Summary
Disse protokoller indeholder den metode, der anvendes til at vurdere den enzymatiske aktivitet hos individuelle medlemmer af proteinalgininmethylentransferasefamilien (PRMT) i celler. Der er beskrevet detaljerede retningslinjer for vurdering af PRMT-aktivitet ved hjælp af endogene og eksogene biomarkører, methylalginin, der genkender antistoffer, og hæmmerværktøjsforbindelser.
Abstract
Proteinmethyletransferaser (PRMT'er) katalyserer overførslen af en methylgruppe til argininrester af substratproteiner. PRMT-familien består af ni medlemmer, der kan monomethylat eller symmetrisk/asymmetrisk dimethylat argininrester. Flere antistoffer, der genkender forskellige typer argininmethylering af forskellige proteiner, er tilgængelige; således giver værktøjer til udvikling af PRMT aktivitet biomarkør assays. PRMT antistof-baserede assays er udfordrende på grund af overlappende substrater og motiv-baserede antistof specificiteter. Disse spørgsmål og den eksperimentelle opsætning til at undersøge argininmethylen, som de enkelte PRMT'er bidrager med, diskuteres. Gennem omhyggelig udvælgelse af de repræsentative substrater, der er biomarkører for otte ud af ni PRMT'er, blev der designet et panel af PRMT-aktivitetsanalyser. Her rapporteres protokollerne for cellulære analyser, der kvantitativt måler den enzymatiske aktivitet hos individuelle medlemmer af PRMT-familien i celler. Fordelen ved de beskrevne metoder er deres enkle ydeevne i ethvert laboratorium med cellekultur og fluorescerende vestlige blot kapaciteter. Substratspecifikiteten og den valgte antistofpålidelighed blev fuldt valideret med knockdown- og overekspressionsmetoder. Ud over detaljerede retningslinjer for assaybiomarkører og antistoffer gives der også oplysninger om brugen af en hæmmerværktøjsforbindelse til PRMT'er.
Introduction
Argininmethylering er en vigtig postoversættelsesændring, der regulerer proteinprotein- og protein-RNA-interaktioner og dermed spiller en vigtig rolle i forskellige cellulære processer som præ-mRNA-splejsning, DNA-skade, transskriptionsrespons og vækstfaktormedieret transduktion1,2. Arginin er methyleret med protein arginin methyltransferaser (PRMTs), hvilket resulterer i monomethyl arginin (Rme1), asymmetrisk dimethylarginin (Rme2a), eller symmetrisk dimethylarginin (Rme2s)3. Baseret på methyleringstypen klassificeres PRMT'er i tre grupper: Type I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 og 8), som katalyserer mono- og asymmetrisk dimethylering; Type II (PRMT5 og PRMT9), som katalyserer mono- og symmetrisk dimethylering; og type III (PRMT7), som kun kan monomethylat arginin3.
På grund af et stigende antal kommercielt tilgængelige argininmethyle methyleringsspecifikke antistoffer kan PRMT-aktivitet måles ved hjælp af vestlig blotting. Fluorescerende-baserede vestlige blot er den foretrukne teknik over chemiluminescent afsløring på grund af en større dynamikområde og linearitet, højere følsomhed, og giver mulighed for multiplexing4. For at kvantificere proteinmethylenniveauerne kræves normalisering af methyleringssignalet til det samlede proteinniveau. Ved at vælge antistofferne for totalt og methyleret protein, der er opdrættet i forskellige værtsarter (f.eks. mus og kanin), kan der anvendes sekundære antistoffer mærket med forskellige fluorophorer, og signalet for begge antistoffer kan bestemmes i samme prøvebånd. Methyl-arginin antistoffer blev udviklet til at identificere og karakterisere monomethylerede, asymmetrisk eller symmetrisk dimethylerede proteiner, hvor methyl-arginin findes i en bestemt sammenhæng. Da størstedelen af PRMT'ernes methylatglycin- og argininrige motiver i deres substrater5, blev der opdrættet flere antistoffer for peptider, der indeholder monomethyl eller asymmetriske, symmetriske dimethyl-arginin-glycin-gentagelser som henholdsvis D5A12, ASYM24 eller ASYM25 og SYM11. Andre methylalgininantistoffer blev genereret mod et peptidbibliotek, der indeholder asymmetrisk, symmetrisk dimethyl- og monomethylalginin i en gentagen sammenhæng, der letter påvisning af methylalginin i disse særlige sammenhænge6. Der er også et stigende antal antistoffer, der genkender specifikke arginin mærke på et enkelt protein, som muliggør selektiv påvisning af methylering såsom histone H4R3me2a eller BAF155-R1064me2a.
Der er flere kommercielt tilgængelige PRMT-hæmmere, som kan bruges som værktøjer til PRMT cellulære assays. Men ikke alle af dem er grundigt karakteriseret for selektivitet og off-target effekter, og nogle bør bruges med forsigtighed. Det strukturelle genomiske konsortium har i samarbejde med akademiske laboratorier og pharmapartnere udviklet velkaraktererede potente, selektive og cellegennemtrængelige PRMT-hæmmere (kemiske sonder), der kan bruges uden begrænsninger af det videnskabelige samfund. Oplysninger om disse hæmmere kan findes på https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics og https://www.chemicalprobes.org/. Kemiske sonder er små molekylehæmmere med in vitro IC 50 eller Kd < 100 nM, over 30 gange selektivitet over proteiner i samme familie og betydelig cellulær aktivitet ved 1 μM. Derudover har hver kemisk sonde en tæt kemisk analog, der er inaktiv i forhold til det tilsigtede mål7,8,9,10,11,12.
Målet med denne protokol er at måle den cellulære aktivitet af individuelle PRMT familiemedlemmer ved hjælp af fluorescerende vestlige blot metode. Her gives detaljerede oplysninger om validerede assaybiomarkører, antistoffer og potente celleaktive hæmmere samt værdifulde strategier for vellykket analyseimplementering.
Protocol
1. Celledyrkning og belægning
BEMÆRK: Kulturceller med anbefalede medier og test rutinemæssigt for mycoplasmaforurening. HEK293T-, MCF7- og C2C12-celler blev valgt som eksempler, da disse cellelinjer med succes blev brugt i PRMT-analyse.
- Kultur HEK293T, MCF7 og C2C12 i DMEM suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS), penicillin (100 Ul−1) og streptomycin (100 μg mL−1)i 10 cm vævskulturbehandlede (TC) retter.
- For PRMT8-analysen skal du dyrke PRMT1-indukbel knockdown HEK293T-celler i medier, der indeholder doxycyclin (2 μg/mL) i 3 dage før analysen starter.
- For at pladen cellerne, fjerne og kassere medier fra pladen.
- Der tilsættes 10 ml PBS (uden Ca+2 og Mg+2 ioner) til vask af celler og kassere opløsningen.
- Der tilsættes 1 ml Trypsin-EDTA (0,25 %), inkuber i 1 min ved stuetemperatur (RT), og opløsningen kasseres derefter. Inkuber, indtil cellerne bliver runde og løsnes fra pladen. Tryk på pladen for at hjælpe med at løsne celler, hvis det er nødvendigt. For celler, der er svære at afprøve, såsom C2C12, inkuberes pladen i 1-2 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Undgå celleeksponering for trypsinopløsning i længere perioder (>10 min.), da det vil reducere celleygtigheden. - Tilsæt 1 mL forvarmede medier til pladen, og rør forsigtigt celler op og ned for at bryde op celle klumper. Overfør celler til et 15 mL rør, og tilsæt 3-5 mL medier.
- For at måle cellenummer blandes 10 μL celler med 10 μL Trypan blå og overføres 10 μL til hæmocytometer eller anvendes en anden celletællingsmetode.
- Celler fortyndes til anbefalet celletæthed, og der anbringes 500 μL/et godt indhold i TC-plader med 24 brønde (tabel 1). For endogene assays (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 og PRMT9) skal du gå videre til trin 3.1.
2. Celletransfekt
- For eksogene assays (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfektERE HEK293T celler med den anbefalede mængde DNA (Tabel 2). HEK293T-celler er nemme at transfekte, så ethvert transfektreagens kan bruges efter producentens anvisninger.
3. Sammensatte behandling
BEMÆRK: Koncentrationen af dimethylsulfoxid (DMSO) må ikke overstige 0,1 % i dyrkningsmedierne. Hold den samme DMSO-koncentration i hver brønd. De selektive PRMT-hæmmere (kemiske sonder) og deres nært beslægtede inaktive analoger findes i tabel 3.
- For endogene assays (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 og PRMT9) fjernes medier fra celler og erstattes med 500 μL medier med sammensatte eller DMSO alene (kontrol).
BEMÆRK: Det tager normalt 2 dage at observere over 80% fald i R-methyleringsniveauer. - For eksogene assays (PRMT3, PRMT6, PRMT8), fjern medier 4 timer efter transfekt, tilsæt 500 μL medier med sammensatte eller DMSO alene (kontrol), og inkuber i 20-24 timer.
4. Forberedelse af cellelysat
- Alle medier fjernes fra brønde, vaskes med 100 μL PBS for at fjerne restmedier, og der tilsættes 60 μL lysisbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8 150 mM NaCl, 1 mM ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA), 10 mM MgCl2,0,5% Triton X-100, 12,5 U mL−1 benzonase, komplet EDTA-fri protease-hæmmercocktail) til hver brønd.
- Inkuber i mindre end 1 min ved RT, rokkende pladen til at distribuere lysis buffer over cellerne. Derefter tilsættes 3 μL på 20% w/v natrium dodecyl sulfat (SDS), til en endelig koncentration på 1 % og blandes ved forsigtigt at ryste. Overfør lysat i mikrocentrifugerør og hold det på is.
BEMÆRK: Tilsæt benzonase og proteinhæmmercocktail frisk før brug. Tilsætning af benzonase hydrolyserer hurtigt nukleinsyrer, hvilket reducerer cellelysatviskositeten.
- Inkuber i mindre end 1 min ved RT, rokkende pladen til at distribuere lysis buffer over cellerne. Derefter tilsættes 3 μL på 20% w/v natrium dodecyl sulfat (SDS), til en endelig koncentration på 1 % og blandes ved forsigtigt at ryste. Overfør lysat i mikrocentrifugerør og hold det på is.
- Bestem proteinkoncentrationen af prøverne ved hjælp af BCA Protein Assay Kit eller brug enhver anden metode, der tåler 1% SDS i opløsning.
- Der tilsættes 2 μL lysat- og proteinstandarder (0, 1, 2, 4 og 8 μg/mL BSA i lysisbuffer) i brøndene på den 96-brønds klare plade.
- Reagens A blandes med reagens B ved 50:1-forhold, og der tilsættes 200 μL pr. brønd. Inkuber i 20 minutter ved 37 °C og aflæs absorbansen.
- Proteinkoncentrationen justeres med lysisbuffer, så den er ens på tværs af prøverne.
- Der tilsættes 20 μL 4x læssebuffer til 60 μL cellelysat og opvarmes ved 95 °C i 5 min. Efter varme denaturering kan lysater opbevares ved -20 °C.
5. Analyse af vestlige skamplet
- 5-20 μg totalcelle lysat til analyse af histoneproteiner og 20-100 μg for andre proteiner indlæses i en 4-12% Bis-Tris proteingel.
- Kør gelen i MOPS SDS løbebuffer (50 mM MOPS, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7,7) i ca. 2 timer ved 100 V, eller indtil farvefronten når bunden af gelen.
- Hvis du udfører en våd overførsel, skal du samle overførselssandwichen i iskold Tris-Glycine-overførselsbuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 20% v/v methanol og 0,05% w/v SDS).
- Placer svampe, filterpapir, PVDF-membran og gel i henhold til producentens anvisninger. Aktiver PVDF membran ved iblødsætning i methanol og ekvilibrering gel i overførsel buffer i 30 s før samling.
BEMÆRK: Brug den anbefalede PVDF vestlige blottingmembran, da den har lav autofluorescens og egnethed til proteiner med lav molekylvægt, såsom histoner (Tabel over materialer).
- Placer svampe, filterpapir, PVDF-membran og gel i henhold til producentens anvisninger. Aktiver PVDF membran ved iblødsætning i methanol og ekvilibrering gel i overførsel buffer i 30 s før samling.
- Overfør proteiner fra gelen til PVDF-membranen i Tris-Glycine overførselsbuffer ved 70 V i 1,5 timer på is.
- Blokmembran i 30 minutter i blokeringsbuffer (5% m/v mælk i fosfatbufferet saltvand, PBS). Skylles med vaskebuffer (PBST: 0,1% v/v Tween-20 i PBS) og inkuberes med primære antistoffer i BSA-opløsning (5% BSA i PBST) natten over ved 4 °C (tabel 3).
BEMÆRK: Ved længere opbevaring tilsættes 0,02% w/v natriumazid til den filtersteriliserende BSA-opløsning, og den holdes ved 4 °C. - Vask membran 3 x 5 min med PBST. Derefter inkuberes med ged-anti-kanin (IR800) og æsel anti-mus (IR680) antistoffer i anbefalede blokering buffer(Tabel over materialer, Tabel 3) i 30 min på RT og vask 3 x 5 min med PBST.
- Aflæs signalet på en fluorescerende western blot imager ved 800 og 700 nm. Brug helst instrumentet, som gør det muligt at billed stærke og svage bånd tydeligt i et enkelt billede med høj følsomhed og dynamisk område, højt signal-til-støj-forhold, en advarsel, når et billede mætning er nået samt multiplexing af to fluorescerende farver i samme prøvebånd.
- Bestem båndintensiteter for western blot-analyse ved hjælp af passende software til fluorescerende vestlig billeddannelse.
Representative Results
Eksempler på vestlige blot resultater for cellulære assays af de enkelte PRMTs er præsenteret nedenfor. Analysens detaljer er også sammenfattet i tabel 4.
PRMT1-analyse
PRMT1 er den største bidragyder til histone 4 arginin 3 asymmetrisk dimethylering (H4R3me2a) icellerne 13. Ved tab af PRMT1 aktivitet, globale Rme1 og Rme2s niveauer stige betydeligt13. Som vist i figur 1A og 1Bkan flere antistoffer bruges til at overvåge globale ændringer i Rme1, Rme2a, Rme2s samt H4R3me2a. Et betydeligt fald i det globale Rme2a- og H4R3me2a-niveau og stigninger i Rme1 og Rme2s kan observeres efter 3 dages PRMT1-knockdown (Figur 1A, B). Cellelinjer adskiller sig i basal H4R3me2a-signal for at lette overvågningen af tabet af PRMT1-aktivitet, cellelinjer som MCF7 med høje basale methyleringsniveauer kan derfor anvendes (Figur 1C). Den optimale tid til at observere effekten af PRMT1-hæmning, f.eks. Længere behandling resulterer i nedsat celle levedygtighed og vækst.
PRMT3-analyse
For PRMT3 cellulære analyse, ingen selektiv biomarkør proteiner, som methylering ændringer kunne påvises i det vestlige skamplet på PRMT3 knockdown eller overexpression. PRMT3 viste sig at asymmetrisk dimethylat H4R3 in vitro14, men mærket er overvejende deponeret af PRMT1, og derfor en udefrakommende analyse med overekspresseret PRMT3 blev designet. I overensstemmelse med in vitro-fund førte overekspression af prmt3 af vildtype, men ikke dens katalytiske mutant (E338Q), til en stigning i H4R3me2a-niveauerne (Figur 2A). HEK293T-celler blev anvendt, da de har lav basal methylering af dette mærke (Figur 1C). Analysen blev yderligere valideret med PRMT3 selektiv hæmmer SGC7077, som hæmmede PRMT3-afhængig H4R3 asymmetrisk methylering (Figur 2B).
PRMT4-analyse
PRMT4 asymmetrisk dimethylater BAF155 ved arginin 106415. Da antistoffet, der detekterer BAF165-R1064me2a, er kommercielt tilgængeligt, kan PRMT4-aktiviteten i celler overvåges af western blot ved at påvise ændringerne i R1064me2a-mærkets niveauer. Tabet af PRMT4-protein eller hæmning af katalytisk aktivitet med prmt4-selektiv hæmmer, TP-06410, resulterer i et fald i BAF165-R1064me2a-niveauerne (figur 3). En 2-dages behandling er normalt tilstrækkelig til at fjerne det meste af methyleringssignalet.
PRMT5-analyse
PRMT5 er ansvarlig for størstedelen af protein arginin symmetrisk dimethylering. Det er tidligere blevet rapporteret, at de forskellige SMN-komplekse proteiner, herunder SmBB', er PRMT5-substrater16. PRMT5-aktivitet kan overvåges ved at se på ændringer i det globale niveau af symmetrisk arginin dimethylering eller symmetrisk dimethylering af SmBB's proteiner. Knockdown af PRMT5, men ikke PRMT1, 3, 4, 6 og 7 resulterer i et fald i det globale Rme2s-niveau (Figur 4A). I de fleste cellelinjer undertrykte behandlingen af celler med PRMT5 selektive hæmmere LLY-28311 og GSK591 i 2-3 dage det meste af SmBB'Rme2s-signalet (Figur 4B). De fleste celler er følsomme over for PRMT5-hæmning, hvilket resulterer i et fald i cellespredning og celledød med langvarig hæmmereksponering.
PRMT6-analyse
Det er blevet rapporteret, at PRMT6 er den største bidragyder til histone H3 arginin 2 asymmetrisk dimethylering (H3R2me2a) i celler17. I HEK293T-celler var PRMT6-knockdown i 3 dage ikke tilstrækkelig til at observere et betydeligt fald i H3R2me2a-niveauerne. Overekspression af vilde typer PRMT6, men ikke dens katalytiske mutant (V86K/D88A) øger imidlertid niveauet af H3R2me2a samt H3R8me2a og H4R3me2a (Figur 5A). Der er flere hæmmere, der hæmmer PRMT6-aktivitet med forskellig styrke og selektivitet: selektiv, allosterisk PRMT6-hæmmer SGC687018, PRMT type I-hæmmer MS0238og PRMT4/6-hæmmer MS0499. Alle disse hæmmede PRMT6-afhængige H3R2 (Figur 5B) samt asymmetrisk H4R3- og H3R8-dimethylering (data vises ikke).
PRMT7-analyse
PRMT7 monomethylater arginin 469 i både konstituerende og indukbel form for HSP70 (henholdsvis HSPA8 og HSPA1/6)12. Selvom der ikke er nogen kommercielt tilgængelige antistoffer, som registrerer HSP70-R469me1-niveauer, kan mærket påvises med pan monomethylantistoffer. Tabet af PRMT7-protein eller hæmning af katalytisk aktivitet med PRMT7-selektiv hæmmer, SGC302712, resulterer i nedsat niveau af HSP70-R469me1 (Figur 6A, B). SGC3027 er et celletrængeligt prodrug, som i celler konverteres af reductaser til PRMT7 selektiv hæmmer SGC8158, derfor kan cellulær styrke variere mellem cellelinjer. Flere kræftcellelinjer udtrykker indukible HSP70-isoformer ved høje niveauer, og methylering kan være svær at opdage på grund af et overlappende uspecifikt bånd af nuklear oprindelse (Figur 6C). Derfor anbefales cellelinjer, der udtrykker det meste HSPA8 som C2C12, for PRMT7 cellulær analyse, eller da HSP70 hovedsageligt lokaliserer i cytoplasmaet, bestemmer HSP70-R469me1-niveauerne i den cytoplasmiske fraktion af foretrukne cellelinjer.
PRMT8-analyse
PRMT8 er den eneste PRMT med et vævsbegrænset udtryksmønster - stort set udtrykt i hjernen19. Det deler 80% sekvens lighed og har en lignende substrat præference som PRMT119. Det adskiller sig fra PRMT1 hovedsageligt ved N-endestationen, hvor myristoylering resulterer i tilknytning af PRMT8 med plasmamembranen20. Det er blevet rapporteret, at PRMT8 sammen med PRMT1 methylater RNA-bindende protein EWS21. Da PRMT8 aktivitet er lav i ikke-neuronale cellelinjer og EWS kan også methyleres af PRMT1, en analyse, hvor PMRT8 er co-overekspresseret sammen med EWS i PRMT1 knockdown celler blev udviklet. Da PRMT1 er et vigtigt gen, og dets langsigtede tab resulterer i celledød, blev et inducerbart system, hvor PRMT1 slås ned i 3 dage før brug i PRMT8-analysen, udnyttet (Figur 7A). Co-udtryk for wild-type PRMT8, men ikke katalytisk inaktiv mutant (E185Q), sammen med EWS resulterede i øgede niveauer af EWS asymmetrisk dimethylering (Figur 7B). Flere asymmetriske dimethylargininantistoffer blev testet, og methyleringen blev kun påvist med Asym25 antistof. Analysen blev yderligere valideret med en PRMT type I selektiv kemisk sonde, MS0238, som faldt PRMT8-afhængige asymmetrisk dimethylering af udefrakommende EWS (Figur 7B). Selv om MS023 er meget potent til at hæmme PRMT8 i in vitro-assays, kræves der i celler høje koncentrationer af MS023 for at se methyleringshæmmende21.
PRMT9-analyse
PRMT9 viste sig at være symmetrisk dimethylat SAP145 ved arginin 50822. Desværre kan ingen kommercielt tilgængelige antistoffer genkende mærket. For PRMT9 assay, antistoffer, der var venligt begavet af Dr. Yanzhong Yang (Beckman Research Institute of City of Hope) blev brugt. Når den er overekspresseret, methyleres vildtype, men ikke R508K mutant SAP145, af PRMT9 (Figur 8A). Analysen var designet til at overvåge niveauerne af endogene SAP145-R508me2s og blev valideret med Compound X, en prototype PRMT9-hæmmer (igangværende arbejde, endnu ikke offentliggjort), som kraftigt hæmmer PRMT9 in vitro med nanomolar potens. Sammensatte X faldt SAP145-R508me2s niveauer i en dosis-afhængig måde (Figur 8B).
Figur 1. PRMT1 cellulær analyse. (A) PRMT1 knockdown resulterer i et fald i den globale asymmetriske arginin dimethylering (Rme2a) og øgede niveauer af symmetrisk arginin dimethylering (Rme2s) og monomethylering (Rme1). PRMT1 knockdown effektiviteten præsenteres i panel B. (B) PRMT1 knockdown reducerer asymmetrisk dimethylering af histone H4R3 (H4R3me2a). (C) De basale H4R3me2a-niveauer varierer på tværs af forskellige cellelinjer. (D) Type I PRMT-hæmmer MS023 nedsætter H4R3me2a-niveauerne på en dosisafhængig måde. MCF7-celler blev behandlet med MS023 i 2 dage. (E)Grafen repræsenterer den ikke-lineære pasform af H4R3me2a signalintensiteter normaliseret til den samlede histone H4. MS023 IC50 = 8,3 nM (n=1). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. PRMT3 cellulær analyse. (A)Overekspressionen af vildtype (WT), men ikke E338Q-katalysatormutant af PRMT3 øger H4R3me2a-niveauet i HEK293T-celler. Celler blev transfected med FLAG-mærkede PRMT3 for 24 timer (B) PRMT3 selektiv hæmmer, SGC707, nedsætter ektopiske PRMT3 afhængige H4R3 asymmetrisk demethylation Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. PRMT4 cellulær analyse. (A) PRMT4 knockdown resulterer i et fald i BAF155-R1064 asymmetrisk arginin dimethylering (HEK293T celler). (B) Selektiv prmt4-hæmmer, TP-064, nedsætter BAF155-R1064Rme2a-niveauet. HEK293T celler blev behandlet med sammensatte i 2 dage. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. PRMT5 cellulær analyse. (A) PRMT5 knockdown resulterer i et fald i det globale symmetriske arginin dimethyleringsniveauer (MCF7-celler). (B) PRMT5 selektive hæmmere GSK591 og LLY-283, mindske SmBB's symmetriske arginin dimethylering (grøn), mens det samlede niveau af SmBB' forbliver uændret (rød). MCF7 celler blev behandlet med forbindelser i 2 dage. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. PRMT6 cellulær analyse. (A)Overekspressionen af vildtype (WT), men ikke V86K/D88A-katalysator mutant PRMT6 øger niveauet H4R3me2a, H3R2me2a og H3R8me2a i HEK293T-celler. Celler blev transfected med FLAG-mærkede PRMT6 i 24 timer (B) PRMT6 selektiv inhibitor (SGC6870), PRMT type I-hæmmer (MS023) og PRMT4/6-hæmmer (MS049) reducerer PRMT6-afhængige H3R2me2a-niveauer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. PRMT7 cellulær analyse. (A) PRMT7 knockout resulterer i et fald i HSP70-R469 monomethylering (HCT116 celler). (B) SELEKTIV PRMT7-hæmmere, SGC3027, reducerer monomethylering af HSP70-R469 i C2C12-celler. Celler blev behandlet med sammensatte i 2 dage. (C) Det kan være vanskeligt at påvise HSP70-R469-methylering af indukbel HSP70 (HSPA1/6) med pan monomethylalgininantistoffer (Rme1) på grund af et overlappende uspecifikt bånd af nuklear oprindelse. Det anbefales at måle HSP70-methyleringsniveauer i den cytoplasmiske fraktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. PRMT8 cellulær analyse. (A) PRMT8-methylering af EWS kan påvises, når PRMT1-aktiviteten hæmmes af knockdown. HEK293T celler blev transduceret med en inducerbar PRMT1 knockdown vektor. Efter 3 dages doxycyclinbehandling blev PRMT1-niveauerne drastisk reduceret. (B) Når PRMT1 slås ned, dimethyleres eksogen EWS asymmetrisk af overekspresseret vildtype PRMT8, men ikke katalytisk mutant (E185Q) af PRMT8. Methyleringen reduceres med en høj koncentration af PRMT type I-hæmmer (MS023). HEK293T PRMT1KD celler blev co-transfected med FLAG-mærkede PRMT8 vilde type eller katalytisk mutant og GFP-mærkede EWS og behandlet med MS023 i 20 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. PRMT9 cellulær analyse. (A) Vild type, men ikke R508K mutant SAP145 er methyleret af PRMT9. HEK293T celler blev transfected med GFP-mærkede SAP145 i 1 dag. (B) Prototypen PRMT9-hæmmer (Compound X) nedsætter PRMT9-afhængig R508 symmetrisk dimethylering af SAP145 på en dosisafhængig måde. HEK293T celler blev behandlet med forbindelsen i 2 dage. Klik her for at se en større version af dette tal.
| PRMT | Celler | Massefylde pr. ml |
| PRMT1 | MCF7 | 1 x 105 |
| PRMT3 | HEK293T | 2 x 105 |
| PRMT4 | HEK293T | 1 x 105 |
| PRMT5 | MCF7 | 1 x 105 |
| PRMT6 | HEK293T | 2 x 105 |
| PRMT7 | C2C12 | 1 x 105 |
| PRMT8 | HEK293T (PRMT1 KD)* | 2 x 105 |
| PRMT9 | HEK293T | 2 x 105 |
| *behandle celler med doxycyclin (2 μg/mL) 3 dage før plating til PRMT8 assay | ||
Tabel 1. Celletyper og tætheder anbefales til PRMT-analyse.
| PRMT | μg DNA/24-brønd | Addgene # | Yderligere bemærkninger |
| PRMT3 | 0,5 FLAG-PRMT3 | 164695 | |
| eller 0,5 FLAG-PRMT3 (E338Q) | 164696 | ||
| PRMT6 | 0,5 FLAG-PRMT6 | 164697 | |
| eller 0,5 FLAG-PRMT6(V86K/D88A) | 164698 | ||
| PRMT8 | 0,05 EWS-GFP | 164701 | |
| 0,45 PRMT8-FLAG | 164699 | ||
| eller 0,45 PRMT8(E185Q)-FLAG | 164700 | ||
| PRMT9 | 0,05 SAP145-GFP | Na | gave fra Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope |
| eller 0,05 SAP145-R508K-GFP | |||
| 0,45 tom vektor |
Tabel 2. Den DNA-koncentration, der anbefales til transfektforsøg.
| PRMT | antistof | Kemisk sonde (Celleaktivitet IC50) | Negativ kontrol |
| PRMT1 | H4R3me2a (1:2000) | MS023 -PRMT type I | MS094 |
| Rme1 (1:1000) | (PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = henholdsvis 9, 56, 1000, 5000 nM) | ||
| Rme2s (1:2000) | |||
| Rme2a (1:2000) | |||
| Rme2a (ASYM24, 1:3000) | |||
| Rme2a (ASYM25, 1:2000) | |||
| H4 (1:2000) | |||
| B-actin (1:500) | |||
| PRMT3 | H4 (1:2000) | SGC707 (IC50 = 91 nM) | XY-1 |
| H4R3me2a (1:2000) | |||
| FLAG (1:5000) | |||
| PRMT4 | BAF155 (1:200) | TP-064 (IC50 = 43 nM) | TP064N |
| BAF155-R1064me2a (1:3000) | SKI-73 (IC50 = 540 nM)* | SKI-73N* | |
| PRMT5 | anti-SmBB' (1:100) | LLY-283 (IC50 = 30 nM) | LLY-284 |
| Rme2s (#13222, 1:2000) | GSK591 (IC50 = 56 nM) | SGC2096 | |
| PRMT6 | H4R3me2a (1:2000) | SGC6870 (IC50 = 0,9 μM) | SGC6870N |
| H4 (1:2000) | MS023 -PRMT type I | MS094 | |
| H3R2me2a ( 1:2000) | (PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = henholdsvis 9, 56, 1000, 5000 nM) | ||
| H3R8me2a (1:2000) | MS049 (PRMT 4, 6 IC50 = henholdsvis 970, 1400 nM) | MS049N | |
| H3 ( 1:5000) | |||
| FLAG ( 1:5000) | |||
| PRMT7 | Rme1 (1:1000) | SGC3027 (IC50 = 1300 nM) * | SGC3027N* |
| Hsp/Hsc70 (1:2000)* | |||
| PRMT8 | GFP (1:3000) | MS023 (50 μM) | MS094 |
| Rme2a (ASYM25,1:2000) | |||
| FLAG (1:5000) | |||
| PRMT9 | SAP145 (1:1000) | ||
| SAP145-R508me2s-slags gave fra Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope (1:1000) (PIMID: 25737013) | |||
| Sekundære antistoffer | ged-anti-kanin IgG-IR800 (1:5000) | ||
| æsel anti-mus IgG-IR680 (1:5000) | |||
| *- antistof genkender HSPA8, HSPA1 og HSPA6 (testet med overekspresserede GFP-mærkede proteiner), * prodrug – IC50 kan variere mellem forskellige cellelinjer | |||
Tabel 3 . Anbefalede antistoffer og PRMT kemiske sonde / negative kontrol værktøj forbindelser.
| PRMT | Biomarkør | Assay udlæsning | Analysevalidering | Anbefalet cellelinje | Ref. | ||||||||
| PRMT1 | H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a | H4R3me2a niveauer normaliseret til den samlede H4 globale Rme1, Rme2a eller Rme2s niveauer normaliseret til B-actin. | Knockdown af PRMT1 faldt basal H4R3me2a og globale Rme2a niveauer og øget globale Rme1 og Rme2s niveauer i celler (Fig.1A, B). PRMT Type I kemisk sonde MS023 reducerede niveauerne af H4R3me2a på en dosisafhængig måde (fig. 1D). | Cellerne varierer i basale H4R3me2a-niveauer (fig. 1C). MCF7 celler har høje basale H4R3me2a niveauer, som gør det at foretrække for assays overvåge faldet i PRMT1 aktivitet. | 8 | ||||||||
| PRMT3 | H4R3me2a | H4R3me2a methyleringsniveauer forårsaget af eksogen FLAG-mærket PRMT3 WT eller katalytisk E338Q mutant (baggrund) normaliseret til total histone H4 | Overekspression af vilde typer PRMT3, men ikke dens katalytiske mutant (E338Q) øgede H4R3me2a (fig. 2A). PRMT3 selektiv hæmmer SGC707 nedsat PRMT3 afhængig stigning i H4R3me2a niveauer (Fig. 2B) | HEK293T-celler har et lavt basalt H4R3me2a-niveau (fig. 1C), hvilket er at foretrække til overvågning af eksogen PRMT3-aktivitet | 7 | ||||||||
| PRMT4 | BAF155-R1064me2a | BAF155-R1064me2a niveauer normaliseret til det samlede BAF155 | PRMT4 knockdown faldt asymmetrisk dimethylering af BAF155 (fig. 3A). 2 dages behandling med PRMT4 selektiv kemisk sonde (TP-064) faldt asymmetrisk dimethylering af BAF155 (fig. 3B). | En vilkårlig cellelinje | 10 | ||||||||
| PRMT5 | SmBB'-Rme2s | SmBB'-Rme2s niveauer opdaget med pan Rme2s antistoffer (CST) normaliseret til det samlede SmBB ' | Knockdown af PRMT5 resulterede i nedsat SmBB's symmetriske dimethyleringsniveauer (fig. 4A). 2 dages behandling med PRMT5 selektive kemiske sonder, GSK591 og LLY285, faldt SmBB'-Rme2s niveauer (Fig. 4B). | En vilkårlig cellelinje | 11 | ||||||||
| PRMT6 | H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a |
H4R3me2a, H3R2me2a eller H3R8me2a methyleringsniveauer øges med eksogent FLAG-mærket PRMT6 WT, men ikke katalytisk V86K,D88A mutant (baggrund) normaliseret til henholdsvis histone H4 eller H3 | Overekspressionen af vilde typer PRMT6, men ikke dens katalytiske mutant (V86K,D88A) øgede niveauerne H3R2me2a, H3R8me2a og H4R3me2a (fig. 5A). Allosterisk PRMT6-hæmmer (SGC6870), PRMT type I-hæmmer MS023 , PRMT4/6-hæmmer MS049 reduceret PRMT6-afhængig stigning i H3R2me2a-niveauer (fig. 5B). | HEK293T-celler har et lavt basalt niveau H4R3me2a- og H3R2me2a- og H3R8me2a-niveau, hvilket er at foretrække til overvågning af eksogen PRMT6-aktivitet | 8,9 | ||||||||
| PRMT7 | HSP70-R469me1 | HSP70-Rme1-methyleringsniveauer normaliseret til det samlede HSP70 | PRMT7 knockout eller knockdown reducerede HSP70 monomethylering (fig. 6A). 2 dages behandling med PRMT7 selektiv kemisk sonde SGC3027 reducerede PRMT7-afhængig HSP70 monomethylering på en dosisafhængig måde (fig. 6B). | C2C12, HT180 Flere kræftcellelinjer udtrykker en uovervindelig form for HSP70, hvis methyleringssignal overlapper med et uspecifikt protein af nuklear oprindelse (fig. 6C). I dette tilfælde anbefaler vi at analysere HSP70-methyleringsniveauer i den cytoplasmiske fraktion. |
12 | ||||||||
| PRMT8 | Ews-Rme2a | Eksogen GFP-mærket EWS-methyleringsniveauer forårsaget af eksogent FLAG-mærket PRMT8 WT eller E185Q katalytisk mutant (baggrund), normaliseret til det samlede GFP-signal i PRMT1 KO-celler. | Overekspression af den vilde type PRMT8, men ikke katalytisk E185Q mutant methyleret ektopisk EWS kun i PRMT1 KD-celler (fig. 7A). PRMT type I kemisk sonde MS023 hæmmede asymmetrisk dimethylering af eksogen EWS ved PRMT8 (fig. 8B). | HEK293T PRMT1 KD (uovervindelig). PRMT1 knockdown resulterer i celledød derfor anbefaler vi at bruge et inducible system. |
8 | ||||||||
| PRMT9 | SAP145-R508me2s | PRMT9-afhængig SAP145 symmetrisk dimethylering ved R508 normaliseret til SAP145 | Tabet PRMT9, men ikke PRMT5 føre til nedsat symmetrisk dimethylering af SAP145. GFP-mærket SAP145 WT, men ikke SAP145mut (R508K) blev methyleret af PRMT9 (fig. 8A). 2-dages behandling med Copound X, prototypen PRMT9-hæmmeren, reducerede SAP145-R508me2s-niveauerne på en dosisafhængig måde Fig. 8B). | En vilkårlig cellelinje | 21 | ||||||||
Tabel 4 . PRMT assays resumé.
Discussion
Her beskrives de detaljerede cellulære analyseprotokoller for medlemmer af PRMT-familien, der bruger fluorescerende vestlige blotting-metoder. Unikke substrater, for hvilke ændringerne i argininmethylen let kan påvises ved individuel PRMT-tab eller katalytisk hæmning og ikke kan kompenseres af andre familiemedlemmer, blev valgt. Nogle proteiner er methyleret af flere PRMT'er21,23, hvilket tyder på en overlapning i substrat specificitet, hvor nogle PRMT'er kun bidrager med en lille mængde cellulært mærke i et givet proteinsubstrat24,25,26,27, for eksempel bidrager både PRMT8 og PRMT1 til methylering af EWS. Derfor krævede hver analyse grundig validering af substrater og antistoffer med knockdown og / eller overekspressionseksperimenter og yderligere validering med velkaraktererede selektive hæmmere. Der blev identificeret PRMT-specifikke substrater, for hvilke der kunne påvises ændringer i methyleringsmærket inden for 2-3 dage efter PRMT-tab/hæmning for at undgå sammensatte virkninger af nedsat celles levedygtighed og spredning, som indirekte kan påvirke methylalgininmærkeniveauerne. Selv om det var muligt at finde unikke substrater til PRMT1, 4, 5, 7 og 9; for PRMT3, 6 og 8 skulle funktionstilgangen anvendes. Flere argininmethylespecifikke antistoffer blev testet for forskellige cellulære mål, men ingen var i stand til at påvise væsentlige ændringer inden for 3 dage efter PRMT3 og PRMT6 knockdown; Derfor blev biomarkøranalyser udviklet ved hjælp af ektopisk udtrykte enzymer sammen med katalytisk inaktive mutanter, der fungerede som kontrol for basissubstratmethyleneringen. PRMT8 er en tæt PRMT1 homolog og deler lignende substratpræferencer. Da en PRMT8 selektiv biomarkør ikke kunne identificeres, blev der udviklet en analyse i PRMT1 knockdown-celler, hvor PRMT8 blev udtrykt sammen med EWS. PRMT1 er også et stort enzym, der er ansvarlig for H4R3 asymmetrisk methylering, derfor at bruge H4R3me2a som biomarkør for PRMT3 og PRMT6 cellulære assays, celler med lave basale H4R3me2a niveauer blev valgt samt katalytisk inaktive mutanter blev brugt som baggrundskontrol. Selv om endogene assays foretrækkes, exogenous assays vise sig uvurderlig for at teste den cellulære styrke af flere selektive PRMT hæmmere7,8,9. Med voksende viden om PRMT biologi forventer vi at forbedre analysen ved at finde mere specifikke biomarkørproteiner til PRMT3, PRMT6 og PRMT8.
Brugen af validerede antistoffer og passende kontroller er afgørende for PRMT-analysens ydeevne. Alle antistoffer, der anbefales her, er blevet grundigt valideret af knockdown- og overekspressionseksperimenter, men batch-til-batch-forskelle, især i tilfælde af polyklonale antistoffer, kan stadig påvirke deres ydeevne. Derfor er det afgørende at bruge genetiske metoder og kemiske sonder sammen med deres nært beslægtede negative kontroller for at bekræfte analysens pålidelighed. For PRMT-analyse, der kræver proteinovertryk, er det desuden afgørende at bruge katalytisk inaktive mutanter sammen med protein af vild type til at bestemme de basale methyleringsniveauer.
Denne samling af kvantitative analyser til profilering af PRMT's aktivitet i celler kan i det store og hele være nyttig for det videnskabelige samfund, da det hurtigt og nemt kan gennemføres med minimalt udstyr og begrænset teknisk ekspertise, der kun omfatter grundlæggende cellekultning og fluorescerende vestlige blotting-teknikker. De anbefalede antistoffer og kemiske sonder for PRMT'er kan også anvendes til aktivitetsbaserede proteinprofileringsanalyser (ABPP) for at fastslå egnetheden af en given ABPP-sonde, overvåge målengagement og vurdere off-target-effekter ved hjælp af det konkurrencedygtige ABPP-format. De analyseudviklingsmetoder, der diskuteres her, kan også ekstrapoleres for andre enzymfamilier såsom protein lysin-methyltransferaser og acetyletransferaser.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser eller andre modstridende interesser at erklære.
Acknowledgments
Structural Genomics Consortium er en registreret velgørenhedsorganisation (nr. 1097737), der modtager midler fra AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada gennem Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU og EFPIA gennem Joint Undertaking 2 i initiativet for innovative lægemidler [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (alias EMD i Canada og USA), Pfizer, Takeda og Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
| 24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
| Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
| anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
| anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
| anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
| anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
| anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
| anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
| anti-GFP | Clontech | 632381 | |
| anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
| anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
| anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
| anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
| anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
| anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
| anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
| anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
| anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
| anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
| anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
| anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
| anti-Rme1 | CST | 8015 | |
| anti-Rme2a | CST | 13522 | |
| anti-Rme2s | CST | 13222 | |
| anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
| anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
| anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
| anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
| benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
| BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
| C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
| donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
| doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
| EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| FBS | Wisent | 80150 | |
| glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
| goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
| HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
| Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
| Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
| MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
| Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
| PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
| PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
| penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
| SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
| skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
| Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
| Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
| Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
| trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |
References
- Blanc, R. S., Richard, S. Arginine Methylation: The Coming of Age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
- Yang, Y., Bedford, M. T.
- Bedford, M. T., Richard, S. Arginine methylation an emerging regulator of protein function. Molecular Cell. 18 (3), 263-272 (2005).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. The Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S.
- Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Science Reports. 3, 1311 (2013).
- Kaniskan, H. U., et al. A potent, selective and cell-active allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3 (PRMT3). Angewandte Chemie International Edition. 54 (17), 5166-5170 (2015).
- Eram, M. S., et al. A Potent, Selective, and Cell-Active Inhibitor of Human Type I Protein Arginine Methyltransferases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 772-781 (2016).
- Shen, Y., et al. Discovery of a Potent, Selective, and Cell-Active Dual Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 4 and Protein Arginine Methyltransferase 6. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (19), 9124-9139 (2016).
- Nakayama, K., et al. TP-064, a potent and selective small molecule inhibitor of PRMT4 for multiple myeloma. Oncotarget. 9 (26), 18480-18493 (2018).
- Bonday, Z. Q., et al. LLY-283, a Potent and Selective Inhibitor of Arginine Methyltransferase 5, PRMT5, with Antitumor Activity. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (7), 612-617 (2018).
- Szewczyk, M. M., et al. Pharmacological inhibition of PRMT7 links arginine monomethylation to the cellular stress response. Nature Communications. 11 (1), 2396 (2020).
- Goulet, I., Gauvin, G., Boisvenue, S., Cote, J. Alternative splicing yields protein arginine methyltransferase 1 isoforms with distinct activity, substrate specificity, and subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 33009-33021 (2007).
- Siarheyeva, A., et al. An allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3. Structure. 20 (8), 1425-1435 (2012).
- Stefansson, O. A., Esteller, M. CARM1 and BAF155: an example of how chromatin remodeling factors can be relocalized and contribute to cancer. Breast Cancer Research. 16 (3), 307 (2014).
- Pesiridis, G. S., Diamond, E., Van Duyne, G. D. Role of pICLn in methylation of Sm proteins by PRMT5. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21347-21359 (2009).
- Guccione, E., et al. Methylation of histone H3R2 by PRMT6 and H3K4 by an mLL complex are mutually exclusive. Nature. 449 (7164), 933-937 (2007).
- Yudao Shen,, L, F., et al. A First-in-class, Highly Selective and Cell-active Allosteric Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 6 (PRMT6). BioRxiv. , 1-21 (2020).
- Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Identification of proteins interacting with protein arginine methyltransferase 8: the Ewing sarcoma (EWS) protein binds independent of its methylation state. Proteins. 72 (4), 1125-1137 (2008).
- Lee, J., Sayegh, J., Daniel, J., Clarke, S., Bedford, M. T. PRMT8, a new membrane-bound tissue-specific member of the protein arginine methyltransferase family. Journal of Biological Chemistry. 280 (38), 32890-32896 (2005).
- Kim, J. D., Kako, K., Kakiuchi, M., Park, G. G., Fukamizu, A. EWS is a substrate of type I protein arginine methyltransferase, PRMT8. International Journal of Molecular Medicine. 22 (3), 309-315 (2008).
- Yang, Y., et al. PRMT9 is a type II methyltransferase that methylates the splicing factor SAP145. Nature Communications. 6, 6428 (2015).
- Rakow, S., Pullamsetti, S. S., Bauer, U. M., Bouchard, C. Assaying epigenome functions of PRMTs and their substrates. Methods. 1175, 53-65 (2020).
- Musiani, D., et al. Proteomics profiling of arginine methylation defines PRMT5 substrate specificity. Science Signaling. 12 (575), (2019).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and Computational Approaches for the Large-Scale Analysis of Protein Arginine Methylation by Mass Spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Shishkova, E., et al. Global mapping of CARM1 substrates defines enzyme specificity and substrate recognition. Nature Communications. 8, 15571 (2017).
- Pawlak, M. R., Banik-Maiti, S., Pietenpol, J. A., Ruley, H. E. Protein arginine methyltransferase I: substrate specificity and role in hnRNP assembly. Journal of Cellular Biochemistry. 87 (4), 394-407 (2002).
