Summary
Ett långsiktigt ex vitro 3D organoid kultursystem inrättades från mus hepatocyter. Dessa organoider kan passeras och genetiskt manipuleras av lentivirus infektion av shRNA/ektopisk konstruktion, siRNA transfection och CRISPR-Cas9 teknik.
Abstract
Levern är det största organet hos däggdjur. Det spelar en viktig roll i glukoslagring, proteinsekresion, metabolism och avgiftning. Som exekutor för de flesta leverfunktioner har primära hepatocyter begränsad prolifererande kapacitet. Detta kräver upprättandet av ex vivo hepatocytexpansion modeller för leverfysiologisk och patologisk forskning. Här isolerade vi murin hepatocyter genom två steg av kollagenas perfusion och etablerade en 3D organoid kultur som "mini-lever" för att rekapitulera cell-cell interaktioner och fysiska funktioner. Organoiderna består av heterogena cellpopulationer inklusive stamceller och mogna hepatocyter. Vi introducerar processen i detalj för att isolera och odla murin hepatocyter eller fetala hepatocyter för att bilda organoider inom 2-3 veckor och visa hur man passerar dem genom att mekaniskt pipettera upp och ner. Dessutom kommer vi också att introducera hur man smälter organoiderna i enstaka celler för lentivirusinfektion av shRNA / utomkvedskonstruktion, siRNA-transfektion och CRISPR-Cas9-teknik. Organoiderna kan användas för läkemedelsskärmar, sjukdomsmodellering och grundläggande leverforskning genom modellering av leverbiologi och patobiologi.
Introduction
Organoider är självorganiserade, tredimensionella (3D) in vitro-kluster som inkluderar självförnyande stamceller och differentierade multi-lineageceller1,2. Organoiderna i många organ har etablerats antingen från pluripotenta eller vuxna stamceller av väldefinierade nischfaktorer inklusive tarmen, hjärnan, tjocktarmen, njuren, levern, bukspottkörteln, sköldkörteln, magen, huden och lungan3,4,5,6,7 . Organoiderna rekapitulerar fysiska cellfunktioner genom att efterlikna antingen utveckling (som härrör från embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller, PSC) eller homeostas/regenereringsprogression (härrör från vuxna stamceller, ASCs), vilket öppnar nya vägar inom sjukdomsforskning och terapi8,9.
Som det största organet hos däggdjur är levern främst ansvarig för lagring, metabolism och avgiftning. Två typer av epitelial celltyper, hepatocyter och cholangiocyter, konstruera den grundläggande enheten i en leverlobule. Hepatocyter är ansvariga för 70-80% av leverfunktionen10. Även om levern har anmärkningsvärd regenereringskapacitet, sker snabb förlust av hepatocytfunktioner under traditionell monolayer-odling av dysreglerad cellpolarisering och dedifferentiation, vilket ökar behovet av forskare och kliniker att bygga "gap-överbryggande" levermodeller i en maträtt. Fram till nyligen hade dock ex vivo-expansionsmodellerna från primära hepatocyter inte varit väletablerade11,12,13,14,15. Leverorganoider kan etableras från embryonala/inducerade pluripotenta stamceller, fibroblastkonvertering till hepatocytliknande celler och vävnadsbaserade celler. Utvecklingen av leverorganoider ökar tillämpningen av en in vitro-modell för läkemedelsskärmar och levertoxicitetsanalyser16,17.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att fastställa lever organoider från murine primära hepatocyter. Genom att använda detta protokoll, vi inrätta ett in vitro kultursystem av hepatocyt organoider med två perfusioner av kollagenas. Dessa organoider kan passeras för långsiktig expansion i månader. Deras fysiologiska funktion är mycket förenlig med hepatocyter. Dessutom ger vi också en detaljerad beskrivning av hur man utför genetisk manipulation, såsom lentivirusinfektion, siRNA-transduktion och CRISPR-Cas9-teknik med hjälp av organoider. Förökningen av hepatocytorganoider belyser möjligheten att använda organoider för att förstå leverbiologi och utveckla personliga och translationella medicinska metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mössexperiment godkändes av Animal Care and Use Committee vid School of Basic Medical Sciences vid Shandong University och utfördes enligt licensen enligt Home Office riktlinjer och förordningar (Nr. ECSBMSSDU2019-2-079).
OBS: Detta protokoll används främst för att odla 3D-organoider från isolerade primära hepatocyter.
1. Upprättande av Murine Hepatocyte Organoid Kultur
OBS: Extracellulär matris som Matrigel eller BME används som källarmatris för att odla organoider. Förvara den extracellulära matrisen vid -20 °C och förinstaller den vid 4 °C eller på is. Håll den extracellulära matrisen på is under experimenten. Tvättmediet är Advanced DMEM/F12 kompletterat med GlutaMAX, HEPES och penicillin/streptomycin. En standardinkubator (37 °C, fuktad atmosfär, 5% CO2) används för organoidkultur.
- Beredning av material
- Förbered de instrument som krävs för experimentet: muskudden, sterila kirurgiska instrument som pincett, sax, rör och en pump med en flödeshastighet på 2-10 ml/min.
- Förbered reagenserna inklusive perfusionsbufferten, matsmältningsbufferten och gör dem sterila för hepatocytisolering. Tillsätt färskt kollagenas av typ IV (0,10 mg/ml) och CaCl2 (0,50 M) och förvärm bufferten vid 37 °C i ett vattenbad.
- Förbered det villkorade mediet för att producera R-spondin 1 och alla kemiska och tillväxtfaktorlager enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Undvik att ofta frysa och tina det villkorliga mediet och lagren. Förbered odlingsmediet fräscht och använd det inom en månad. Detta är avgörande för organoidformningseffektivitet.
- Murin hepatocytisolering genom leverperfusion och matsmältning
OBS: Hanmöss eller honmöss mellan 12 veckor och 6 månader användes för organoid kultur. Inga uppenbara skillnader hittades i organoid bildandet effektivitet från givaren mus ålder inom detta intervall.- Avliva musen med en etiskt godkänd metod.
- Fäst musen på muskudden och rengör bukpälsen och huden med 70% alkohol. Exponera buken och lyft levern över resten av kroppen. Gör ett mittlinjesnitt för att exponera levern.
- Fyll röret som är anslutet till pumpen med perfusionsbuffert. Gör ett snitt av portalvenen (ca 1/3 av venens diameter) och placera försiktigt en kateter i den. Lyft upp matsmältningsorganen för att hjälpa till att sätta in kanylen. En slips med den kirurgiska linjen är valfritt för att undvika att glida ut och brista.
- Starta pumpen och utför perfusion med en flödeshastighet på 5-7 ml/min med perfusionsbuffert. Om levern blir blek omedelbart, skär den sämre vena cava för att låta perfusionsbufferten flöda genom hela levern och driva blodet ut.
- När utflödet blir rent, ta bort kanylen. Det tar ca 5-10 minuter.
- Ändra perfusionsbufferten med förvärmd rötningsbuffert med en hastighet av 5 ml/min. Stoppa inte pumpen förrän levern blir mjuk och sväller. Ta bort katetern när levern slutar svälla.
OBS: Det är mycket viktigt att hålla rätt matsmältningstid för att undvika överdriven matsmältning och få enstaka leverceller. - Skär av levern och placera den i en 100 mm tallrik fylld med 15 ml kalltvättsmedium. Skär ligamenten med en liten sax. Riv levern i bitar med pipettspetsar eller tångar.
- Pipettera upp och ner försiktigt för att frigöra cellerna tills bufferten är mättad med celler (12-15 gånger). Häll cellfjädringen i ett 50 ml-rör genom 70 μm filter.
- Centrifugera i 1-3 minuter vid 50 x g och 4 °C. Dekantera supernatanten. Alternativt återanvänder du cellerna med tvättmedium eller återanvänder cellerna direkt. Räkna cellerna med en hematometer.
- Urskilja levande eller döda celler med cellräknaren efter färgfärgning av levande celler.
OBS: Det är bäst att rena hepatocyter med kalla 40% Percoll. Efter detta steg kommer livskraftiga hepatocyter att vara längst ner i rören.
- Organoid kultur och passage
- Ta bort supernatanten och återanvänd hepatocyterna med en blandning av extracellulär matris och odlingsmedium i ett förhållande av 3:1.
OBS: 10 000-20 000 celler i en 50-60 μL-blandning per brunn för en 24-välplatta rekommenderas. Det är viktigt att arbeta snabbt och hålla blandningen på is under hela processen. 200-500 organoider kan bildas vid denna koncentration. - Tillsätt cell-/blandningsdroppen på plattan med små droppar för att förhindra att droppen ansluts ihop. Inkubera plattan i cellinkubatorn vid 37 °C, 5% CO2 i 5-10 min och ta sedan ut plattan i 20-25 min tills den extracellulära matrisen blir fast.
- Tillsätt odlingsmedium (500 μL per brunn för en 24-brunnsplatta) i brunnarna och återför plattan till inkubatorn för organoidkultur. Byt medium var 3-4 dagar. Observera organoiderna tills de är tillräckligt stora för att passeras.
OBS: En diameter med cirka 400-500 μm är lämplig för passage av hepatocytorganoider. - Isolera organoider från den extracellulära matrisen med den detaljerade processen nedan. Håll en pasteurpipeett i glas i en låga för att begränsa dess bländare (med ~1/2). Mekaniskt pipettera upp och ner 5-10 gånger för att separera organoiderna till mindre organoider under passaging.
OBS: Under passaging, förbered förtvättade mikropipettespetsar och rör med spetstvättbuffert för att undvika förlust av organoider som fastnar på rören eller spetsarna.
- Ta bort supernatanten och återanvänd hepatocyterna med en blandning av extracellulär matris och odlingsmedium i ett förhållande av 3:1.
2. Genetisk manipulering av murin hepatocytorganoider
- Enstaka celler från hepatocytorganoider
- Tillsätt 500 μL kalltvättsmedium/cellåtervinningslösning till varje brunn. Pipettera upp och ner för att förstöra cell/extracellulär matrisblandning med en mikropipette och överför sedan den organoida suspensionen till ett 15 ml centrifugrör på is. Vrid eventuellt röret upp och ner då och då för att tina blandningen noggrant.
- Centrifugera i 5 min vid 500-800 x g och 4 °C och kassera supernatanten. Tillsätt 1 ml trypsinlösning till pelleten och pipetten den för att blanda. Inkubera vid 37 °C i 5-10 min och stoppa sedan matsmältningen genom att tillsätta en 2x volym tvättmedel.
- Centrifugera i 5 min vid 800 x g och 4 °C och kassera supernatanten. Resuspend pelleten med odlingsmedium och räkna cellerna med hjälp av en hemacytometer.
- siRNA eller plasmidtransfektion
OBS: Mindre organoider med en diameter mindre än 50 μm eller enstaka celler från hepatocytorganoider transfekteras med siRNA med lipofectamin eller plasmider med hjälp av transfektreagens enligt tillverkarens instruktioner.- Blanda siRNA eller plasmider med transfekt reagens. Tillsätt enstaka celler från organoider och Lipofectamine-RNA/Lipo-plasmidblandningen (t.ex. RNAiMAX) i 1-2 brunnar i 24-brunnsplattan och centrifugen i 1 h vid 500 x g och 32 °C. Efter centrifugering, inkubera plattan i inkubatorn i 4-5 h vid 37 °C.
- Samla cellerna och fröet i extracellulär matris med odlingsmedium i en koncentration av 10 000 celler per brunn. Ändra mediet till urvalsvillkoret två dagar efter transfektion. Utvärdera organoidbildningseffektiviteten efter 10 dagar.
- Lentiviral infektion
OBS: Små organoider med en diameter mindre än 50 μm eller enstaka celler från hepatocytorganoider smittas av lentivirus med hjälp av infektionsreagensmedium enligt tillverkarens instruktioner.- Blanda 250 μL av encellssuspensionen från organoiden och 250 μL viruspartiklar i ett 1,5 ml-rör.
- Plätera blandningen och centrifugen i 1 h vid 500 x g och 32 °C. Inkubera i 4-5 h vid 37 °C.
- Samla cellerna och fröet i extracellulär matris med odlingsmedium. Ändra mediet till urvalsvillkoret två dagar efter transfektion. Utvärdera organoidbildningseffektiviteten efter 10 dagar.
- Genteknik av CRISPR/Cas9
OBS: Vi tillhandahåller video för denna prestanda i de kompletterande materialen. Enstaka celler från organoider smittades med lentivirus eller transfected av plasmider som bär sgRNA och Cas9.- Smält enstaka celler från hepatocytorganoider odlade och passage enligt ovanstående metod.
- Infektera enstaka celler med sgRNA med Opti-MEM medium och infektionsreagens enligt tillverkarens instruktioner.
- Blanda 250 μL av en encellsfjädring och 250 μL viruspartiklar tillsammans i ett 1,5 ml rör.
- Centrifugera 500 μL-blandningen i 1 h vid 500 x g och 32 °C och inkubera sedan i 4-5 timmar vid 37 °C.
- Samla cellfjädringen och fröet i extracellulär matris. Utvärdera organoidbildningseffektiviteten efter 10 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocytorganoiderna från kvinnliga Alb-Cre; Rosa26-GFP mus (8 veckor) observerades fem dagar efter sådd (figur 1A). Organoiderna fortplantar sig med Ki67 positiv färgning (figur 1B). Störande uttryck av representativa gener i hepatocyt organoider antingen genom siRNA transfection eller lentivirus infektion undersöktes av qRT-PCR och västra blot. Resultaten visas i figur 2A och 2B. Figur 2C visar urvalsresultaten från leverorganoider efter 14 dagars behandling med RSL-3 och CRISPR/Cas9 genomiska biblioteksskärmen. Resultaten tyder på att dessa organoider kan utökas in vitro och genetiskt manipuleras.
Figur 1: Etablering och expansion samt av murin hepatocytorganoider. A) Representativ bild av hepatocytorganoider från Alb-Cre. Rosa26-GFP. Skalstången är 400 μm. (B) Representativ bild av hela monterings staning av hepatocytorganoider med b-catenin och Ki67 antikroppar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Genetisk manipulering av murin hepatocytorganoider. (A) MRNA-nivån av Hdac3 och Wee1 i förhållande till GAPDH i hepatocytorganoider efter transfekterad med siRNA. Felstaplar representerar standardfel (n=3). B) Western bolt analys av organoider infekterade av lentivirus. (C) Representativ bild av leverorganoider efter CRISPR-Cas9-skärmen i odlingsmedium med RSL-3-urval. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande material. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att odla mogna hepatocyter under långa perioder är grundläggande för att studera lever grundläggande vetenskap, läkemedelstoxikologi och hepatotropa värdmikrobiologi infektioner såsom malaria och hepatitvirus. Med en väldefinierad nisch inrättar protokollet här ett kultursystem för hepatocyter. Detta protokoll driver mogna hepatocyter att expandera i 3D-kulturen med en heterogenitet som rekapitulerar cell-cellinteraktion, de flesta hepatocytfunktion och genetiska modifieringar, vilket möjliggör design av genfunktionsstudier och nya terapeutiska vägar mot regenerativ terapi.
Högkvalitativa hepatocyter är mycket viktiga för etablering och genetisk manipulering av hepatocytorganoider. Matsmältningstiden för kollagenasbehandling är ganska kritisk. Det finns dock fortfarande vissa begränsningar i metoden. För det första föreslås mer nischfaktorer i en studie för att hjälpa organoiderna att expandera längre. För det andra gillar organoiderna inte att vara enstaka celler i följd och ofta. Hepatocyt-härledda organoider verkar rekapitulera regenerativa svar vuxna lever efter partiell hepatectomy, men de skiljer sig fortfarande från quiescent mogna hepatocyter.
Observera att använda hepatocytorganoider för att expandera hepatocyter öppnar nya vägar för levergenfunktionsstudier. Samodling av organoider med kärlceller, immunceller och levervirus förväntas ytterligare studera angiogenes, mikromiljö och infektionslever. Ett standard hög genomgående skärmsystem med dessa organoider rekommenderas också för en ex vivo avgiftning studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna avslöjar inga konflikter.
Acknowledgments
Vi tackar professor Hans Clevers för att han vänligen tillhandahåller cellinjerna för att producera rekombinant R-spondin1. Detta arbete stöddes av bidrag från National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), National Natural Science Foundation of China (31970779) till H.H., och Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group of Shandong University (2020QNQT003) till H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
