Här presenterar vi hur man genererar en alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD) -associerad hepatocellulärt karcinom (HCC) zebrafiskmodell för att studera effekten av kolesterolöverskott på levermikromiljö och immuncelllandskap.
Levercancer är för närvarande den tredje ledande orsaken till cancerrelaterad död över hela världen, och hepatocellulärt karcinom (HCC) står för 75-90% av alla levercancerfall. Med införandet av effektiva behandlingar för att förebygga och behandla hepatit B / C blir alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD) och den mer aggressiva formen som kallas alkoholfri steatohepatit (NASH) snabbt de främsta riskfaktorerna för att utveckla HCC i moderna samhällen. För att bättre förstå vilken roll NASH har på utvecklingen av HCC designade vi en NASH-associerad HCC-zebrafisk. Den optiska klarheten och genetiska dragbarheten hos zebrafisklarverna gör dem till en tilltalande och kraftfull modell för att studera levermikromiljön och immuncellkompositionen med hjälp av icke-invasiv fluorescerande levande avbildning. Detta protokoll beskriver hur man använder en NASH-associerad HCC-zebrafiskmodell för att undersöka effekten av kolesterolöverskott i leverns mikromiljö och dess inverkan på immuncellkompositionen i tidiga skeden av sjukdomen. Först matar vi HCC-larver (s704Tg), som uttrycker hepatocytspecifikt aktiverat beta-catenin, med en 10% hög kolesteroldiet i 8 dagar för att utveckla en NASH-associerad HCC-modell. Här beskriver vi hur man använder olika transgena linjer för att utvärdera flera tidiga malignitetsegenskaper i levern genom icke-invasiv konfokalmikroskopi, såsom leverområde, cell och nukleär morfologi (hepatocytområde, kärnområde, nukleärt: cytoplasmatiskt förhållande (N: C-förhållande), kärncirkularitet, mikrokärnor / kärnbråckspoäng) och angiogenes. Sedan, med hjälp av transgena linjer med märkta immunceller (neutrofiler, makrofager och T-celler) visar vi hur man analyserar leverimmuncellsammansättning i NASH-associerade HCC-larver. De beskrivna teknikerna är användbara för att utvärdera levermikromiljö och immuncellsammansättning i tidiga hepatocarcinogenesstadier, men de kan också modifieras för att studera sådana egenskaper i andra leversjukdomsmodeller.
Hepatocellulärt karcinom (HCC) är en aggressiv cancer med begränsade terapeutiska alternativ. Det har visat sig att uppemot 30% av alla patienter med HCC är överviktiga och har NASH, en aggressiv form av NAFLD 1,2,3,4. Konsumtion av kaloririka dieter ökar drastiskt fettsyratillgängligheten som orsakar lokala och systemiska metaboliska förändringar och utlöser steatos, hepatocytskada, inflammation och fibros – alla viktiga funktioner i NASH. NASH-progression till HCC innebär ackumulering av lipider i levern, vilket utlöser inflammation och förändrad immuncellsammansättning 5,6,7. Det är av särskilt intresse och betydelse att förstå hur levermikromiljön och immuncelllandskapet förändras under leversjukdomsprogression, och hur det förändras på grund av vissa etiologiska faktorer. För att bättre identifiera den inverkan som kolesterolöverskott har på levermikromiljö och immuncelllandskap har vi utvecklat en unik zebrafiskmodell av NASH-associerad HCC. Användningen av denna modell har gett oss en bättre förståelse för effekterna av kost och övernäring på levermikromiljö och leversjukdomsprogression.
Däggdjursmodeller, såsom möss och mänskliga vävnadsprover, har varit avgörande för att förstå patogenesen av steatohepatit och steatos8. Möss är den föredragna modellen för leversjukdom och cancer, men de saknar optisk klarhet på cellnivå, medan mänskliga vävnadsprover ofta saknar den 3D-miljö som djurmodeller kan imitera. Dessa hinder har gjort zebrafisk till en kraftfull modell i forskarsamhället. Zebrafisk har anmärkningsvärda likheter med människor, med minst 70% genbevarande. De upprätthåller levermikromiljö, levercellulär sammansättning, funktion, signalering och svar på skador 9,10. Med hjälp av en högkolesteroldiet (HCD) i kombination med en etablerad transgen zebrafiskmodell av HCC har vi utvecklat en zebrafiskmodell av NASH-associerad HCC.
Här presenterar vi ett protokoll som förklarar hur man genererar en NASH-associerad HCC-zebrafiskmodell och hur man studerar levermikromiljö och hanterar tidiga malignitetsfunktioner in vivo. Med hjälp av icke-invasiv konfokalmikroskopi i kombination med zebrafiskens transgena linjer med fluorescerande märkt hepatocytmembran och kärna kan vi adressera tidiga malignitetsegenskaper genom att analysera levermorfologi (area, volym och ytarea), cell- och kärnmorfologi (hepatocytområde, kärnområde, N: C-förhållande, kärncirkularitet, mikrokärnor / kärnbråckspoäng) och angiogenes (kärldensitet). Immuncellsmikromiljö är också en viktig funktion vid hepatocarcinogenes11,12,13,14, därför visar vi också hur man analyserar leverimmuncellsammansättning i NASH-associerade HCC-larver med hjälp av transgena zebrafisklinjer med märkta immunceller (neutrofiler, makrofager och T-celler). De beskrivna teknikerna är unika för modellen och extremt användbara för att utvärdera levermikromiljö och immuncellsammansättning i leversjukdomsprogression.
Med en ökad förekomst av HCC, specifikt NASH-inducerad HCC, är det av stor vikt att ha effektivare modeller för att studera de cellulära och molekylära mekanismerna som är involverade i NASH-associerad HCC. Dekonvolution av cell-cellinteraktioner i levern är avgörande för att bättre förstå leversjukdomsprogression och hepatocarcinogenes. Tillvägagångssättet som beskrivs i detta protokoll erbjuder ett unikt sätt att analysera leversjukdomsprogression in vivo och icke-invasivt.
Beredning av diet är avgörande för framgången med att etablera en NASH-associerad HCC-modell. Det är viktigt att låta dietyleter helt avdunsta inuti rökhuven för att undvika skadliga effekter, samtidigt som man förbereder dieter för zebrafisk. För att använda dessa dieter med larver (5-12 dagar efter befruktning) är det extremt viktigt att mala upp dieterna i fina partiklar för att säkerställa larvernas matintag. Användningen av fluorescerande märkta fettsyraanaloger kan användas för att utvärdera matintag i larver.
Innan larverna placeras i avelslådorna och utfodringsproceduren påbörjas är det viktigt att se till att experimentell provtagning likformas genom att larver blandas från olika plattor. Detta steg är viktigt eftersom olika mikromiljöer, som börjar på dag 0, främjas i var och en av plattorna och kan påverka inflammatoriskt svar.
Ett annat viktigt steg är att räkna larverna, för att veta hur mycket mat som behövs för varje matningslåda. Om mängden mat inte är tillräcklig för antalet larver som finns i varje låda kommer ett av de två scenarierna att inträffa: 1) larver kommer att underföras; 2) larver kommer att överföras. Felaktig utfodring kommer att leda till ohälsosamma tillstånd i samband med undernäring eller övernäring, såsom inflammation, vilket drastiskt påverkar levermikromiljön. Om felaktig utfodring inträffar kommer larver att visa rörelseproblem. Vid detta utvecklingsstadium bör larver simma intensivt, därför om rörelseproblem märks höjdes larver under ohälsosamma förhållanden (undernäring eller exponering för giftiga doser kolesterol på grund av övermatning). Av denna anledning måste utfodringsförfarandena kontrolleras noggrant för både dieter, normala och kolesterolberikade. Vissa analyser kan utföras för att snabbt ta itu med noggrannheten i utfodring och hälsa hos larver inklusive närvaro av hepatomegali (leverstorlek) och inflammation i vävnad och organ, särskilt lever och tarm (synlig ökad infiltration av neutrofiler och makrofager).
Daglig rengöring och ersättning av 95% av E3 är avgörande för att minska tillväxten av mikroorganismer i matningslådorna och förbättra larvernas hälsa och överlevnad. Alternativt kan larver placeras i ett fristående racksystem. För bästa resultat, placera 60-80 larver i en 3-liters tank. Håll vattenflödet på miniminivå genom att justera flödet till ett snabbt droppande läge och mata larver 3-4 mg två gånger om dagen (AM och PM). Vattenflödet bör kontrolleras regelbundet för att säkerställa korrekt flöde i varje tank. I vårt laboratorium ger denna metod oss 95-100% överlevnad med kortvarig utfodring av 10% HCD. Dessutom minskade denna metod kraftigt arbetsbelastningen som är inneboende i den dagliga rengöringen och vattenutbytet som är nödvändigt i det statiska matningsprotokollet som beskrivs.
Medan vi använde en 10% kolesterolberikad diet för att inducera NASH vid en kortvarig exponering (5 dagar räcker för att inducera steatohepatit), kan dietförändringar utföras och utökas för att använda fruktos 18, fettsyror (som palmitinsyra)19 eller matningsprotokoll som kan förlängas med en 4% kolesterolberikad diet20. För närvarande finns det få framgångsrika terapeutiska mål för HCC och inga för NASH. Användningen av zebrafiskmodeller erbjuder en unik möjlighet att utöka vår kunskap om hepatocarcinogenes men också ett oöverträffat ryggradsdjursystem för att utföra stora genomströmningsundersökningar. De tekniker som beskrivs i detta protokoll kommer att underlätta framtida fynd och terapeutiska mål för leversjukdom och hepatocarcinogenes.
The authors have nothing to disclose.
Författaren vill erkänna Albert Einstein College of Medicine Zebrafish Core Facility-tekniker Clinton DePaolo och Spartak Kalinin för hjälp och underhåll av våra zebrafisklinjer. FJMN stöds av Cancer Research Institute och Fibrolamellar Cancer Foundation.
Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Easily degraded. Store -20°C. |
Corning Netwells carrier kit 15 mm | Fisher | 07-200-223 | |
Corning Netwells inserts | Fisher | 07-200-212 | |
Diethyl ether | Fisher | 60-046-380 | Highly Volatile. |
Dumont forceps #55 dumostar | Fisher | NC9504088 | |
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in | Fisher | 22-183624 | |
4% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres | Brine Shrimp Direct | – | Any commercial dry powder food for larvae can be used. |
Graduated Transfer Pipets | Fisher | 22-170-404 | |
Isopropanol | Fisher | BP26181 | |
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack | Crystalgen | 221-1422-10 | |
Petri Dishes 100X20MM | Fisher | 08-747D | |
Tricaine | Sigma | A-5040 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
Oil Red O solution 0.5% isopropanol | Sigma | O1391-500ML | |
Tricaine | Sigma | A-5040 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
Vactrap | VWR | 76207-630 | Vacuum system for larvae collection |
Microscopes | |||
Fluorescent Stereomicroscope | Leica | M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large | |
Spinning Disk Confocal Microscope | Nikon | Nikon CSU-W1 | |
Stereomicroscope | Leica | S9i with transilluminated base | |
Software | |||
Fiji | Open-source Java image processing program. | ||
Imaris 9.6 | Bitplane; Oxford Instruments. |