Summary
تم إنشاء نظام ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد سابقة طويلة الأجل من خلايا الكبد الماوس. يمكن تمرير هذه organoids والتلاعب بها وراثيا عن طريق عدوى الفيروس العدسي من بناء shRNA / خارج الرحم ، انتقال الحمض النووي الريبي والهندسة CRISPR-Cas9.
Abstract
الكبد هو أكبر عضو في الثدييات. وهو يلعب دورا هاما في تخزين الجلوكوز، إفراز البروتين، والتمثيل الغذائي وإزالة السموم. كمنفذ لمعظم وظائف الكبد، خلايا الكبد الأولية لديها قدرة محدودة على الانتشار. وهذا يتطلب إنشاء نماذج التوسع في خلايا الكبد في الجسم الحي السابق للبحوث الفسيولوجية والمرضية الكبد. هنا، قمنا بعزل خلايا الكبد المورين بخطوتين من التشوش الكولاجيني وأنشأنا ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد ك "الكبد المصغر" لتلخيص التفاعلات بين الخلايا الخلوية والوظائف الفيزيائية. تتكون الأجهزة العضوية من مجموعات خلايا غير متجانسة بما في ذلك السلف والخلايا الكبدية الناضجة. نحن نقدم هذه العملية بالتفصيل لعزل وثقافة خلايا الكبد مورين أو خلايا الكبد الجنينية لتشكيل organoids في غضون 2-3 أسابيع وتبين كيفية تمريرها عن طريق الأنابيب ميكانيكيا صعودا وهبوطا. وبالإضافة إلى ذلك، سوف نقدم أيضا كيفية هضم organoids في خلايا واحدة لعدوى الفيروس العدسي من shRNA / البناء خارج الرحم، سيرنا transfection و CRISPR-Cas9 الهندسة. يمكن استخدام الأجهزة العضوية لشاشات الأدوية ونمذجة الأمراض وأبحاث الكبد الأساسية من خلال نمذجة بيولوجيا الكبد وعلم الأحياء المرضية.
Introduction
الأجهزة العضوية هي ذاتية التنظيم وثلاثية الأبعاد (3D) في مجموعات المختبر التي تشمل الخلايا الجذعية ذاتية التجديد والخلايا المتباينة متعددة النسب1,2. تم إنشاء الأعضاء العضوية للعديد من الأعضاء إما من خلايا جذعية متعددة القدرات أو بالغة من خلال عوامل متخصصة محددة جيدا بما في ذلك الأمعاء والدماغ والقولون والكلى والكبد والبنكرياس والغدة الدرقية والمعدة والجلد والرئة3،4،5،6،7 . تقوم الأجهزة العضوية بتلخيص وظائف الخلايا الفيزيائية عن طريق محاكاة التطور (الناشئ عن الخلايا الجذعية الجنينية أو المستحثة متعددة القدرات ، PSCs) أو تطور التوازن / التجديد (نشأت من الخلايا الجذعية البالغة ، ASCs) ، مما يفتح آفاقا جديدة في أبحاث الأمراض والعلاج 8،9.
كأكبر عضو في الثدييات ، فإن الكبد مسؤول بشكل رئيسي عن التخزين والتمثيل الغذائي وإزالة السموم. نوعين من أنواع الخلايا الظهارية، خلايا الكبد وcholeangiocytes، وبناء الوحدة الأساسية لفصيص الكبد. خلايا الكبد هي المسؤولة عن 70-80٪ من وظائف الكبد10. على الرغم من أن الكبد لديه قدرة تجديد ملحوظة ، إلا أن الخسارة السريعة لميزات الخلايا الكبدية تحدث أثناء زراعة أحادية الطبقة التقليدية عن طريق استقطاب الخلايا غير التنظيمية والتمايز ، مما يزيد من حاجة الباحثين والأطباء لبناء نماذج الكبد "لسد الفجوة" في الطبق. ومع ذلك ، حتى وقت قريب لم تكن نماذج توسع الجسم الحي السابق من خلايا الكبد الأولية راسخة 11،12،13،14،15. يمكن إنشاء أعضاء الكبد من الخلايا الجذعية الجنينية / المستحثة متعددة القدرات ، وتحويل الخلايا الليفية إلى خلايا تشبه خلايا الكبد ، والخلايا المشتقة من الأنسجة. تطوير organoids الكبد يعزز تطبيق نموذج في المختبر لشاشات المخدرات وسمية الكبد المقايسات16,17.
هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لإنشاء organoids الكبد من خلايا الكبد مورين الأولية. باستخدام هذا البروتوكول، وضعنا نظام ثقافة في المختبر من organoids الكبدية مع اثنين من perfusions من الكولاجيناز. يمكن تمرير هذه الأجهزة العضوية للتوسع على المدى الطويل لعدة أشهر. وظيفتها الفسيولوجية تتفق إلى حد كبير مع خلايا الكبد. علاوة على ذلك، نقدم أيضا وصفا مفصلا لكيفية إجراء التلاعب الجيني، مثل عدوى الفيروس العدسي، ونقل سيرنا، والهندسة CRISPR-Cas9 باستخدام الأجهزة العضوية. انتشار الخلايا الكبدية organoids تسليط الضوء على إمكانية استخدام organoids لفهم بيولوجيا الكبد وتطوير نهج الطب الشخصية والترجمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان واستخدامه التابعة لكلية العلوم الطبية الاساسية بجامعة شاندونغ على جميع تجارب الفئران وتم تنفيذها وفقا للترخيص بموجب الخطوط العامة واللوائح الداخلية ( رقم 1000 / . ECSBMSSDU2019-2-079).
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول بشكل رئيسي لزراعة الأجهزة العضوية ثلاثية الأبعاد من خلايا الكبد الأولية المعزولة.
1. إنشاء مورين هيباتوسيت الثقافة Organoid
ملاحظة: يتم استخدام مصفوفة خارج الخلية مثل Matrigel أو BME كمصفوفة الطابق السفلي لزراعة organoids. تخزين مصفوفة خارج الخلية في -20 درجة مئوية وقبل ذوبانه في 4 درجة مئوية أو على الجليد. الحفاظ على مصفوفة خارج الخلية على الجليد خلال التجارب. وسيلة الغسيل هي DMEM/F12 المتقدمة تكملها غلوتاماكس، HEPES والبنسلين / ستريبتوميسين. تستخدم حاضنة قياسية (37 درجة مئوية، جو رطب، 5٪ ثاني أكسيد الكربون) في زراعة الأعضاء العضوية.
- إعداد المواد
- إعداد الأدوات اللازمة للتجربة: وسادة الماوس، والأدوات الجراحية العقيمة مثل ملاقط، مقص، أنابيب، ومضخة مع معدل تدفق 2-10 مل / دقيقة.
- إعداد الكواشف بما في ذلك العازلة النتوعة، وحاجز الهضم وجعلها عقيمة لعزل خلايا الكبد. أضف الكولاجيناز من النوع الرابع الطازج (0.10 ملغم/مل) وCaCl2 (0.50 م) ودفئ العازلة مسبقا عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- إعداد المتوسطة المشروطة لإنتاج R-spondin 1 وجميع المخزونات الكيميائية وعامل النمو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: تجنب تجميد و إذابة المتوسطة الشرطية و الأسهم بشكل متكرر. إعداد الثقافة متوسطة طازجة واستخدامها في غضون شهر واحد. هذا أمر بالغ الأهمية لكفاءة تشكيل الجهازية.
- عزل خلايا الكبد مورين عن طريق تغلغل الكبد والهضم
ملاحظة: تم استخدام الفئران الذكور أو الإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 12 أسبوعا و 6 أشهر لثقافة الجهازية. لم يتم العثور على اختلافات واضحة في كفاءة تكوين الجهازية من عمر الماوس المانحة داخل هذا النطاق.- قتل الفأر باستخدام طريقة معتمدة أخلاقيا.
- إصلاح الماوس على وسادة الماوس وتنظيف فرو البطن والجلد مع الكحول 70٪. كشف البطن ورفع الكبد فوق بقية الجسم. إجراء شق خط الوسط لفضح الكبد.
- ملء أنبوب تعلق على المضخة مع المخزن المؤقت perfusion. إجراء شق الوريد المدخل (حوالي 1/3 من قطر الوريد) ووضع بعناية القسطرة في ذلك. رفع الجهاز الهضمي للمساعدة في إدراج القنية. التعادل مع الخط الجراحي اختياري لتجنب الانزلاق والتمزق.
- بدء تشغيل المضخة وأداء التخبط بمعدل تدفق 5-7 مل / دقيقة مع المخزن المؤقت perfusion. إذا أصبح الكبد شاحبا على الفور ، فقطع الوريد الأجوف السفلي للسماح للحاجز التغلغلي بالتدفق عبر الكبد بأكمله ودفع الدم إلى الخارج.
- عندما يصبح التدفق نظيفا ، قم بإزالة القنية. يستغرق حوالي 5-10 دقائق.
- تغيير المخزن المؤقت perfusion مع المخزن المؤقت الهضم قبل تسخينها بمعدل 5 مل / دقيقة. لا توقف المضخة حتى يصبح الكبد لينة وتضخم. إزالة القسطرة عندما يتوقف الكبد تورم.
ملاحظة: من المهم جدا الحفاظ على وقت الهضم المناسب لتجنب الهضم المفرط والحصول على خلايا الكبد واحدة. - قطع الكبد ووضعه في لوحة 100 ملم مليئة 15 مل من المتوسط غسل الباردة. قطع الأربطة بمقص صغير. تمزق الكبد إلى قطع مع نصائح ماصة أو ملقط.
- ماصة صعودا وهبوطا بلطف للافراج عن الخلايا حتى يتم تشبع العازلة مع الخلايا (12-15 مرات). صب تعليق الخلية في أنبوب 50 مل من خلال مرشحات 70 ميكرومتر.
- جهاز طرد مركزي لمدة 1-3 دقائق عند 50 × ز و 4 درجات مئوية. (ديكانت) العملاق. اختياريا، إعادة إنفاق الخلايا مع غسل المتوسطة أو إعادة إنفاق الخلايا مع ثقافة المتوسطة مباشرة. عد الخلايا مع مقياس الخلايا.
- تمييز الخلايا الحية أو الميتة بواسطة آلة عداد الخلية بعد تلطيخ صبغة الخلية الحية.
ملاحظة: فمن الأفضل لتنقية خلايا الكبد باستخدام البرد 40٪ Percoll. بعد هذه الخطوة، ستكون خلايا الكبد القابلة للحياة في الجزء السفلي من الأنابيب.
- الثقافة العضوية والمرور
- إزالة supernatant وإعادة إنفاق خلايا الكبد مع خليط من مصفوفة خارج الخلية والثقافة المتوسطة في نسبة 3:1.
ملاحظة: يوصى ب 10,000-20,000 خلية في خليط 50-60 ميكرولتر لكل بئر للوحة من 24 بئرا. من المهم العمل بسرعة والحفاظ على الخليط على الجليد طوال العملية. 200-500 يمكن تشكيل الأجهزة العضوية في هذا التركيز. - إضافة الخلية / الخليط قطرة على لوحة مع قطرات صغيرة لمنع القطيرات من الاتصال معا. احتضان لوحة في حاضنة الخلية في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 5-10 دقيقة ومن ثم تأخذ لوحة من 20-25 دقيقة حتى تصبح المصفوفة خارج الخلية الصلبة.
- إضافة ثقافة المتوسطة (500 ميكرولتر لكل بئر للوحة 24 جيدا) في الآبار والعودة لوحة إلى حاضنة لثقافة organoid. تغيير المتوسطة كل 3-4 أيام. مراقبة organoids حتى تكون كبيرة بما يكفي لتمريرها.
ملاحظة: قطر حوالي 400-500 ميكرومتر مناسب لمرور الخلايا الكبدية العضوية. - عزل organoids من مصفوفة خارج الخلية مع عملية مفصلة أدناه. عقد ماصة باستور الزجاج في لهب لتضييق فتحة العدسة (من قبل ~ 1/2). ماصة ميكانيكيا صعودا وهبوطا 5-10 مرات لتفكيك organoids إلى الأعضاء أصغر أثناء passaging.
ملاحظة: أثناء passaging، وإعداد نصائح micropipette غسلها مسبقا وأنابيب مع تلميح غسل العازلة لتجنب فقدان organoids الشائكة إلى أنابيب أو نصائح.
- إزالة supernatant وإعادة إنفاق خلايا الكبد مع خليط من مصفوفة خارج الخلية والثقافة المتوسطة في نسبة 3:1.
2. التلاعب الجيني من organoids الخلايا الكبدية مورين
- خلايا واحدة من الخلايا الكبدية العضوية
- إضافة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد متوسط / الخلية الانتعاش لكل بئر. ماصة صعودا وهبوطا لتدمير خليط مصفوفة الخلية / خارج الخلية مع micropipette ومن ثم نقل تعليق organoid إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل على الجليد. اختياريا، بدوره أنبوب صعودا وهبوطا من وقت لآخر لإذابة الخليط جيدا.
- جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500-800 × ز و 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant. إضافة 1 مل من محلول تريبسين إلى بيليه وماصة لخلط. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة ثم وقف الهضم عن طريق إضافة حجم 2X من المتوسط غسل.
- الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 800 × ز و 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant. Resuspend بيليه مع ثقافة المتوسطة وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
- سيرنا أو plasmid العدوى
ملاحظة: يتم تحويل الأعضاء الأصغر التي يقل قطرها عن 50 ميكرومتر أو خلايا واحدة من الأجهزة العضوية الكبدية مع سيرنا باستخدام ليبفيكتامين أو بلازميدات باستخدام كاشف العدوى وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.- مزيج سيرنا أو البلازميدات مع كاشف العدوى. إضافة خلايا واحدة من الأجهزة العضوية وخليط Lipofectamine-RNA/Lipo-plasmid (على سبيل المثال، RNAiMAX) إلى 1-2 آبار في لوحة 24 جيدا وجهاز الطرد المركزي لمدة 1 ساعة في 500 × ز و 32 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، احتضان لوحة في الحاضنة لمدة 4-5 ساعة في 37 درجة مئوية.
- جمع الخلايا والبذور في مصفوفة خارج الخلية مع متوسطة الثقافة بتركيز 10،000 خلية لكل بئر. تغيير الوسط إلى شرط التحديد بعد يومين من العدوى. تقييم كفاءة تكوين الجهازية بعد 10 أيام.
- عدوى لينتيفيرال
ملاحظة: تصاب الأعضاء الصغيرة التي يقل قطرها عن 50 ميكرومتر أو خلايا واحدة من الأجهزة العضوية الكبدية بفيروس العدس باستخدام كاشفات العدوى المتوسطة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.- مزيج 250 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة من organoid و 250 ميكرولتر من الجسيمات الفيروسية في أنبوب 1.5 مل.
- صفيح الخليط والطرد المركزي لمدة ساعة واحدة عند 500 × جم و32 درجة مئوية. حضانة لمدة 4-5 ساعة في 37 درجة مئوية.
- جمع الخلايا والبذور في مصفوفة خارج الخلية مع ثقافة المتوسطة. تغيير الوسط إلى شرط التحديد بعد يومين من العدوى. تقييم كفاءة تكوين الجهازية بعد 10 أيام.
- الهندسة الوراثية بواسطة CRISPR/Cas9
ملاحظة: نحن نقدم الفيديو لهذا الأداء في المواد التكميلية. أصيبت خلايا واحدة من الأجهزة العضوية بفيروس العدسي أو مصابة بplasmids تحمل sgRNA و Cas9.- هضم خلايا واحدة من organoids الكبدي المستزرعة والمرور وفقا للطريقة المذكورة أعلاه.
- تصيب خلايا واحدة مع sgRNA باستخدام Opti-MEM المتوسطة وشفوات العدوى وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- اخلط 250 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة و250 ميكرولتر من الجسيمات الفيروسية معا في أنبوب 1.5 مل.
- طارد مركزي خليط 500 ميكرولتر لمدة ساعة واحدة عند 500 × ز و 32 درجة مئوية ثم يحتضن لمدة 4-5 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- جمع تعليق الخلية والبذور في مصفوفة خارج الخلية. تقييم كفاءة تكوين الجهازية بعد 10 أيام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الأجهزة الكبدية من أنثى Alb-Cre; وقد لوحظ فأر Rosa26-GFP (8 أسابيع) بعد خمسة أيام من البذر (الشكل 1A). وتنتشر الأجهزة العضوية مع تلطيخ إيجابي Ki67 (الشكل 1B). التدخل في التعبير عن الجينات التمثيلية في organoids خلايا الكبد إما عن طريق العدوى سيرنا أو عدوى الفيروس العدسي تم فحصها من قبل qRT-PCR ولطخة الغربية. تظهر النتائج في الشكل 2A و 2B. الشكل 2C يظهر نتائج الاختيار من organoids الكبد بعد 14 يوما من العلاج مع RSL-3 وشاشة مكتبة الجينوم CRISPR / Cas9. وتشير النتائج إلى أن هذه الأعضاء يمكن توسيعها في المختبر والتلاعب بها وراثيا.
الشكل 1: إنشاء وتوسيع وor organoids الخلايا الكبدية مورين. (أ) صورة تمثيلية لأجهزة عضوية خلايا الكبد من ألبيك - كر؛ روزا26-GFP. شريط المقياس هو 400 ميكرومتر (ب) صورة تمثيلية من ستانينج جبل كامل من organoids الكبدية مع الأجسام المضادة ب كاتينين وKi67. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التلاعب الوراثي من organoids الخلايا الكبدية مورين. (أ) مستوى مرنا من Hdac3 و Wee1 بالنسبة ل GAPDH في organoids الكبدية بعد المصابة مع سيرنا. تمثل أشرطة الخطأ الأخطاء القياسية (n = 3). (ب) تحليل الترباس الغربية من organoids المصابين بفيروس العدسي. (ج) صورة تمثيلية من organoids الكبد بعد CRISPR-Cas9 الشاشة في الثقافة المتوسطة مع اختيار RSL-3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المواد التكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
القدرة على زراعة خلايا الكبد الناضجة على مدى فترات طويلة أمر أساسي في دراسة العلوم الأساسية للكبد، وعلم السموم المخدرات والتهابات الميكروبيولوجيا المضيفة الهباتوتروبية مثل الملاريا وفيروسات التهاب الكبد. مع مكانة محددة جيدا ، يضع البروتوكول هنا نظاما ثقافة للخلايا الكبدية. يدفع هذا البروتوكول خلايا الكبد الناضجة إلى التوسع في الثقافة ثلاثية الأبعاد مع عدم التجانس الذي يلخص التفاعل بين الخلية والخلية ، ومعظم وظائف خلايا الكبد والتعديلات الوراثية ، مما يسمح بتصميم دراسات وظائف الجينات والطرق العلاجية الجديدة نحو العلاج التجديدي.
خلايا الكبد عالية الجودة مهمة جدا لإنشاء والتلاعب الجيني من organoids الكبدية. وقت الهضم من العلاج collagenase أمر بالغ الأهمية. لا تزال هناك بعض القيود في الأسلوب على الرغم من. أولا ، يتم اقتراح المزيد من العوامل المتخصصة في تجربة لمساعدة organoids توسيع لفترة أطول. ثانيا، لا تحب الأعضاء العضوية أن تكون خلايا مفردة على التوالي وفي كثير من الأحيان. يبدو أن الأجهزة العضوية المشتقة من خلايا الكبد تلخص الاستجابة التجديدية للكبد البالغ بعد استئصال الكبد الجزئي ، ولكنها لا تزال مختلفة عن خلايا الكبد الناضجة.
من الجدير بالذكر، وذلك باستخدام organoids خلايا الكبد لتوسيع خلايا الكبد فتح مسارات جديدة لدراسات وظائف الجينات الكبد. ومن المتوقع أن يزيد الاستزراع المشترك للأعضاء مع خلايا الأوعية والخلايا المناعية والفيروسات الكبدية من دراسة تولد الأوعية والفيروسات الدقيقة وأمراض الكبد المعدية. يوصى أيضا بنظام قياسي عالي في جميع أنحاء الشاشة مع هذه الأجهزة العضوية لدراسة إزالة السموم من الجسم الحي السابق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يكشف صاحبا البلاغ عن أي تضارب.
Acknowledgments
نشكر البروفيسور هانز ذكيز على التكرم بتوفير خطوط الخلية لإنتاج R-spondin1 المؤتلف. وقد دعم هذا العمل المنح المقدمة من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFA0111400)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31970779) إلى H.H.، ومجموعة أبحاث صناديق الشباب متعددة التخصصات والابتكار في جامعة شاندونغ (2020QNQT003) إلى H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
