Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Zebrafisk modell av Neuroblastom metastasering

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62416
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic Cancer Center

Summary

Detta dokument introducerar metoden att utveckla, karakterisera och spåra i realtid tumör metastasering i zebrafisk modell av neuroblastom, särskilt i den transgena zebrafisk linjen med överuttryck av MYCN och LMO1, som utvecklar metastasering spontant.

Abstract

Zebrafisk har dykt upp som en viktig djurmodell för att studera mänskliga sjukdomar, särskilt cancer. Tillsammans med den robusta transgena och genomredigeringstekniken som tillämpas i zebrafiskmodellering, gör det enkla underhållet, högvkastande produktivitet och kraftfull levande avbildning helt och hållet zebrafisken till ett värdefullt modellsystem för att studera metastasering och cellulära och molekylära baser som ligger till grund för denna process in vivo. Den första zebrafisk neuroblastom (OBS) modellen av metastasering utvecklades genom att överuttrycka två onkogener, MYCN och LMO1, under kontroll av dopamin-beta-hydroxylas (dβh) promotorn. Co-overexpressed MYCN och LMO1 ledde till minskad latens och ökad penetrance av neuroblastomagenesis, liksom accelererade avlägsna metastasering av tumör celler. Denna nya modell upprepar på ett tillförlitligt sätt många nyckeldrag i human metastaserad NB, inklusive medverkan av kliniskt relevanta och metastaseringsrelaterade genetiska förändringar. naturlig och spontan utveckling av metastasering in vivo; och bevarade platser för metastaser. Därför har zebrafiskmodellen unika fördelar för att dissekera den komplexa processen med tumörmetastasering in vivo.

Introduction

Zebrafisk har använts flitigt och tillämpats på flera forskningsområden, särskilt vid cancer. Denna modell ger många fördelar - såsom dess robusta reproduktion, kostnadseffektivt underhåll och mångsidig visualisering av tumörtillväxt och metastasering - som alla gör zebrafisk till ett kraftfullt verktyg för att studera och undersöka de cellulära och molekylära baserna för tumorigenesis och metastasering. Nya tekniker för storskalig genomkartläggning, transgenes, gener överuttryck eller knockout, celltransplantation och kemiska skärmar har enormt ökat kraften hos zebrafiskmodellen1. Under de senaste åren har många zebrafisklinjer utvecklats för att studera tumorigenesis och metastasering av en mängd olika mänskliga cancerformer, inklusive men inte begränsat till leukemi, melanom, rabdomyosarkom och hepatocellulärt karcinom2,3,4,5. Dessutom genererades den första zebrafiskmodellen av neuroblastom (OBS) genom att överuttrycka MYCN, en onkogen, i det perifera sympatiska nervsystemet (PSNS) under kontroll av dopamin-beta-hydroxylas (dβh) promotorn. Med denna modell visades det ytterligare att aktiverade ALK kan synergisera med MYCN för att påskynda tumör debuten och öka tumör penetrance in vivo6.

NB härleds från sympathoadrenal härstamning av neurala vapen celler, och är en mycket metastaserad cancer hos barn7. Det är ansvarig för 10% av pediatrisk cancerrelaterad död8. Allmänt metastasized vid diagnos, NB kan presenteras kliniskt som tumörer främst med ursprung längs kedjan av sympatiska ganglier och binjure medulla av PSNS9,10. MYCN förstärkning är ofta associerad med dåliga resultat i NB patienter11,12. Dessutom har LMO1 identifierats som en kritisk NB mottaglighet gen i högriskfall13,14. Studier fann att det transgena uttryck av MYCN och LMO1 i PSNS av zebrafiskmodellen inte bara främjar tidigare uppkomst av NB, men inducerar också utbredd metastasering till vävnader och organ som liknar platser som vanligtvis ses hos patienter med högrisk NB13. Helt nyligen har en annan metastaserad fenotyp av NB också observerats i en nyare zebrafiskmodell av NB, där både MYCN och Lin28B, som kodar ett RNA-bindande protein, överuttrycks under kontroll av dβhpromotorn16.

Det stabila transgena tillvägagångssättet hos zebrafisk används ofta för att studera om överuttryck av en gen av intresse kan bidra till normal utveckling och sjukdomspatogenes14,15. Denna teknik har framgångsrikt använts för att visa vikten av flera gener och vägar till NB tumorigenesis6,16,17,18,19,20. Detta dokument kommer att introducera hur den transgena fisklinjen som överuttrycker både MYCN och LMO1 i PSNS skapades och hur det visades att samarbetet mellan dessa två onkogener påskyndar uppkomsten av NB tumorigenesis och metastasering13. För det första utvecklades den transgena linje som överuttrycker EGFP-MYCN under kontroll av dβhpromotorn (utsedd MYCN-linje) genom att dβh-EGFP-MYCN konstrueras i encellsstadiet av embryon av vildtyp (WT) AB, som tidigare beskrivits6,17. En separat transgen linje som överuttrycker LMO1 i PSNS (betecknad LMO1-linje) utvecklades genom att mynta två DNA-konstruktioner, dβh-LMO1 och dβh-mCherry, i WT-embryon i encellssteg13. Det har tidigare visats att myntinkastade dubbla DNA-konstruktioner kan cointegreras i fiskgenomet; Därför uttrycks LMO1 och mCherry i PSNS-cellerna hos de transgena djuren. När de injicerade F0 embryon nådde sexuell mognad, de sedan över-korsas med WT fisk för identifiering av positiva fisk med transgene(s) integration. Kort, F1 avkomman först screenades av fluorescerande mikroskopi för mCherry uttryck i PSNS celler. Den bakteriella integrationen av LMO1 i mCherry-positiva fisk bekräftades ytterligare av genomisk PCR och sekvensering. Efter framgångsrik identifiering av varje transgen linje interbred avkomman av heterozygous MYCN och LMO1 transgen fisk för att generera en sammansatt fisklinje som uttrycker både MYCN och LMO1 (betecknad MYCN; LMO1-linjen). Tumörbärande MYCN; LMO1 fisk övervakades av fluorescerande mikroskopi varannan vecka för bevis på ögonbevarande tumörer i regionerna avlägset till den primära platsen, interrenal körtel regionen (IRG, zebrafisk motsvarighet till mänskliga binjuren)13. För att bekräfta metastasering av tumörer i MYCN; LMO1 fisk, histologiska och immunohistochemical analyser tillämpades.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla forskningsmetoder med zebrafisk och djurvård/underhåll utfördes i enlighet med de institutionella riktlinjerna vid Mayo Clinic.

1. Beredning och mikroinjektion av transgenekonstruktioner för utveckling av LMO1 transgen zebrafisklinje med överuttryck i PSNS

  1. För att utveckla LMO1-pDONR221-inmatningsklonen , förstärka kodningsregionen för humant LMO1 från cDNA som erhållits från mänsklig cellinje med PCR.
    1. Gör en 25 μL-reaktion enligt beskrivningen här: 2,5 μL 10x standard Taq Reaction Buffer, 0,125 μL Taq DNA Polymerase, 0,5 μL av 10 mM dNTPs, 2 μL cDNA-mall, 0,5 μL 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 mM dNTPs, 2 μL cDNA-mall, 0,5 μL 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 μM framåt LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL av 10 μM framåt LMO1 ATTB1 Primer, 0
      OBS: Använd framåt LMO1 ATTB1 primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' och omvänd LMO1 ATTB2 primer: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
    2. Förstärka med följande program: 1 cykel på 94 °C, 2 min; följt av 30 cykler (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 min) och 72 °C, 7 min.
  2. Klona LMO1 PCR-produkten i pDONR221 gateway donator vektor av BP recombinas reaktion6,13 (PCR fragment + Donator vektor = Entry Clone).
    1. För en 10 μL-reaktion, blanda 1 μL renad LMO1 PCR-produkt (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) pDONR221 donatorvektor och 6 μL TE-buffert (pH 8.0) med 2 μL BP enzymblandning, inkubera i 1 h vid 25 °C och omvandla till TOP10-kompetenta E.
    2. Sprid sedan 50-200 μL från omvandlingsflaskan på en Luria Broth (LB) agarplatta som innehåller 50 μg/ml kanamycin och inkuberar vid 37 °C över natten.
    3. Välj kloner genom att inokurera en enda koloni till 2-5 ml LB med 50 μg/mL kanamycin och odling över natten (16-18 h) vid 37 °C.
    4. Använd 2 ml bakteriekultur över natten för plasmidisolering enligt tillverkarens protokoll. För att verifiera LMO1-plasmiden, skicka ut plasmidprov för sekvensering med M13-F-primer (5- GTAAAACGACGGCCAG-3').
  3. För att generera en dβh-pDONRP4-P1R-ingångsklon, skaffa dβh PCR-produkt6,13 genom att förstärka den promotoriska regionen 5,2 kb med hjälp av CH211-270H11 BAC-klonen som mall för att förbereda en 20 μL-reaktion som tidigare beskrivits i steg 1.1.1. Använd följande PCR-programparametrar: 94 °C, 2 min; 10 cykler på 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 30 cykler på 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 68 °C, 4 min (med framprimer 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
    CCCCTTTTTAGG-3' och omvänd primer 5'-GGGGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGG
    TCGTCTTTTGA-3').
    OBS: På grund av de långa DNA-mallarna i det här steget, se till att ett lämpligt PCR-system används för korrekt PCR-förstärkning.
  4. Klona dβh PCR-produkten i pDONRP4-P1R gateway donator vektorn genom BP recombinase reaktion6,13 (PCR fragment + Donator vektor = entry klon).
    1. Blanda 1 μL renad dβh PCR-produkt (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) pDONRP4-P1R donatorvektor och 6 μL TE-buffert (pH 8.0) med 2 μL BP enzymblandning i totalt 10 μL reaktion, inkubera för 1 h vid 25 °C.
    2. Omvandla till TOP10 kompetent E. coli enligt tillverkarens protokoll. Isolera plasmiden enligt beskrivningen i steg 1.2.2-1.2.4 och verifiera plasmid genom sekvensering med M13-F (5'-GTAAACGACGGCCAG-3') och M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') primers.
  5. Generera uttryckskonstruktionen dβh:LMO1 .
    1. Kombinera 1 μL av varje ingångsklon (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 och p3E-polyA11) (20 fmole vardera), 1 μL (60 ng/μL) modifierad destinationsvektor med I-SceI-igenkänningsplatser och 4 μL TE-buffert (pH 8.0) som innehåller 2 μL av LR-rekombinasenzymblandningen. Inkubera denna blandning i 1 h vid 25 °C.
    2. När du följer tillverkarens protokoll omvandlar du bakterier till kemiskt kompetenta TOP10 E. coli. Isolera plasmid enligt beskrivningen i steg 1.2.2-1.2.4 och verifiera plasmid genom sekvensering med DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTGTG-3') och LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3') primers.
  6. Generera dβh:mCherry DNA-konstruktion med ett gatewaysystem genom att kombinera inmatningskloner av en 5,2 kb dβh-promotor, pME-mCherry och p3E-polyA i den modifierade destinationsvektorn som innehåller I-SceI-igenkänningsplatser som tidigare nämnts i steg 1.5.16. Isolera plasmid enligt beskrivningen i steg 1.2.2-1.2.4 och verifiera plasmid genom sekvensering med DBH Forward primer (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTGTG-3').
  7. Linearisera dβh:LMO1 DNA-konstruktion och dβh:mCherry DNA-konstruktion (med ett 3:1-förhållande) i totalt 15 μL reaktionsvolym med 1 μL I-SceI-enzym (5 U/μL) respektive 0,75 μL buffert (10x) och inkubera vid rumstemperatur i minst 4 timmar eller över natten. Se till att DNA-koncentrationen inte överstiger 750 ng i reaktion.
  8. Tillsätt 0,5 μL färskt I-SceI-enzym (5 U/μL) och 0,5 μL 0,5 % fenolrött i 5 μL total DNA-blandning från föregående steg på 1,7. Mikroinjektion den totala lösningen (på 50-80 pg linjäriserat DNA) i encellssteg av vilda AB-embryon (och så många som 500 embryon) med en diameter på glasmikropipettnål som tidigare beskrivits17. Förvara den återstående DNA-blandningen vid -20 °C för framtida injektioner.

2. Screena och verifiera LMO1 transgen fisklinje för överföring av könsceller av LMO1 och mCherry

  1. Vid 3-4 dagar-efter-befruktning (dpf), bedöva injicerade embryon med 0,02% trikain och screena dem för fluorescerande mCherry uttryck, som presenterar var som helst i hela fiskkroppen på grund av mosaiktransgenes. Överför mCherry-positiva embryon till en Petri-maträtt med färskt äggvatten och höj embryon till sexuell mognad i enlighet med zebrafiskboken21.
    OBS: Förvänta dig att förhållandet mellan positiv fisk varierar beroende på forskningspersonalens expertis och erfarenhet. Till exempel kan nybörjare ha en låg integrationsgrad på 10%, jämfört med en experts på ≥50%.
  2. För att bestämma grundarfisken med dβh:LMO1 och dβh:mCherrytransgener integrerade i könsceller, överträffar ett par injicerad mCherry-positiv F0 sexuellt mogen fisk från föregående steg (2.1) med WT AB fisk. Screena F1-generationen för mCherry-positiva embryon vid 3-4 dpf.
  3. För att bekräfta att den mCherry-positiva fisken bär LMO1-transgen , isolera gDNA från F1 mCherry-positivt enda embryo med hjälp av gDNA-extraktionsbufferten, som innehåller: 12,5 μL 4x lysbuffert (500 μL 1 M Tris med pH på 8,4, 2,5 ml 1 M kaliumklorid och 47 ml renat vatten), 4, 2,5 ml 1 M kaliumklorid och 47 ml renat vatten, 3 och 2,5 μL proteinas K vid 10 mg/ml. Inkubera provet i 16 timmar vid 55 °C, följt av 10 min vid 98 °C.
  4. Använd det extraherade gDNA (2 μL) som mall för genotypning PCR med primers: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' och LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3', och följande PCR-program: 1 cykel av 94 °C, 10 min; 35 cykler av (94 °C för 30 s, 60 °C för 30 s; 68 °C, 30 s), och 68 °C i 7 min. Bekräfta det förstärkta 182 bp-fragmentet genom sekvensering.
  5. Efter bekräftelse av genotypen, höja de återstående mCherry-positiva F1 embryona till mognad i enlighet med standardriktlinjerna i zebrafiskboken21. Fin klipp och genotyp dem vid 2-3 månaders ålder med steg 2.3-2.4 från protokollet ovan för att ytterligare bekräfta integrationen av LMO1 transgene i fisken.
    OBS: Den LMO1-positiva F1-fisken kommer att vara den stabila transgena fisken [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (betecknad som LMO1-linjen ).
  6. Odla F1 LMO1 stabil transgen fisk med WT-fisk och upprepa efter behov för att föröka denna linje.

3. Outcross av LMO1 och MYCN transgena linjer för att skapa metastaserad modell

  1. När LMO1 transgen zebrafisklinjen har genererats, interbreed med MYCN linje6,17 för att utveckla heterozygous transgen fisk linje överuttrycker både MYCN och LMO1.
  2. Vid 1 dpf, sortera avkomman av outcross för EGFP uttryck med stereoskopiska fluorescens mikroskop, som presenterar som EGFP-positiva punkter i hindbrain regionen.
    OBS: Alternativt, om inte alla embryon sorteras för MYCN vid 1 dpf, höj embryona till vuxen ålder och genotyp genom finklippning och användning av tidigare angivna riktlinjer från steg 2.3-2.4 för gDNA isolering och PCR genotyping, med primers: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', och följande program med standard Taq polymeras: 1 cykel av 94 °C för 3 min, 35 cykler av (94 °C för 30 s, 60 °C för 30 och 68 °C för 3 min) och 68 °C för 7 min med förväntad ampliconstorlek på 14 punkter.
  3. Efter sortering för EGFP vid 1 dpf, isolera screenade embryon i separata Petri-rätter och märka rätter som: MYCN+ (EGFP-positiv) eller MYCN- (EGFP-negativ).
  4. Vid 3-4 dpf, visualisera och sortera embryon från båda grupperna (steg 3.3) för LMO1 uttryck med ett stereoskopiskt fluorescensmikroskop. Leta efter röda fluorescerande protein uttryck som fläckar i både överlägsen livmoderhalscancer ganglion och icke-PSNS dopaminerga neuronala celler i huvud regionen, särskilt i avlångata medulla av hindbrain6,13.
    OBS: Skärm för mCherry/LMO1 innan embryon når 5 dpf, eftersom luftfyllda simblåsor utvecklas fullt ut då och kommer att få embryona att flyta, vilket resulterar i svår mikroskopisk fokusering av PSNS-cellerna under sorteringsprocessen.
  5. När sorteringen är klar isolerar du sorterad fisk i fyra grupper av olika genotyper och märker enligt nedan. Höj den sorterade fisken under identiska förhållanden enligt standardprotokollen från zebrafiskboken21.
    1. ENDAST MYCN (EGFP-positiv),
    2. Endast LMO1 (mCherry-positiv),
    3. MYCN; LMO1 (EGFP och mCherry dubbelt positiva),
    4. WT (EGFP och mCherry dubbelnegativ).

4. Visualisera tumörbördan i transgena zebrafisklinjer

  1. Vid 4 veckor-efter-befruktning (wpf), bedöva sorterad fisk från steg 3,5 med 0,02% trikain i en petriskål.
  2. Visualisera tumörer med ett stereoskopiskt fluorescensmikroskop genom att försiktigt vända fisk med en metallspatel på båda sidor för att se tumör. Förvänta dig tumörer att presentera som enda EGFP-, single mCherry-, eller dubbla EGFP-och-mCherry-positiva massor som uppstår från interrenal körtel regionen (nära huvud och njure).
    OBS: Det är möjligt att den första tumör debuten vanligtvis presenteras med en ljusare och större fluorescens positiv massa på ena sidan av interrenal körtel, varför det är viktigt att visualisera båda sidor av fisk för att undvika saknas tidiga tumör debut.
  3. Efter identifiering av möjliga tumörbärande fisk, isolera fisk i en separat tank med lämpliga etiketter, som inkluderar födelsedatum, datum då tumör screenas och genotyp.
  4. Vid 6 wpf, upprepa tidigare steg 4.1-4.3 för att screena tumörbärande fisk och icke-tumörbärande fisk igen för att bekräfta förekomsten av tumörer för tidigare screenade tumörbärande fisk eller identifiera nya möjliga tumörbärande fisk, respektive. Leta efter ihållande eller ökad storlek av fluorescenspositiv massa i bekräftad tumörbärande fisk.
  5. Efter att ha identifierat tumörbärande fisk, övervaka dem varannan vecka för bevis på tumör cell migration, som presenterar som små EGFP- och/eller mCherry-positiva tumör massor långt från den primära platsen för tumorgenesis (interrenal körtel regionen). Isolera dessa fiskar i separata tankar efter behov och märk på lämpligt sätt för att indikera eventuell metastasering.
  6. För att ytterligare bekräfta metastaseringen, fortsätt att spåra dessa fiskar regelbundet (varannan vecka) tills de avlägsna fluorescenspositiva tumörmassorna visar tydligt ökad storlek, vilket indikerar tillväxt av tumörer i de ögonbevarande platserna.

5. Vävnadsbearbetning och paraffinsektion av tumörbärande fisk

OBS: Utför detta steg för att karakterisera spontant utvecklade primära och/eller ögonbevarande tumörer i MYCN och MYCN; LMO1 transgen fisk.

  1. Efter identifiering och verifiering av tumörbärande fisk, offra fisk från steg 4.6 i en Petri-maträtt genom att sänka fisken i 0,02% trikain för att först bedöva och sedan öka trikaindosen tills fisken inte längre aspirerar. Skär fisken i två bitar - med en bit som innehåller huvudet och en del av kroppens mittsektion (inklusive tumör) och en annan bit med resten av fiskens mittsektion och svans.
  2. Fixera båda fisksektionerna med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 1 h vid rumstemperatur på en vipp. För att förbättra fixeringseffektiviteten, ersätt bufferten med färsk 4% PFA för att öka penetrance till de inre organen effektivt och snabbt. Lämna fisk med färsk fästbuffert på en vipp vid 4 °C över natten eller i 48 timmar.
    VARNING: PFA är giftigt. Eftersom försiktighetsförfaranden och korrekt bortskaffande av reagens beror på din institutions föreskrifter, sök lämpliga riktlinjer innan du använder och bortskaffar reagens.
  3. Före bearbetningen, placera prover i 100% snabb avkalkningslösning i 15-20 min vid rumstemperatur. Se till att använda en icke-metal behållare och kontrollera prover under inkubationen för att förhindra överkalkning. Om provvävnaden ser kraftigt försämrad ut, placera provet i vatten eller vid 4 °C för att bromsa avkalkningsprocessen.
  4. När fiskproverna har varit fasta och avkalkade ska de tvättas med rinnande kranvatten i 1 timme och placera det i processorkassetter. Om det finns mer än ett prov, separera var och en i sin egen kassett.
  5. Dehydrera och förbered vävnaden för paraffininbäddning genom att placera kassetter med fisk i vävnadsprocessorn där provet(erna) är nedsänkta i olika lösningar, enligt följande: 70% etanol (60 min, 40 °C), 85% etanol (50 min, 40 °C), 95% etanol (40 min, 40 °C) två gånger, 100% etanol (30 min, 40% etanol (40% 40 °C) två gånger, xylen (30 min, 40 °C), en annan färsk lösning av xylen (50 min, 40 °C), en annan färsk xylen (50 min, 45 °C), paraffin (30 min, 45 °C), paraffin (20 min, 58 °C) tre gånger.
  6. När vävnaden har bearbetats, lossa kassetterna från processormaskinen samtidigt som du upprätthåller organisationen av varje kassett och ser till att förhindra att fiskproverna blandas.
  7. Välj lämplig form baserat på fiskens storlek, se till att formen passar hela kassetten med fiskprovet. Täck botten av formen med flytande paraffin vid 60 °C.
  8. Placera omedelbart kassetten med fisken ovanpå mögel (se till att fisken läggs på sin platta sidosida för sagitalsektioner) med flytande paraffin och avsluta fyllningen med paraffin till toppen av formen för att helt bädda in fisken.
  9. Placera den färdiga formen på den kalla plattan på sektionsmikrotomen tills paraffinet härdas.
  10. När paraffinblocket är hårt, vilket kan bedömas genom att visuellt observera högre opacitet och en fast beröring till blocket, ta försiktigt bort blocket från formen. Skrapa försiktigt bort överflödigt paraffin från kassettens sidor.
  11. Dela upp det paraffininbäddade fiskblocket sagittally vid 4 mikron på mikrotomen och flyta sektionerna på ett varmt vattenbad vid 40 °C som innehåller destillerat vatten.
  12. Överför försiktigt sektionerna till positivt laddade diabilder och grädda i ugnen vid 60 °C i 30 minuter innan du fortsätter till antingen steg 6, 7 eller 8.

6. Hematoxylin och eosin (H&E) färgning av paraffinsektioner för patologigranskning

  1. Placera bilder som innehåller paraffinsektioner från steg 5.12 i en bildhållare. Inuti en kemisk rökhuv, deparaffinisera med xylen 3 gånger, 5 min vardera. Kassera lösningen efter varje användning.
  2. Rehydrera sektioner med 100% etanol i 3 min och upprepa två gånger med färsk 100% etanol. Ersätt 100% etanol med 95% etanol i 3 min och sedan 80% etanol i 3 min.
  3. Skölj sektionerna med destillerat vatten i 5 min. Medan sektionerna tvättas i vatten, se till att ta bort oxiderade partiklar från hematoxylin genom att antingen filtrera eller skumma ytan av hematoxylin med en luddfri våtservett.
  4. Blot överskottsvattnet från glidhållaren med luddfria våtservetter och fläckrutschbanor i 50% hematoxilin (1:1 utspädning med destillerat vatten) i 2-5 min beroende på önskad färgningspreferens och reagensförsämring. Kassera hematoxylin när lösningsfärgen ändras från plommon till blå/brun eller när färgningstiden blir överdriven. Skölj rutschkanorna med rinnande kranvatten i 20 min.
  5. Avfärga sektionerna i 1% sur etanol (3,3 ml saltsyra med 50 ml 70% etanol) genom att snabbt doppa bilderna flera gånger. Diabilder kan doppas upp till 3 s, men ju längre bilderna doppas, desto ljusare blir sektionerna.
  6. Skölj rutschkanorna i kranvatten två gånger i 1 min vardera och en gång med avjoniserat vatten. Som ett alternativ kan bilder lämnas över natten i detta skede och blötläggas i vatten.
  7. Sänk ner sektionerna i 1,36% litiumkarbonatlösning (47 g litiumkarbonat, 3500 ml vatten) för 3 s. Se till att inte överinkubera sektionerna eftersom ju längre tid i litiumkarbonatlösning, desto mer sannolikt kommer vävnaden att flyta.
  8. Skölj sektionerna i kranvatten i 5 minuter och fläcka överflödigt vatten från skjuthållaren med luddfria professionella våtservetter.
  9. Mothåll rutschkanorna i 100% färdig eosin i 15-30 s och torka omedelbart med 95% etanol två gånger i 5 min vardera. Ersätt med 100% etanol två gånger i 5 min vardera och kassera lösningarna efter varje användning.
  10. Rensa sektionerna i xylen i 15 minuter och upprepa två gånger i totalt 3 gånger. Alternativt kan bilderna lämnas i xylen över natten vid rumstemperatur för att bättre rensa överflödigt vatten.
  11. Låt rutschkanorna lufttorka i den kemiska rökhuven och montera sedan en täcksvittnad med monteringsmedium för att täta vävnadsprov.
  12. Visualisera och avbilda de färgade vävnadssektionerna under mikroskopi. Undersök noggrant tumörerna på den primära platsen (den interrenala körtelregionen i huvudet njure) och de avlägsna sporadiska metastaserna i andra vävnader och organ i fisken. Skicka ut färgade bilder för vävnadssektioner som ska granskas av patologer. Baserat på fiskmodellens liknande patologiska egenskaper som mänskliga neuroblastom, förvänta dig tumörerna som uppstod i MYCN-only eller MYCN; LMO1 fisk ska först diagnostiseras som neuroblastom av patologer.

7. Immunohistokemisk analys (IHC) med antikroppar mot NB-markör och överuttryckta transgener för att ytterligare bekräfta spridningen av tumör och deras sympatiska härstamningsegenskap

  1. Färgning med helautomatiskt färgningssystem
    1. Om du vill jämföra IHC-resultatet bättre med H&E-färgning väljer du intilliggande bilder från steg 5.12 för IHC-färgning.
      OBS: Även om ett automatiserat färgningssystem möjliggör snabbare och mindre mödosamma resultat, kan ett manuellt protokoll för IHC-färgning användas i avsaknad av sådant genom att hänvisa till stegen i underavsnitt 7.2.
    2. Späd ut den primära antikroppen mot tyrosinhydroxilas (TH) (1:500), en neuroblastommarkör, baserat på önskad koncentration och total mängd som behövs med det automatiserade systemets motsvarande primära antikroppsdluent.
      OBS: Optimala antikroppskoncentrationer kan variera beroende på antikropp och vävnad.
    3. Eftersom det automatiserade systemet använder värmeinducerad antigenhämtning ombord med epitopehämtningslösning i 20 min och systemets motsvarande detektionsreagens, se till att parametrarna för maskinen är inställda som: Peroxidasblockering, 5 min; Primär antikropp med önskad koncentration, 15 min; biotinylerad antikanin IgG sekundär antikropp (1:500), 8 min; Streptavidin HRP, 8 min; blandat DAB intensivt substrat, 5 min; och Hematoxylin, 5 min.
    4. När inställningarna är inställda placerar du antikroppsfacket i maskinen. Ställ in bilderna genom att skapa ett nytt ärende som kommer att märka bilderna. Maskinen är nu laddad och klar att köras (dewaxing, färgning och mottaining).
    5. När bilderna är dewaxed, färgade och counterstained med hjälp av den automatiserade maskinen, dehydrera bilderna i etanol gradienter på 70%, 95% och 100% för 5 min vardera. Sänk ner rutschkanorna av sektioner i 100% färsk etanol igen i 5 min.
    6. Rensa sektionerna i xylen i 5 minuter, två gånger eller lämna rutschkanorna i xylen över natten för att bättre rensa överflödigt vatten.
    7. Låt rutschkanorna lufttorka i den kemiska rökhuven och montera sedan en täcksvittnad med hjälp av ett monteringsmedium. Visualisera och avbilda de färgade vävnadssektionerna med mikroskopi.
    8. För att bekräfta metastasering i fiskmodellen, jämför bilderna färgade med antikroppar mot neuroblastommarkör från steg 7 till de som färgas av H&E från steg 6.
      OBS: Förvänta dig att se positiva färgning för neuroblastom markör, TH, i alla tumör celler identifieras av H&E färgning. Förvänta dig också ingen positiv färgning för TH i angränsande vävnader där de ögonbevarande tumörerna identifierades i LMO1; MYCN fisk. Se till att välja kontroll WT och MYCN-endast fisk som är i liknande ålder som MYCN; LMO1 fisk för denna analys att utesluta möjligheten att de ögonbevarande tumörer är multifokal primära tumörer.
  2. Manuell färgning utan automatiserat IHC-färgningssystem
    1. När bilderna har bakats väljer du intilliggande bilder från steg 5.12 för att möjliggöra bättre jämförelse mellan H&E- och IHC-färgning för att deparaffinisera. Inuti en kemisk rökhuv, dewax och rehydrera rutschkanorna med xylen med hjälp av tidigare steg 6.1 respektive 6.2.
    2. Efter deparaffinering och rehydrering, blötlägg glidningar i endogen peroxidblockeringslösning (1x PBS innehållande 0,1% natriumazid och 0,3% väteperoxid) i 5 min vid rumstemperatur. Tvätta rutschkanorna i färsk 1x PBS i 3 min och upprepa två gånger i totalt 3 gånger.
      VARNING: Natriumazid är akut giftigt. Se till att du tillämpar försiktighetsrutiner och korrekt bortskaffande av reagens beroende på din institutions föreskrifter.
    3. Hämta antigen genom att inkubera diabilder i lösning med proteinas K (1:500 i 1x PBS) i 10 min vid rumstemperatur. Tvätta rutschkanorna 3 gånger med 1x PBS i 3 min vardera.
    4. Blockera diabilder genom att inkubera med 5% getserum i 1x PBS i 30 min vid rumstemperatur på rocker. Tvätta rutschkanorna med färsk 1x PBS två gånger i 3 min vardera.
    5. Tillsätt 4 droppar Avidin-blockeringslösning direkt på glid och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur. Efter att ha tvättat diabilder med färsk 1x PBS två gånger i 3 min vardera, tillsätt 4 droppar Biotin-blockeringslösning och inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
    6. Efter blockering av diabilder, inkubera i primär antikropp av tyrosinhydroxilas (TH) (1:500) i 45-60 min vid rumstemperatur, eller över natten vid 4 °C.
      OBS: Fläck med ytterligare antikroppar mot transgener och andra relevanta markörer för att ta itu med fysiologi och aktivitet av primära tumör och andra ögonbevarande platser. Optimala antikroppskoncentrationer kan variera beroende på antikropp och vävnad.
    7. Tvätta rutschkanorna med färsk 1x PBS i 3 minuter och upprepa två gånger med totalt 3 gånger.
    8. Inkubera diabilder i sekundär antikropp av biotinylerad antikanin IgG sekundär antikropp (1:500) utspädd i blockerande lösning i 45-60 min vid rumstemperatur. Upprepa föregående tvättsteg 7.2.7.
    9. Tillsätt HRP konjugerad Avidin (1:300 i 1x PBS) och inkubera i 20 min vid rumstemperatur. Tvätta rutschkanorna 3 gånger med färsk 1x PBS i 5 min vardera.
    10. Förbered 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) lösning (2,5 ml destillerat vatten, 1 droppe kitbuffert, 1 droppe väteperoxid och 2 droppar DAB från kit) och placera droppar DAB direkt på diabilder nära ett mikroskop. Observera färgförändringsreaktionen på bilderna under mikroskop efter att du har lagt till DAB. När önskad färgningsintensitet har uppnåtts, stoppa reaktionen genom att placera glidsektioner i kalldestillerat vatten.
    11. Mottain rutschkanorna med färsk 50% hematoxylin genom att sänka eller doppa prover i några korta sekunder och placera tillbaka i destillerat vatten. Upprepa efter önskemål, men normalt bör en gång räcka eftersom vävnadssektionerna är tunna.
    12. Dehydrera vävnadsprover på diabilder i alkoholgradient som tidigare beskrivits i steg 7.1.5 och fortsätt genom de återstående stegen (med det sista steget som 7.1.8) för att slutföra IHC-analysen.

8. Picrosirius röd färgning av paraffinrutschbanor för kollagenansamling i tumörer som mekanismstudie

  1. Upprepa steg 6.1-6.3 för att dewax, hydrera och tvätta paraffinsektioner på diabilder.
  2. Efter att ha blottat överflödigt vatten från glidhållaren med professionella luddfria våtservetter, fläcka i 50% hematoxylin i 10 min. Skölj rutschkanorna med rinnande kranvatten i 10 min.
  3. Överför bilderna till Picrosirius Red och inkubera vid rumstemperatur i 1 h.
  4. Tvätta rutschkanorna i surgjort vatten (5 ml ättiksyra i 1 L kran eller destillerat vatten) två gånger och inkubera i 5 minuter på shaker.
  5. Dekantera det mesta av vattnet från rutschkanorna först innan du fysiskt skakar och blottar sektioner på diabilder för att ta bort så mycket vatten som möjligt.
  6. Placera snabbt glidningar i tre förändringar av 100% etanol för att dehydrera paraffinsektioner.
  7. Upprepa steg 6.10 och 6.11 för att rensa bilder i xylen och montera prov. Därefter bild med sammansatt mikroskop som är utrustad med en kamera.
  8. Använd ImageJ, räkna picrosirius rödpositiva kollagenfibrer i minst tre slumpmässiga fält för varje avsnitt. Jämför mellan bilder av MYCN och MYCN; LMO1 fisksektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att avgöra om LMO1 synergiserar med MYCN för att påverka NB-patogenes, injicerades transgena konstruktioner som driver uttryck för antingen LMO1 (dβh:LMO1 och dβh:mCherry) eller MYCN (dβh:EGFP-MYCN) i PSNS-cellerna under kontroll av dβhpromotorn i zebrafiskembryon13. Som illustreras i figur 1A, efter utvecklingen av stabila transgena linjer och validering av deras genotyper, var heterozygous MYCN och LMO1 fisk interbred. Deras avkommor sorterades för MYCN (EGFP+) eller LMO1 (mCherry+) uttryck vid 1 dpf respektive 3-4 dpf. MYCN överuttryck har visat sig undertrycka PSNS utveckling6. Egfp-MYCN-uttrycket är således mer framträdande i de icke-PSNS dopaminerga neuronala cellerna vid 1 dpf6, såsom hjärnskålen ganglier (CA), ärkeassocierade katekolonergiska nervceller (AAC) och medulla oblongata (MO). På grund av instabiliteten i EGFP-MYCN-proteinet blir EGFP-signalen dimmer efter 2 dagar. Däremot är mCherry-uttrycket framträdande i både PSNS-celler, såsom överlägsen livmoderhalscancer ganglion och icke-PSNS dopaminerga neuronala celler, som inkluderar CA, AAC och MO, från 3 dpf och framåt6. Därför sorteras avkomman från MYCN och LMO1 parning vid 1 dpf för MYCN (EGFP +) och vid 3 dpf för LMO1 (mCherry+). Den sorterade fisken delades upp i olika genotypiska grupper enligt följande: i) MYCN, ii) LMO1, iii) MYCN; LMO1 och iv) WT, och uppvuxen under identiska förhållanden. Från och med 4 wpf, avkomman screenades varannan vecka för bevis på tumörer genom fluorescerande mikroskopi. Fluorescerande positiva tumör massorna upptäcktes i vävnader och organ långt från den primära tumör platsen i den sammansatta transgena fisken med överuttryck av både MYCN och LMO1, men inte i den transgena fisken med uttryck av MYCN ensam (figur 1B).

För att ytterligare verifiera metastaseringen hos dessa transgena djur, tumörbärande MYCN och MYCN; LMO1 transgen fisk vid 5 till 9 månaders ålder utsattes för paraffin avsnitt och immunohistochemical analyser med en antikropp mot neuroblastom markör, TH. De representativa resultaten för ett MYCN; LMO1-fisken presenteras i figur 2. H&E färgning av sagittal avsnitten visade att den primära tumör uppstod från interrenal körtel regionen, zebrafisk motsvarigheten till den mänskliga binjuren, som är den vanligaste platsen för primära sjukdomen hos neuroblastom patient12,22 (siffror 2A,B). Tumören bestod av små, odifferentierade och runda cancerceller med hyperkromatiska atomkärnor och bildade ofta lager som var histologiskt lika de mänskliga neuroblastomerna som beskrivits tidigare6 (figur 2A,B). I överensstämmelse med observationen av fluorescerande mikroskopi (figur 1B) upptäcktes utbredda tumörmassor som ligger långt från interrealkörteln i flera regioner, inklusive: distala delar av njuren (den primära hematopoetiska nischen hos zebrafisk och jämförbar med däggdjursbenets benmärg23) (figur 2A,C), omloppsbana (figur 2A,D), gill (analog med däggdjurslungan24) (figur 2A, E), mjälte (analog med däggdjurslymfknutor25) (figur 2A och 2F) och innerväggen i förmakskammaren i hjärtat (figur 2G). Många av dessa metastaser rekapitulerar de gemensamma platserna för metastaser som ses hos patienter med högriskneuroblastom, som inkluderar benmärgen, lymfkörteln, omloppsregionen och lungan13,23,24,25. Ytterligare immunohistochemistry med antikroppen mot TH bekräftade PSNS neuroblast härstamning av tumörceller vid den primära tumören och alla ögonbevarande platser (figurerna 2H-M).

I ett försök att bättre förstå mekanismerna bakom synergin mellan MYCN och LMO1 i accelererande tumör ögonbevarande spridning, upptäcktes det att uttrycksnivåerna för en panel av gener som är involverade i tumör cell till extracellulär matris interaktion var betydligt förhöjda i fisk tumörer med överuttryck av både MYCN och LMO113. För att undersöka om den extracellulära matrisen verkligen påverkades av det förändrade genuttrycket i LMO1-överuttryckande tumörer som leder till förbättrad tumör spridning eller migration, paraffin avsnitten från MYCN-only och MYCN. LMO1 tumörer var färgade med Picrosirius röd (PSR), en mycket selektiv fläck för kollagen fibrer, att bedöma kollagen nedfall och extracellulär matris (ECM) styvhet26,27. Som visas i figur 3A-E fanns det signifikant förstärkta mängder och ökad tjocklek av PSR-färgade kollagenfibrer som finns i MYCN. LMO1 tumörer, jämfört med tumörer uttrycker bara MYCN ensam. Tillsammans visar dessa resultat att överuttryck av LMO1 kan omforma tumör ECM för att öka dess styvhet, och därmed underlätta tumör cell spridning.

Figure 1
Figur 1: Illustration av tumörscreeningsanalysen på avkommor från uppfödningen av MYCN - och LMO1-transgena zebrafisklinjer. (A) Schematisk illustration av sortering och tumör screening av MYCN och/eller LMO1-överuttryck stabil transgen fisk för neuroblastom studie. Övre paneler: Representativa bilder av EGFP-MYCN+ embryon vid 1 dags eftergödsel (dpf) (dorsala vy till vänster och lateral vy till höger). Nedre paneler: Representativa bilder av mCherry-LMO1+ embryon vid 3 dpf (sidovy till vänster och ventral vy till höger). AAC, ärkeassocierade kateominergiska nervceller; CA, kraniala ganglier; och MO, medulla oblongata. Skalstång, 100 μm. Skapad med BioRender.com (B) Coexpression av LMO1 och MYCN främjar neuroblastommetastasering. Vänster: Transgenic fisk överuttrycka MYCN ensam (MYCN) med EGFP-uttrycka tumör (vit pil) vid 36 månaders ålder. Höger: Transgen fisk som överuttrycker både MYCN och LMO1 (MYCN; LMO1) med en mCherry-positiv tumör massa på den primära platsen (IRG, vit pil) och flera ögonbevarande platser (solida pilspetsar) vid 36 månaders ålder. Skalstreck, 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Samuttryck av MYCN och LMO1 främjar avlägsna metastaser av neuroblastom i transgen zebrafisk modell. (A-G) H&E-färgade sagittal delar av MYCN; LMO1 transgen fisk vid 6 månaders ålder. (H-M) Förstorade vyer av immunohistochemical analyser av MYCN; LMO1 transgen fisk i sagittal vävnad sektioner, med hjälp av tyrosin hydroxylas (TH) antikroppar. Vit låda beskriver den interrenala körteln (b, h), med förstorade vyer i panelerna B och H. Spridda tumörceller hittades i njurmärg (c, i, C och jag med solida svarta pilspetsar), ögonsclera (d, j, D och J med svart skisserade och vita fyllda öppna pilar), gillet (e, k, E och K med svarta skisserade och vita fyllda öppna pilspetsar), mjälten (f, l, F och L med solida svarta pilar), och hjärtkammaren (G och M med svart skisserad och vit fylld dubbel pilspetsar). Skalstänger, 100 μm (A) och 50 μm (B-M). Denna siffra har modifierats från Zhu, S. et al. LMO1 Synergizes med MYCN för att främja neuroblastominitiering och metastasering. Cancercellen. 32, 310-323 (2017)13. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Ökat LMO1-uttryck främjar kollagendeposition och ECM-styvhet som leder till underlättad tumörcellsspridning i zebrafiskmodeller. (A-D) Representativa ljusmikroskopibilder av kollagenfibrer färgade av Picrosirius röd (PSR) endast i MYCN (A, B) eller MYCN; LMO1 (C,D) transgen zebrafisk. (B) och D förstoras från de boxade områdena (A) och C, med hjälp av pilar (A och B) och pilspetsar (C och D) för att ange de PSR-positiva kollagenfibrerna. Skalstänger, 100 μm (A och C) och 50 μm (B och D). E) Kvantifiering av PSR-färgade områden endast på tumördelar av MYCN eller MYCN. LMO1 transgen fisk. Resultaten normaliserades till medelvärdet av PSR-färgade områden i MYCN-endast tumörer. Statistiken presenterar som medelvärdet ± SD på tre MYCN-endast eller tre MYCN; LMO1 tumörer; p = 0,02 genom tvåsidig t-test. Denna siffra har modifierats från Zhu, S. et al. LMO1 Synergizes med MYCN för att främja neuroblastominitiering och metastasering. Cancercellen. 32, 310-323 (2017)13. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zebrafisk har använts ofta i forskning under de senaste decennierna, särskilt inom cancerforskning, av uppenbara skäl, såsom dess enkla underhåll, robust reproduktion och tydliga fördelar för in vivo imaging1,28. Zebrafiskmodellen kan lätt manipuleras embryonalt på grund av deras externa befruktning och utveckling, som kompletterar väl till däggdjursmodellorganismer, såsom råttor och möss, för storskaliga genetiska studier1,2,3. Dessutom har zebrafiskgenomet högnivå likheter med det mänskliga genomet. Genom att jämföra de detaljerade anteckningarna av zebrafiskgenomet med det mänskliga referensgenomet har cirka 70% av mänskliga gener visat sig erhålla en zebrafisk ortolog29. Dessutom har andra användningsområden för zebrafisk i forskning utvidgats till läkemedelsupptäckt och patientavatarer för individualiserad cancerbehandling30,31. Ackumulerande studier har visat att tumörer inducerad i zebrafisk liknar mänskliga tumörer på histologiska och molekylära nivåer, vilket kan bidra till dissekering av tumörinitiering, progression och heterogenitet32,33. Tillsammans visar zebrafisken en enorm potential som en värdefull djurmodell som kan användas för att studera metastasering och belysa eventuella onkogena vägar involverade i sjukdomspatogenes.

Med hjälp av den transgena zebrafisk modellen med överuttryck av både LMO1 och MYCN, samarbetet mellan dessa två oncogenes i NB tumorigenesis och metastasering har tydligt visats. Med dagens tillgång till kraftfulla live imaging tekniker, tumör skärmar kan enkelt utföras varannan vecka och metastasering kan spåras över tid. Den utbredda metastaseringen kan också bekräftas ytterligare genom paraffinsektion och antikroppsfärgning. Slående, metastaser upptäckta i MYCN; LMO1 zebrafisk korrelerar väl med de gemensamma platserna för metastasering som ses i högriskfall, såsom i benmärgen, lymfkörtlarna, omloppsbanan och lung34,35, vilket ytterligare stöder zebrafisk som en genomförbar och fördelaktig modell för metastaseringsstudie.

Dessutom, på grund av relativt liten kroppsstorlek, kan hela zebrafisken delas upp helt, vilket är ännu en tydlig fördel med denna modell, vilket möjliggör noggrann karakterisering av den primära tumören tillsammans med metastaserna i andra delar av kroppen. Picrosirius röda färgning av tumör avsnitt har tydligt belyst kollagen nätverk i fisk tumörer och visar ökad styvhet av extracellulär matris i tumörer med LMO1 överuttryck. Även om denna teknik inte är unik för zebrafisk, dess tillämpning tillsammans med hög-genomströmning förening screening på zebrafisk embryon som är genetiskt modifierade eller transplanteras med tumörceller kan ge ett nytt sätt att screening för effektiva föreningar som kan rikta extracellulär matris ombyggnad, som är en kritisk process som är involverad i tumör cell metastasering.

Stabila transgena zebrafiskmodeller är till stor hjälp för oss att förstå bidraget från kandidat onkogener till tumörutveckling in vivo, även om det kan vara utmanande och mödosamt att utveckla dessa linjer. Att skapa en stabil transgen linje kräver en lång tid eftersom flera generationer måste förvärvas före linjeutbredning. Dessutom kan det vara tråkigt att sprida dessa linjer, och strategiska parningsplaner kan behövas. Till exempel reduceras produktiviteten hos en MYCN-transgen fisk ofta markant när tumören har utvecklats, och homozygous MYCN transgen fisk överlever inte långt in i vuxen ålder. För att bättre upprätthålla MYCN transgena fisklinjen rekommenderas därför att överträffa heterozygous icke-tumörbärande MYCN transgen fisk i en yngre ålder med WT eller andra genetiskt konstruerade fisklinjer, såsom LMO1 transgen fisk linje. För att övervinna utmaningarna i att utveckla och upprätthålla stabila transgena fisklinjer, mosaik transient transgenesis kan vara ett alternativt tillvägagångssätt för att snabbt och effektivt bedöma bidraget av en enda gen eller kombination av gener till tumör initiering och progression i främst injicerad fisk. Dessutom kan mosaik mönstret av transgene integration i den primära injicerade fisken bättre efterlikna sjukdomen patogenes, särskilt de som framkallas av somatiska händelser36.

Men som alla andra djurmodeller som används i forskning för att studera cancer har zebrafisken också sina nackdelar. Till exempel är antikroppar specifikt mot zebrafiskproteiner fortfarande till stor del underutvecklade, även om flera antikroppar mot neuroblastommarkörgener- såsom tyrosinhydroxilas, synaptofysin och HuC-fungerar lyckligtvis bra i zebrafisk6,13. För att bekämpa denna fråga har många leverantörer börjat testa sina produkter och förutsäga potentialen hos sina antikroppar i korsreagerande med zebrafiskproteiner. Mer information om validerade antikroppar finns också i zebrafiskens informationsnätverk (ZFIN). Med dessa ansträngningar kommer fler och fler antikroppar som specifikt kan upptäcka zebrafiskproteiner snart att bli tillgängliga för zebrafisksamhället. En annan utmaning med att använda zebrafisk som en genetisk modell för att dissekera samspelet mellan komplexa signalvägar i NB-patogenes är dess delvis duplicerade genom. Sådan genomduplicering, som inträffade i zebrafiskens naturliga anor37,38, kan ofta leda till mer än en variant av zebrafisk homologer till människor. Detta kan orsaka en utvecklad vinst av nya genfunktioner eller unika uttrycksmönster i djurmodellen39. Därför, när man studerar gener med potentiella roller i tumör undertryckande, kan det vara nödvändigt för flera alleler av de duplicerade generna att slås ut samtidigt för att visa sin tumör undertryckande funktion, vilket kan vara en potentiellt tidskrävande och en tekniskt utmanande strävan.

Ändå kan den transgena zebrafiskmodellen troget rekapitulera alla stadier av tumör metastasering in vivo, och har tydliga fördelar för genetisk analys och realtid imaging av tumör spridning. Detta modellsystem erbjuder därför ett unikt verktyg för oss att ta itu med många skrämmande frågor inom området, till exempel vilka molekylära och cellulära händelser som ligger till grund för multistep-processen för tumörspridning och metastasering in vivo är, när NB-cellerna sprids från primära tumörer och hur tumörmikromiljön bidrar till NB-metastasering. Med zebrafiskens robusthet för läkemedelsscreening och testning skulle fiskmodellen också utgöra ett värdefullt sätt att utvärdera effekten av nya agenser och hämmare för att förebygga eller behandla metastaserad NB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett bidrag R01 CA240323 (S.Z.) från National Cancer Institute; ett bidrag W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) från Förenta staternas försvarsdepartement (DoD); en V Scholar-utmärkelse från V Foundation for Cancer Research (S.Z.) och ett plattformsbidrag från Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); och stöd från Mayo Clinic Cancer Center och Center for Individualized Medicine (S.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit Vector SK-4100
Acetic Acid Fisher Scientific / Acros Organic 64-19-7
Agarose GP2 Midwest Scientific 009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody Pel-Freez P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit Vector SP-2001
BOND Intense R Detection Leica Biosystems DS9263
BOND primary antibody diluent Leica Biosystems Newcastle, Ltd. AR9352
BOND-MAX IHC instrument Leica Biosystems Newcastle, Ltd. N/A fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone BACPAC resources center (BRFC) N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera Olympus AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) Richard-Allan Scientific 8312-4
Eosin Leica 3801601 ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol Carolina 86-1263
Expand Long Template PCR System Roche Applied Science, IN 11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) Dako E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC HHS-32-1L
HRP Avidin D Vector A-2004
Hydrochloric Acid Aqua Solutions 4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3% Fisher Scientific H324-500
I-SceI enzyme New England Biolabs, MA R0694L
Kanamycin sulfate Teknova, Inc. K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 34133
Lithium Carbonate Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC 554-13-2
Microtome for sectioning Leica Biosystems RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404006
p3E-polyA  Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah N/A a generous gift
(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax Surgipath Paraplast 39603002 Parrafin to parafin
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany N/A a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector Thermo Fisher Scientific 12536-017
pDONRP4-P1R donor vector  Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah N/A a generous gift
Phenol red, 0.5% Sigma Aldrich  P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X BioRad 1610780
Picrosirrius red stain kit Polysciences 24901-250
pME-mCherry Addgene 26028
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Roche 21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit Qiagen 27104
RDO Rapid Decalcifier Apex Enginerring RDO04
Sodium Azide (NaN3) Sigma Aldrich 26628-22-8
Stereo fluorescence microscope Leica MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging Nikon SMZ-1500
Taq DNA Polymerase New England Biolabs, MA M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor Sakura N/A Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S Western Chemical Incorporated 20513
Xylene Thermo Fisher Scientific X3P1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
  2. Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
  3. Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
  4. Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
  5. Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
  6. Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  7. Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), London, England. 2106-2120 (2007).
  8. Park, J. R., et al. Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
  9. Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
  10. Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
  11. Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
  12. Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
  13. Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
  14. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
  15. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  16. Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
  17. Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
  18. Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
  19. Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
  20. Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  22. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  23. Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
  24. Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
  25. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  26. Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
  27. Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
  28. Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
  29. Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  30. Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
  31. Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
  32. Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
  33. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
  34. Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), London, England. 466-470 (2006).
  35. Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
  36. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  37. Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), New York, N.Y. 1711-1714 (1998).
  38. Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
  39. Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).

Tags

Cancerforskning nummer 169
Zebrafisk modell av Neuroblastom metastasering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Her, Z. P., Yeo, K. S., Howe, C.,… More

Her, Z. P., Yeo, K. S., Howe, C., Levee, T., Zhu, S. Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis. J. Vis. Exp. (169), e62416, doi:10.3791/62416 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter