Summary
Bu protokol, aynı sıçan kohortunun kullanılmasıyla dört tekrar içeren bir nesne konumu görevi için ayrıntılı adımlar sağlar. Zayıf ve güçlü kodlama kısa ve uzun süreli anılar üretebilir. Protokolün tekrarlama ile esnekliği, zaman ve emek tasarrufu sağlayarak cerrahi operasyonları içeren çalışmalar için faydalı olabilir.
Abstract
Nesne yeri tanıma, kemirgenlerdeki mekansal hafızayı araştırmak için kullanılan önemli bir yöntemdir. Bu nesne yerleştirme tanıma belleği, nesne konumu görevinin temelini oluşturur. Bu makale, aynı sıçan kohortunu kullanarak dört tekrar seçeneğiyle bir nesne konumu görevinin kurulmasına rehberlik etmek için kapsamlı bir protokol sağlar. Hem zayıf hem de güçlü kodlama protokolleri, değişen gücün kısa ve uzun süreli mekansal anılarını incelemek ve ilgili hafıza engelleyici veya artırıcı manipülasyonların uygulanmasını sağlamak için kullanılabilir. Ek olarak, burada sunulan karşı denge ile testin tekrarlanması, sıçanlar arasındaki değişkenliği azaltmak için konu içi karşılaştırma için iki veya daha fazla testten elde edilen sonuçların kombinasyonunu sağlar. Bu yöntem istatistiksel gücü artırmaya yardımcı olur ve özellikle bireysel davranışta yüksek varyasyon üreten deneyler çalıştırırken şiddetle önerilir. Bu, her hayvandan elde edilen verileri artırarak ve ihtiyaç duyulan toplam hayvan sayısını azaltarak çalışmayı doğrudan rafine eder. Son olarak, tekrarlanan nesne yeri görevinin uygulanması, zaman ve emek tasarrufu sağlayarak cerrahi prosedürleri içeren çalışmaların verimliliğini artırır.
Introduction
Kemirgenlerdeki hafızanın araştırılmasında spontan tanıma görevleri(örneğin, nesne tanıma, nesne yeri tanıma) büyük ölçüde kullanılmıştır. Bu testler, spontan tanıma görevlerinin yalnızca yeni uyaranlara karşı spontan keşif davranışına dayandığı için korku şartlandırma veya ödül motivasyonuna dayanan hafızayı değerlendirmek için kullanılan çeşitli testlerden farklıdır. 'Neotik tercih' olarak adlandırılan bu davranış 1 , kemirgenlerin yanı sıra diğermemelitürlerinde ve kuşlar ve balıklar gibi bazı memeli olmayanlarda doğaldır2. Uzamsal belleğe bağlı olan nesne yeri tanıma, nesne konumu görevi (uzamsal nesne tanıma görevi olarak da bilinir)3kullanılarak gözlemlenebilir. Lezyon çalışmaları, nesne yeri tanımanın bozulmamış bir hipokampus gerektirdiğini göstermiştir4,5. Nispeten basit eğitim protokolü ve herhangi bir takviyenin olmaması nedeniyle, bu görev birçok çalışmada tercih edilir. Hem pozitif hem de olumsuz takviyenin olmaması, davranışı yönlendirebilecek ek parametreleri ve beyin bölgelerini en aza indirir. Bu nedenle, buradaki davranış nötrdür ve merak ve mekansal hafızaya dayanır, mekansal belleğin kodlenmesi, birleştirilmesi ve alınmasında rol oynayan mekanizmaların araştırılmasına izin verir.
Nesne konumu görevi protokolü genellikle alışkanlık oturumlarından ve ardından birkaç dakikadan saate değişen bir gecikme süresiyle ayrılmış tek bir kodlama ve test denemesi oturumundan oluşur. Sıçanların, hayvanların stres seviyesini en aza indirmek için önceden ele alınması ve bu nedenle, yeniliğe karşı nefret gibi tanıma hafızasını etkileyebilecek davranışların ele alınması şiddetle tavsiye edilir. Benzer şekilde, iyi tasarlanmış bir alışkanlık protokolü, görev sırasında sıçanın doğal davranışını engelleyebilecek stresi önlemede önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, elleçleme ve alışkanlık kapsamı büyük ölçüde laboratuvarlar ve deneyciler arasında değişir, bu da düşük yanıtlanabilirliğe katkıda bulunabilir6,7,8. Kodlama denemesinde, sıçana belirlenen iki köşede bulunan iki özdeş nesneye sahip bir arenayı keşfetmesi için zaman verilir. Bir süre ertelenen test denemesinde, sıçana aynı nesne çiftiyle arenayı keşfetmesi için zaman verilir, ancak bu sefer bunlardan biri yeni bir yere taşındı. Sıçanlar tarafından sergilenen spontan tercih ve yeni konumda nesneyi keşfetmek için harcanan zamanın artması, mekansal tanımanın ve nesne konumlarının hafızasınıngöstergesidir 3. Kodlama denemesinin değiştirilmesi (süre ve tekrar sayısı) belleğin gücünü etkiler.
Çalışmanın amacına bağlı olarak, kodlama ve test çalışmaları arasındaki gecikmenin uzunluğu protein-sentezden bağımsız kısa süreli bellek veya protein sentezine bağımlı uzun süreli hafızayı modellemek için değiştirilebilir. Bu nedenle, nesne konumu görevi, protokolü gerektiği gibi uyarlayarak çok çeşitli çalışmalar için kullanılabilir. Ayrıca, farmakolojik ve optogenetik müdahaleler gibi deneysel manipülasyonların uygulanması da in vivo görüntüleme gibi bu denemeler arasında mümkündür. Aynı sıçan kohort içinde nesne konumu görevinin tekrarlanan yinelemelerini rapor eden birkaç çalışma vardır9,10. Bu, bir hayvanın tekrarsız bir seansa sahip olduğu geleneksel kullanımla çelişmektedir. Bununla birlikte, bu paradigmaların etkinliği ayrıntılı olarak araştırılmamıştır ve bunları açıklayan herhangi bir yöntem makalesi yoktur. Bilgimiz dahilinde, bu, her tekrardan elde edilen sonuçları sistematik olarak karşılaştıran aynı sıçan kohortunun en fazla dört tekrarı olan bir nesne konumu görevini ayrıntılı olarak açıklayan bir protokolün bildirilen ilk açıklamasıdır. Tekrarlar, testler arasındaki değişkenliğin azalmasıyla konu içi karşılaştırmaya izin vermek için deneysel koşulları dengelemek için kullanılabilir. Görevin güvenilir tekrarı, verilerin birikmesine izin verir, yani nispeten az sayıda sıçan kullanılarak yeterince büyük miktarda veri üretilebilir. Son olarak, aynı sıçanı kullanan tekrarlar, cerrahi operasyonlar ve implantasyonları içeren deneylerde, sonuç olarak zaman ve işçilik maliyetlerinden tasarruf sağlayan sıçan sayısını azaltarak faydalı olabilir.
Bu çalışma, güçlü ve zayıf kodlama denemeleri ve ardından 1-h ve 24-h gecikmeleri olan test denemeleri kullanılarak yetişkin sıçanlarda bir nesne konumu görevinin nasıl gerçekleştirildiğini ayrıntılı olarak açıklayan kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Güçlü kodlama protokolü, 1-h ve 24-h gecikmeleri ile test edildiğinde istatistiksel olarak anlamlı tanıma belleği üretir ve böylece bu anıları inhibe etmek için manipülasyonların uygulanması üzerine hem kısa hem de uzun vadeli anıları incelemek için kullanılabilir11. Buna karşılık, zayıf kodlama protokolü yalnızca 1-h gecikme ile test edildiğinde önemli kısa süreli bellek üretir. Uzun süreli belleğin yokluğu, belleğin tutulmasını artırmak için manipülasyonları incelemek için kullanılabilir11,12. Bu protokol, nesne konumu görevinin yanıtlanabilirliğini artırmayı amaçlayan ayrıntılı işleme ve alışkanlık oturumlarını da içerir. Bu makale ayrıca, her seferinde tekrarlanabilir ve tutarlı sonuçlar ürettiği doğrulanan zayıf kodlama protokolünü kullanarak aynı sıçan kohortları ile görevin dört farklı bağlamda tekrarlanmasını göstermektedir.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Danimarka ve AB hayvan refahı mevzuatına uygun olarak Danimarka Ulusal Makamları (Lisans numarası: 2018-15-0201-01405) tarafından onaylanmıştır.
1. Deneysel kurulum ve farklı bağlamların hazırlanması
- Bağlamlı nesne konumu arenası
NOT: Aşağıdaki kurulum, tavanın kenarları boyunca bulunan ışık kaynağı ve kutunun tavanının merkezinde bulunan kamera ile kapalı bir ses geçirmez kutuda(Şekil 1B)gösterilmiştir. 100 cm yüksekliğinde duvarlara sahip 60 cm x 60cm(Şekil 1B)arena, kutunun içine yerleştirilmiş ve çevredeki odadan tamamen izole edilmiştir. Tüm uzaysal ipuçları arenanın içinde. Bu, farklı bağlamlar oluşturma işlemini basitleştirir. Duvarların etrafında tek tip bir perde ile normal bir açık alan arenasını kapatarak çevredeki odadan benzer bir izolasyon seviyesi elde edilebilir.- En az 60 cm genişliğe ve en az 50 cm yüksekliğe sahip opak, gözeneksiz sert plastiktan yapılmış kare bir arena elde edin. Otomatik yazılım tarafından fare hareketlerinin başarılı bir şekilde kaydedilmesi için (varsa) sıçanın rengiyle zıt zemin için bir renk seçin. Arenayı bir kutunun içine (Şekil 1B) veya perde ile çevrili bir platforma yerleştirin.
- Bir bağlam oluşturmak için, farklı renklerde ve/veya desenlerde(örneğin, siyah, beyaz, çizgiler veya noktalar) ikinci bir eklenebilir duvar katmanı(örneğin, arenayla aynı malzemeden yapılmış duvar kaplaması veya kolayca temizlenebilen plastik duvar kağıdı) elde edin. İkinci duvar katmanını arenaya birbirinden farklı olacak şekilde yerleştirin.
- 10 cm x 10 cm x 5 cm ve 20 cm x 15 cm x 15 cm (genişlik x uzunluk x yükseklik) arasında değişen boyutlara sahip üç boyutlu (3D) uzamsal ipuçları (bağlam başına 1-2) elde edin ve (i) farklı geometrik şekillere ve (ii) duvar rengine zıt renklere sahip. Farelerin bu ipuçlarına ulaşamaması için onları duvarlara yeterince yükseğe asın.
- Gözeneksiz, çiğnenemeyen ve temizlenmesi kolay farklı nesne çiftleri (bağlam numarası kadar) elde edin. Her yeni nesne için farklı geometrik şekillere ve dokulara sahip olmayı hedefleyin. Genişliği ve yüksekliği 5 ila 15 cm arasında olan nesneleri seçin (daha yüksek nesnelerden kaçının). Dört farklı nesneye (koniler, futbollar, dikdörtgen prizmalar ve üçgen prizmalar) örnekler için Şekil 1D'ye bakın.
NOT: Her nesne sıçanlarla benzer ilgi çekici olmalıdır, böylece tüm nesneler için toplam keşif süreleri karşılaştırılabilir. - Arenanın zeminine nesneleri takmak için en iyi çözümü bulun(örneğin, yapışkan paspaslar, çift taraflı bant, nesnenin altına metal bir plaka ve arenanın altına bir eşleştirme mıknatısı vb.) takarak).
- Başka bir bağlam oluştururken, duvarların renk ve desen dağılımını önceki bağlamlardan farklı olacak şekilde yeniden oluşturun. Önceki tüm ipuçlarından farklı ve bunlarla zıt olan yeni 3D uzamsal ipuçları kullanın. Dört farklı bağlam örneği için Şekil 1C'ye bakın.
- Arenada dağınık ve eşit bir aydınlatma sağlayacak ve daha az bir seçeneğe sahip bir ışık kaynağı elde edin. Her bağlamı oluşturduktan sonra ışık yoğunluğunu arenanın köşelerinde yaklaşık 100-120 lükse ayarlayın. Bir kamera edinin ve kutunun tavanının ortasına yerleştirin.
NOT: Otomatik puanlama yazılımı kullanılmazsa ışık yoğunluğu daha düşük bir seviyeye ayarlanabilir.
- Nesne demeti
- Bir kova (>50 cm çapında) elde edin. Deneysel arenaya herhangi bir benzerliği önlemek için kare bir şekil seçmeyin. Yatak malzemesi ile doldurun.
- Farklı şekil ve boyutlarda 5-10 nesne elde edin (deneyde kullanılacak nesnelerden farklı) ve hepsini rastgele kovaya yerleştirin (Şekil 1A).
Şekil 1: Dört farklı bağlam ve nesne içeren deneysel kurulum. (A) Nesne alışkanlığı için nesne demeti. (B) Nesne konumu arenasını, kamerayı ve ışık kaynağını içine alan deney aparatı (solda). Bağlam kurulumundan önceki deneysel kutu ve arena (orta) ve bağlam kurulumuna sahip arena (sağda). (C) Farklı duvar renkleri ve desenlerinin yanı sıra üç boyutlu uzamsal ipuçlarına sahip dört bağlam (1-4). (D) Sırasıyla 1-4 bağlamında kullanılan dört nesne. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Kamera ve izleme yazılımı (isteğe bağlı)
- Kamera kaydediciyi uzaktan kontrol etmek için kullanılabilecek ve fare burunlarını izleyebilen yazılımlar edinin. Her denemeden önce her belirli bağlam ve sıçan suşu için yazılım ayarlamaları yapın.
- Nesne konumlarının ve deneysel grupların karşı dengelenme
- Kodlama ve test denemeleri için nesne konumlarının olası birleşimlerini hazırlayın ve bunları sayaç olarak adlandırın. Tüm köşeleri nesne konumları olarak kaplayacak şekilde birleşimler oluşturun ve bitişik köşelerden köşelere nesne hareketi ve bunun tersi de vardır (Şekil 2A).
- Belirli bir deney için bir program hazırlayın, bir deney grubundaki her sıçanı bir sayaçla eşleştirin. Yeterli sıçan varsa, iki eşleştirilmiş sayacın her çiftini (Şekil 2A) bir grup içinde kullanın. Tek bir kodlama/test oturumunda her iki deneysel grup için de aynı sayaç kümesini kullanın (Şekil 2B). Aşağıdaki oturumlar için sayaçları yeniden atayın(örneğin, her yeni bağlam).
NOT: Kodlama/ test seansları sırasında sıçanları karışık bir sırada çalıştırın(örneğin,tüm sıçanları birbiri ardına bir kafeste çalıştırmayın; bunun yerine, birden fazla sıçanın kafesi içinde sakin bir ortam sağlamak için kafesleri döndürün). - Deneysel grupları dengelemek için iki veya daha fazla bağlam kullanırken(örneğin, 1-h bellek ve 24-h bellek grupları), her gruba sıçanlar atayın ve grupları aşağıdaki bağlamlarda değiştirin (Şekil 2B).
Şekil 2: Temsili karşı dengeleme yöntemleri. (A) Kodlama ve test denemelerinde arenadaki nesnelerin olası yönelimleri sayaç olarak adlandırılır. Nesne 1 her zaman hareketli nesnedir. Her iki sayaç, hareketli nesnenin konumunun değişerek dengelenir. Her köşe iki kez işgal edilir ve nesne 1 çaprazdan bitişik olarak taşınır ve bunun tersi eşit sayıdadır. (B) İki dengelenmiş oturum için kodlama/test programı örneği(örneğin, bağlam 1 ve 2). Sıçanlar 1. Bir dizi karşı çift(örneğin, 1-2, 3-4, 5-6 ve 7-8) seçilir ve her sıçana bir deney grubunda atanır. Aynı sayaç seti her iki deney grubundaki sıçanlara da atanır. Bağlam 2'deki bir sonraki oturumda (oturum X+1; sağda), deneysel gruplardaki sıçanlar karşı dengeleme için değiştirilir ve yeni bir sayaç çifti kümesi atanır. Kodlama ve test denemelerinin başlangıcındaki süreye dikkat edilmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
NOT: Bu protokoldeki tüm işleme, alışkanlık ve kodlama/test seansları 12-h ışık/karanlık döngünün ışık evresi sırasında optimize edilmiştir ve bu nedenle, deneylerin ışık aşamasında yapılması önerilir.
2. Elleçleme ve alışkanlık
- Fareleri, ya tokmadan (sıçanlar ev tesisinde yetiştirilirse) ya da deneylerin başlamasından 2-3 hafta önce (sıçanların varıştan sonra bir hafta boyunca alışmalarına izin verdikten sonra harici bir tesisten sipariş edilirse) işlemeye başlayın.
- Sıçanlar deneyci tarafından dokunulana ve alınana kadar haftada 2 veya 3 gün boyunca 4 sıçanın her kafesine en az 10-15 dakika harcayın. Kafes başına ayrılan süreyi kafesteki sıçan sayısına bağlı olarak ayarlayın.
NOT: Sıçanlarla çalışmayı bekleyen tüm deneycilerin elleçleme sırasında mevcut olması önemlidir. - Taşımanın tonlamada başladığı durumlarda, bu seviyeye ulaşıldıktan sonra işlemeyi minimuma (isteğe bağlı) düşürün. Deneylerden 2-3 hafta önce başlıyorsanız, alışkanlık seanslarının başlangıcına kadar işlemeye devam edin.
- Kafeslerindeki fareleri deney odasına getirin, sıçanları nakil aracına ve deneysel odaya alışın. Farelerin sakinleşmeleri ve alışkanlıkları için zaman vermek için en az 30 dakika oturmalarına izin verin. Bu süreden sonra, sıçanları / kafesleri konut odasına geri koyun.
NOT: Adım 2.4 elleçleme ile birleştirilebilir ve gerektiği kadar tekrarlanabilir. Protokol başka manipülasyonlar içeriyorsa(örneğin, enjeksiyon prosedürü için işleme vb.) bu adımda ek alışkanlıklar uygulanabilir. - Sıçanları nesnelerle etkileşime alışkanlık haline getirmek ve yeni ortamların deneyiminden kaynaklanan genel stres seviyelerini azaltmak için nesne alışkanlığı gerçekleştirin.
- 1. oturum için, tüm ev kafeslerini deney odasına getirin ve sıçanların odaya alışmasına izin verin ve en az 30 dakika yetinin. Aynı kafesten sıçanları (2-4 sıçan) 20 dakika boyunca kovaya koyun. Her sıçan grubu arasındaki dışkı maddesini çıkararak kovayı temizleyin. Tüm kafesler için prosedürü tekrarlayın. Tüm sıçanları ev kafeslerine koyun ve barınma odasına geri dönün.
- 2. oturum için, ayrı bir günde tüm kafesleri deney odasına getirin ve en az 30 dakika bekletin. Her sıçanı ayrı ayrı 10 dakika boyunca kovaya koyun. Sıçanı ev kafesine geri yerleştirin ve her sıçandan sonra kovayı temizleyin. Tüm kafesleri barınma odasına geri verin.
- 3. oturum için, 2.5.2 adımlarını ayrı bir günde yineleyin.
- Deneysel cihaz kapalı bir kutuysa (Şekil 1B), sıçanları yeni deneysel cihaza alışkanlık haline getirmek için boş kutu alışkanlığı gerçekleştirmeyi tercih edin. 4. oturumda, tüm kafesleri deney odasına getirin ve en az 30 dakika bekletin. Aynı kafesten sıçanları (2-4 sıçan) 20 dakika boyunca bağlam veya mekansal ipuçları olmadan boş arenaya yerleştirin(Şekil 1B, ortada). Tüm sıçanları ev kafesine geri yerleştirin ve her sıçan grubundan sonra arenayı% 70 etanol ile silin.
NOT: Adım 2.5 ve 2.6, bağlam alışkanlık haftasından önce tek bir haftada gerçekleştirilmelidir (adım 2.7; bkz. Şekil 3). Bu adımlar sırasında birkaç gün ara vermek kabul edilebilir. Ancak, 2.7 adımını başlattıktan sonra, her adım belirtildiği gibi ardışık günlerde, test denemesinin sonuna kadar (adım 2.9) gerçekleştirilmelidir. - Sıçanları bağlama ve 3D ipuçlarına alışkanlık haline getirmek, genel stres seviyelerini azaltmak ve ortamın mekansal öğrenmesini desteklemek için bağlam alışkanlığı gerçekleştirin.
- Bölüm 1.1'de açıklandığı gibi ilk bağlamı oluşturmak için boş arenayı değiştirin, ancak nesneleri arenaya koymayın. Kayıt ekipmanlarını hazırlayın.
- 1. oturum için tüm kafesleri deney odasına getirin ve en az 30 dakika bekletin. Bunu el ile yapıyorsanız kaydediciyi başlatın. İlk sıçanı arenanın ortasına yerleştirin ve sıçanın arenayı 10 dakika keşfetmesine izin verin. Ardından, kayıt cihazı (manuel ise) durdurun ve sıçanı ev kafesine geri yerleştirin. Her sıçandan sonra arenayı% 70 etanol ile iyice silin ve bittiğinde tüm kafesleri muhafaza odasına geri verin.
- 2. ve 3. oturumlar için, her sıçan için 2.7.2 adımını art arda iki gün boyunca tekrarlayın, böylece sıçan başına toplam 3 bağlam alışkanlığı seansı vardır.
NOT: Özellikle büyük bir grupla uğraşırken sıçanların arenaya girme sırasını karıştırmayı düşünün. Bu, belirli sıçanların günün aynı saatinde tekrar tekrar çalıştırılmaktan kaçınır.
Şekil 3: İşleme, alışkanlık ve nesne konumu görev protokollerini içeren davranışsal deneyin tasarımı. Sıçanlar, alışkanlık haftasından birkaç hafta önce başlayarak düzenli olarak ele alınmalıdır. 0. haftada, nesne ve deneysel kutu alışkanlıkları, aralarında en az 24 saat aralıklarla 4 seans boyunca gerçekleştirilir. 1. haftada, bağlam alışkanlığı, arada 24-h aralıklarla ardışık 3 seans üzerinde gerçekleştirilir, ardından kodlama ve test çalışmaları yapılır. Bir sonraki oturuma geçmeden önce en az 48 saat ve 1 haftaya kadar aralık olmalıdır(örneğin, 2 veya 3. haftada bir sonraki bağlama alışın). Kısaltma: Hab., alışkanlık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Kodlama denemesi (Oturum 4)
NOT: Farmakolojik manipülasyonlarda, bir ajanı uygulamak için makul bir süre, kodlama denemelerinden önce veya hemen sonra ve/veya farmakolojik ajanın niteliğine bağlı olarak test denemesinden önce veya hemen önce olabilir.- Tüm kafesleri deney odasına getirin ve en az 30 dakika bekletin. Önceden hazırlanan programı kullanarak (Şekil 2B), yapışkan paspaslar veya çift taraflı bant kullanarak ilk özdeş nesne çiftini belirlenen yerlere (2 köşeye ve her ilgili duvardan 10 cm> bir mesafeye yerleştirin; L şeklinde bir karton parçası her seferinde aynı mesafeyi korumak için kullanılabilir).
- Kaydediciyi başlatın (el ile ise). İlk sıçanı arenaya bir duvara veya herhangi bir nesne tarafından işgal olmayan bir köşeye (her nesneye eşit mesafe) yerleştirin.
NOT: Zayıf veya güçlü kodlama için aşağıdaki adımları izleyin. - Zayıf kodlama (1 deneme) için,sıçanın arenayı ve nesneleri 20 dakika boyunca keşfetmesine izin verin. Ardından, kayıt cihazı (manuel ise) durdurun ve sıçanı ev kafesine geri yerleştirin. Nesneleri çıkarın ve hem nesneleri hem de arenayı% 70 etanol ile iyice silin.
- Tüm sıçanlar için 2.8.3 adımını tekrarlayın, böylece her sıçan 20 dakikalık 1 kodlama denemesi alır.
- Güçlü kodlama (3 deneme)için, sıçanın arenayı ve nesneleri 5 dakika boyunca keşfetmesine izin verin. Ardından, kayıt cihazı (manuel ise) durdurun ve sıçanı ev kafesine geri yerleştirin. Nesneleri kaldırmayın. Arenayı ve nesneleri% 70 etanol ile silin.
- 2.8.5 adımını aynı sıçanla iki kez daha tekrarlayın, böylece toplamda 3 deneme vardır. Süre bittiğinde fareyi ev kafesine geri yerleştirin. Nesneleri iyice temizlemek için çıkarın ve nesneleri ve arenayı% 70 etanol ile silin.
