath Paraplast 39603002 Parrafin to parafin
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany N/A a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector Thermo Fisher Scientific 12536-017
pDONRP4-P1R donor vector  Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah N/A a generous gift
Phenol red, 0.5% Sigma Aldrich  P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X BioRad 1610780
Picrosirrius red stain kit Polysciences 24901-250
pME-mCherry Addgene 26028
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Roche 21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit Qiagen 27104
RDO Rapid Decalcifier Apex Enginerring RDO04
Sodium Azide (NaN3) Sigma Aldrich 26628-22-8
Stereo fluorescence microscope Leica MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging Nikon SMZ-1500
Taq DNA Polymerase New England Biolabs, MA M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor Sakura N/A Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S Western Chemical Incorporated 20513
Xylene Thermo Fisher Scientific X3P1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
  2. Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
  3. Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
  4. Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
  5. Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
  6. Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  7. Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), London, England. 2106-2120 (2007).
  8. Park, J. R., et al. Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
  9. Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
  10. Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
  11. Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
  12. Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
  13. Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
  14. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
  15. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  16. Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
  17. Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
  18. Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
  19. Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
  20. Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  22. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  23. Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
  24. Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
  25. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  26. Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
  27. Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
  28. Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
  29. Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  30. Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
  31. Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
  32. Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
  33. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
  34. Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), London, England. 466-470 (2006).
  35. Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
  36. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  37. Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), New York, N.Y. 1711-1714 (1998).
  38. Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
  39. Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).

Tags

Исследование рака выпуск 169
Модель метастазов нейробластомы рыбок данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Her, Z. P., Yeo, K. S., Howe, C.,… More

Her, Z. P., Yeo, K. S., Howe, C., Levee, T., Zhu, S. Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis. J. Vis. Exp. (169), e62416, doi:10.3791/62416 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter