Her præsenterer vi, hvordan man genererer en ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) -associeret Hepatocellulært Carcinom (HCC) zebrafiskmodel for at studere virkningen af kolesteroloverskud på levermikromiljø og immuncellelandskab.
Leverkræft er i øjeblikket den tredje førende årsag til kræftrelateret død på verdensplan, og hepatocellulært karcinom (HCC) tegner sig for 75-90% af alle leverkræfttilfælde. Med indførelsen af effektive behandlinger til forebyggelse og behandling af hepatitis B / C, ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) og den mere aggressive form kendt som ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH) bliver hurtigt de største risikofaktorer for at udvikle HCC i moderne samfund. For bedre at forstå den rolle, NASH har på udviklingen af HCC, designede vi en NASH-associeret HCC-zebrafisk. Zebrafisklarvernes optiske klarhed og genetiske trækkraft gør dem til en tiltalende og kraftfuld model til at studere levermikromiljøet og immuncellesammensætningen ved hjælp af ikke-invasiv fluorescerende levende billeddannelse. Denne protokol beskriver, hvordan man bruger en NASH-associeret HCC-zebrafiskmodel til at undersøge effekten af kolesteroloverskud i levermikromiljøet og dets indvirkning på immuncellesammensætningen i tidlige stadier af sygdommen. Først fodrer vi HCC-larver (s704Tg), som udtrykker hepatocytspecifik aktiveret beta-catenin, med en 10% højt kolesteroltal diæt i 8 dage for at udvikle en NASH-associeret HCC-model. Her beskriver vi, hvordan man kan bruge forskellige transgene linjer til at evaluere flere tidlige malignitetsfunktioner i leveren ved ikke-invasiv konfokal mikroskopi, såsom leverareal, celle og nuklear morfologi (hepatocytområde, nukleart område, nukleart: cytoplasmatisk forhold (N: C-forhold), nuklear cirkularitet, mikronuklei / nuklear brokulationsscore) og angiogenese. Derefter viser vi ved hjælp af transgene linjer med mærkede immunceller (neutrofiler, makrofager og T-celler), hvordan man analyserer leverimmuncellesammensætning i NASH-associerede HCC-larver. De beskrevne teknikker er nyttige til at evaluere levermikromiljø og immuncellesammensætning ved tidlige hepatocarcinogenesestadier, men de kan også ændres til at studere sådanne funktioner i andre leversygdomsmodeller.
Hepatocellulært karcinom (HCC) er en aggressiv kræft med begrænsede terapeutiske muligheder. Det har vist sig, at op mod 30% af alle patienter med HCC er overvægtige og har NASH, en aggressiv form for NAFLD 1,2,3,4. Forbrug af kalorierige kostvaner øger tilgængeligheden af fedtsyrer drastisk, der forårsager lokale og systemiske metaboliske skift og udløser steatose, hepatocytskade, betændelse og fibrose – alle nøglefunktioner i NASH. NASH-progression til HCC involverer ophobning af lipider i leveren, hvilket udløser betændelse og ændret immuncellesammensætning 5,6,7. Det er af særlig interesse og betydning at forstå, hvordan levermikromiljøet og immuncellelandskabet ændres under leversygdomsprogression, og hvordan det ændrer sig på grund af visse etiologiske faktorer. For bedre at identificere den indvirkning, som kolesteroloverskud har på levermikromiljø og immuncellelandskab, har vi udviklet en unik zebrafiskmodel af NASH-associeret HCC. Brugen af denne model har givet os en bedre forståelse af virkningen af kost og overernæring på levermikromiljø og leversygdomsprogression.
Pattedyrmodeller, såsom mus og humane vævsprøver, har været afgørende for at forstå patogenesen af steatohepatitis og steatose8. Mus er den foretrukne model for leversygdom og kræft, men de mangler optisk klarhed på celleniveau, mens humane vævsprøver ofte mangler det 3D-miljø, som dyremodeller er i stand til at efterligne. Disse forhindringer har gjort Zebrafish til en stærk model i forskningsmiljøet. Zebrafisk har bemærkelsesværdige ligheder med mennesker, med mindst 70% genbevarelse. De opretholder levermikromiljø, levercellulær sammensætning, funktion, signalering og respons på skader 9,10. Ved hjælp af en diæt med højt kolesteroltal (HCD) i kombination med en etableret transgen zebrafiskmodel af HCC har vi udviklet en zebrafiskmodel af NASH-associeret HCC.
Her præsenterer vi en protokol, der forklarer, hvordan man genererer en NASH-associeret HCC-zebrafiskmodel, og hvordan man studerer levermikromiljø og adresserer tidlige malignitetsfunktioner in vivo. Ved hjælp af ikke-invasiv konfokal mikroskopi i kombination med zebrafisktransgene linjer med fluorescerende mærket hepatocytmembran og kerne kan vi adressere tidlige malignitetsfunktioner ved at analysere levermorfologi (areal, volumen og overfladeareal), celle- og nuklear morfologi (hepatocytområde, nukleart område, N: C-forhold, nuklear cirkularitet, mikrokerner / nuklear herniationsscore) og angiogenese (kartæthed). Immuncellemikromiljø er også et vigtigt træk ved hepatocarcinogenese11,12,13,14, derfor viser vi også, hvordan man analyserer leverimmuncellesammensætning i NASH-associerede HCC-larver ved hjælp af transgene zebrafisklinjer med mærkede immunceller (neutrofiler, makrofager og T-celler). De beskrevne teknikker er unikke for modellen og yderst nyttige til at evaluere levermikromiljø og immuncellesammensætning i leversygdomsprogression.
Med en øget forekomst af HCC, specifikt NASH-induceret HCC, er det af stor betydning at have mere effektive modeller til at studere de cellulære og molekylære mekanismer, der er involveret i NASH-associeret HCC. Dekonvolution af celle-celle interaktioner i leveren er afgørende for bedre at forstå leversygdom progression og hepatocarcinogenese. Den tilgang, der er beskrevet i denne protokol, tilbyder en unik måde at analysere leversygdomsprogression in vivo og ikke-invasivt.
Forberedelse af kost er afgørende for succesen med at etablere en NASH-associeret HCC-model. Det er vigtigt at lade diethylether fordampe fuldstændigt inde i røghætten for at undgå skadelige virkninger, mens du forbereder diæter til zebrafisk. For at bruge disse kostvaner med larver (5-12 dage efter befrugtning) er det ekstremt vigtigt at male kosten op i fine partikler for at sikre larvernes fødeindtag. Anvendelsen af fluorescerende mærkede fedtsyreanaloger kan bruges til at evaluere fødeindtagelse i larver.
Før larverne placeres i avlskasserne og påbegyndes fodringsproceduren, er det afgørende at sikre, at eksperimentel prøveudtagning ensartes ved at blande larver fra forskellige plader. Dette trin er vigtigt, da forskellige mikromiljøer, der begynder på dag 0, fremmes i hver af pladerne og kan påvirke inflammatorisk respons.
Et andet vigtigt skridt er at tælle larverne for at vide, hvor meget mad der er behov for til hver foderkasse. Hvis mængden af mad ikke er tilstrækkelig til antallet af larver, der er til stede i hver kasse, vil et af de to scenarier forekomme: 1) larver vil blive underfodret; 2) larver vil blive overfødt. Unøjagtig fodring vil føre til usunde forhold forbundet med underernæring eller overernæring, såsom betændelse, hvilket drastisk vil påvirke levermikromiljøet. Hvis der opstår unøjagtig fodring, vil larver vise bevægelsesproblemer. På dette udviklingsstadium bør larver svømme intensivt, derfor hvis der opdages bevægelsesproblemer, blev larver opdrættet under usunde forhold (underernæring eller udsættelse for giftige doser kolesterol på grund af overfeeding). Af denne grund skal fodringsprocedurer kontrolleres tæt for både kostvaner, normal og kolesterolberiget. Nogle assays kan udføres for hurtigt at behandle nøjagtigheden af fodring og sundhed af larver, herunder tilstedeværelse af hepatomegali (leverstørrelse) og betændelse i væv og organer, især lever og tarm (synlig øget infiltration af neutrofiler og makrofager).
Daglig rengøring og udskiftning af 95% af E3 er afgørende for at reducere væksten af mikroorganismer i foderkasserne og forbedre larvernes sundhed og overlevelse. Alternativt kan larver placeres i et enkeltstående racksystem. For de bedste resultater skal du placere 60-80 larver i en 3-liters tank. Hold vandstrømmen på minimumsniveauet ved at justere strømmen til en hurtigt dryppende tilstand og fodre larver 3-4 mg to gange om dagen (AM og PM). Vandstrømmen skal kontrolleres regelmæssigt for at sikre korrekt strømning i hver tank. I vores laboratorium giver denne metode os 95-100% overlevelse med kortvarig fodring af 10% HCD. Desuden reducerede denne metode i høj grad arbejdsbyrden forbundet med den daglige rengøring og vandudveksling, der er nødvendig i den beskrevne statiske fodringsprotokol.
Mens vi brugte en 10% kolesterolberiget diæt til at inducere NASH i en kortvarig eksponering (5 dage er nok til at inducere steatohepatitis), kan diætændringer udføres og udvides til at bruge fructose 18, fedtsyrer (såsom palmitinsyre)19 eller fodringsprotokoller, der kan udvides ved hjælp af en 4% kolesterolberiget diæt20. I øjeblikket er der få vellykkede terapeutiske mål for HCC og ingen for NASH. Brugen af zebrafiskmodeller giver en unik mulighed for at udvide vores viden om hepatocarcinogenese, men også et uovertruffent hvirveldyrsystem til at udføre store gennemstrømningslægemiddelscreeninger. De teknikker, der er beskrevet i denne protokol, vil lette fremtidige fund og terapeutiske mål for leversygdom og hepatocarcinogenese.
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren vil gerne anerkende Albert Einstein College of Medicine Zebrafish Core Facility teknikere Clinton DePaolo og Spartak Kalinin for hjælp og vedligeholdelse af vores zebrafisklinjer. FJMN er støttet af Cancer Research Institute og Fibrolamellar Cancer Foundation.
Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Easily degraded. Store -20°C. |
Corning Netwells carrier kit 15 mm | Fisher | 07-200-223 | |
Corning Netwells inserts | Fisher | 07-200-212 | |
Diethyl ether | Fisher | 60-046-380 | Highly Volatile. |
Dumont forceps #55 dumostar | Fisher | NC9504088 | |
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in | Fisher | 22-183624 | |
4% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres | Brine Shrimp Direct | – | Any commercial dry powder food for larvae can be used. |
Graduated Transfer Pipets | Fisher | 22-170-404 | |
Isopropanol | Fisher | BP26181 | |
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack | Crystalgen | 221-1422-10 | |
Petri Dishes 100X20MM | Fisher | 08-747D | |
Tricaine | Sigma | A-5040 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
Oil Red O solution 0.5% isopropanol | Sigma | O1391-500ML | |
Tricaine | Sigma | A-5040 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
Vactrap | VWR | 76207-630 | Vacuum system for larvae collection |
Microscopes | |||
Fluorescent Stereomicroscope | Leica | M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large | |
Spinning Disk Confocal Microscope | Nikon | Nikon CSU-W1 | |
Stereomicroscope | Leica | S9i with transilluminated base | |
Software | |||
Fiji | Open-source Java image processing program. | ||
Imaris 9.6 | Bitplane; Oxford Instruments. |