Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analys av levermikromiljö under tidig progression av alkoholfritt fettleversjukdomsassocierat hepatocellulärt karcinom hos zebrafisk

Published: April 1, 2021 doi: 10.3791/62457
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Medicine (Hepatology), Albert Einstein College of Medicine, 3Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Marion Bessin Liver Research Center, Albert Einstein College of Medicine

Summary

Här presenterar vi hur man genererar en alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD) -associerad hepatocellulärt karcinom (HCC) zebrafiskmodell för att studera effekten av kolesterolöverskott på levermikromiljö och immuncelllandskap.

Abstract

Levercancer är för närvarande den tredje ledande orsaken till cancerrelaterad död över hela världen, och hepatocellulärt karcinom (HCC) står för 75-90% av alla levercancerfall. Med införandet av effektiva behandlingar för att förebygga och behandla hepatit B / C blir alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD) och den mer aggressiva formen som kallas alkoholfri steatohepatit (NASH) snabbt de främsta riskfaktorerna för att utveckla HCC i moderna samhällen. För att bättre förstå vilken roll NASH har på utvecklingen av HCC designade vi en NASH-associerad HCC-zebrafisk. Den optiska klarheten och genetiska dragbarheten hos zebrafisklarverna gör dem till en tilltalande och kraftfull modell för att studera levermikromiljön och immuncellkompositionen med hjälp av icke-invasiv fluorescerande levande avbildning. Detta protokoll beskriver hur man använder en NASH-associerad HCC-zebrafiskmodell för att undersöka effekten av kolesterolöverskott i leverns mikromiljö och dess inverkan på immuncellkompositionen i tidiga skeden av sjukdomen. Först matar vi HCC-larver (s704Tg), som uttrycker hepatocytspecifikt aktiverat beta-catenin, med en 10% hög kolesteroldiet i 8 dagar för att utveckla en NASH-associerad HCC-modell. Här beskriver vi hur man använder olika transgena linjer för att utvärdera flera tidiga malignitetsegenskaper i levern genom icke-invasiv konfokalmikroskopi, såsom leverområde, cell och nukleär morfologi (hepatocytområde, kärnområde, nukleärt: cytoplasmatiskt förhållande (N: C-förhållande), kärncirkularitet, mikrokärnor / kärnbråckspoäng) och angiogenes. Sedan, med hjälp av transgena linjer med märkta immunceller (neutrofiler, makrofager och T-celler) visar vi hur man analyserar leverimmuncellsammansättning i NASH-associerade HCC-larver. De beskrivna teknikerna är användbara för att utvärdera levermikromiljö och immuncellsammansättning i tidiga hepatocarcinogenesstadier, men de kan också modifieras för att studera sådana egenskaper i andra leversjukdomsmodeller.

Introduction

Hepatocellulärt karcinom (HCC) är en aggressiv cancer med begränsade terapeutiska alternativ. Det har visat sig att uppemot 30% av alla patienter med HCC är överviktiga och har NASH, en aggressiv form av NAFLD 1,2,3,4. Konsumtion av kaloririka dieter ökar drastiskt fettsyratillgängligheten som orsakar lokala och systemiska metaboliska förändringar och utlöser steatos, hepatocytskada, inflammation och fibros - alla viktiga funktioner i NASH. NASH-progression till HCC innebär ackumulering av lipider i levern, vilket utlöser inflammation och förändrad immuncellsammansättning 5,6,7. Det är av särskilt intresse och betydelse att förstå hur levermikromiljön och immuncelllandskapet förändras under leversjukdomsprogression, och hur det förändras på grund av vissa etiologiska faktorer. För att bättre identifiera den inverkan som kolesterolöverskott har på levermikromiljö och immuncelllandskap har vi utvecklat en unik zebrafiskmodell av NASH-associerad HCC. Användningen av denna modell har gett oss en bättre förståelse för effekterna av kost och övernäring på levermikromiljö och leversjukdomsprogression.

Däggdjursmodeller, såsom möss och mänskliga vävnadsprover, har varit avgörande för att förstå patogenesen av steatohepatit och steatos8. Möss är den föredragna modellen för leversjukdom och cancer, men de saknar optisk klarhet på cellnivå, medan mänskliga vävnadsprover ofta saknar den 3D-miljö som djurmodeller kan imitera. Dessa hinder har gjort zebrafisk till en kraftfull modell i forskarsamhället. Zebrafisk har anmärkningsvärda likheter med människor, med minst 70% genbevarande. De upprätthåller levermikromiljö, levercellulär sammansättning, funktion, signalering och svar på skador 9,10. Med hjälp av en högkolesteroldiet (HCD) i kombination med en etablerad transgen zebrafiskmodell av HCC har vi utvecklat en zebrafiskmodell av NASH-associerad HCC.

Här presenterar vi ett protokoll som förklarar hur man genererar en NASH-associerad HCC-zebrafiskmodell och hur man studerar levermikromiljö och hanterar tidiga malignitetsfunktioner in vivo. Med hjälp av icke-invasiv konfokalmikroskopi i kombination med zebrafiskens transgena linjer med fluorescerande märkt hepatocytmembran och kärna kan vi adressera tidiga malignitetsegenskaper genom att analysera levermorfologi (area, volym och ytarea), cell- och kärnmorfologi (hepatocytområde, kärnområde, N: C-förhållande, kärncirkularitet, mikrokärnor / kärnbråckspoäng) och angiogenes (kärldensitet). Immuncellsmikromiljö är också en viktig funktion vid hepatocarcinogenes11,12,13,14, därför visar vi också hur man analyserar leverimmuncellsammansättning i NASH-associerade HCC-larver med hjälp av transgena zebrafisklinjer med märkta immunceller (neutrofiler, makrofager och T-celler). De beskrivna teknikerna är unika för modellen och extremt användbara för att utvärdera levermikromiljö och immuncellsammansättning i leversjukdomsprogression.

Protocol

Djurstudier utförs enligt förfaranden som godkänts av den institutionella djurvårds- och användningskommittén (IACUC) vid Albert Einstein College of Medicine. För recept på buffertar och lösningar som används i protokollet, se tilläggstabell 1.

1. Beredning av 10% kolesterolberikad diet för akut kolesterolöverskott.

  1. Väg 2 x 4 g Golden Pearl Diet 5-50 nm Active Spheres (GPAS) i två 25 ml glasbägare-en för normal diet (ND) och den andra för 10% högt kolesterol diet (HCD).
    OBS: Alla kommersiella torrfoderdieter för zebrafisklarver kan användas.
  2. Väg 0,4 g kolesterol i en 10 ml glasbägare. Täck bägaren med lite folie.
  3. Mät upp 5 ml dietyleter med en 10 ml spruta med en 20 G nål. Tillsätt sedan dietyleter till ND-bägaren och blanda den omedelbart med torrfoder med en spatel.
    VARNING: Dietyleter orsakar irritation i ögon, hud och luftvägar. Använd endast i en kemisk dragskåp.
  4. Mät igen 5 ml dietyleter med en 10 ml spruta med en 20 g nål och tillsätt den i 10 ml bägare med kolesterol, blanda omedelbart aspirerande upp och ner med sprutan.
  5. Tillsätt snabbt kolesterollösningen till HCD-bägaren och blanda den omedelbart med en spatel tills lösningen är enhetlig.
  6. Lämna bägare i huven i upp till 24 timmar för att helt förånga dietyletern. Nästa dag, slipa upp GPAS-dieter till fina partiklar med hjälp av en stöt och murbruk.
    OBS: Att mala dieterna är ett avgörande steg, larver kommer inte att kunna äta partiklar större än 50 nm.
  7. Överför varje diet till en liten, märkt plastpåse eller till ett 50 ml centrifugrör och förvara vid -20 °C.

2. NASH-induktion med kortvariga larver som matar med kolesterolberikad diet - statiska förhållanden.

  1. Sätt upp transgena fisklinjer dag -1 (tabell 1). Nästa morgon (dag 0), efter att fisken har lekt, samla ägg i en nätsil.
  2. Använd en tvättflaska med embryovatten (E3), skölj äggen noggrant och överför försiktigt äggen till en 10 cm petriskål med E3-medium.
  3. Rengör plattorna från allt skräp som kan ha samlats i avelslådorna, inklusive döda eller obefruktade ägg.
    OBS: Sköljning av äggen och rengöring av plattorna är avgörande för att undvika okontrollerad odling av mikroorganismer och därmed defekter på larvernas utveckling.
  4. Dela ägg i en densitet av 70/80 per 10 cm petriskålar (i 25 ml E3). Vid dag 1, under ett dissektionsomfång utrustat med en transilluminationsbas, kontrollera och rengör döda embryon eller embryon med utvecklingsfel.
    OBS: Använd transilluminationsbas darkfield-läge för att identifiera embryon med utvecklingseffekter och för att kontrollera tillväxten av mikroorganismer i plattorna. Olika anläggningar har olika mikroorganismutbyte i sina system. Byt E3-medium och / eller rätter vid behov, för att undvika negativa effekter.
  5. På dag 5, kombinera larver från alla rätter i en 15 cm petriskål, tillsätt E3 utan metylenblå. Dela sedan larverna i matningslådorna enligt följande (tabell 2).
    OBS: Under kontrollförhållanden, för att generera friska larver utan att utlösa systemisk kronisk inflammation, bör larver matas med cirka 0,1 mg mat per larver per dag. Observera att den totala mängden mat (tabell 2) delas lika i två matningar per dag.
  6. Håll larverna i en inkubator vid 28 °C, i en mörk ljuscykel (t.ex. 14 h ljus/10 h mörk cykel) och mata larver två gånger om dagen från dag 5 till dag 12.
  7. Aspirera dagligen allt matrester, liksom 90-95% av mediet med hjälp av ett vakuumsystem fäst vid en 1 ml pipettspets. Häll sedan försiktigt ny E3 utan metylenblått i ena hörnet av matningsboxen för att undvika att skada larverna.
    OBS: Daglig rengöring av matningslådorna är avgörande för att undvika okontrollerad tillväxt av mikroorganismer.

3. Samling av 13 dagar efter befruktning larver från matningslådor.

  1. Vid dag 13, förbered insamlingsrätter i enlighet med antalet experimentella förhållanden som inrättades. Gör med en permanent markörpenna ett märke på sidan av skålarna (lock och botten) för att undvika att byta prover, till exempel en svart rand för normal kost (ND) och två svarta ränder för HCD.
  2. Häll tillräckligt med E3 utan metylenblått för att täcka botten av varje maträtt. Använd försiktigt vakuumsystemet aspirera vattnet från matningslådorna, försök att aspirera skräp eller döda larver från botten för att undvika att överföra dessa material till uppsamlingsdiskarna.
  3. När vattennivån börjar bli låg, lyft långsamt matningsboxen för att få larver att simma till ett av hörnen och sedan aspirera i motsatt riktning.
    OBS: Använd 1 ml pipett med skurna spetsar, i olika höjder, för att möjliggöra olika diametrar när du suger upp vattnet. Växla mellan de olika storlekarna, börja med en större diameter och byt till en mindre när vattenvolymen minskar och larvernas densitet ökar.
  4. När det bara finns cirka 20-30 ml vätska, dekantera försiktigt larver i samlingen petriskål som beretts i steg 1. Placera den märkta tejpen från matningslådan på locket på skålen.
  5. Upprepa steg 3.2-3.4 för alla matningslådor.

4. Kontrollanalys för dietinducerad leversteatos - Oil Red O (ORO) färgning, avbildning och poängsättning.

  1. Använd en pasteurpipett av glas och överför 15-20 larver till ett 2 ml runt bottenrör och lägg på is i cirka 15-30 minuter. Ta bort det mesta av mediet från röret.
  2. Tillsätt 2 ml 4 % paraformaldehyd (PFA) för att fixera larver och inkubera vid 4 °C över natten.
  3. Nästa morgon, ta bort 4% PFA-lösning och tvätta larverna tre gånger med 2 ml 1x PBS.
  4. Förbered en 12-brunnsplatta (figur 2A) per villkor med en nätbrunnsinsats.
  5. Använd en glaspipett och överför larven från 2 ml röret till insatsen som tidigare placerats i brunnen, tillsätt 5 ml 1x PBS. Spara 2 ml rören för provförvaring efter färgning.
    VARNING: Larver är extremt klibbiga i detta skede använd inte plastpipetter.
  6. Överför insats med larver till en annan brunn med 5 ml 60% isopropanollösning. Inkubera larver i 30 min rumstemperatur (RT).
  7. Under tiden förbereder du en 0,3% oljeröd O i 60% isopropanollösning. Filtrera 0,3% Oil Red-lösningen två gånger med ett 0,45 μm sprutfilter.
    OBS: Förbered 5 ml lösning per brunn genom att blanda 3 ml 0,5% olja röd O i isopropanol med 2 ml destillerat vatten. 0,3% olja röd O i 60% isopropanollösning måste vara nyberedd.
  8. Överför sedan nätinsatsen med larver till en annan brunn med 5 ml nygjord 0,3% olja röd O i 60% isopropanollösning. Inkuberade larver i 3 timmar vid RT med försiktig gungning.
  9. Efter ORO-färgning, skölj larverna genom att överföra insatsen till en annan brunn med 60% isopropanol. Tvätta larverna två gånger i 60% Isopropanol i 30 minuter varje gång genom att överföra insatsen sekventiellt till brunnar med 60% Isopropanol.
  10. Tvätta larverna tre gånger i 5 min i 1x PBS-0,1% Tween genom att överföra insatsen sekventiellt till brunnar med 1x PBS-0,1% Tween.
  11. Överför larver till 2 ml rör. Ta bort PBST, tillsätt 1 ml 80% glycerol och förvara vid 4 °C tills det är avfattat.
  12. För bättre avbildning, överför larver till 1x PBS-0.1% Tween och under ett dissektionsomfång dissekera lever genom att försiktigt dra vävnader med två # 55 pincett.
    OBS: Om du använder en Casper-bakgrundsavbildning kan utföras med hela larverna.
  13. Använd en glaspipett och överför försiktigt lever till en brunn på en porslinsplatta med 50% glycerol. Placera lever med hjälp av ett litet verktyg för att manipulera larver (t.ex. ögonfransverktyg - figur 2B). Bildlever i ett stereomikroskop utrustat med en färgkamera.
  14. Poäng leversteatos (ingen ORO-färgning = ingen; ljusröd ORO-färgning = mild; röd-mörkröd ORO-färgning = måttlig / svår).

5. Icke-invasiv konfokal avbildning med zebrafiskens sår- och infångningsanordning för tillväxt och avbildning (zWEDGI).

  1. Förbered en 10 cm petriskål med 15-20 ml 1x Tricaine-E3, precis tillräckligt för att täcka botten.
    OBS: En 1x trikain-E3-arbetslösning (0,16 mg / ml) kan erhållas genom utspädning av 2 ml av en 25x trikainstamlösning (4 mg / ml) i 48 ml E3. Trikainkoncentrationen får inte överstiga 0,16 mg/ml eftersom larverna är extremt känsliga för anestesi i detta utvecklingsstadium.
  2. Överför 15-20 larver med en plastpasteurpipett till petriskålen som innehåller 1x trikain-E3 och bedöva larverna i 5 min.
  3. Förbered en 6-brunnsplatta med 2-3 ml E3 utan metylenblått per brunn.
  4. På ett fluorescerande stereomikroskop screenar du de bedövade larverna för önskade fluorescerande markörer (tabell 1). Överför screenade larver i minsta mängd trikain i E3 och låt dem återhämta sig i 6-brunnsplattan tills det är dags att avbilda.
    OBS: Screening av dubbla, tredubbla och fyrdubbla transgena larver tar tid, placera larver i E3 och byt media från 6-brunnsplattan ofta för att minska onödig exponering för trikain. Larver i detta utvecklingsstadium flyter också så använd ett ögonfransverktyg för att placera larver för screening utan att framkalla vävnadsskador.
  5. Efter screening, förbered en 10 cm petriskål med 25 ml 1x Tricaine-E3. Överför 15-20 larver med en plastpasteurpipett till petriskålen som innehåller 1x Tricaine-E3 och bedöva larverna i 5 min.
  6. Under tiden lägger du under stereomikroskopet till 1x Tricaine-E3 i kamrarna på sår- och infångningsanordningen (t.ex. zWEDGI)15,16. Ta bort luftbubblor från kamrarna och fasthållningstunneln med en P200-mikropipett. Ta bort allt överskott av 1x Tricaine-E3 och lämna bara tillräckligt med volym för att fylla kamrarna.
  7. Överför en bedövad larva till laddningskammaren i zWEDGI och placera den med hjälp av ett ögonfransverktyg under stereomikroskopet. Tryck försiktigt på larvernas huvud och tryck på det så att svansen kommer in i fasthållningstunneln. Dessutom tar man med hjälp av mikropipetten bort 1x Tricaine-E3 från sårkammaren för att hjälpa larven att komma in i tunneln. Se till att larven är placerad på lämpligt sätt för avbildning av vänster lob - Inverterat mikroskop: vänster sida nedåt; Upprätt mikroskop: vänster sida uppåt.
    OBS: Om en zWEDGI inte är tillgänglig kan fisk monteras och placeras i 1% låg smältpunkt agaros i 1x Tricaine-E3, men agarosfördjupning kan användas bara för snabb avbildning (upp till 15 min).
  8. För hepatocyt- och kärnmorfologianalys, bildlever med ett konfokalmikroskop med ett 40x luftmål och z-stackar med 2 μm optiska sektioner. För levermorfologi, angiogenes och immuncellrekryteringsanalyser avbildar lever med hjälp av ett 20x luftmål och z-stackar med 5 μm optiska sektioner. För larver med stora lever bör 2 x 2 kakelbilder tas för att säkerställa avbildning av all lever och omgivande område på 75 μm.
  9. Efter avbildning, använd en plastpasteurpipett med 1x Tricaine-E3 för att dra larven från fasthållningstunneln och överför till en petriskål med E3 utan metylenblått.

6. Analys av levermorfologiska variationer.

OBS: Stegen nedan utförs för leveryta och volymkvantifiering:

  1. Öppen bildbehandlingsprogramvara. Lägg till mapp som innehåller bildfiler som ska analyseras till Arena genom att välja ikonen Observera mapp. Genom att högerklicka på miniatyrer väljer du sedan Konvertera till inbyggt Imaris-filformat för att konvertera filer till formatet (.ims).
  2. På undermenyn Överträffa justerar du ljusstyrka och kontrast för varje kanal. Skapa sedan en yta från levern genom att klicka på den blå knappen Lägg till nya ytor .
  3. På panelen för att skapa ytan väljer du sedan Segmentera endast ett område av intresse för att manuellt skapa en yta på levern.
  4. Klicka på Hoppa över automatisk skapande | Redigera manuellt alternativ. Välj Kontur och avmarkera alternativet "Volym" på scenpanelen.
    OBS: Volymvisningsalternativet måste avmarkeras, annars kommer val av region av intresse i olika z-stackar inte att kunna.
  5. Navigera genom z-stackar och rita intressanta regioner i varje plan genom att välja Läge, välj det ritläge du föredrar. För att börja rita ändra pekaren till Välj läge och inte Navigera, klicka sedan på Rita och börja dra pekaren genom levern för att rita en ROI.
  6. När du har valt en ROI i de olika fokusplanen väljer du Skapa en yta för att slå samman alla valda ROI:er och skapa leveryta.
  7. Därefter skapar du en mask av hepatocytsignalen med hjälp av den nyskapade ytan. Klicka på ytan och välj Mask All under fliken Redigera (pennan). I fönstret som visas väljer du den kanal du vill maskera som ska användas för att kvantifiera levervolym och yta. Välj sedan ställ in voxels utanför ytan till 0 och markera alternativet Duplicera kanal innan du applicerar masken.
  8. Använd leveryte- och levervolymvärden från statistisk analysmeny för analys.

OBS: Utför följande steg för kvantifiering av leverområdet.

  1. Öppna Fiji-programvaran. På plugins-menyn väljer du Bioformat följt av Bio-format Importör, kryssa på Dela kanaler alternativ för att öppna bildfil.
  2. På bildmenyn väljer du Egenskaper för att kontrollera att bilden har rätt pixelstorlek och voxeldjup, om inte korrekta värden. Gå sedan till Bildmeny, klicka på Justera följt av ljusstyrka och kontrast, justera bildens ljusstyrka och kontrast.
  3. Därefter skapar hepatocytkanalen en maximal intensitetsprojektion av levern. Gå till Bildmeny, klicka på Staplar följt av Z Project. Välj Projektion med maximal intensitet.
  4. Med hjälp av frihandsvalsverktyget skapar du manuellt en region av intresse (ROI) som omger larvleveren. Klicka sedan på Analysera på Mät för att få leverområde. Spara resultat som kalkylblad för vidare analys.

7. Hepatocyt och nukleär morfologisk analys.

  1. Öppna Fiji-programvaran. På plugins-menyn väljer du Bioformat följt av Bio-format Importör kryssa på Dela kanaler alternativ för att öppna bildfil.
  2. På bildmenyn väljer du Egenskaper för att kontrollera att bilden har rätt pixelstorlek och voxeldjup, om inte korrekta värden. Gå sedan till bildmenyn, klicka på Justera följt av ljusstyrka och kontrast, justera bildens ljusstyrka och kontrast.
  3. I menyn Analysera väljer du Ställ in mått på alla parametrar som du vill analysera (t.ex. område, omkrets och formbeskrivare). Välj hepatocytmembran fluorescerande kanal. Navigera genom Z, använd frihandsvalsverktyget för att rita perfekt ROI runt en hepatocyt. Klicka sedan på Analysera menyn Mät för att beräkna hepatocytområdet.
  4. Upprepa steg 7.3 för 15-30 hepatocyter. Spara resultat som kalkylblad för vidare analys.
  5. Välj sedan kärnfluorescerande kanal. Navigera genom Z, använd frihandsvalsverktyget för att rita perfekt ROI runt hepatocytkärnan. Klicka sedan på Analysera på Analysera meny för att beräkna kärnkraftsområde och cirkularitet.
  6. Upprepa steg 7.5 för 15-30 hepatocyter. Spara resultat som ett kalkylblad för vidare analys, inklusive kvantifiering av kärn-, cytoplasmatiskt förhållande.
  7. Poängsätta prover för förekomst av mikrokärnor och herniation enligt följande (tabell 3).

8. Angiogenes analys.

  1. Skapa en yta för lever manuellt enligt beskrivningen i avsnitt 6 i detta protokoll. Namnge denna yta som "Leveryta".
  2. Skapa en mask för endotelcellernas signal inuti levern. Klicka på ytan och välj Mask All under redigeringsfliken (pennan). I fönstret som visas väljer du endotelcellkanalen för att isolera kärlsignaler bara från levern. Välj ställ in voxels utanför ytan till 0 och markera alternativet Duplicera kanal innan du använder Mask.
  3. Byt namn på nya endotelceller maskerad kanal som Liver Vasculature.
  4. För att mäta kärlvolym och ytarea skapa en andra yta. Klicka på den blå knappen Lägg till nya ytor. I det första steget i ytskapandet ser du till att alla alternativ är avmarkerade för att automatiskt skapa en yta.
  5. I det andra steget väljer du Liver Vasculature kanal för att skapa en yta över. Avmarkera utjämningsalternativet om du vill identifiera så många detaljer från fartyg som möjligt och aktivera bakgrundssubtraktion i tröskelalternativet.
  6. Justera tröskeln för att säkerställa att den detekterade ytan samlokaliseras med leverkärlssignalen. Använd yt- och volymvärden från statistisk analysmeny. Beräkna kärldensitetsindex med hjälp av följande ekvationer:
    Kärldensitetsindex (med lever μm 2) = (kärlyta (μm 2)) / (leveryta (μm2))
    Kärldensitetsindex (med lever μm 3) = (kärlvolym (μm 3)) / (levervolym (μm3))

9. Analys av rekrytering av immunceller.

  1. Öppna Fiji-programvaran. På plugins-menyn väljer du Bioformat följt av Bio-format Importör kryssa på Dela kanaler alternativ för att öppna bildfil.
  2. På bildmenyn väljer du Egenskaper för att kontrollera att bilden har rätt pixelstorlek och voxeldjup, om inte korrekta värden. Gå sedan till menyn Bilder, klicka på Justera följt av ljusstyrka och kontrast, justera bildens ljusstyrka och kontrast (t.ex. makrofager - mCherry eller dTomato; neutrofiler - BFP; T-celler - EGFP; hepatocyter - EGFP eller mCherry).
  3. Skapa sedan prognoser med maximal intensitet för varje kanal.
  4. Som beskrivs i avsnitt 6 (Steg 6.9-6.12), skapa en ROI som omger larvleveren och mät leverområdet. Skapa en andra ROI inklusive leverområde och 75 μm omgivande område ("Rekryteringsområde").
  5. Välj sedan Val på Redigera-menyn Alternativ följt av Lägg till i chef. Om du väljer en medfödd immuncellkanal Maximal intensitetsprojektion, klicka på leverns ROI från ROI Manager-fönstret för att ställa in rekryteringsområdet.
  6. På menyn Plugins väljer du alternativet Analysera följt av Cell Counter och räknar immunceller i rekryteringsområdet. Rekordmånga rekryterade immunceller till leverområdet på ett kalkylblad.
  7. Beräkna neutrofil-, makrofag- och T-celltätheter genom att normalisera antalet immunceller per leverområde.

Representative Results

Genom att införa en kortvarig diet med högt kolesterol i en hepatocellulärt karcinom (HCC) zebrafiskmodell, som överuttrycker en hepatocytspecifik konstitutivt aktiv form av beta-catenin (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17, vi kan skapa en icke-däggdjursmodell av NASH-associerad HCC. Leversjukdomsprogression kan övervakas tidigt genom att mäta leversteatos, leverstorlek, hepatocyt, nukleär morfologi, angiogenes och immuncellsinfiltration (figur 1).

HCC-larver som matas med en normal diet visar ingen för mild leversteatos, mätt med Oil Red O-färgning. HCC-larver som matas med en diet med högt kolesterol visar emellertid en signifikant ökning av leversteatos (figur 2).

En välkänd markör för leversjukdom är hepatomegali17. För att utvärdera leverstorlek kan HCC-larver korsas med en transgen linje som specifikt uttrycker en fluorescerande markör på hepatocyter, såsom Tg (fabp10a: H2BmCherry). För att bedöma hepatomegali utförs utvärdering av leverområdet (2D), leverytan och levervolymen (3D). Efter 8 dagars exponering för ett kolesterolöverskott observerades leverförstoring hos HCC-larver (figur 3).

Med hjälp av icke-invasiv levande avbildning kan transgena fisklinjer som uttrycker fluorescerande proteiner i hepatocytmembran (såsom Tg (fabp10a: Life-actin-EGFPP) och i hepatocytkärnor (såsom Tg (Fabp10a: H2B-mCherry) användas för att bedöma cellulära och nukleära morfologiska förändringar associerade med malignitet i hepatocyter. Hepatocytområdet ökade i NASH-associerad HCC (figur 4A, B, D), liksom kärnområde (figur 4C, E) och nukleär: cytoplasmatiskt förhållande (figur 4F). En signifikant minskning av nukleär cirkularitet observerades också i HCD+HCC-gruppen (figur 4G). Lipotoxicitet utlöser DNA-skador, en egenskap hos cancerframkallande i närvaro av mikrokärnor. Med hjälp av H2B-mCherry-markören observerade vi en större förekomst av mikrokärnor i HCC-larverna som matades med en diet med högt kolesterol (figur 4H).

Hepatisk vaskulatur kan enkelt utvärderas i zebrafiskmodeller med hjälp av en transgen taggad linje, såsom Tg (kdrl: mCherry eller Tg (fli: EGFP), som märker vaskulatur. En signifikant ökning av kärltätheten observerades hos HCC+HCD-larver (figur 5).

För att observera det inflammatoriska svaret som utlöstes tidigt i NASH-associerad HCC, korsades en transgen fisklinje som uttrycker fluorescerande proteiner i makrofager och neutrofiler, såsom Tg (mfap4: tdTomato-CAAX; lyz: BFP), med HCC: s transgena linje. Infiltration av neutrofiler och makrofager förekommer i både HCC och HCC som utfodras med HCD, vilket bedömdes genom kvantifiering av antal och densitet av neutrofiler/makrofager i levern och närheten (omgivande område upp till 75 μm) (figur 6A-H). HCC+HCD uppvisade dock en signifikant ökning av antalet neutrofiler och densiteten (figurerna 6F-H). Vid 13 dagar efter befruktning är det adaptiva immunsystemet redan funktionellt. Använda en transgen fisklinje som uttrycker fluorescerande protein i T-celler, såsom Tg (lck: EGFP), och i kombination med HCC-transgenlinjen; vi utvärderade effekten av kolesterolöverskott på rekrytering av T-celler till levern. En signifikant minskning av T-celldensiteten och det totala antalet observerades hos HCC-larver som utfodrades med HCD (figur 6I-K).

Transgena zebrafisklinjer ZFIN-referens Prövning
Casper RoyA9; MitfaW2 Hepatisk steatos
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus / fabp10a:H2B-mCherry ) s704Tg / uwm41Tg Levermorfologi
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP) s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg Hepatocyter och kärnmorfologi
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP) s704Tg / y1Tg Angiogenes
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus;  mfap4:Tomat-CAAX; lyzC:BFP) s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg Makrofag och neutrofil rekrytering
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP) s704Tg / cz1Tg Rekrytering av T-celler

Tabell 1: Transgena zebrafisklinjer att använda i olika analyser.

Antal larver Matningsboxens storlek Mängd mat per dag (mg) E3 Volym (ml)
30-40 Liten avelslåda 3-4 200
60-80 Liten/Stor avelslåda 6-8 400
100-150 Stor avelslåda 10-15 500

Tabell 2: Ställ in villkor för matningslådor.

Fenotyp Poängsättning
Ingen Normala kärnor, inga mikrokärnor eller herniation
Mild Lågt antal mikrokärnor (mindre än 5 per synfält) och/eller herniation
Måttlig/Svår Måttligt till högt antal mikrokärnor (mer än 5 per synfält) och/eller herniation

Tabell 3: Poäng för mikrokärnor och kärnbråck.

Figure 1
Figur 1: Protokolldiagram som sammanfattar de viktigaste experimentella stegen och analysmetoden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kontrollanalys för leversteatos - ORO-färgning. HCC-larver matades med normal eller hög kolesteroldiet och Oil Red O (ORO) färgning utfördes för att bedöma leversteatos. (A) Diagram över 12-brunnsplattan för att utföra sekventiell ORO-färgning med hjälp av nätbrunnsinsatserna. (B) Bild av ögonfransverktyg som används för att manipulera larver. C) Representativa bilder av lever färgade med oljerött. HCC- och HCC+HCD-larver. (D) Chi-kvadratdiagram som visar procentandelen larver med olika poängsättning av leversteatos. Skala bar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Representativa bilder från leverstorlek. Transgena HCC-larver som uttrycker en levermarkör (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) avbildades levande och icke-invasivt, på ett inverterat spinnskivkonfokalmikroskop med hjälp av en zWEDGI. A) Representativa 3D-rekonstruktioner av lever i HCC- och HCC+HCD-larver. (B–D) Diagram som visar levermorfologiska förändringar inklusive leverarea (B) leveryta (C) och levervolym (D) i HCC- och HCC+HCD-larver. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa bilder från hepatocyter och kärnmorfologi. Transgena HCC-linjer som uttrycker fluorescerande proteiner i hepatocytmembran (Tg(fabp10a: Life-actin-EGFP) och i hepatocytkärnor (Tg(fabp10a:H2B-mCherry) avbildades. (AC) Representativa 3D-rekonstruktioner av F-aktin och hepatocytkärnor av HCC- och HCC+HCD-larver. Öppna pilspetsar visar förstorade kärnor; vita pilspetsar visar kärnan med förändrad form; och röda pilar visar mikrokärnor och kärnbråck. (D-G) Grafer som visar medelvärden av cell- och kärnparametrar i HCC och HCC+HCD 13 dagar gamla larver. (D) Hepatocyter område. e) Kärnenergiområde. (F) Nukleärt:Cytoplasmaförhållande. (G) Cirkularitet på kärnenergiområdet. Varje punkt representerar medelvärden per larv. Punktdiagram visar medelvärdet ±SEM (H) Chi-kvadratdiagram som visar procentandel larver med olika poäng av mikrokärnor och kärnbråck. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Representativa bilder från levervaskulatur. Transgena HCC-linjer som uttrycker fluorescerande proteiner i hepatocytkärnor (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) och i endotelceller (Tg)fli:EGFP)). A) Representativa 3D-rekonstruktioner av levervaskulatur i HCC- och HCC+HCD-larver. (B–C) Diagram som visar kärltäthetsindex efter leverytearea (B) volym (C) i HCC- och HCC+HFCD-larver. Punktdiagram visar medelvärdet ±SEM. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Representativa bilder från leverimmuncelllandskapet. Transgen HCC-linje som uttrycker fluorescerande proteiner i makrofager och neutrofiler (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) eller i T-celler (Tg(lck-EGFP). (A,C,F) Representativa 3D-rekonstruktioner av lever och leukocytrekrytering till leverområdet hos 13 dagar gamla HCC- och HCC+HCD-larver. (B) Diagram över avbildat leverområde. (D-E) Diagram som visar makrofagtäthet (D) och antal (E) i leverområdet hos HCC- och HCC+HCD-larver. (G-H) Diagram som visar neutrofilers densitet (G) och antal (H) i leverområdet i HCC- och HCC + HCD-larver. G) Representativa 3D-rekonstruktioner av T-cellrekrytering till leverområdet hos HCC- och HCC+HCD-larver. (H-I) Diagram som visar T-celltäthet (H) och antal (I) i leverområdet hos HCC- och HCC+HCD-larver. Punktdiagram visar medelvärdet ±SEM. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande tabell 1: Tabell över buffertar och lösningar Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

Med en ökad förekomst av HCC, specifikt NASH-inducerad HCC, är det av stor vikt att ha effektivare modeller för att studera de cellulära och molekylära mekanismerna som är involverade i NASH-associerad HCC. Dekonvolution av cell-cellinteraktioner i levern är avgörande för att bättre förstå leversjukdomsprogression och hepatocarcinogenes. Tillvägagångssättet som beskrivs i detta protokoll erbjuder ett unikt sätt att analysera leversjukdomsprogression in vivo och icke-invasivt.

Beredning av diet är avgörande för framgången med att etablera en NASH-associerad HCC-modell. Det är viktigt att låta dietyleter helt avdunsta inuti rökhuven för att undvika skadliga effekter, samtidigt som man förbereder dieter för zebrafisk. För att använda dessa dieter med larver (5-12 dagar efter befruktning) är det extremt viktigt att mala upp dieterna i fina partiklar för att säkerställa larvernas matintag. Användningen av fluorescerande märkta fettsyraanaloger kan användas för att utvärdera matintag i larver.

Innan larverna placeras i avelslådorna och utfodringsproceduren påbörjas är det viktigt att se till att experimentell provtagning likformas genom att larver blandas från olika plattor. Detta steg är viktigt eftersom olika mikromiljöer, som börjar på dag 0, främjas i var och en av plattorna och kan påverka inflammatoriskt svar.

Ett annat viktigt steg är att räkna larverna, för att veta hur mycket mat som behövs för varje matningslåda. Om mängden mat inte är tillräcklig för antalet larver som finns i varje låda kommer ett av de två scenarierna att inträffa: 1) larver kommer att underföras; 2) larver kommer att överföras. Felaktig utfodring kommer att leda till ohälsosamma tillstånd i samband med undernäring eller övernäring, såsom inflammation, vilket drastiskt påverkar levermikromiljön. Om felaktig utfodring inträffar kommer larver att visa rörelseproblem. Vid detta utvecklingsstadium bör larver simma intensivt, därför om rörelseproblem märks höjdes larver under ohälsosamma förhållanden (undernäring eller exponering för giftiga doser kolesterol på grund av övermatning). Av denna anledning måste utfodringsförfarandena kontrolleras noggrant för både dieter, normala och kolesterolberikade. Vissa analyser kan utföras för att snabbt ta itu med noggrannheten i utfodring och hälsa hos larver inklusive närvaro av hepatomegali (leverstorlek) och inflammation i vävnad och organ, särskilt lever och tarm (synlig ökad infiltration av neutrofiler och makrofager).

Daglig rengöring och ersättning av 95% av E3 är avgörande för att minska tillväxten av mikroorganismer i matningslådorna och förbättra larvernas hälsa och överlevnad. Alternativt kan larver placeras i ett fristående racksystem. För bästa resultat, placera 60-80 larver i en 3-liters tank. Håll vattenflödet på miniminivå genom att justera flödet till ett snabbt droppande läge och mata larver 3-4 mg två gånger om dagen (AM och PM). Vattenflödet bör kontrolleras regelbundet för att säkerställa korrekt flöde i varje tank. I vårt laboratorium ger denna metod oss 95-100% överlevnad med kortvarig utfodring av 10% HCD. Dessutom minskade denna metod kraftigt arbetsbelastningen som är inneboende i den dagliga rengöringen och vattenutbytet som är nödvändigt i det statiska matningsprotokollet som beskrivs.

Medan vi använde en 10% kolesterolberikad diet för att inducera NASH vid en kortvarig exponering (5 dagar räcker för att inducera steatohepatit), kan dietförändringar utföras och utökas för att använda fruktos 18, fettsyror (som palmitinsyra)19 eller matningsprotokoll som kan förlängas med en 4% kolesterolberikad diet20. För närvarande finns det få framgångsrika terapeutiska mål för HCC och inga för NASH. Användningen av zebrafiskmodeller erbjuder en unik möjlighet att utöka vår kunskap om hepatocarcinogenes men också ett oöverträffat ryggradsdjursystem för att utföra stora genomströmningsundersökningar. De tekniker som beskrivs i detta protokoll kommer att underlätta framtida fynd och terapeutiska mål för leversjukdom och hepatocarcinogenes.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författaren vill erkänna Albert Einstein College of Medicine Zebrafish Core Facility-tekniker Clinton DePaolo och Spartak Kalinin för hjälp och underhåll av våra zebrafisklinjer. FJMN stöds av Cancer Research Institute och Fibrolamellar Cancer Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholesterol Sigma C8667-25G Easily degraded. Store -20°C.
Corning Netwells carrier kit 15 mm Fisher 07-200-223
Corning Netwells inserts Fisher 07-200-212
Diethyl ether Fisher 60-046-380 Highly Volatile.
Dumont forceps #55 dumostar Fisher NC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in Fisher 22-183624
4% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres Brine Shrimp Direct - Any commercial dry powder food for larvae can be used.
Graduated Transfer Pipets Fisher 22-170-404
Isopropanol Fisher BP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack Crystalgen 221-1422-10
Petri Dishes 100X20MM Fisher 08-747D
Tricaine Sigma A-5040
Tween 20 Fisher BP337-500
Oil Red O solution 0.5% isopropanol Sigma O1391-500ML
Tricaine Sigma A-5040
Tween 20 Fisher BP337-500
Vactrap VWR 76207-630 Vacuum system for larvae collection
Microscopes
Fluorescent Stereomicroscope Leica M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large
Spinning Disk Confocal Microscope Nikon Nikon CSU-W1
Stereomicroscope Leica S9i with transilluminated base
Software
Fiji Open-source Java image processing program.
Imaris 9.6 Bitplane; Oxford Instruments.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude. Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
  2. El-Serag, H. B., Kanwal, F. Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go. Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).
  3. Estes, C., et al. Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030. Journal of Hepatology. 69 (4), 896-904 (2018).
  4. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  5. Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools. Frontiers in Immunology. 5, 177 (2014).
  6. Ganz, M., et al. Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice. Journal of Translational Medicine. 13, 193 (2015).
  7. Ma, C., et al. NAFLD causes selective CD4(+) T lymphocyte loss and promotes hepatocarcinogenesis. Nature. 531 (7593), 253-257 (2016).
  8. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  9. Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).
  10. Goessling, W., Sadler, K. C. Zebrafish: An important tool for liver disease research. Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).
  11. Huo, X., et al. Transcriptomic profiles of tumor-associated neutrophils reveal prominent roles in enhancing angiogenesis in liver tumorigenesis in zebrafish. Science Reports. 9 (1), 1509 (2019).
  12. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-associated neutrophils and macrophages promote gender disparity in hepatocellular carcinoma in zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  13. Capece, D., et al. The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: A pivotal role for tumor-associated macrophages. Biomed Research International. 2013, 187204 (2013).
  14. de Oliveira, S., et al. Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish. Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).
  15. Huemer, K., et al. Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
  16. Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
  17. Evason, K. J., et al. Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
  18. Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition. Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).
  19. Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish. Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).
  20. Progatzky, F., et al. Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation. Nature Communication. 5, 5864 (2014).

Tags

Cancerforskning nummer 170
Analys av levermikromiljö under tidig progression av alkoholfritt fettleversjukdomsassocierat hepatocellulärt karcinom hos zebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michael, C., Martínez-Navarro,… More

Michael, C., Martínez-Navarro, F. J., de Oliveira, S. Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62457, doi:10.3791/62457 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter