Summary
חלבון הנוגדן הרקומביננטי המתבטא בתאי pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO ובנוגדנים חד-שבטיים המיוצרים בטכנולוגיית היברידימה מסורתית יכול לזהות ולהיקשר לחלבון אמינופפטידאז N (APN) חזירי.
Abstract
אמינופפטידאז N חזירי (APN), מטלופפטידאז הקשור לקרום ונמצא בשפע ברירית המעי הדק, יכול ליזום תגובה חיסונית רירית ללא כל הפרעה כגון ביטוי חלבון נמוך, חוסר פעילות אנזימים או שינויים מבניים. זה הופך את APN למועמד אטרקטיבי בפיתוח חיסונים המכוונים באופן סלקטיבי לאפיתל הרירית. מחקרים קודמים הראו כי APN הוא חלבון קולטן הן עבור Escherichia coli אנטרוטוקסיגני (E. coli) F4 והן עבור וירוס גסטרואנטריטיס הניתן להעברה. לפיכך, APN מראה הבטחה בפיתוח הצמדות נוגדנים-תרופות או חיסונים חדשניים המבוססים על נוגדנים ספציפיים ל-APN. במחקר זה, השווינו ייצור של נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים ל-APN (mAbs) באמצעות טכנולוגיית היברידיומה מסורתית ושיטת ביטוי נוגדנים רקומביננטית. הקמנו גם קו תאים של שחלות אוגר סיניות (CHO) עם זיהום יציב באמצעות pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN וזן BL21(DE3) של ביטוי E. coli המכיל את וקטור pET28a (+)-rAbs-APN. התוצאות מראות כי נוגדנים המבוטאים בתאי pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO ובתאי mAbs המיוצרים באמצעות היברידיות יכולים לזהות את חלבון APN ולהיקשר אליו. זה מספק את הבסיס להבהרה נוספת של פונקציית קולטן APN לפיתוח טיפולים המכוונים לאפיטופים ספציפיים שונים של APN.
Introduction
Aminopeptidase N (APN), אנזים מאיר ירח השייך למשפחת Metalloproteinase M1, פועל כסמן גידול, קולטן ומולקולת איתות באמצעות מסלולים תלויי אנזים ובלתי תלויים באנזימים 1,2. בנוסף לניתוק שאריות חומצות אמינו N-טרמינליות של פפטידים ביו-אקטיביים שונים לוויסות פעילותם הביולוגית, APN ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות דלקתיות שונות. APN משתתף בעיבוד אנטיגן והצגתו על ידי פפטידים גזורים הנקשרים בחוזקה למולקולות מורכבות היסטותאימות עיקריות מסוג II 2,3. APN גם מפעיל השפעות אנטי דלקתיות על ידי קשירה עם קולטנים מצומדים לחלבון G המשתתפים בהעברת אותות מרובים, מווסת הפרשת ציטוקינים, ותורם לפאגוציטוזה בתיווך קולטן גמא Fc בתגובה החיסונית 4,5,6,7.
כאקסופפטידאז הקשור לקרום המפוזר באופן נרחב, APN נמצא בשפע ברירית המעי הדק החזירית והוא קשור קשר הדוק עם אנדוציטוזהבתיווך קולטן 1,5,8. APN מזהה וקושר את חלבון הספייק של נגיף הגסטרואנטריטיס הניתן להעברה לצורך כניסה לתאים, ומקיים אינטראקציה ישירה עם תת-היחידה FaeG של פימבריה אנטרוטוקסיגנית Escherichia coli F4 כדי להשפיע על היצמדות חיידקים לתאים מארחים 9,10,11. לפיכך, APN הוא יעד טיפולי פוטנציאלי בטיפול במחלות זיהומיות ויראליות וחיידקיות.
מאז הפיתוח של טכנולוגיית hybridoma ואסטרטגיות אחרות לייצור נוגדנים חד שבטיים (mAbs) בשנת 1975, mAbs היו בשימוש נרחב באימונותרפיה, מתן תרופות, ואבחון12,13,14. כיום, mAbs משמשים בהצלחה לטיפול במחלות, כגון סרטן, מחלות מעי דלקתיות וטרשת נפוצה12,15. בגלל הזיקה והספציפיות החזקה שלהם, mAbs יכולים להיות מטרות אידיאליות בפיתוח הצמדות נוגדנים-תרופות (ADC) או חיסונים חדשים16,17. חלבון APN הוא קריטי להעברה סלקטיבית של אנטיגנים לתאים ספציפיים, והוא יכול לעורר תגובה חיסונית רירית ספציפית וחזקה נגד פתוגנים ללא כל הפרעה, כולל ביטוי חלבון נמוך, חוסר פעילות אנזימים או שינויים מבניים 5,8,18. לכן, מוצרים טיפוליים המבוססים על mAbs ספציפיים ל-APN מראים הבטחה מפני זיהומים חיידקיים ונגיפיים. במחקר זה, אנו מתארים ייצור של mAbs ספציפי ל-APN באמצעות טכנולוגיית hybridoma, וביטוי של נוגדנים רקומביננטיים נגד APN (rAbs) באמצעות וקטורים פרוקריוטים ואוקריוטים. התוצאה מצביעה על כך שחלבון APN זוהה הן על ידי rAbs המתבטא בתאי pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO והן בתאי mAbs שמקורם בהיברידיומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת יאנגג'ואו (SYXK20200041).
1. הכנת אנטיגן חלבון APN חזירי
הערה: זן pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) ותאי APN בעלי ביטוי יציב pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 נבנו במחקר קודם11.
- יש לשחזר חיידקים ממלאי גליצרול קפוא ולפסוע על לוחות לוריא-ברטאני (LB) המכילים קנמיצין של 50 מק"ג/מ"ל (ק"מ+) לבידוד מושבה יחידה.
- בחר מושבה אחת מהצלחת המפוספסת הטרייה, תרבית ב 4 מ"ל של LB בינוני (10 גרם / ליטר טריפטון, 10 גרם / ליטר נתרן כלורי (NaCl) ו 5 גרם / ליטר תמצית שמרים, pH 7.2) בתוספת KM+ (50 מיקרוגרם / מ"ל), ולהשאיר לגדול לילה (12-16 שעות) עם תסיסה (178 סל"ד) ב 37 ° C.
- לדלל את החיידקים המוכנים ב 1:100 בציר טרי KM+ LB ולדגור ב 37 ° C עם ניעור במשך 2-3 שעות עד OD600 מגיע 0.4-0.6.
- הוסף איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) למדיום לריכוז סופי של 0.4 mM, ודגר על התרביות במשך 10 שעות נוספות ב 16 ° C.
- כתוצאה מכך, צנטריפוגות וקוצרות את החיידקים באמצעות אינדוקציה IPTG (10,000 × גרם, 4 ° C 15 דקות).
- יש להשהות מחדש את גלולת התא באמצעות 5 מ"ל של חיץ LEW (Lysis/Equilibration/Wash) (50 mM נתרן פוספט מונובסיסי נטול מים (NaH2PO4) ו-300 mM NaCl, pH 8.0) המכיל 1 מ"ג/מ"ל ליזואנזים. ערבבו את המתלה החיידקי במשך 30 דקות על קרח ובצעו סוניקציה מלאה (פעימה של 15 שניות ו-20 שניות כיבוי, 15 דקות) באמצעות הומוגנייזר על-קולי.
- צנטריפוגה של התא הגולמי ליזט ב 4 ° C ו 10,000 × גרם במשך 30 דקות כדי להסיר פסולת תאית. מעבירים סופרנאטנט לטור מאוזן מראש ודוגרים 1-2 דקות לפני ניקוז כוח הכבידה. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- שטפו את העמוד באמצעות 20 מ"ל של חיץ LEW ונקזו באמצעות כוח הכבידה. יש להקפיד על חלבון APN המתויג בהיסטידין באמצעות 9 מ"ל של חיץ אלוציה (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl ו-250 mM imidazole, pH 8.0) ולאסוף לתוך צינורות דיאליזה.
- דיאליזה של תמיסת החלבון למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C במאגר נתרן פחמתי-נתרן ביקרבונט (PBS, 135 mM NaCl, 4.7 mM אשלגן כלורי, 2 mM NaH 2 PO4 ו-10 mM dodecahydrate sodium phosphate dibasic, pH7.2).
- יש לנתח באמצעות ג'ל SDS-PAGE 12.0% וכתמים מערביים כדי להעריך את טוהר חלבון APN.
- לטעון 5 מיקרוגרם של חלבון לתוך כל באר של הג'ל ולאפשר לרוץ ב 110 V במשך 1.5 שעות. לאחר מכן, העבירו חלבון לקרום PVDF למשך 50 דקות ב-15 וולט. קבעו את ריכוז החלבון המטוהר באמצעות בדיקת BCA.
2. חיסון בעלי חיים
- עכברים תת-עוריים (s.c) מזריקים נקבות BALB/c בגיל 6-8 שבועות, עם 50 מיקרוגרם חלבון APN או PBS (בקרה שלילית) מעורבבים עם אדג'ובנטים אחת לשבועיים. השתמשו באדג'ובנט שלם של פרוינד המכיל את המיקובקטריה המושמדת בחום לחיסון ראשוני, ובאדג'ובנט לא שלם של פרוינד לחיסוני דחף. מערבבים נפחים שווים של חלבון APN (או PBS) ואדג'ובנט של פרוינד או אדג'ובנט לא שלם של פרוינד, בהתאמה.
- זיהוי טיטרים של נוגדנים כנגד APN בסרה של עכברים אלה על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים עקיפה (ELISA) באמצעות צלחת מיקרוטיטר המצופה בחלבון APN של 5 מיקרוגרם/מ"ל המדולל ב-0.05 M PBS (pH 9.6). .
3. טכנולוגיית Hybridoma לייצור נוגדנים חד שבטיים נגד APN
- תוך צפקית (כלומר) להזריק 100 מיקרוגרם של חלבון APN לעכברים שנבחרו לקבלת דחיפה סופית של אנטיגן.
- שלושה ימים לאחר מכן, הרדימו את העכברים באמצעות נתרן pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג, v/v, intraperitoneal) ונקע צוואר הרחם.
- לאסוף טחול, ולשטוף עם DMEM פעמיים כדי להסיר תאי דם ושומן. סנן את תרחיף תאי הטחול באמצעות רשת נחושת של 200 רשת כדי להסיר פסולת רקמות, וקצור תאי טחול באמצעות צנטריפוגה (1500 × גרם, 10 דקות) כדי להסיר את קרום הטחול.
- תאי מיאלומה SP2/0 של עכבר זרע בבקבוק25 ס"מ 2 המכיל 5 מ"ל DMEM בתוספת 6% סרום בקר עוברי (FBS) ותרבית ב 37 ° C, 6% CO2 אטמוספירה כדי לשמור על קיום התא. לאחר 5-6 ימי תרבית, התאים מגיעים למפגש של 80%-90% לאחר החייאה ונמצאים בשלב יומן הגדילה. מתחת למיקרוסקופ, התאים עגולים, בהירים וצלולים.
- יום לפני ההכלאה, אספו מקרופאגים מחללי הצפק של העכברים על פי שיטה12,19 שפורסמה בעבר.
- מקרופאגים פריטוניאליים של זרעים בצפיפות של 0.1-0.2 × 105/mL בצלחות של 96 בארות, שכל באר מכילה 100 μL של מדיום HAT (DMEM בתוספת 10% FBS ותוספת HAT 1x), ודגרים ב 37 ° C, 6% CO2 אטמוספירה לחה למשך הלילה.
- להכלאה, יש לשאוף בעדינות תאי SP2/0 עם פיפטה מ-8-10 בקבוקים, ולהשהות ב-10 מ"ל של מדיום DMEM ללא סרום. לשטוף תאים עם DMEM טרי, צנטריפוגה (1500 × גרם, 10 דקות) פעמיים, ולאחר מכן להשעות מחדש ב 10 מ"ל של DMEM.
- ערבבו את תאי הטחול המכומתים עם תאי SP2/0 ביחס של 10:1 והעבירו לצינורות של 50 מ"ל. צנטריפוגה (1500 × גרם, 10 דקות) ולהשליך את הסופרנטנט. אספו את כדורי התא בתחתית הצינורות וטפחו בכף היד כדי לשחרר את הכדוריות לפני ההכלאה.
- יש להוסיף 1 מ"ל פוליאתילן גליקול 1500 (PEG 1500), שחומם מראש ל-37°C, ולטפטף באמצעות טפטפת לכדורית התא המשוחררת במשך פרק זמן של 45 שניות תוך סיבוב עדין של תחתית הצינור.
- להוסיף באיטיות 1 מ"ל של DMEM שחומם מראש ל 37 ° C לתערובת לעיל במשך תקופה של 90 s, ואחריו עוד 30 מ"ל של DMEM טרי. הכניסו את צינור ההיתוך לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
- לאחר הדגירה באמבטיה החמה, קוצרים את התאים ומשהים מחדש במדיום HAT. ואז תרבית בצלחת 96 באר מחוסנת במקרופאגים פריטוניאליים.
- חמישה ימים לאחר מכן, להוסיף 100 μL של מדיום HAT טרי לכל באר, ולדגור על הצלחת במשך 5 ימים נוספים, ולאחר מכן להחליף את המדיום עם מדיום HT (DMEM בתוספת 10% FBS ו 1x HT תוספת).
- השתמש בצלחת מיקרוטיטר המצופה בחלבון APN 5 מיקרוגרם/מ"ל מדולל ב- 0.05 M PBS (pH 9.6) כדי לנתח נוגדנים חד שבטיים בסופרנאטנט ההיברידי באמצעות בדיקת ELISA.
- כאשר התווך בבארות של צלחת 96 בארות הופך צהוב (עקב צמיחת תאים ושחרור מטבוליטים, pH בתווך יורד ל 6.8, ואדום פנול הופך מפוקסיה לצהוב) או אשכולות תאים נצפים, לרכוש 100 μL supernatant מן הבארות שנבחרו ולהוסיף בארות של צלחת ELISA מצופה. השתמש בקורא מיקרו-לוחות כדי למדוד את ערכי OD450.
- השתמש בנוגדנים רב-שבטיים נגד APN וסרום עכבר לא נגוע כבקרה חיובית ושלילית, בהתאמה, והשתמש ב- PBS כבקרה ריקה. במחקר זה, יחס OD450 בין דגימה לבקרה שלילית (P/N) ≥ 2.1 הוכר כתקן ברירה חיובית.
- לאחר שלושה סבבי בחירה חיוביים רצופים, בחר את ההיברידיומה המציגה תגובה סרולוגית מוגברת כנגד חלבון APN לבדיקת דילול מוגבלת.
- הכינו מקרופאגים פריטוניאליים וזרעים בצלחות 96 בארות כפי שתואר קודם לכן.
- להשהות תאי היברידיומה בתווך HT בממוצע של 0.5-2 תאים לבאר ותרבית באינקובטור 37°C, 6% CO2 . חזור על שלב זה שלוש או ארבע פעמים עד שיעור חיובי שצוין על ידי ELISA immunoassay מגיע 100%.
- תחת לחץ של הקפאה והפשרה מתמשכות, בחר את תאי ההיברידיומה החיוביים המסוגלים להפריש ביציבות נוגדנים נגד APN ולהתרבות באופן נורמלי.
- יש לבצע זריקה בודדת של 0.3 מ"ל פריסטן לכל עכבר (8-10 שבועות). לאחר 10 ימים לאחר קבלת בתולי, להזריק לכל עכבר 2-5 x 105 תאי hybridoma ב 0.5 מ"ל של PBS (pH 7.2).
- בזהירות לאסוף נוזל הצפק מחלל הצפק של עכברים אלה 8 עד 10 ימים לאחר ההזרקה.
- קצרו את הסופרנאטנטים על ידי צנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 15 דקות, וטיהרו נוגדנים בסופרנאטנטים באמצעות 33% אמוניום סולפט רווי [(NH 4)2SO4] משקעים וחלבון A אגרוז.
4. אפיון mAbs כנגד חלבון APN
- קבע את תת-סוג האימונוגלובולינים של ה- mAbs שנאסף באמצעות מערכת קלונוטיפינג SBA - HRP20. השתמש ב-SDS-PAGE ובכתמים מערביים כדי להעריך את הטוהר והספציפיות של mAb.
- נתח את הספציפיות של אפיטופ mAb מול חלבון APN באמצעות ELISA21. ערך תוספתי (AV) הוא היחס בין OD mAbs (a+b) ל- (OD mAbs-a+OD mAbs-b), המשמש להערכה אםmAbs מזהה את אותו אתר אנטיגני; ODmAbs-a ו- OD mAbs-b מייצגים את ערכי OD450 של נוגדנים חד-שבטיים שונים כנגד APN בלבד, ו- OD mAbs(a+b) מייצגים את ערכי OD450 של תערובת 1:1 של שניmAbs כנגד APN.
- להעריך כל מדגם לפחות ארבעה עותקים משוכפלים, ולחזור על כל הניסוי לפחות שלוש פעמים.
5. ביטוי של rAbs נגד APN
- חלצו את סך כל הרנ"א מתאי ההיברידיומה והטחול שהוזכרו לעיל של עכברים שחוסנו נגד APN (למשל, TRIzol)22. סנתז DNA משלים (cDNA) באמצעות ערכת סינתזת cDNA בהתאם להוראות היצרן.
- הגבירו אזורים משתנים של mAbs באמצעות PCR מקונן וקבעו רצפי שרשרת כבדה (VH) ושרשרת קלה (VL) באמצעות ריצוף. נתח את הגנים המקודדים VH ו- VL באמצעות כלי ניתוח הגנום של עכבר IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- שלב את הגנים VH ו- VL עם רצפים מובילים ושכפל אותם ברצף לווקטורים pET28a (+) ו- pIRES2-ZsGreen1, בהתאמה, תוך שימוש בטכנולוגיית שיבוט חלקה כדי לאפשר החדרת מקטע DNA ללא צלקת. הפריימרים הספציפיים מפורטים בטבלה 1.
- גדל את החיידקים pET28a (+)-rAbs-APN-BL21-transformed בנוכחות 0.4 mM IPTG בשייקרים מסלוליים ב 37 ° C במשך 10 שעות. לאחר מכן השרה, טיהור והערכה של ביטוי חלבון rAbs באמצעות טיהור חלבון שגרתי.
- זרעו 100 μL 0.5 x 105 תאי CHO לכל באר לתוך צלחת 96 בארות ודגרו ב 37 ° C באטמוספירה 6% CO2 במשך 18-24 שעות. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80-90%, יש לדלל את פלסמיד pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN עם Opti-MEM לריכוז סופי של 0.1 מק"ג/μL, ולדגור 5 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש לטרנספקציה.
- ערבבו בעדינות 50 μL של פלסמיד pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN מדולל עם 1 μL של Lipofectamine 2000 ו-49 μL של Opti-MEM, ודגרו על התערובת במשך 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. הוסף 100 μL של תערובת לכל באר של צלחת 96 בארות המכילה תאי CHO ודגור ב 37 ° C ב 6% CO2 אטמוספירה במשך 4-6 שעות.
- ב 4-6 שעות לאחר transfection, להחליף את המדיום עם מדיום DMEM-F12 בתוספת 10% FBS, ולדגור את הצלחת עוד 48 שעות. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוגרם / מ"ל G418 לכל באר כדי לבחור את התאים הנגועים ביציבות.
- לאחר 10 ימים של בחירה באמצעות מדיום DMEM-F12 בתוספת 10% FBS ו- 400 מיקרוגרם / מ"ל G418, מיין את התאים (3.0 × 107 תאים / מ"ל) על ידי מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיים. כ-10-15% מאוכלוסיית התאים היו חיוביים.
- תאים חיוביים שנקטפו בדילול סריאלי, זרעים בממוצע של 0.5-2 תאים לבאר בצלחת של 96 בארות, ותרבית באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 6% CO2 . שמור על תאי pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO הנגועים ביציבות באמצעות בחירה עם G418 (200 מיקרוגרם/מ"ל).
- ריכוז FBS בתווך תרבית התאים המתואר לעיל יורד בהדרגה מ -10% ל -0% במהלך שלב הגידול הלוגריתמי במהלך פרק הזמן של 3 שבועות. לאחר מכן, התאימו את תאי ה-CHO הנצמדים לצמיחת תרחיף בתווך נטול סרום.
- תרבית את תאי pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO בשלב הגידול הלוגריתמי בתווך נטול סרום בצפיפות של 0.8-1.0 ×10 5 תאים/מ"ל בצלוחיות טלטול במהירות ניעור של 80-110 סל"ד ו-37°C, 6% CO2.
- אספו את תרחיף התא כל 12 שעות כדי לקבוע שינויים בכדאיות התא ובחיוניותו באמצעות ערכת ספירת תאים (לדוגמה, CCK-8) בהתאם להוראות היצרן.
- ביטוי נוגדנים מגיע לרמות שיא כאשר כדאיות התא ירדה ל -80% וצפיפות התא מגיעה ל 1.0-2.0 ×10 6 תאים / מ"ל. קצרו סופרנאטנטים של תאים באמצעות צנטריפוגה, סננו באמצעות מסנן קרום פוליטטרה-פלואוראתילן 0.22 מיקרומטר, וטיהרו באמצעות חלבון A אגרוז.
- אשר ייצור של נוגדנים ספציפיים ל-APN באמצעות בדיקות עקיפות של immunofluorescence (IFA).
- קבע טיטרים נוגדנים וזיקות קשירה באמצעות בדיקת ELISA כפי שתואר קודם לכן. 23 חישוב קבוע דיסוציאציה של שיווי משקל (ערךK D ) של הנוגדנים באמצעות משוואה לוגיסטית בת ארבעה פרמטרים באמצעות תוכנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, חלבון APN מסיס מטוהר (2.12 מ"ג / מ"ל) שימש לחיסון עכברים. עכברים שחוסנו בחלבון APN ארבע פעמים במרווחים של 14 יום הציגו נוגדנים גבוהים יותר נגד APN בסרה. למרות ש-14 היברידיומות הושגו באמצעות ניסויי ההיתוך, רק 9 היברידיומות שרדו את שלושת מחזורי ההקפאה-הפשרה המתמשכים, והתוצאה הייתה 9 שיבוטים יציבים שהפרישו נוגדנים כנגד APN. כל התאים האלה עגולים, בהירים ושקופים (איור 1). ה-mAbs המטוהרים בעלי השרשראות הכבדות והקלות (50 kDa ו-25 kDa, בהתאמה) אושרו על-ידי SDS-PAGE ונמצאו במיימת המטוהרת (איור 2). הטיטרים של mAbs אנטי-APN אלה בסופרנאטנטים ובמיימת תרבית מוצגים בטבלה 2.
התוצאה של איזוטיפ mAbs של עכברים גילתה כי mAbs שמקורם בשיבוטים 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 ו-6C56 היה בעל תת-מחלקות IgG2b, בעוד APN-2A20 היה נוגדן מסוג IgG2a κappa (κ), ו-mAbs APN-3FD9, -3F10 ו--10F3 השתייכו לסוג IgM ועיבדו שרשראות אור κ (טבלה 3). כפי שניתן לראות בטבלה 4, רוב ה-mAbs הללו הראו ערכי AV של יותר מ-50%, מה שמצביע על כך שהם התמקדו באפיטופים שונים ב-APN, בעוד שהנוגדנים APN-5C51 זיהו אפיטופים אנטיגניים דומים לאלה שזוהו על-ידי APN-3C48, -5B31 ו-6C56 mAbs.
APN-5B36 הראה טיטר נוגדנים גבוה משמעותית בהשוואה לאלה של mAbs אחרים. לכן, הגן APN-5B36 VH-VL הוגבר וחובר לווקטור pET28a (+) או pIRES2-ZsGreen1 כדי לבנות את פלסמידים הביטוי הרקומביננטי pET28a (+)-rAbs-APN ו-pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN, בהתאמה (איור 3). הנוגדנים המבוטאים הן על ידי pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) והן על ידי תאי pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO טוהרו ונותחו באמצעות בדיקות ELISA ו- IFA. אולם כפי שניתן לראות באיור 4, רק הנוגדן המתבטא בסופרנאטנט של תאי pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO זיהה את חלבון APN, וכך גם mAbs שמקורו בהיברידיומה. נוגדן רקומביננטי זה כלל שרשראות כבדות IgG2b ושרשראות קלות למדא, והראה טיטר של 2.56 × 105 כפי שנקבע באמצעות ELISA. הקישור של APN-5B36 mAbs לחלבוני APN הגיע לשיווי משקל מוקדם יותר מאשר rAbs (איור 5), והראה ערך KD של (4.232±0.475) ×-10-9 ו-(2.201±0.367) ×-10-8mol/L, בהתאמה.
| תחל | רצף (5'-3') | ||
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG | ||
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGAGGGGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
טבלה 1. הפריימרים הספציפיים שבהם נעשה שימוש במחקר זה.
| תאים | שכבות של סופרנאטנטים (U/mL) | שכבות של מיימת (U/mL) |
| 2א20 | 0.64×104 | 3.20×105 |
| 5B31 | 1.28×104 | 1.60×105 |
| 5B36 | 0.64×104 | 1.28×106 |
| 3ג48 | 0.16×104 | 0.80×105 |
| 5ג51 | 0.16×104 | 0.80×104 |
| 6ג56 | 0.80×103 | 0.80×104 |
| 3FD9 | 0.80×103 | 0.80×104 |
| 3F10 | 0.16×104 | 0.16×105 |
| 10F3 | 0.80×103 | 0.32×105 |
טבלה 2. הטיטרים של ELISA של APN mAbs.
| יג | איגה | IgM | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | קאפה | למדא | תקציר | |
| 2א20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a, קאפה |
| 5B31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b, למדא |
| 5B36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b, למדא |
| 3ג48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b, למדא |
| 5ג51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b, למדא |
| 6ג56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b, למדא |
| 3FD9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM, קאפה |
| 3F10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM, קאפה |
| 10F3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM, קאפה |
טבלה 3. איזוטיפים של APN mAbs הנגזרים מהיברידיומה.
| mAbs | AV (100 %) | ||||||||
| 2א20 | 5B31 | 5B36 | 3ג48 | 5ג51 | 6ג56 | 3FD9 | 3F10 | 10F3 | |
| 2א20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5B31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5B36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3ג48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5ג51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6ג56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3FD9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3F10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10F3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
טבלה 4. אפליה של ספציפיות אנטיגן-אפיטופ של mAbs ספציפי APN. ערכי AV גדולים מ- 0.5 מצביעים על כך ששני mAbs אלה מזהים אתרים אנטיגניים שונים; ערכי AV נמוכים מ-0.5 מצביעים על כך ששני mAbs אלה מזהים אתר אנטיגני דומה.
איור 1. תמונה של היברידיות. תחת ניתוח מיקרוסקופי, היברידיות הן עגולות, בהירות וברורות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. רמות ביטוי נוגדנים רקומביננטיים ומיימת נותחו באמצעות SDS-PAGE. (A) ליין M, סמן חלבון; נתיב 1, pET28a מטוהר (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) ליזט; נתיב 2, pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) supernatant; נתיב 3, מיימת נוזל מטוהר על ידי 33% (NH 4)2SO4 משקעים. (B) ליין M, סמן חלבון; נתיב 1, מיימת נוזל מטוהר באמצעות חלבון A agarose. בבדיקה זו, 3-5 מיקרוגרם של חלבון הכולל הועמסו לתוך כל נתיב של הג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. פלסמידים של ביטוי רקומביננטי pET28a (+)-rAbs-APN ו- pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN נותחו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. נתיב M, Trans 2K בתוספת סמן DNA; נתיב 1, pET28a (+) וקטור (5369 bp); נתיב 2 ו -5, גן VH-VL בשילוב עם רצף מוביל APN-5B36; נתיב 3, pET28a (+)-rAbs-APN פלסמיד מבוטא BL21 (DE3) E. coli; נתיב 4, וקטור pIRES2-ZsGreen1 (5283 bp); נתיב 6, pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN פלסמיד מבוטא ב- DH5α E. coli. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. ביטוי של חלבון נוגדנים רקומביננטי ומיימת מנותחים באמצעות immunofluorescence עקיף. תאי pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 (פלואורסצנטיות ירוקה) המבטאים APN ביציבות טופלו ב-(A) PBS, המשמש כטיפול בקרה; (B) חלבון מטוהר מבוטא על ידי pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); (C) נוגדן רב-שבטי APN (1:500); (D) נוזל מיימת מטוהר (1:500); E) סופרנאטנט מטוהר המתקבל מתאי pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO (1:500). DAPI שימש ככתם נגדי גרעיני במיקרוסקופ קונפוקלי. התאים שדגרו עם נוגדן IgG משני נגד עכבר עז מצומד DyLight 549 (1:200) וטופלו במיימת מטוהרת ובסופרנאטנט מטוהר מתאי pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO הראו אות פלואורסצנטי אדום חזק המעיד על הנוגדן הרב-שבטי APN. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. קביעת זיקות קשירה יחסית של נוגדנים באמצעות ELISA22. בליעת דגימות המכילות APN-5B36 mAbs או rAbs, בהיעדר ובנוכחות חלבון APN, נמדדה באורך גל של 450 ננומטר. עקומת הקשירה שורטטה באמצעות התאמה של עקומה לוגיסטית בת ארבעה פרמטרים; ציר X מראה את הריכוז הלוגריתמי של נוגדנים, וציר Y מראה את הספיגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השראת חסינות רירית היא אחת הגישות היעילות ביותר בנטרול פתוגנים ובמניעה וטיפול במחלות שונות. APN, חלבון הקשור לקרום בעל ביטוי גבוה ברירית המעי, מעורב בהשראת תגובה חיסונית נרכשת ובאנדוציטוזה נגיפית וחיידקיתבתיווך קולטן 1,5,8. APN משמש כחלקיקי אנטיגן בפורמטים רבים של טעינת אנטיגן ואספקת חיסונים. מתן פומי של נוגדנים ממוקדי APN יכול גם לעורר תגובות חיסוניות יעילות 18,24,25. עם זאת, נוגדנים חד-שבטיים המכוונים לאפיטופים ספציפיים שונים ל-APN דורשים חקירה נוספת.
השיטות המתוארות כאן שימשו לייצור נוגדנים חד-שבטיים נגד APN באמצעות טכנולוגיות היברידיות מסורתיות ורקומביננטיות. גישה זו יכולה לשמש בייצור של mAbs אחרים. ראשית, עקבנו אחר פרוטוקול שהוזכר קודם לכן כדי להשיג תשעה mAbs שמקורם בשיבוטים שונים של היברידיומה. אף על פי שהטיטרים של mAbs אלה בסופרנאטנטים של תאים ובמיימת היו שונים, כל ה-mAbs הכילו את השרשרת הכבדה של 50 kDa ואת השרשרת הקלה של 25 kDa והראו קשירה ספציפית עם חלבון APN חזירי. תוצאות האיזוטיפ והזיהוי של אפיטופים של אנטיגן הראו כי רוב ה- mAbs התמקדו באפיטופים שונים והשתייכו לסוגי נוגדנים שונים. תוצאות אלה מצביעות על כך שטכנולוגיית היברידיומה מסורתית נותרה בחירה יעילה בייצור mAbs.
גישות המשמשות לייצור נוגדנים רקומביננטיים יכולות להגביר את יעילות הייצור של mAb ולמזער עלויות הקשורות לעבודה ולזמן. לכן, גישות אלה גדלו בפופולריות, במיוחד בפיתוח נוגדנים ליישומים אבחוניים וטיפוליים16,17,26. rAbs מראים מספר יתרונות על פני mAbs שמקורם בהיברידיומה. ראשית, ניתן לייצר rAbs במבחנה על ידי שיבוט גנים של נוגדנים לווקטורי ביטוי, ובכך לבטל את השימוש בבעלי חיים בייצור נוגדנים. בנוסף, שימוש במערכות ביטוי אאוקריוטיות או פרוקריוטיות לייצור rAbs גורם לשינויים נמוכים בין אצווה לאצווה ומגביר את האמינות והיציבות של המוצר הסופי. לעומת זאת, mAbs המיוצרים באמצעות היברידיות לעתים קרובות אינם מזהים או נקשרים לאפיטופים של האנטיגן הממוקד, ומושפעים מסחף קו תאי היברידי, זיהום, אובדן גנים ומוטציות. כיום, mAbs שמקורם בהיברידיומה משמשים בעיקר בריאגנטים חיסוניים אבחוניים או טיפוליים, המדגישים את הצורך לייצר נוגדנים יציבים ואמינים בתקופת ייצור מוגבלת. עבור יישומים אבחוניים וטיפוליים, טכנולוגיית נוגדנים רקומביננטיים היא בחירה טובה יותר מאשר גישה מסורתית מבוססת היברידיומה. הסיבה לכך היא שטכנולוגיית נוגדנים רקומביננטיים מאפשרת לנו לשנות את רצף rAbs כדי להחליף איזוטיפים אימונוגלובולינים, ובכך להגדיל את ספציפיות הקישור של הנוגדן14,16,17.
במחקר זה השתמשנו בטכנולוגיה של הנדסת נוגדנים כדי להשיג נוגדנים רקומביננטיים ממוקדי APN. מצאנו שגם הטחול של עכברים מחוסנים וגם תאי היברידיומה היו יעילים באותה מידה להגברת רצפי השרשרת הכבדה והקלה של mAb. הנוגדן שבוטא על ידי pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) לא זיהה ביעילות APN בבדיקות ELISA או אימונופלואורסנציה עקיפה. עם זאת, rAbs מבוטא על ידי pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO השעיית תאים ו- mAbs שמקורו בהיברידיומה זיהו וקשרו ביעילות את חלבון APN. השיטות המתוארות במחקר זה יכולות לשמש לפיתוח ADC מבוסס נוגדנים APN ומוצרים טיפוליים אחרים המכוונים לאפיטופים ספציפיים שונים של APN. מחקר זה יסייע גם בהבהרה נוספת של תפקיד APN במניעה וטיפול במחלות שונות. עם זאת, אסטרטגיות לשיפור הזיקה והתשואה של rAbs דורשות חקירה נוספת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים. כל המחברים אישרו ונתנו את הסכמתם המפורשת לפרסום כתב היד.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק הקרן הלאומית הסינית למדע (מס '32072820, 31702242), מענקים ממלגת ממשלת ג'יאנגסו ללימודים בחו"ל (JS20190246) וכישרונות ברמה גבוהה של קרן המחקר המדעי של אוניברסיטת יאנגז'ו, פרויקט שנוסד על ידי התוכנית האקדמית המועדפת לפיתוח מוסד להשכלה גבוהה ג'יאנגסו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), Hoboken, N.J. 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient's need. British Journal of Nursing. 24 (16), Suppl 1 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
