Summary
Se estableció un sistema de cultivo de organoides 3D ex vitro a largo plazo a partir de hepatocitos de ratón. Estos organoides pueden ser atravesados y manipulados genéticamente por infección por lentivirus de construcción shRNA/ectópica, transfección de siRNA e ingeniería CRISPR-Cas9.
Abstract
El hígado es el órgano más grande en los mamíferos. Juega un papel importante en el almacenamiento de glucosa, la secreción de proteínas, el metabolismo y la desintoxicación. Como ejecutor de la mayoría de las funciones hepáticas, los hepatocitos primarios tienen una capacidad de proliferación limitada. Esto requiere el establecimiento de modelos de expansión de hepatocitos ex vivo para la investigación fisiológica y patológica del hígado. Aquí, aislamos los hepatocitos murinos por dos pasos de perfusión de colagenasa y establecimos un cultivo de organoides 3D como el "mini-hígado" para recapitular las interacciones célula-célula y las funciones físicas. Los organoides consisten en poblaciones celulares heterogéneas que incluyen progenitores y hepatocitos maduros. Introducimos el proceso en detalle para aislar y cultivar los hepatocitos murinos o el hepatocito fetal para formar organoides en 2-3 semanas y mostrar cómo pasarlos canalizando mecánicamente hacia arriba y hacia abajo. Además, también presentaremos cómo digerir los organoides en células individuales para la infección por lentivirus de la construcción shRNA / ectópica, la transfección de siRNA y la ingeniería CRISPR-Cas9. Los organoides se pueden utilizar para pruebas de detección de drogas, modelado de enfermedades e investigación hepática básica mediante el modelado de la biología hepática y la patobiología.
Introduction
Los organoides son grupos in vitro autoorganizados, tridimensionales (3D) que incluyen células madre autorrenovantes y células diferenciadas multilinaje1,2. Los organoides de muchos órganos se han establecido a partir de células madre pluripotentes o adultas por factores de nicho bien definidos, incluidos el intestino, el cerebro, el colon, el riñón, el hígado, el páncreas, la tiroides, el estómago, la piel y el pulmón3,4,5,6,7 . Los organoides recapitulan las funciones de las células físicas imitando el desarrollo (originado a partir de células madre pluripotentes embrionarias o inducidas, PSC) o la progresión de la homeostasis/regeneración (originada a partir de células madre adultas, ASC), lo que abre nuevas vías en la investigación y terapia de enfermedades8,9.
Como el órgano más grande en los mamíferos, el hígado es principalmente responsable del almacenamiento, el metabolismo y la desintoxicación. Dos tipos de tipos de células epiteliales, los hepatocitos y los colangiocitos, construyen la unidad básica de un lóbulo hepático. Los hepatocitos son responsables del 70-80% de la función hepática10. Aunque el hígado tiene una notable capacidad de regeneración, la rápida pérdida de las características de los hepatocitos ocurre durante el cultivo monocapa tradicional por polarización y desdiferenciación celular desregulada, lo que aumenta la necesidad de investigadores y médicos de construir modelos hepáticos de "puente de brecha" en un plato. Sin embargo, hasta hace poco los modelos de expansión ex vivo de los hepatocitos primarios no estaban bien establecidos11,12,13,14,15. Los organoides hepáticos se pueden establecer a partir de células madre pluripotentes embrionarias / inducidas, conversión de fibroblastos en células similares a hepatocitos y células derivadas de tejidos. El desarrollo de organoides hepáticos impulsa la aplicación de un modelo in vitro para cribados farmacológicos y ensayos de toxicidad hepática16,17.
Aquí, describimos un protocolo detallado para establecer organoides hepáticos a partir de hepatocitos primarios murinos. Mediante el uso de este protocolo, establecimos un sistema de cultivo in vitro de organoides de hepatocitos con dos perfusiones de colagenasa. Estos organoides pueden ser pasados para la expansión a largo plazo durante meses. Su función fisiológica es altamente consistente con los hepatocitos. Además, también proporcionamos una descripción detallada de cómo realizar la manipulación genética, como la infección por lentivirus, la transducción de siRNA y la ingeniería CRISPR-Cas9 utilizando organoides. La propagación de organoides de hepatocitos arrojó luz sobre la posibilidad de utilizar organoides para comprender la biología hepática y desarrollar enfoques de medicina personalizados y traslacionales.
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Protocol
Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Ciencias Médicas Básicas de la Universidad de Shandong y se llevaron a cabo de acuerdo con la Licencia bajo las pautas y regulaciones del Ministerio del Interior (No. ECSBMSSDU2019-2-079).
NOTA: Este protocolo se utiliza principalmente para cultivar organoides 3D a partir de hepatocitos primarios aislados.
1. Establecimiento del cultivo de organoides de hepatocitos murinos
NOTA: La matriz extracelular como Matrigel o BME se utilizan como matriz de sótano para cultivar organoides. Almacene la matriz extracelular a -20 °C y descongele previamente a 4 °C o sobre hielo. Mantenga la matriz extracelular en hielo durante los experimentos. El medio de lavado es Advanced DMEM/F12 suplementado con GlutaMAX, HEPES y penicilina/estreptomicina. Se utiliza una incubadora estándar (37 °C, atmósfera humidificada, 5% de CO2) para el cultivo de organoides.
- Preparación de materiales
- Prepare los instrumentos necesarios para el experimento: la almohada del ratón, instrumentos quirúrgicos estériles como pinzas, tijeras, tubos y una bomba con un caudal de 2-10 ml / min.
- Prepare los reactivos, incluido el tampón de perfusión, el tampón de digestión y hágalos estériles para el aislamiento de hepatocitos. Añadir colagenasa tipo IV fresca (0,10 mg/ml) y CaCl2 (0,50 M) y precalentar el tampón a 37 °C en un baño de agua.
- Prepare el medio condicional para producir R-spondina 1 y todas las existencias químicas y de factor de crecimiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Evite congelar y descongelar con frecuencia el medio condicional y las existencias. Preparar el medio de cultivo fresco y utilizarlo en el plazo de un mes. Esto es fundamental para la eficiencia de la formación de organoides.
- Aislamiento de hepatocitos murinos por perfusión hepática y digestión
NOTA: Se utilizaron ratones machos o hembras entre las edades de 12 semanas y 6 meses para el cultivo de organoides. No se encontraron diferencias obvias en la eficiencia de la formación de organoides con respecto a la edad del ratón donante dentro de este rango.- Sacrificar al ratón con un método éticamente aprobado.
- Fije el ratón en la almohada del ratón y limpie el pelaje abdominal y la piel con un 70% de alcohol. Exponga el abdomen y levante el hígado por encima del resto del cuerpo. Haga una incisión en la línea media para exponer el hígado.
- Llene el tubo conectado a la bomba con tampón de perfusión. Haga una incisión de la vena porta (aproximadamente 1/3 del diámetro de la vena) y coloque cuidadosamente un catéter en ella. Levante los órganos digestivos para ayudar a insertar la cánula. Un lazo con la línea quirúrgica es opcional para evitar deslizarse y romperse.
- Arranque la bomba y realice la perfusión a un caudal de 5-7 ml/min con tampón de perfusión. Si el hígado se pone pálido inmediatamente, corte la vena cava inferior para permitir que el tampón de perfusión fluya a través de todo el hígado y expulse la sangre.
- Cuando el flujo de salida se limpie, retire la cánula. Tarda unos 5-10 minutos.
- Cambie el tampón de perfusión con el tampón de digestión precalentado a una velocidad de 5 ml / min. No detenga la bomba hasta que el hígado se vuelva blando e hinchado. Retire el catéter cuando el hígado deje de hincharse.
NOTA: Es muy importante mantener un tiempo de digestión adecuado para evitar la digestión excesiva y obtener células hepáticas individuales. - Cortar el hígado y colocarlo en una placa de 100 mm llena de 15 ml de medio de lavado en frío. Corta los ligamentos con tijeras pequeñas. Rompa el hígado en pedazos con puntas de pipeta o fórceps.
- Pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para liberar las células hasta que el tampón esté saturado de células (12-15 veces). Vierta la suspensión celular en un tubo de 50 ml a través de filtros de 70 μm.
- Centrifugar durante 1-3 minutos a 50 x g y 4 °C. Decantar el sobrenadante. Opcionalmente, resuspend las células con medio de lavado o resuspend las células con medio de cultivo directamente. Cuente las células con un hemacitómetro.
- Distinguir las células vivas o muertas por la máquina de contador de células después de la tinción de tinte de células vivas.
NOTA: Lo mejor es purificar los hepatocitos usando Percoll frío al 40%. Después de este paso, los hepatocitos viables estarán en la parte inferior de los tubos.
- Cultivo y paso organoide
- Retire el sobrenadante y resuspenda los hepatocitos con una mezcla de matriz extracelular y medio de cultivo en una proporción de 3:1.
NOTA: Se recomiendan 10,000-20,000 células en una mezcla de 50-60 μL por pocillo para una placa de 24 pocillos. Es importante trabajar rápidamente y mantener la mezcla en hielo durante todo el proceso. Se podrían formar 200-500 organoides a esta concentración. - Agregue la gota de célula / mezcla en la placa con gotas pequeñas para evitar que la gota se conecte entre sí. Incubar la placa en la incubadora celular a 37 °C, 5% co2 durante 5-10 min y luego sacar la placa durante 20-25 min hasta que la matriz extracelular se vuelva sólida.
- Agregue el medio de cultivo (500 μL por pocillo para una placa de 24 pocillos) en los pozos y devuelva la placa a la incubadora para el cultivo de organoides. Cambie el medio cada 3-4 días. Observe los organoides hasta que sean lo suficientemente grandes como para ser pasados.
NOTA: Un diámetro con alrededor de 400-500 μm es adecuado para el paso de organoides hepatocitos. - Aísle los organoides de la matriz extracelular con el proceso detallado a continuación. Sostenga una pipeta Pasteur de vidrio en una llama para reducir su apertura (en ~ 1/2). Pipetear mecánicamente hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces para disociar los organoides en organoides más pequeños durante el pasaje.
NOTA: Durante el pasaje, prepare puntas y tubos de micropipeta prelavados con tampón de lavado de punta para evitar la pérdida de organoides que se adhieren a los tubos o puntas.
- Retire el sobrenadante y resuspenda los hepatocitos con una mezcla de matriz extracelular y medio de cultivo en una proporción de 3:1.
2. Manipulación genética de organoides hepatocitos murinos
- Células individuales de organoides de hepatocitos
- Agregue 500 μL de medio de lavado en frío/solución de recuperación celular a cada pozo. Pipete hacia arriba y hacia abajo para destruir la mezcla de matriz celular / extracelular con una micropipeta y luego transfiera la suspensión organoide a un tubo de centrífuga de 15 ml en hielo. Opcionalmente, gire el tubo hacia arriba y hacia abajo de vez en cuando para descongelar la mezcla a fondo.
- Centrifugar durante 5 min a 500-800 x g y 4 °C y desechar el sobrenadante. Agregue 1 ml de solución de tripsina al pellet y pipetearlo para mezclar. Incubar a 37 °C durante 5-10 min y luego detener la digestión agregando un volumen 2x de medio de lavado.
- Centrifugar durante 5 min a 800 x g y 4 °C y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con medio de cultivo y cuente las células con un hemacitómetro.
- transfección de siRNA o plásmido
NOTA: Los organoides más pequeños con un diámetro inferior a 50 μm o células individuales de organoides de hepatocitos se transfectan con siRNA utilizando lipofectamina o plásmidos que usan reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.- Mezcle siRNA o plásmidos con reactivo de transfección. Agregue células individuales de organoides y la mezcla lipofectamina-ARN/lipoplasma (por ejemplo, RNAiMAX) en 1-2 pocillos en la placa de 24 pocillos y la centrífuga durante 1 h a 500 x g y 32 °C. Después de la centrifugación, incube la placa en la incubadora durante 4-5 h a 37 ° C.
- Recolectar las células y semillas en matriz extracelular con medio de cultivo a una concentración de 10.000 células por pozo. Cambie el medio a la condición de selección dos días después de la transfección. Evaluar la eficiencia de la formación de organoides después de 10 días.
- Infección lentiviral
NOTA: Los organoides pequeños con un diámetro inferior a 50 μm o células individuales de organoides hepatocitos están infectados por lentivirus utilizando reactivos de infección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.- Mezclar 250 μL de la suspensión unicelular del organoide y 250 μL de partículas virales en un tubo de 1,5 ml.
- Envasar la mezcla y centrifugar durante 1 h a 500 x g y 32 °C. Incubar durante 4-5 h a 37 °C.
- Recolectar las células y semillas en matriz extracelular con medio de cultivo. Cambie el medio a la condición de selección dos días después de la transfección. Evaluar la eficiencia de la formación de organoides después de 10 días.
- Ingeniería genética por CRISPR/Cas9
NOTA: Proporcionamos video para esta actuación en los materiales complementarios. Las células individuales de los organoides fueron infectadas con lentivirus o transfectadas por plásmidos portadores de sgRNA y Cas9.- Digiera células individuales de organoides de hepatocitos cultivados y pase de acuerdo con el método anterior.
- Infectar células individuales con sgRNA utilizando medio Opti-MEM y reactivos de infección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Mezcle 250 μL de una suspensión unicelular y 250 μL de partículas virales en un tubo de 1,5 ml.
- Centrifugar la mezcla de 500 μL durante 1 h a 500 x g y 32 °C y luego incubar durante 4-5 h a 37 °C.
- Recoger la suspensión celular y la semilla en matriz extracelular. Evaluar la eficiencia de la formación de organoides después de 10 días.
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Representative Results
Los organoides hepatocitos de Alb-Cre femenino; Se observó ratón Rosa26-GFP (8 semanas) cinco días después de la siembra (Figura 1A). Los organoides están proliferando con tinción positiva de Ki67 (Figura 1B). La expresión interferente de genes representativos en organoides de hepatocitos, ya sea por transfección por siRNA o infección por lentivirus, se examinó mediante qRT-PCR y western blot. Los resultados se muestran en las Figuras 2A y 2B. La Figura 2C muestra los resultados de la selección de organoides hepáticos después de 14 días de tratamiento con RSL-3 y la pantalla de la biblioteca genómica CRISPR/Cas9. Los resultados sugieren que estos organoides podrían expandirse in vitro y manipularse genéticamente.
Figura 1: Establecimiento y expansión y de organoides hepatocitos murinos. A) Imagen representativa de organoides hepatocitos de Alb-Cre; Rosa26-GFP. La barra de escala es de 400 μm. (B) Imagen representativa de la montura completa de organoides hepatocitos con anticuerpos b-catenina y Ki67. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Manipulación genética de organoides de hepatocitos murinos. (A) El nivel de ARNm de Hdac3 y Wee1 en relación con GAPDH en organoides de hepatocitos después de ser transfectados con siRNA. Las barras de error representan errores estándar (n=3). (B) Análisis de pernos occidentales de organoides infectados por lentivirus. (C) Imagen representativa de organoides hepáticos después del cribado CRISPR-Cas9 en medio de cultivo con selección RSL-3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Material complementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La capacidad de cultivar hepatocitos maduros durante largos períodos es fundamental en el estudio de la ciencia básica del hígado, la toxicología de medicamentos y las infecciones hepatotrópicas de microbiología del huésped, como la malaria y los virus de la hepatitis. Con un nicho bien definido, el protocolo aquí establece un sistema de cultivo para hepatocitos. Este protocolo impulsa a los hepatocitos maduros a expandirse en cultivo 3D con una heterogeneidad que recapitula la interacción célula-célula, la función más hepatocitaria y las modificaciones genéticas, lo que permite el diseño de estudios de función génica y nuevas vías terapéuticas hacia la terapia regenerativa.
Los hepatocitos de alta calidad son muy importantes para el establecimiento y la manipulación genética de organoides de hepatocitos. El tiempo de digestión del tratamiento con colagenasa es bastante crítico. Sin embargo, sigue habiendo algunas limitaciones en el método. Primero, se sugieren más factores de nicho en un ensayo para ayudar a que los organoides se expandan por más tiempo. En segundo lugar, a los organoides no les gusta ser células individuales consecutiva y frecuentemente. Los organoides derivados de hepatocitos parecen recapitular la respuesta regenerativa de los hígados adultos después de la hepatectomía parcial, pero siguen siendo diferentes de los hepatocitos maduros inactivos.
Cabe destacar que el uso de organoides de hepatocitos para expandir los hepatocitos abre nuevas vías para los estudios de la función génica hepática. Se espera que los organoides de cultivo conjunto con células de vasos, células inmunes y virus hepáticos estudien más a fondo la angiogénesis, los microambientes y la enfermedad hepática infecciosa. También se recomienda un sistema de pantalla estándar de alto nivel con estos organoides para un estudio de desintoxicación ex vivo.
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Disclosures
Los autores no revelan conflictos.
Acknowledgments
Agradecemos al profesor Hans Clevers por proporcionar amablemente las líneas celulares para producir R-spondin1 recombinante. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Programa Nacional Clave de I + D de China (2019YFA0111400), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31970779) a H.H., y los Fondos para la Juventud Interdisciplinaria y el Grupo de Investigación de Innovación de la Universidad de Shandong (2020QNQT003) a H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
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