Summary
Fare hepatatitlerinden uzun süreli ek vitro 3D organoid kültür sistemi kuruldu. Bu organoidler shRNA/ektopik yapı, siRNA transfeksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliğinin lentivirüs enfeksiyonu ile geçiş ve genetik olarak manipüle edilebilir.
Abstract
Karaciğer memelilerdeki en büyük organdır. Glikoz depolama, protein salgılama, metabolizma ve detoksifikasyonda önemli bir rol oynar. Karaciğer fonksiyonlarının çoğu için uygulayıcı olarak, birincil hepatositler sınırlı çoğalma kapasitesine sahiptir. Bu, karaciğer fizyolojik ve patolojik araştırmalar için ex vivo hepatosit genleşme modellerinin kurulmasını gerektirir. Burada, murine hepatositleri iki adım kollajenaz perfüzyonu ile izole ettik ve hücre-hücre etkileşimlerini ve fiziksel fonksiyonları yeniden oluşturmak için 'mini karaciğer' olarak 3D organoid kültürü kurduk. Organoidler, progenitörler ve olgun hepatositler de dahil olmak üzere heterojen hücre popülasyonlarından oluşur. 2-3 hafta içinde organoid oluşturmak için murine hepatositleri veya fetal hepatositleri izole etmek ve kültüre etmek ve mekanik olarak yukarı ve aşağı pipetleyerek nasıl geçişlerini göstereceğimizi göstermek için süreci ayrıntılı olarak tanıtıyoruz. Ek olarak, shRNA / ektopik yapı, siRNA transfeksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliğinin lentivirüs enfeksiyonu için organoidlerin tek hücreye nasıl sindirileceğini de tanıtacağız. Organoidler, karaciğer biyolojisi ve patobiyolojisi modellenerek ilaç elekleri, hastalık modellemesi ve temel karaciğer araştırmaları için kullanılabilir.
Introduction
Organoidler, kendi kendini yenileyen kök hücreleri ve çok soylu farklılaştırılmış hücreleri içeren kendi kendine organize edilmiş, üç boyutlu (3D) in vitro kümelerdir1,2. Birçok organın organoidleri, bağırsak, beyin, kolon, böbrek, karaciğer, pankreas, tiroid, mide, cilt ve akciğer3,4,5,6,7 gibi iyi tanımlanmış niş faktörlerle pluripotent veya yetişkin kök hücrelerinden kurulmuştur. . Organoidler, hastalık araştırma ve tedavisinde yeni yollar açan gelişim (embriyonik veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden, PSC'lerden) veya homeostaz/rejenerasyon ilerlemesini (yetişkin kök hücrelerinden, ASC'lerden kaynaklanır) taklit ederek fiziksel hücre fonksiyonlarını yeniden kapsüllerler8,9.
Memelilerde en büyük organ olarak, karaciğer esas olarak depolama, metabolizma ve detoksifikasyondan sorumludur. İki tür epitel hücre tipi, hepatositler ve kolanjiositler, bir karaciğer lobüllerinin temel birimini oluşturur. Hepatositler karaciğer fonksiyonlarının % 70-80'inden sorumludur10. Karaciğer olağanüstü rejenerasyon kapasitesine sahip olmasına rağmen, hepatosit özelliklerinin hızlı kaybı, düzensiz hücre polarizasyonu ve adanmışlık ile geleneksel monolayer kültleme sırasında meydana gelir ve bu da araştırmacıların ve klinisyenlerin bir tabakta 'boşluk köprüleme' karaciğer modelleri inşa etme ihtiyacını arttırır. Bununla birlikte, yakın zamana kadar birincil hepatositlerden ex vivo genişletme modelleri iyi kurulmamıştı11,12,13,14,15. Karaciğer organoidleri embriyonik/indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden, fibroblast hepatosit benzeri hücrelere ve dokudan türetilmiş hücrelerden kurulabilir. Karaciğer organoidlerinin gelişimi, ilaç elekleri ve karaciğer toksisitesi tahlilleri için bir in vitro modelin uygulanmasını artırır16,17.
Burada, murine primer hepatositlerden karaciğer organoidleri oluşturmak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak, kollajenazın iki perfüzyonu ile hepatosit organoidlerinden oluşan bir in vitro kültür sistemi kurduk. Bu organoidler aylarca uzun süreli genişleme için geçiş yapılabilir. Fizyolojik fonksiyonları hepatositlerle oldukça uyumludur. Ayrıca, organoidler kullanılarak lentivirüs enfeksiyonu, siRNA transdüksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliği gibi genetik manipülasyonun nasıl gerçekleştirildiğinin ayrıntılı bir açıklamasını da sunuyoruz. Hepatosit organoidlerinin yayılması, karaciğer biyolojisini anlamak ve kişiselleştirilmiş ve çevirisel tıp yaklaşımları geliştirmek için organoid kullanma olasılığına ışık tutmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fare deneyleri Shandong Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Okulu Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve İçişleri Bakanlığı yönergeleri ve yönetmelikleri uyarınca Lisansa göre gerçekleştirilmiştir (Hayır. ECSBMSSDU2019-2-079).
NOT: Bu protokol esas olarak izole primer hepatositlerden 3D organoidleri kültüre etmek için kullanılır.
1. Murine Hepatosit Organoid Kültürünün Kurulması
NOT: Matrigel veya BME gibi hücre dışı matris, organoidleri kültüre etmek için bodrum matrisi olarak kullanılır. Hücre dışı matrisi -20 °C'de saklayın ve 4 °C'de veya buzda önceden çözün. Deneyler sırasında hücre dışı matrisi buzun üzerinde tutun. Yıkama ortamı GlutaMAX, HEPES ve penisilin/streptomisi ile desteklenmiş Gelişmiş DMEM/F12'dir. Organoid kültürü için standart bir inkübatör (37 °C, nemlendirilmiş atmosfer, %5 CO2) kullanılır.
- Malzemelerin hazırlanması
- Deney için gerekli aletleri hazırlayın: fare yastığı, cımbız, makas, tüp gibi steril cerrahi aletler ve 2-10 mL / dk akış hızına sahip bir pompa.
- Perfüzyon tamponu, sindirim tamponu dahil olmak üzere reaktifleri hazırlayın ve hepatosit izolasyonu için steril hale getirin. Taze tip IV kollajenaz (0,10 mg/mL) ve CaCl2 (0,50 M) ekleyin ve bir su banyosunda 37 °C'de tamponu önceden ısıtın.
- R-spondin 1 ve tüm kimyasal ve büyüme faktörü stoklarını üreticinin talimatlarına göre üretmek için koşullu ortamı hazırlayın.
NOT: Koşullu ortamı ve stokları sık sık dondurmaktan ve çözmekten kaçının. Kültür ortamını taze hazırlayın ve bir ay içinde kullanın. Bu organoid şekillendirme verimliliği için kritik öneme sahiptir.
- Karaciğer perfüzyonu ve sindirimi ile Murine hepatosit izolasyonu
NOT: Organoid kültürü için 12 hafta ile 6 ay arasında erkek veya dişi fareler kullanılmıştır. Bu aralıktaki donör fare çağından organoid oluşum verimliliğinde belirgin bir farka rastlanmadı.- Fareyi etik olarak onaylanmış bir yöntemle ötenazi.
- Fareyi fare yastığına sabitleyin ve karın kürkü ve cildini% 70 alkolle temizleyin. Karnı açığa çıkar ve karaciğeri vücudun geri kalanının üzerine kaldırın. Karaciğeri açığa çıkarmak için bir orta hat kesiği yapın.
- Pompaya bağlı tüpü perfüzyon tamponu ile doldurun. Portal damarın bir kesisini yapın (damarın çapının yaklaşık 1/3'ü) ve içine dikkatlice bir kateter yerleştirin. Kanın yerleştirilmesine yardımcı olmak için sindirim organlarını kaldırın. Dışarı kaymayı ve yırtılmayı önlemek için cerrahi hatla bir kravat isteğe bağlıdır.
- Pompayı çalıştırın ve perfüzyon tamponu ile 5-7 mL/dk debide perfüzyon gerçekleştirin. Karaciğer hemen soluklaşırsa, perfüzyon tamponun tüm karaciğerden akmasını ve kanı dışarı sürmesini sağlamak için alt vena kavayı kesin.
- Akış temizlendiğinde, kanı çıkarın. Yaklaşık 5-10 dakika sürer.
- Perfüzyon tamponunu önceden ısıtılmış sindirim tamponu ile 5 mL/dk hızında değiştirin. Karaciğer yumuşayana ve şişene kadar pompayı durdurmayın. Karaciğer şişmeyi bıraktığında kateteri çıkarın.
NOT: Aşırı sindirimden kaçınmak ve tek karaciğer hücreleri almak için uygun sindirim süresini tutmak çok önemlidir. - Karaciğeri kesin ve 15 mL soğuk yıkama ortamı ile dolu 100 mm'lik bir tabağa yerleştirin. Bağları küçük makasla kesin. Karaciğeri pipet uçları veya asalarla parçalara ayırın.
- Tampon hücrelere doyurulana kadar hücreleri serbest bırakmak için pipet yukarı ve aşağı doğru (12-15 kez). Hücre süspansiyonu 70 μm filtreler aracılığıyla 50 mL'lik bir tüpe dökün.
- 50 x g ve 4 °C'de 1-3 dakika santrifüjleyin. Üsttanan decant. İsteğe bağlı olarak, hücreleri yıkama ortamıyla yeniden biriktirin veya hücreleri doğrudan kültür ortamıyla yeniden biriktirin. Hemacytometer ile hücreleri sayın.
- Canlı hücre boyası boyamadan sonra canlı veya ölü hücreleri hücre sayacı makinesiyle ayırt edin.
NOT: Hepatositleri soğuk % 40 Percoll kullanarak saflaştırmak en iyisidir. Bu adımdan sonra, uygulanabilir hepatositler tüplerin dibinde olacaktır.
- Organoid kültürü ve geçişi
- Üstnatantı çıkarın ve hepatositleri hücre dışı matris ve kültür ortamının bir karışımıyla 3:1 oranında yeniden canlandırın.
NOT: 24 kuyulu bir plaka için kuyu başına 50-60 μL karışımda 10.000-20.000 hücre önerilir. Hızlı bir şekilde çalışmak ve karışımı işlem boyunca buzda tutmak önemlidir. Bu konsantrasyonda 200-500 organoid oluşabilir. - Damlacıkların birbirine bağlanmasını önlemek için küçük damlacıklarla tabağa hücre/karışım damlasını ekleyin. Plakayı hücre inkübatöründe 37 °C'de, %5 CO2'de 5-10 dakika kuluçkaya yatırın ve hücre dışı matris katılaşana kadar plakayı 20-25 dakika dışarı alın.
- Kuyulara kültür ortamı (24 kuyu plakası için kuyu başına 500 μL) ekleyin ve plakayı organoid kültürü için inkübatöre geri verin. Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin. Organoidleri geçilecek kadar büyük olana kadar gözlemleyin.
NOT: Hepatatosit organoidlerinin geçişi için yaklaşık 400-500 μm'lik bir çap uygundur. - Aşağıdaki ayrıntılı işlemle organoidleri hücre dışı matristen izole edin. Diyaframını daraltmak için bir cam Pasteur pipeti alev içinde tutun (~1/2). Organoidleri pas geçme sırasında daha küçük organoidlere ayrıştırmak için mekanik olarak 5-10 kez yukarı ve aşağı pipet.
NOT: Geçiş sırasında, tüplere veya uçlara yapışan organoidlerin kaybını önlemek için önceden yıkanmış mikropipette uçları ve tüpleri uç yıkama tamponu ile hazırlayın.
- Üstnatantı çıkarın ve hepatositleri hücre dışı matris ve kültür ortamının bir karışımıyla 3:1 oranında yeniden canlandırın.
2. Murine hepatosit organoidlerinin genetik manipülasyonu
- Hepatosit organoidlerinden tek hücreler
- Her kuyuya 500 μL soğuk yıkama orta/hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı hücre / hücre dışı matris karışımını bir mikropipette ile yok etmek ve daha sonra organoid süspansiyonu buz üzerinde 15 mL santrifüj tüpüne aktarmak için. İsteğe bağlı olarak, karışımı iyice eritmek için tüpü zaman zaman yukarı ve aşağı çevirin.
- 500-800 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj ve süpernatantı atın. Peletin içine 1 mL tripsin çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin. 37 °C'de 5-10 dakika kuluçkaya yaslanın ve ardından 2x hacimli yıkama ortamı ekleyerek sindirimi durdurun.
- 800 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj ve süpernatantı atın. Peleti kültür ortamı ile yeniden biriktirin ve hemacytometer kullanarak hücreleri sayın.
- siRNA veya plazmid transfeksiyon
NOT: 50 μm'den daha küçük bir çapa sahip küçük organoidler veya hepatosit organoidlerinden tek hücreli olanlar, üreticinin talimatlarına göre Lipofectamin veya plazmidler kullanılarak siRNA ile transfeksiyon reaktifi kullanılarak transkrna ile enfekte edilir.- SiRNA veya plazmidleri transfeksiyon reaktifi ile karıştırın. Organoidlerden ve Lipofectamine-RNA/Lipo-plazmid karışımından (örneğin, RNAiMAX) tek hücreleri 24 kuyu plakasındaki 1-2 kuyuya ekleyin ve 500 x g ve 32 °C'de 1 saat santrifüj ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, plakayı 37 °C'de 4-5 saat boyunca inkübatörde kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri ve tohumu hücre dışı matriste, kuyu başına 10.000 hücre konsantrasyonunda kültür ortamı ile toplayın. Ortamı transfectiondan iki gün sonra seçim koşuluna değiştirin. 10 gün sonra organoid oluşum verimliliğini değerlendirin.
- Lentiviral enfeksiyon
NOT: Çapı 50 μm'den az olan küçük organoidler veya hepatosit organoidlerinden tek hücreli olanlar, üreticinin talimatlarına göre enfeksiyon reaktifleri ortamı kullanılarak lentivirüs ile enfekte olur.- Organoidden tek hücreli süspansiyonun 250 μL'sini ve 1,5 mL'lik bir tüpte 250 μL viral partikülleri karıştırın.
- Karışımı ve santrifüjü 500 x g ve 32 °C'de 1 saat boyunca plakalayın. 37 °C'de 4-5 saat kuluçkaya yaslanın.
- Kültür ortamı ile hücre dışı matriste hücreleri ve tohumu toplayın. Ortamı transfectiondan iki gün sonra seçim koşuluna değiştirin. 10 gün sonra organoid oluşum verimliliğini değerlendirin.
- CRISPR/Cas9 tarafından genetik mühendisliği
NOT: Ek malzemelerde bu performans için video sağlıyoruz. Organoidlerden tek hücreler lentivirüs ile enfekte edildi veya sgRNA ve Cas9 taşıyan plazmidler tarafından trans enfekte edildi.- Yukarıdaki yönteme göre kültürlenmiş ve geçişli hepatosit organoidlerinden tek hücreleri sindirin.
- Üreticinin talimatlarına göre Opti-MEM ortamı ve enfeksiyon reaktifleri kullanarak tek hücreleri sgRNA ile enfekte edin.
- 1,5 mL'lik bir tüpte 250 μL tek hücreli süspansiyon ve 250 μL viral partikülü karıştırın.
- 500 μL karışımı 500 x g ve 32 °C'de 1 saat santrifüjleyin ve ardından 37 °C'de 4-5 saat kuluçkaya yatırın.
- Hücre süspansiyonu ve tohumu hücre dışı matriste toplayın. 10 gün sonra organoid oluşum verimliliğini değerlendirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dişi Alb-Cre'den hepatatit organoidleri; Rosa26-GFP fare (8 hafta) tohumlamadan beş gün sonra gözlendi (Şekil 1A). Organoidler Ki67 pozitif lekeleme ile çoğalmaktadır (Şekil 1B). Hepatosit organoidlerinde siRNA transfeksiyonu veya lentivirüs enfeksiyonu ile temsili genlerin müdahale edici ekspresyonu qRT-PCR ve batı blotu ile incelendi. Sonuçlar Şekil 2A ve 2B'de gösterilmiştir. Şekil 2C , RSL-3 ve CRISPR/Cas9 genomik kütüphane ekranı ile 14 günlük tedaviden sonra karaciğer organoidlerinden elde edilen seçim sonuçlarını göstermektedir. Sonuçlar, bu organoidlerin in vitro olarak genişletilebileceğini ve genetik olarak manipüle edilebileceğini göstermektedir.
Şekil 1: Murine hepatosit organoidlerinin kurulması ve genişletilmesi. (A) Alb-Cre'den hepatosit organoidlerinin temsili görüntüsü; Rosa26-GFP. Ölçek çubuğu 400 μm'dir. (B) Hepatosit organoidlerinin b-catenin ve Ki67 antikorları ile tüm montaj staninginin temsili görüntüsüdür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Murine hepatosit organoidlerinin genetik manipülasyonu. (A) SiRNA ile transkrna edildikten sonra hepatosit organoidlerinde GAPDH'ye göre Hdac3 ve Wee1'in mRNA düzeyi. Hata çubukları standart hataları temsil eder (n=3). (B) Lentivirüs ile enfekte olan organoidlerin Batı cıvata analizi. (C) RSL-3 seçimi ile kültür ortamında CRISPR-Cas9 ekranından sonra karaciğer organoidlerinin temsili görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Malzeme. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olgun hepatositleri uzun süreler boyunca kültürleme yeteneği, karaciğer temel bilimi, ilaç toksikolojisi ve sıtma ve hepatit virüsleri gibi hepatotropik konak mikrobiyoloji enfeksiyonlarının incelenmesinde temeldir. İyi tanımlanmış bir niş ile, protokol burada hepatositler için bir kültür sistemi kurar. Bu protokol, olgun hepatositlerin hücre-hücre etkileşimini, çoğu hepatosit fonksiyonunu ve genetik değişiklikleri yeniden sağlayan bir heterojenlikle 3D kültüründe genişlemesini sağlar ve gen fonksiyon çalışmalarının ve rejeneratif tedaviye yönelik yeni terapötik yolların tasarlanmasına izin verir.
Yüksek kaliteli hepatositler hepatat organoidlerinin kurulması ve genetik manipülasyonu için çok önemlidir. Kollajenaz tedavisinin sindirim süresi oldukça kritiktir. Yine de yöntemde bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, organoidlerin daha uzun süre genişlemesine yardımcı olmak için bir denemede daha niş faktörler önerilmektedir. İkincisi, organoidler ardışık ve sık olarak tek hücreli olmayı sevmezler. Hepatosit türevi organoidler, kısmi hepatektomi sonrası yetişkin karaciğerlerinin rejeneratif yanıtını yeniden özetler gibi görünmektedir, ancak yine de sessiz olgun hepatositlerden farklıdırlar.
Not olarak, hepatositleri genişletmek için hepatosit organoidlerini kullanmak karaciğer gen fonksiyon çalışmaları için yeni yollar açar. Organoidlerin damar hücreleri, bağışıklık hücreleri ve hepatik virüslerle birlikte anjiogenez, mikroçevronmentler ve enfeksiyöz karaciğer hastalıklarını daha fazla incelemesi beklenmektedir. Ex vivo detoksifikasyon çalışması için bu organoidlere sahip standart bir yüksek ekran sistemi de önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çatışma açıklamaz.
Acknowledgments
Profesör Hans Clevers'e rekombinant R-spondin1 üretmek için hücre hatlarını sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı'ndan (2019YFA0111400), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (31970779) H.H.'ye ve Shandong Üniversitesi Gençler Arası ve İnovasyon Araştırma Grubu'ndan (2020QNQT003) H.H.'ye verilen hibelerle desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
