Summary
Et langsiktig ex vitro 3D organoid kultursystem ble etablert fra musen hepatocytter. Disse organoidene kan passeres og genetisk manipuleres ved lentivirusinfeksjon av shRNA / ektopisk konstruksjon, siRNA-transfeksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid.
Abstract
Leveren er det største organet i pattedyr. Det spiller en viktig rolle i glukoselagring, proteinsekresjon, metabolisme og avgiftning. Som eksekutor for de fleste leverfunksjonene har primære hepatocytter begrenset spredningskapasitet. Dette krever etablering av ex vivo hepatocyte ekspansjonsmodeller for leverfysiologisk og patologisk forskning. Her isolerte vi murine hepatocytter med to trinn collagenase perfusjon og etablerte en 3D organoid kultur som "mini-leveren" for å rekapitulere cellecelleinteraksjoner og fysiske funksjoner. Organoidene består av heterogene cellepopulasjoner, inkludert forfedre og modne hepatocytter. Vi introduserer prosessen i detalj for å isolere og kultur murine hepatocytter eller føtal hepatocytt for å danne organoider innen 2-3 uker og vise hvordan du passerer dem ved mekanisk pipettering opp og ned. I tillegg vil vi også introdusere hvordan du fordøyer organoidene i enkeltceller for lentivirusinfeksjon av shRNA / ektopisk konstruksjon, siRNA-transfeksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid. Organoidene kan brukes til legemiddelskjermer, sykdomsmodellering og grunnleggende leverforskning ved modellering av leverbiologi og patobiologi.
Introduction
Organoider er selvorganiserte, tredimensjonale (3D) in vitro-klynger som inkluderer selvfornyende stamceller og flerlinjede differensierte celler1,2. Organoidene i mange organer har blitt etablert enten fra pluripotente eller voksne stamceller av veldefinerte nisjefaktorer, inkludert tarmen, hjernen, tykktarmen, nyrene, leveren, bukspyttkjertelen, skjoldbruskkjertelen, magen, huden og lungen3,4,5,6,7 . Organoidene rekapitulerer fysiske cellefunksjoner ved å etterligne enten utvikling (stammer fra embryonale eller induserte pluripotente stamceller, PSCer) eller homeostase/regenereringsprogresjon (stammer fra voksne stamceller, ASC), som åpner nye veier i sykdomsforskning og terapi8,9.
Som det største organet i pattedyr er leveren hovedsakelig ansvarlig for lagring, metabolisme og avgiftning. To typer epitelceller, hepatocytter og cholangiocytter, konstruerer den grunnleggende enheten av en leverlobul. Hepatocytter er ansvarlige for 70-80% leverfunksjon10. Selv om leveren har bemerkelsesverdig regenereringskapasitet, skjer raskt tap av hepatocyttfunksjoner under tradisjonell monolayerkultur ved dysregulert cellepolarisering og dedifferentiasjon, noe som øker behovet for forskere og klinikere for å bygge "gap-brobygging" levermodeller i en tallerken. Inntil nylig hadde imidlertid ex vivo-utvidelsesmodellene fra primære hepatocytter ikke blitt godt etablert11,12,13,14,15. Leverorganoider kan etableres fra embryonale/induserte pluripotente stamceller, fibroblastkonvertering til hepatocyttlignende celler og vevsavledede celler. Utviklingen av leverorganoider øker anvendelsen av en in vitro-modell for legemiddelskjermer og levertoksisitetsanalyser16,17.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for etablering av leverorganoider fra murin primære hepatocytter. Ved å bruke denne protokollen setter vi opp et in vitro kultursystem av hepatocytt organoider med to perfusjoner av kollagenalus. Disse organoidene kan passeres for langsiktig ekspansjon i flere måneder. Deres fysiologiske funksjon er svært konsistent med hepatocytter. Videre gir vi også en detaljert beskrivelse av hvordan man utfører genetisk manipulasjon, for eksempel lentivirusinfeksjon, siRNA-transduksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid ved hjelp av organoider. Forplantningen av hepatocyttorganoider kaster lys over muligheten for å bruke organoider for å forstå leverbiologi og utvikle personlige og translasjonelle medisintilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museeksperimenter ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen ved School of Basic Medical Sciences ved Shandong University og ble utført i henhold til lisensen i henhold til hjemmekontor retningslinjer og forskrifter (Nei. ECSBMSSDU2019-2-079).
MERK: Denne protokollen brukes hovedsakelig til å dyrke 3D-organoider fra isolerte primære hepatocytter.
1. Etablering av Murine Hepatocyte Organoid Culture
MERK: Ekstracellulær matrise som Matrigel eller BME brukes som kjellermatrise til kulturorganoider. Oppbevar den ekstracellulære matrisen ved -20 °C og fortin den ved 4 °C eller på is. Hold den ekstracellulære matrisen på is under forsøkene. Vaskemediet er Avansert DMEM/F12 supplert med GlutaMAX, HEPES og penicillin/streptomycin. En standard inkubator (37 °C, fuktet atmosfære, 5 % CO2) brukes til organoid kultur.
- Fremstilling av materialer
- Forbered instrumentene som kreves for eksperimentet: museputen, sterile kirurgiske instrumenter som pinsett, saks, rør og en pumpe med en strømningshastighet på 2-10 ml / min.
- Forbered reagensene, inkludert perfusjonsbufferen, fordøyelsesbufferen og gjør dem sterile for hepatocytisolasjon. Tilsett fersk type IV kollagenase (0,10 mg/ml) og CaCl2 (0,50 M) og forvarm bufferen ved 37 °C i et vannbad.
- Forbered det betingede mediet for å produsere R-spondin 1 og alle kjemiske og vekstfaktorlagre i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Unngå ofte frysing og opptining av det betingede mediet og bestandene. Forbered kulturmediet friskt og bruk det innen en måned. Dette er avgjørende for organoid forming effektivitet.
- Murine hepatocytisolasjon ved leverperfusjon og fordøyelse
MERK: Mannlige eller kvinnelige mus mellom 12 uker og 6 måneder ble brukt til organoid kultur. Det ble ikke funnet noen åpenbare forskjeller i organoid dannelseseffektivitet fra donormusens alder innenfor dette området.- Euthanize musen med en etisk godkjent metode.
- Fest musen på museputen og rengjør magepels og hud med 70% alkohol. Utsett magen og løft leveren over resten av kroppen. Lag et midtlinje snitt for å eksponere leveren.
- Fyll røret som er festet til pumpen med perfusjonsbuffer. Lag et snitt av portalvenen (ca. 1/3 av venens diameter) og legg forsiktig et kateter inn i den. Løft opp fordøyelsesorganene for å hjelpe til med å sette inn kanylen. Et slips med den kirurgiske linjen er valgfritt for å unngå å skli ut og rupturere.
- Start pumpen og utfør perfusjon med en strømningshastighet på 5-7 ml/min med perfusjonsbuffer. Hvis leveren blir blek umiddelbart, kutt den dårligere vena cava for å la perfusjonsbufferen strømme gjennom hele leveren og drive blodet ut.
- Når utstrømningen blir ren, fjern kanylen. Det tar omtrent 5-10 minutter.
- Endre perfusjonsbufferen med forvarmet fordøyelsesbuffer med en hastighet på 5 ml/min. Ikke stopp pumpen før leveren blir myk og svulmer. Fjern kateteret når leveren slutter å hevelse.
MERK: Det er svært viktig å holde riktig fordøyelsestid for å unngå overdreven fordøyelse og få enkeltleverceller. - Klipp av leveren og legg den i en 100 mm plate fylt med 15 ml kaldt vaskemedium. Klipp leddbåndene med liten saks. Riv leveren i stykker med pipettespisser eller tang.
- Pipette opp og ned forsiktig for å frigjøre cellene til bufferen er mettet med celler (12-15 ganger). Hell cellesuspensjonen i et 50 ml rør gjennom 70 μm filtre.
- Sentrifuge i 1-3 minutter ved 50 x g og 4 °C. Dekanter supernatanten. Du kan eventuelt bruke cellene på nytt med vaskemedium eller bruke cellene direkte på nytt med kulturmedium. Tell cellene med et hemacytometer.
- Skill levende eller døde celler ved celletellermaskinen etter levende cellefargefarging.
MERK: Det er best å rense hepatocytter ved hjelp av kald 40% Percoll. Etter dette trinnet vil levedyktige hepatocytter være på bunnen av rørene.
- Organoid kultur og passasje
- Fjern supernatanten og resuspend hepatocyttene med en blanding av ekstracellulær matrise og kulturmedium i forholdet 3:1.
MERK: 10.000-20.000 celler i en 50-60 μL blanding per brønn for en 24-brønns plate anbefales. Det er viktig å jobbe raskt og holde blandingen på is gjennom hele prosessen. 200-500 organoider kan dannes ved denne konsentrasjonen. - Tilsett celle/blandingsdråpen på platen med små dråper for å hindre at dråpen kobles sammen. Inkuber platen i celleinkubatoren ved 37 °C, 5 % CO2 i 5–10 minutter, og ta deretter ut platen i 20–25 minutter til den ekstracellulære matrisen blir fast.
- Tilsett kulturmedium (500 μL per brønn for en 24-brønns plate) i brønnene og returner platen til inkubatoren for organoidkultur. Bytt medium hver 3-4 dager. Vær oppmerksom på organoidene til de er store nok til å bli passasjet.
MERK: En diameter på rundt 400-500 μm er egnet for passasje av hepatocyttorganoider. - Isoler organoider fra den ekstracellulære matrisen med den detaljerte prosessen nedenfor. Hold en pasteurpipette i en flamme for å begrense blenderåpningen (med ~1/2). Mekanisk pipette opp og ned 5-10 ganger for å dissosiere organoidene i mindre organoider under passivring.
MERK: Under passivring, lag forhåndsvaskede mikropipettespisser og rør med spissvaskbuffer for å unngå tap av organoider som stikker til rørene eller spissene.
- Fjern supernatanten og resuspend hepatocyttene med en blanding av ekstracellulær matrise og kulturmedium i forholdet 3:1.
2. Genetisk manipulering av murin hepatocytt organoider
- Enkeltceller fra hepatocyttorganoider
- Tilsett 500 μL kaldvask medium / celle utvinning løsning til hver brønn. Pipette opp og ned for å ødelegge celle / ekstracellulær matriseblanding med en mikropipette og deretter overføre organoid suspensjon til en 15 ml sentrifuge rør på is. Eventuelt drei røret opp og ned fra tid til annen for å tine blandingen grundig.
- Sentrifuge i 5 min ved 500-800 x g og 4 °C og kast supernatanten. Tilsett 1 ml trypsinoppløsning i pelletsen og pipette den for å blande. Inkuber ved 37 °C i 5-10 minutter og stopp deretter fordøyelsen ved å tilsette et 2x vaskemedium.
- Sentrifuge i 5 min ved 800 x g og 4 °C og kast supernatanten. Resuspend pellet med kulturmedium og telle cellene ved hjelp av et hemacytometer.
- siRNA eller plasmid transfeksjon
MERK: Mindre organoider med en diameter på mindre enn 50 μm eller enkeltceller fra hepatocyttorganoider transfektes med siRNA ved hjelp av lipofektamin eller plasmider ved hjelp av transfeksjonsreagens i henhold til produsentens instruksjoner.- Bland siRNA eller plasmider med transfeksjonsreagens. Tilsett enkeltceller fra organoider og Lipofectamine-RNA/Lipo-plasmidblandingen (f.eks. RNAiMAX) i 1-2 brønner i 24-brønnsplaten og sentrifugen i 1 time ved 500 x g og 32 °C. Etter sentrifugering inkuberer du platen i inkubatoren i 4-5 timer ved 37 °C.
- Samle cellene og frøet i ekstracellulær matrise med kulturmedium i en konsentrasjon på 10.000 celler per brønn. Endre mediet til valgbetingelsen to dager etter transfeksjonen. Vurder organoiddannelseseffektiviteten etter 10 dager.
- Lentiviral infeksjon
MERK: Små organoider med en diameter på mindre enn 50 μm eller enkeltceller fra hepatocyttorganoider er infisert av lentivirus ved hjelp av infeksjonsreagenser medium i henhold til produsentens instruksjoner.- Bland 250 μL av encellet suspensjon fra organoiden og 250 μL virale partikler i et 1,5 ml rør.
- Tallerken blandingen og sentrifugen i 1 time ved 500 x g og 32 °C. Inkuber i 4-5 timer ved 37 °C.
- Samle cellene og frøet i ekstracellulær matrise med kulturmedium. Endre mediet til valgbetingelsen to dager etter transfeksjonen. Vurder organoiddannelseseffektiviteten etter 10 dager.
- Genteknologi av CRISPR/Cas9
MERK: Vi tilbyr video for denne ytelsen i tilleggsmaterialene. Enkeltceller fra organoider ble smittet med lentivirus eller transfektert av plasmider som bærer sgRNA og Cas9.- Fordøye enkeltceller fra hepatocytt organoider dyrket og passasje i henhold til metoden ovenfor.
- Infiser enkeltceller med sgRNA ved hjelp av Opti-MEM medium og infeksjonsreagenser i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bland 250 μL av en encellet suspensjon og 250 μL virale partikler sammen i et 1,5 ml rør.
- Sentrifuger 500 μL-blandingen i 1 time ved 500 x g og 32 °C og inkuber deretter i 4-5 timer ved 37 °C.
- Samle celleoppheng og frø i ekstracellulær matrise. Vurder organoiddannelseseffektiviteten etter 10 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocytt organoider fra kvinnelige Alb-Cre; Rosa26-GFP-mus (8 uker) ble observert fem dager etter sådd (figur 1A). Organoidene sprer seg med Ki67 positiv farging (figur 1B). Forstyrrende uttrykk for representative gener i hepatocyttorganoider enten ved siRNA-transfeksjon eller lentivirusinfeksjon ble undersøkt av qRT-PCR og vestlig blot. Resultatene er vist i figur 2A og 2B. Figur 2C viser utvalgsresultatene fra leverorganoider etter 14 dagers behandling med RSL-3 og CRISPR/Cas9 genomisk bibliotekskjerm. Resultatene tyder på at disse organoidene kan utvides in vitro og genetisk manipulert.
Figur 1: Etablering og ekspansjon og murin hepatocyttorganoider. (A) Representativt bilde av hepatocyttorganoider fra Alb-Cre; Rosa26-GFP. Skalalinjen er 400 μm. (B) Representativt bilde av hele mount staning av hepatocytt organoider med b-catenin og Ki67 antistoffer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Genetisk manipulering av murin hepatocyttorganoider. (A) MRNA-nivået av Hdac3 og Wee1 i forhold til GAPDH i hepatocyttorganoider etter transfektert med siRNA. Feilfelt representerer standardfeil (n=3). (B) Vestlig boltanalyse av organoider smittet av lentivirus. (C) Representativt bilde av leverorganoider etter CRISPR-Cas9-skjerm i kulturmedium med RSL-3-valg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsmateriale. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til å dyrke modne hepatocytter over lange perioder er grunnleggende for å studere leverens grunnleggende vitenskap, narkotikatoksikologi og hepatotrope vertsmikrobiologiske infeksjoner som malaria og hepatittvirus. Med en veldefinert nisje setter protokollen her opp et kultursystem for hepatocytter. Denne protokollen driver modne hepatocytter til å ekspandere i 3D-kultur med en heterogenitet som rekapitulerer cellecelleinteraksjon, de fleste hepatocyttfunksjon og genetiske modifikasjoner, slik at utformingen av genfunksjonsstudier og nye terapeutiske veier mot regenerativ terapi.
Høy kvalitet hepatocytter er svært viktig for etablering og genetisk manipulering av hepatocytt organoider. Fordøyelsestiden for kollagenalissebehandling er ganske kritisk. Det er imidlertid fortsatt noen begrensninger i metoden. For det første foreslås flere nisjefaktorer i en studie for å hjelpe organoidene til å utvide seg lenger. For det andre liker organoidene ikke å være enkeltceller fortløpende og ofte. De hepatocyt-avledede organoidene ser ut til å rekapitulere den regenerative responsen til voksne lever etter delvis hepatektomi, men de er fortsatt forskjellige fra passiv modne hepatocytter.
Vær oppmerksom på at bruk av hepatocyttorganoider for å utvide hepatocytter åpner nye veier for levergenfunksjonsstudier. Kokulturerende organoider med karceller, immunceller og levervirus forventes å studere angiogenese, mikromiljøet og smittsom leversykdom ytterligere. Et standard høyskjermsystem med disse organoidene anbefales også for en ex vivo avgiftningsstudie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne avslører ingen konflikter.
Acknowledgments
Vi takker professor Hans Clevers for vennlig å gi cellelinjene for å produsere rekombinant R-spondin1. Dette arbeidet ble støttet av bevilgningene fra National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), National Natural Science Foundation of China (31970779) til H.H., og Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group of Shandong University (2020QNQT003) til H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
