Aus Maushepatozyten wurde ein langfristiges Ex-vitro-3D-Organoidkultursystem etabliert. Diese Organoide können durch Lentivirus-Infektion der shRNA /ektopischen Konstruktion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9-Engineering durchpasst und genetisch manipuliert werden.
Die Leber ist das größte Organ bei Säugetieren. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Glukosespeicherung, der Proteinsekretion, dem Stoffwechsel und der Entgiftung. Als Vollstrecker für die meisten Leberfunktionen haben primäre Hepatozyten eine begrenzte Proliferationskapazität. Dies erfordert die Etablierung von ex vivo Hepatozytenexpansionsmodellen für die leberphysiologische und pathologische Forschung. Hier isolierten wir murine Hepatozyten durch zwei Schritte der Kollagenase-Perfusion und etablierten eine 3D-Organoidkultur als “Mini-Leber”, um Zell-Zell-Interaktionen und physikalische Funktionen zu rekapitulieren. Die Organoide bestehen aus heterogenen Zellpopulationen, einschließlich Vorläufern und reifen Hepatozyten. Wir stellen den Prozess im Detail vor, um die murinen Hepatozyten oder fetalen Hepatozyten zu isolieren und zu kultivieren, um innerhalb von 2-3 Wochen Organoide zu bilden und zu zeigen, wie man sie durch mechanisches Pipettieren auf und ab durchläuft. Darüber hinaus werden wir auch vorstellen, wie die Organoide in einzelne Zellen für die Lentivirus-Infektion der shRNA / ektopischen Konstruktion, die siRNA-Transfektion und das CRISPR-Cas9-Engineering verdaut werden können. Die Organoide können für Drogenscreenings, Krankheitsmodellierung und grundlegende Leberforschung verwendet werden, indem Leberbiologie und Pathobiologie modelliert werden.
Organoide sind selbstorganisierte, dreidimensionale (3D) In-vitro-Cluster, die selbsterneuernde Stammzellen und mehrliniendifferenzierte Zellen umfassen1,2. Die Organoide vieler Organe wurden entweder aus pluripotenten oder adulten Stammzellen durch genau definierte Nischenfaktoren wie Darm, Gehirn, Dickdarm, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Schilddrüse, Magen, Haut und Lunge hergestellt3,4,5,6,7 . Die Organoide rekapitulieren physikalische Zellfunktionen, indem sie entweder die Entwicklung (entstanden aus embryonalen oder induzierten pluripotenten Stammzellen, PSCs) oder die Homöostase/Regenerationsprogression (entstanden aus adulten Stammzellen, ASCs) nachahmen, was neue Wege in der Krankheitsforschung und -therapie eröffnet8,9.
Als größtes Organ bei Säugetieren ist die Leber vor allem für die Speicherung, den Stoffwechsel und die Entgiftung verantwortlich. Zwei Arten von Epithelzelltypen, Hepatozyten und Cholangiozyten, konstruieren die Grundeinheit eines Leberläppchens. Hepatozyten sind für 70-80% der Leberfunktion verantwortlich10. Obwohl die Leber eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit aufweist, kommt es während der traditionellen Monolayer-Kultivierung durch dysregulierte Zellpolarisation und -dedifferenzierung zu einem schnellen Verlust von Hepatozytenmerkmalen, was die Notwendigkeit von Forschern und Klinikern erhöht, “lückenüberbrückende” Lebermodelle in einer Schale zu erstellen. Bis vor kurzem waren die Ex-vivo-Expansionsmodelle von primären Hepatozyten jedoch nicht gut etabliert11,12,13,14,15. Leberorganoide können aus embryonalen/induzierten pluripotenten Stammzellen, Fibroblastenumwandlung in hepatozytenähnliche Zellen und gewebeabgeleiteten Zellen hergestellt werden. Die Entwicklung von Leberorganoiden fördert die Anwendung eines In-vitro-Modells für Arzneimittelscreenings und Lebertoxizitätstests16,17.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Etablierung von Leberorganoiden aus murinen primären Hepatozyten. Mit diesem Protokoll haben wir ein In-vitro-Kultursystem aus Hepatozyten-Organoiden mit zwei Kollagenase-Perfusionen aufgebaut. Diese Organoide können für eine langfristige Expansion für Monate durchquert werden. Ihre physiologische Funktion ist sehr konsistent mit Hepatozyten. Darüber hinaus bieten wir auch eine detaillierte Beschreibung der Durchführung von Genmanipulationen, wie Lentivirus-Infektion, siRNA-Transduktion und CRISPR-Cas9-Engineering mit Organoiden. Die Vermehrung von Hepatozyten-Organoiden beleuchtet die Möglichkeit, Organoide zu verwenden, um die Leberbiologie zu verstehen und personalisierte und translationale medizinische Ansätze zu entwickeln.
Die Fähigkeit, reife Hepatozyten über lange Zeiträume zu kultivieren, ist von grundlegender Bedeutung für das Studium der Lebergrundforschung, der Arzneimitteltoxikologie und der hepatotropen Wirtsmikrobiologie-Infektionen wie Malaria und Hepatitis-Viren. Mit einer klar definierten Nische richtet das Protokoll hier ein Kultursystem für Hepatozyten ein. Dieses Protokoll treibt reife Hepatozyten dazu, sich in 3D-Kultur mit einer Heterogenität auszudehnen, die die Zell-Zell-Interaktion, die meisten Hepatozytenfunktion…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Professor Hans Clevers für die freundliche Bereitstellung der Zelllinien zur Herstellung von rekombinantem R-Spondin1. Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), der National Natural Science Foundation of China (31970779) an H.H. und der Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group der Shandong University (2020QNQT003) an H.H. unterstützt.
Perfusion Buffer | |||
EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
Digestion Buffer | |||
CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Tip-wash Buffer | |||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
Wash Medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Culture Medium | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
Others | |||
0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
16 # silicone tube | LangerPump | ||
24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
37 °C Water Bath | |||
70 µm filter | BD | 352350 | |
Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |