Bu protokol, aynı sıçan kohortunun kullanılmasıyla dört tekrar içeren bir nesne konumu görevi için ayrıntılı adımlar sağlar. Zayıf ve güçlü kodlama kısa ve uzun süreli anılar üretebilir. Protokolün tekrarlama ile esnekliği, zaman ve emek tasarrufu sağlayarak cerrahi operasyonları içeren çalışmalar için faydalı olabilir.
Nesne yeri tanıma, kemirgenlerdeki mekansal hafızayı araştırmak için kullanılan önemli bir yöntemdir. Bu nesne yerleştirme tanıma belleği, nesne konumu görevinin temelini oluşturur. Bu makale, aynı sıçan kohortunu kullanarak dört tekrar seçeneğiyle bir nesne konumu görevinin kurulmasına rehberlik etmek için kapsamlı bir protokol sağlar. Hem zayıf hem de güçlü kodlama protokolleri, değişen gücün kısa ve uzun süreli mekansal anılarını incelemek ve ilgili hafıza engelleyici veya artırıcı manipülasyonların uygulanmasını sağlamak için kullanılabilir. Ek olarak, burada sunulan karşı denge ile testin tekrarlanması, sıçanlar arasındaki değişkenliği azaltmak için konu içi karşılaştırma için iki veya daha fazla testten elde edilen sonuçların kombinasyonunu sağlar. Bu yöntem istatistiksel gücü artırmaya yardımcı olur ve özellikle bireysel davranışta yüksek varyasyon üreten deneyler çalıştırırken şiddetle önerilir. Bu, her hayvandan elde edilen verileri artırarak ve ihtiyaç duyulan toplam hayvan sayısını azaltarak çalışmayı doğrudan rafine eder. Son olarak, tekrarlanan nesne yeri görevinin uygulanması, zaman ve emek tasarrufu sağlayarak cerrahi prosedürleri içeren çalışmaların verimliliğini artırır.
Kemirgenlerdeki hafızanın araştırılmasında spontan tanıma görevleri(örneğin, nesne tanıma, nesne yeri tanıma) büyük ölçüde kullanılmıştır. Bu testler, spontan tanıma görevlerinin yalnızca yeni uyaranlara karşı spontan keşif davranışına dayandığı için korku şartlandırma veya ödül motivasyonuna dayanan hafızayı değerlendirmek için kullanılan çeşitli testlerden farklıdır. ‘Neotik tercih’ olarak adlandırılan bu davranış 1 , kemirgenlerin yanı sıra diğermemelitürlerinde ve kuşlar ve balıklar gibi bazı memeli olmayanlarda doğaldır2. Uzamsal belleğe bağlı olan nesne yeri tanıma, nesne konumu görevi (uzamsal nesne tanıma görevi olarak da bilinir)3kullanılarak gözlemlenebilir. Lezyon çalışmaları, nesne yeri tanımanın bozulmamış bir hipokampus gerektirdiğini göstermiştir4,5. Nispeten basit eğitim protokolü ve herhangi bir takviyenin olmaması nedeniyle, bu görev birçok çalışmada tercih edilir. Hem pozitif hem de olumsuz takviyenin olmaması, davranışı yönlendirebilecek ek parametreleri ve beyin bölgelerini en aza indirir. Bu nedenle, buradaki davranış nötrdür ve merak ve mekansal hafızaya dayanır, mekansal belleğin kodlenmesi, birleştirilmesi ve alınmasında rol oynayan mekanizmaların araştırılmasına izin verir.
Nesne konumu görevi protokolü genellikle alışkanlık oturumlarından ve ardından birkaç dakikadan saate değişen bir gecikme süresiyle ayrılmış tek bir kodlama ve test denemesi oturumundan oluşur. Sıçanların, hayvanların stres seviyesini en aza indirmek için önceden ele alınması ve bu nedenle, yeniliğe karşı nefret gibi tanıma hafızasını etkileyebilecek davranışların ele alınması şiddetle tavsiye edilir. Benzer şekilde, iyi tasarlanmış bir alışkanlık protokolü, görev sırasında sıçanın doğal davranışını engelleyebilecek stresi önlemede önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, elleçleme ve alışkanlık kapsamı büyük ölçüde laboratuvarlar ve deneyciler arasında değişir, bu da düşük yanıtlanabilirliğe katkıda bulunabilir6,7,8. Kodlama denemesinde, sıçana belirlenen iki köşede bulunan iki özdeş nesneye sahip bir arenayı keşfetmesi için zaman verilir. Bir süre ertelenen test denemesinde, sıçana aynı nesne çiftiyle arenayı keşfetmesi için zaman verilir, ancak bu sefer bunlardan biri yeni bir yere taşındı. Sıçanlar tarafından sergilenen spontan tercih ve yeni konumda nesneyi keşfetmek için harcanan zamanın artması, mekansal tanımanın ve nesne konumlarının hafızasınıngöstergesidir 3. Kodlama denemesinin değiştirilmesi (süre ve tekrar sayısı) belleğin gücünü etkiler.
Çalışmanın amacına bağlı olarak, kodlama ve test çalışmaları arasındaki gecikmenin uzunluğu protein-sentezden bağımsız kısa süreli bellek veya protein sentezine bağımlı uzun süreli hafızayı modellemek için değiştirilebilir. Bu nedenle, nesne konumu görevi, protokolü gerektiği gibi uyarlayarak çok çeşitli çalışmalar için kullanılabilir. Ayrıca, farmakolojik ve optogenetik müdahaleler gibi deneysel manipülasyonların uygulanması da in vivo görüntüleme gibi bu denemeler arasında mümkündür. Aynı sıçan kohort içinde nesne konumu görevinin tekrarlanan yinelemelerini rapor eden birkaç çalışma vardır9,10. Bu, bir hayvanın tekrarsız bir seansa sahip olduğu geleneksel kullanımla çelişmektedir. Bununla birlikte, bu paradigmaların etkinliği ayrıntılı olarak araştırılmamıştır ve bunları açıklayan herhangi bir yöntem makalesi yoktur. Bilgimiz dahilinde, bu, her tekrardan elde edilen sonuçları sistematik olarak karşılaştıran aynı sıçan kohortunun en fazla dört tekrarı olan bir nesne konumu görevini ayrıntılı olarak açıklayan bir protokolün bildirilen ilk açıklamasıdır. Tekrarlar, testler arasındaki değişkenliğin azalmasıyla konu içi karşılaştırmaya izin vermek için deneysel koşulları dengelemek için kullanılabilir. Görevin güvenilir tekrarı, verilerin birikmesine izin verir, yani nispeten az sayıda sıçan kullanılarak yeterince büyük miktarda veri üretilebilir. Son olarak, aynı sıçanı kullanan tekrarlar, cerrahi operasyonlar ve implantasyonları içeren deneylerde, sonuç olarak zaman ve işçilik maliyetlerinden tasarruf sağlayan sıçan sayısını azaltarak faydalı olabilir.
Bu çalışma, güçlü ve zayıf kodlama denemeleri ve ardından 1-h ve 24-h gecikmeleri olan test denemeleri kullanılarak yetişkin sıçanlarda bir nesne konumu görevinin nasıl gerçekleştirildiğini ayrıntılı olarak açıklayan kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Güçlü kodlama protokolü, 1-h ve 24-h gecikmeleri ile test edildiğinde istatistiksel olarak anlamlı tanıma belleği üretir ve böylece bu anıları inhibe etmek için manipülasyonların uygulanması üzerine hem kısa hem de uzun vadeli anıları incelemek için kullanılabilir11. Buna karşılık, zayıf kodlama protokolü yalnızca 1-h gecikme ile test edildiğinde önemli kısa süreli bellek üretir. Uzun süreli belleğin yokluğu, belleğin tutulmasını artırmak için manipülasyonları incelemek için kullanılabilir11,12. Bu protokol, nesne konumu görevinin yanıtlanabilirliğini artırmayı amaçlayan ayrıntılı işleme ve alışkanlık oturumlarını da içerir. Bu makale ayrıca, her seferinde tekrarlanabilir ve tutarlı sonuçlar ürettiği doğrulanan zayıf kodlama protokolünü kullanarak aynı sıçan kohortları ile görevin dört farklı bağlamda tekrarlanmasını göstermektedir.
Nesne konumu görevi, daha önce açıklandığı gibi uzamsal belleği araştırmak için çeşitli çalışmalarda kullanılabilir. Kurulumun esnekliği, farklı güçlü yönlerin kısa ve uzun vadeli belleğinin modelilmesini sağlar ve düşük bir maliyetle kolayca uygulanabilir. Ancak, protokolde sonuçları etkileyebilecek birçok parametre olduğundan ve farklı çalışmalar bu parametrelerde biraz değiştiğinden6, görevi ilk kez başarıyla uygulamakta zorluklarla karşılaşabilirsiniz. Yukarıdaki protokol, okuyuculara bu süreçte sorunsuz bir şekilde rehberlik etmeyi amaçlamaktadır. Görevin yüksek yanıtlanabilirlikle başarılı bir şekilde uygulanmasında önemli olabilecek diğer önemli adımlar aşağıda tartışılacaktır.
Nesne konumu deneyleri çalıştırırken kodlama/test oturumu genellikle odak noktası olsa da, işleme ve alışkanlık protokolleri, sonucun bozulmamış doğal sıçan davranışına bağlı olduğu bu tür davranışsal testlerin sonucu üzerinde derin bir etkiye sahiptir14,15. Bu nedenle, kodlama/test oturumundan önceki adımlar, sıçan davranışını ve hafızasını etkileyebileceğinden ve sonuç olarak son sonuçları etkileyebileceğinden dikkatli bir şekilde tasarlanmalıdır. Sıçanların deneyciye aşina olması ve görev, doğal davranış sergileme olasılığını artırırken stres faktörlerinin etkisini en aza indirecek şekilde iyi bir kullanım ve alışkanlık seviyesi8. Protokolde belirtildiği gibi, sıçan suşu ev tesisinde tutulursa, elleçleme yavruların sütten tutulması kadar erken başlayabilir. Önceki deneyime dayanarak (veriler gösterilmedi) ve önceki birkaç çalışmadan16,17, bu erken kullanım, takip eden aylarda düşük kaygı ve gelişmiş merakla sonuçlanır.
Nesne konumu görevi yalnızca sıçanların içsel keşif dürtüsüne bağlı olduğundan, sıçanlar keşfetmeye istekli değilse veya ‘neofobik davranış’ olarak adlandırılan yeniye yaklaşmak için isteksizse beklenen davranış kolayca engellenebilir1. Bu nedenle, çalışmanın özel ihtiyaçlarına göre kapsamlı bir kullanım ve alışkanlık protokolünün dahil edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu protokol minimum gereksinim kılavuzu olarak kullanılabilir ve daha fazla adım uygulanabilir(örneğin,çalışma daha sonraki bir aşamada enjeksiyonları içerecekse, enjeksiyon prosedürlerine ve belirli tutma pozisyonuna alışmak gerekir). Suş ve deneysel sıçanların yaşı diğer iki etkili faktördür ve yetersiz sonuçlardan kaçınmak için bir deney planlamadan önce düşünülmelidir. Farklı sıçan suşları farklı davranışlara ve temel anksiyete seviyelerine sahip olabilir18,19,20 ve bu nedenle, kullanılan zorlanmaya bağlı olarak protokolde özel ayarlama gerekebilir.
Bu protokolün, Lister Hooded suşu ve vahşi tip Lister Hooded sıçanlara dört kez geri tepilmiş Long-Evans suşu ile Th-Cre transgenik sıçanlarla iyi çalıştığı doğrulanmıştır. Davranış deneylerinde sıçanlar için mantıksal olarak ideal bir başlangıç yaşı yaklaşık 12 hafta20, ancak türler arası değişkenlik ve görevin özel gereksinimleri dikkate alınmalıdır. Ayrıca, çalışmanın ilgisini çekiyorsa, gelişmekte olan sıçanları kullanmak da mümkün olabilir, ancak protokolde düzenlemeler gerekebilir ve burada kapsam dahil değildir. Bununla birlikte, belirli bir yaştaki sıçanın bu görevi başarıyla yerine getirmek için gereken bilişsel işlevleri geliştirip geliştirmediğini düşünmek önemlidir. Bunu araştıran bir çalışma21, yetişkin sıçanlarda gözlemlendiği gibi, sadece doğum sonrası 38. Burada sunulan protokol, ilk kodlama/test seansının başında 15-16 haftalık sıçanlar kullanılarak başarılı oldu. Daha önce, aynı güçlü kodlama protokolü, yeterince genç yaşta kullanım ve alışkanlık eksikliği nedeniyle en uygun alışkanlık seviyesine ulaşamayan 23 haftalık sıçanları kullanırken olumsuz sonuçlara karşı yetersiz üretti. Bu sıçanlar ya şans seviyesinden farklı bir performans gösteremediler ya da aslında, yerinden edilmiş nesneler yerine kararlı nesneleri tercih etme açısından gözlemlendiği gibi yeniliğe karşı nefret gösterdiler (veriler gösterilmedi). Bu sonuçlar, yaşın ve kullanım alışkanlığının zamanlamasının, alışkanlığın etkinliği üzerinde bir etkisi olabileceğine ve sonuç olarak, testlerde endişeli ve neofobik davranışların gözlemlenmesine katkıda bulunabileceğine dair kanıtlar samaktadır.
Burada, nesne konumu görevinde güçlü veya zayıf kodlama sağlayan iki farklı protokol özetlenir. Bu protokollerin oluşturulması sırasında, tek uzun denemeler sırasında(örneğin, 20 dakikalık kodlama) 5-10 dakikalık keşiflerden sonra nesnelere olan ilginin azaldığı ve sıçanların sonunda keşfetmeyi bıraktığı gözlendi. Bu, nesne konumlarının daha zayıf belleğiyle sonuçlanır. Kodlama denemelerini kısa dinlenme süreleriyle(örneğin, 3 x 5 dakikalık kodlama) bir kodlama protokolü bunun üstesinden gelir ve denemeler boyunca yüksek keşiflere yol açar. Bu nedenle, aktif keşif süresi ve bu iki kodlama protokolünün farklı düzeni, 3 x 5 dakikalık kodlamadan sonra 20 dakikalık kodlama protokollerinden daha güçlü olan belleğin gücünü etkiler. Benzer sonuçlar, tek deneme ile aralanmış deneme protokolleri ile biraz farklı süreler kullanılarak da elde edilebilir ve çalışmanın ve sıçan suşunun ihtiyaçlarına uygun ayarlamalar yapılabilir.
Odada sadece dış ipuçları bulunan düz beyaz bir açık alan kullanan protokollerin aksine, burada sunulan protokol, öğrenmek için daha fazla zaman gerektiren farklı bağlamlara ve labirent içi ipuçlarına sahip bir arena kullanır. Bu nedenle, kodlama denemesinden önce protokole bir bağlam alışkanlığı adımı eklenmesi önerilir. Bu, sıçanların alışkanlık sırasında her bağlamın mekansal bir haritasını oluşturmasına ve aşağıdaki kodlama denemesinin süresini azaltmasına izin verecektir, çünkü sıçanların sadece bu haritayla ilgili olarak nesnelerin konumlarını kodlamaları gerekecektir. Ayrıca, bağlam alışkanlığı, sıçanların 3B uzamsal ipuçları gibi her bağlamdaki olası herhangi bir dikkat dağıtıcıya alışmasını ve takip edilecek kodlama / test oturumunda nesne keşfi dışındaki davranışları en aza indirmesini sağlayacaktır. Çeşitli seviyelerden(yani çok çeşitli nesne konum kombinasyonlarından (sayaçlar) ve nesne yer değiştirme yönüne) oluşan kapsamlı bir karşı dengeleme yönteminin uygulanmasıyla, arenanın köşelerindeki ışık yoğunluğu ve duvar renklerindeki/desenlerindeki farklılıklar nedeniyle yükselebilecek istenmeyen tercihler en aza indirilmiş olur.
Kodlama/test oturumları arasındaki yanıtlanabilirliği artırmak ve yinelemenin etkisini en aza indirmek için görevi tekrarlarken çeşitli faktörler göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, aynı bağlamı kullanarak yinelenen oturumların gerçekleştirilmesiyle ortaya çıkabileceği uzamsal belleğin birikmesini önlemek için farklı bağlamların (kodlama/test oturumlarının tekrar sayısı kadar) tasarlanması gerekir. Bunu başarmak için, farklı renk ve desenlerde değiştirilebilir duvarlara sahip bir aparat kullanılmıştır (Şekil 1B, C). Duvarlara asılan farklı duvarlar ve 3D nesneler (oyuncaklar veya farklı renk ve şekillerdeki küçük günlük öğeler gibi, bkz. protokol ve Şekil 1C),sıçanların bağlamlarıyla ilgili olarak nesne konumlarını öğrenmek için potansiyel olarak kullandıkları mekansal ipuçları ve yer işaretleridir. Bir testin taşınan nesne için tercih üretememesi durumunda, bağlamın bu parametrelerini (duvar tasarımı ve uzamsal ipuçları) değiştirmek düşünülebilir. Alternatif olarak, bu protokolde olduğu gibi kare bir arena yerine nesne konumu görevleri için dikdörtgen veya dairesel şekilli bir arena kullanılabilir. Dairesel arenaların, köşeli arenalarda sıklıkla gözlenen köşe tercihleri22’yi ortadan kaldırdığı bildirilmektedir ve bu nedenle, özellikle yüksek anksiyeteli bir sıçan veya fare zorlanması ile uğraşırken faydalı olabilir. Bu protokolde dört farklı bağlam oluşturma gereksinimleri dörtgen bir şekille en uygun şekilde çalışsa da, dairesel bir arena da bazı ayarlamaların ardından işlevsel hale getirilebilir.
İkincisi, her kodlama/ test seansı arasındaki aralıklar, sıçanların her seferinde aynı ilgi seviyesini koruyacak şekilde belirlenmeli ve yoğun bir tekrar programından kaynaklanan kümülatif öğrenme riskinden kaçınılmalıdır. Genellikle, kodlama ve test denemeleri arasındaki gecikme süresinin en az iki katı bir aralık yeterlidir ve daha uzun aralıklar ikiden fazla tekrar için daha elverişlidir. Bu, 24-h testten sonra en az 48-h aralığı bir veya iki tekrar için yeterli olsa da, dört tekrar için 1 haftalık bir aralık kullanılması önerilir. Şekil 5’teki sonuçlar ve ANOVA kullanılarak yapılan karşılaştırmada belirtildiği gibi, görev dört kez başarıyla tekrarlanabilir. Buna dayanarak, belirlenen protokol dört deneysel koşulu dengelemek için kullanılabilir. Deneysel grupların sayısı, kodlama/deneme oturumlarının farklı bağlamlardaki tekrarlarının sayısını belirler. Şekil 5’teki sonuçlar, protokolü iki deneysel grupla kullanmanın olası bir yolunu temsil eder. Gruplar iki oturumda dengelendi ve aynı koşullar iki ek oturumda (doğrulama amacıyla) tekrarlandı. İkinci dengelenmiş oturumlar kümesi, yeni koşulları dengelemek için de kullanılabilir. Benzer şekilde, sırasıyla üç veya dört dengelenmiş seans kullanılarak üç veya dört deneysel koşul karşılaştırılabilir.
Bu gibi durumlarda, bağlamlar protokolde açıklanan zıt özellikleri barındıracak şekilde tasarlanmalıdır. Dengelenmiş tasarımın, uzun süreli bir etki veya hasar bırakabilecek farmakolojik bir müdahale gibi ek manipülasyonların kullanılacağı deneyler için uygun olmayabileceği dikkat çekicidir. Testlerin etkinliğini ve cevaplanabilirliğini korumak için deney buna göre tasarlanmalıdır. Tekrarlanan testlerden elde edilen veriler, Şekil 5’tegösterildiği gibi çeşitli şekillerde sunulabilir ve analiz edilebilir. İlk analiz için, her bağlamdaki deneysel gruplar, önemli bir tercihi belirlemek için tek örnekli t-test kullanılarak şans seviyesiyle ayrı ayrı karşılaştırılabilir (Şekil 5B,D). Bu, verileri hızlı bir şekilde anlamak için yararlı olabilir, ancak grupların yalnızca dolaylı bir karşılaştırmasını sağlar. Bu nedenle, iki veya daha fazla grubu karşılaştırmak için, veriler sırasıyla iki örnekli t-testleri (eşleştirilmiş veya eşleşmemiş) veya ANOVA kullanılarak analiz edilmelidir. Bu, tek bir kodlama/test oturumu içindeki grupların konu karşılaştırması ( Şekil4A ve Şekil 5B,D) veya iki (veya daha fazla) dengelenmiş bağlamdan grupların konu içi karşılaştırması şeklinde olabilir (Şekil 5C,E). İkinci yöntem, özellikle daha önce açıklandığı gibi, davranıştaki rastgelelik nedeniyle yüksek varyansla sonuçlanan zayıf bellek koşullarıyla uğraşırken şiddetle tavsiye edilir.
Dengelenmiş bağlamları birleştirmek, grubun davranışını en az varyasyonla güvenilir bir şekilde görselleştirmek için gereken daha büyük gruplara yol açar. Dengelenmiş oturumlarda tekrarları olan bir protokol kullanarak, sıçan sayısında aynı istatistiksel güce sahip tek bir test kullanılarak gerekli olan sayının yaklaşık üçte birine bir azalma beklenebilir. Genellikle, dengelenmiş seanslar için 7 ila 15 sıçan aralığında (toplam) ve etki boyutu ve gücü 0,8’den büyük olan tek bir seans için 20 ila 50 sıçan (grup başına 10 ila 25) aralığında örnek boyutları yeterlidir. İhtiyaç duyulan hayvan sayısının azalması ve bu protokolü kullanarak her hayvandan edindiğimiz bilgilerdeki artış hem çalışmayı rafine ediyor hem de hayvanların araştırmalarda etik kullanımlarının 3R ilkelerine hizmet ediyor. Bu adımda, güçlü bir hafıza ile eşlik etmeyen rastgele sıçan davranışının hem düşük hem de şans üstü bireysel güçlü tercihlerle sonuçlanabileceğini, ancak grup ortalamasının şanstan önemli ölçüde farklı olmayan bir tercihte bulunduğunu akılda tutmak önemlidir. Bireysel veriler dikkatle yorumlanmalıdır. Bir grup içindeki tek tek veri noktalarının dağılımı da sonuçların yorumlanabilir. Şekil 4 ve Şekil 5‘te görüldüğü gibi, dağılım belleğin gücüne bağlı olarak değişir. Genel olarak, burada sunulan protokol, kısa süreli ve/veya uzun süreli uzamsal belleği modellemek için tekrarlarla nesne konumu görevini uygulamak için kolayca takip edilebilir. Basit ve esnek eğitim protokolü ve daha fazla manipülasyon uygulama olasılığı, bu görevi popüler bir seçim haline getirir. Protokoldeki bu değişiklikler, bellek edinme, birleştirme ve geri çağırma gibi belirli adımların araştırılmasını sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O’Hara ve David Bett’e anlayışlı yorum ve öneriler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Erasmus+ (G.B. ve L.N.’ye) tarafından desteklendi; Aarhus Üniversitesi Sağlık Enstitüsü (K.H.’ye); Novo Nordisk Vakfı Genç Araştırmacı Ödülü 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) ve PROMEMO – Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı (DNRF133) tarafından finanse edilen bir Mükemmeliyet Merkezi olan Promemo – Center for Proteins in Memory (T.T.’ye).
Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |