מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט
Summary
מערכת תרבות אורגנויד חוץ גופית חוץ גופית ארוכת טווח הוקמה מהפטוציטים של עכברים. אורגנוידים אלה ניתן לעבור מניפולציה גנטית על ידי זיהום lentivirus של בנייה shRNA / חוץ רחמי, transfection siRNA והנדסת CRISPR-Cas9.
Abstract
הכבד הוא האיבר הגדול ביותר ביונקים. הוא ממלא תפקיד חשוב באחסון גלוקוז, הפרשת חלבונים, חילוף חומרים וניקוי רעלים. כמוציא לפועל של רוב תפקודי הכבד, להפטוציטים ראשוניים יש יכולת התפשטות מוגבלת. זה דורש הקמת מודלים להרחבת האקס ויוו הפטוצית למחקר פיזיולוגי ופתולוגי בכבד. כאן בודדנו את הפטוציטים של מורין בשני שלבים של זלוף קולגנאז וביססנו תרבות אורגנויד תלת-ממדית כ’כבד מיני ‘כדי לשחזר אינטראקציות בין תאים ותפקודים פיזיים. האורגנוידים מורכבים מאוכלוסיות תאים הטרוגניות כולל אבות והפטוציטים בוגרים. אנו מציגים את התהליך בפירוט כדי לבודד ולתרבות את הפטוציטים מורין או hepatocyte עוברי כדי ליצור organoids בתוך 2-3 שבועות ולהראות כיצד להעביר אותם על ידי צינורות מכניים למעלה ולמטה. בנוסף, נציג גם כיצד לעכל את האורגנוידים לתאים בודדים לזיהום לנטיוירוס של בנייה של שרנ”א/חוץ רחמי, טרנספקטיון siRNA והנדסת CRISPR-Cas9. האורגנוידים יכולים לשמש למסכי סמים, מידול מחלות ומחקר כבד בסיסי על ידי מידול ביולוגיה של הכבד ופתוביולוגיה.
Introduction
Organoids הם מאורגנים בעצמם, תלת מימדי (3D) באשכולות במבחנה הכוללים תאי גזע מתחדשים עצמית ותאים מובחנים מרובי שושלת1,2. האורגנוידים של איברים רבים הוקמו מתאי גזע פלוריפוטנטיים או בוגרים על ידי גורמי נישה מוגדרים היטב כולל המעי, המוח, המעי הגס, הכליה, הכבד, הלבלב, בלוטת התריס, הקיבה, העור והריאה3,4,5,6,7 . האורגנוידים מסכמים מחדש את תפקודי התא הפיזי על ידי חיקוי התפתחות (שמקורה בתאי גזע עובריים או מושרים, מחשבים אישיים) או התקדמות הומאוסטזיס/התחדשות (שמקורה בתאי גזע בוגרים, ASCs), אשר פותח אפיקים חדשים במחקר מחלות וטיפול8,9.
בתור האיבר הגדול ביותר ביונקים, הכבד אחראי בעיקר לאחסון, חילוף חומרים וניקוי רעלים. שני סוגים של סוגי תאי אפיתל, hepatocytes ו cholangiocytes, לבנות את היחידה הבסיסית של lobule כבד. Hepatocytes אחראים 70-80% של תפקוד הכבד10. למרות הכבד יש יכולת התחדשות יוצאת דופן, אובדן מהיר של תכונות hepatocyte קורה במהלך פולחן monolayer המסורתי על ידי קיטוב תאים dysregulated דיפרנציה, אשר מגביר את הצורך של חוקרים ורופאים לבנות מודלים כבד “גישור פער” בצלחת. עם זאת, עד לאחרונה מודלי הרחבת ex vivo מהפטוציטים ראשוניים לא היו מבוססים היטב11,12,13,14,15. אורגנוידים בכבד ניתן להקים מתאי גזע עובריים/מושרה pluripotent, המרה פיברובלסט לתאים דמויי hepatocyte, ותאים נגזר רקמות. הפיתוח של organoids כבד מגביר את היישום של מודל במבחנה עבור מסכי סמים ורעילות בכבד בדיקות 16,17.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להקמת organoids כבד מן הפטוציטים ראשוניים מורין. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, הקמנו מערכת תרבות הפריה חוץ גופית של אורגנוידים hepatocyte עם שני זלוף של collagenase. אורגנוידים אלה ניתן לעבור להתרחבות ארוכת טווח במשך חודשים. התפקוד הפיזיולוגי שלהם עולה בקנה אחד עם hepatocytes. יתר על כן, אנו מספקים גם תיאור מפורט של כיצד לבצע מניפולציה גנטית, כגון זיהום lentivirus, התמלת siRNA, ו הנדסת CRISPR-Cas9 באמצעות organoids. התפשטות האורגנוידים של הפטוציטים שופכה אור על האפשרות להשתמש באורגנוידים כדי להבין ביולוגיה של הכבד ולפתח גישות לרפואה מותאמת אישית ותרגומית.
Protocol
Representative Results
Discussion
היכולת לתרבות הפטוסיטים בוגרים לאורך תקופות ארוכות היא בסיסית בחקר מדע בסיסי בכבד, טוקסיקולוגיה של תרופות וזיהומים של פונדקאי-מיקרוביולוגיה הפטטרופית כגון מלריה ווירוסי הפטיטיס. עם נישה מוגדרת היטב, הפרוטוקול כאן מקים מערכת תרבות להפטוציטים. פרוטוקול זה מניע hepatocytes בוגרים להתרחב בתרבות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפרופסור הנס פיקחס על שסיפק באדיבות את קווי התא כדי לייצר R-spondinant recombinant1. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים מתוכנית המחקר והפיתוג הלאומית של סין (2019YFA0111400), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31970779) ל- H.H., וקבוצת המחקר הבינתחומית והחדשנות לנוער של אוניברסיטת שאנדונג (2020QNQT003) ל- H.H.
Materials
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