NOT: Bir sıçan için denemeler arası aralık yaklaşık 1-2 dakika olmalıdır. - Her sıçan için 2.8.5-2.8.6 adımlarını yineleyin.
- Gecikme süresi 24 saatten kısaysa, kafesleri test denemesine kadar deney odasında tutun. Değilse, tamamlandığında tüm kafesleri muhafaza odasına geri verin.
- Test denemesi (Oturum 4)
NOT: Gecikme süresi kodlama denemesinin başlangıcından itibaren sayılmalıdır.- 24 saat gecikme (veya test denemesinin ertesi gün yapılmasını gerektiren herhangi bir gecikme) durumunda, tüm kafesleri deney odasına getirin ve sıçanların en az 30 dakika bırakılabilmesi için ilk testten önce yeterli zaman bırakın. Zamanlamaya göre, nesneleri belirlenen konumlara (yeni bir konumdaki nesnelerden biri) yerleştirin.
- Zamanı geldiğinde, kaydediciyi başlatın (el ile ise). İlk sıçanı arenaya bir duvara veya herhangi bir nesne tarafından işgal olmayan bir köşeye (her nesneye eşit mesafe) yerleştirin.
- Sıçanın arenayı ve nesneleri 5 dakika boyunca keşfetmesine izin verin. Ardından, kaydediciyi durdurun (el ile ise). Fareyi ev kafesine geri yerleştirin. Nesneleri çıkarın ve hem nesneleri hem de arenayı% 70 etanol ile iyice silin.
- Her sıçan için 2.9.2-2.9.3 adımlarını tekrarlayın. Tüm kafesleri barınma odasına geri götür.
NOT: Aşağıdaki her kodlama/test oturumunda, en az 48 saat ve 1 haftaya kadar bir aralıktan sonra alışkanlık protokolünü adım 2.7'den (bağlam alışkanlığı) başlatın.
3. Veri analizi
- Her sıçan için, bu amaç için tasarlanmış yazılımı kullanarak veya manuel bir kurulum kullanarak hem kodlama hem de test denemelerinde her nesne için keşif süresini puanlama. Tüm süre boyunca kodlama denemelerini puanla. En iyi ayrımcılık performansı için 2 dakika boyunca test denemelerini puanlama3. Otomatik çevrimiçi yazılım puanlaması kullanıyorsanız, puanlama verilerini yazılımdan dışa aktarın.
- Sıçanın nesneyle temas ettiğinde, nesneyi kokladığında veya nesneye 2 cm'den daha kısa bir mesafede baktığında keşif süresini sayın. Sıçanın dikkati nesneden başka bir yerde görünmediği sürece(örneğin, nesneden uzağa bakmak) keşif olarak nesneye tırmanmayı ve oturmayı ekleyin.
- Her sıçan için her iki nesne için toplam keşif süresini hesaplayın. Güvenilir olmayan keşifleri yansıtabileceğinden, test denemesinde toplam keşif süresi 10 s'den az olan herhangi bir sıçanı (2 dakikalık puanlama için) bu testten hariç tutarak düşünün.
- Her sıçan için her nesne (denklem 1) veya ayrımcılık endeksi (DI) için keşif yüzdesini hesaplayın ve gruplar için ortalama değerleri hesaplayın.
(1)
NOT: % keşif % 50 veya DI 0 ise, performansın şans düzeyinde olduğu ve sıçanın her iki nesne için de tercihi olmadığı anlamına gelir. Kodlama denemeleri sırasında ortalama yüzde keşif ve DI sırasıyla ~% 50 veya 0 olmalıdır. Kodlama denemesinde herhangi bir nesne için [ortalama ± (2 × SD)] daha yüksek bir tercih gösteren herhangi bir sıçan, ilgili testin analizinden hariç tutulmalıdır. Bu, test denemesinde tercihin kararlı nesne konumunun belleği olarak güvenilir bir şekilde yorumlanmasını sağlar. Bu değer, tek bir test veya birkaç testten elde edilen birleşik kodlama verileri için hesaplanabilir. - Deneysel kuruluma en uygun yöntemle verileri analiz edin. Şans seviyesinin üzerinde önemli bir tercihi tespit etmek için tek örnekli bir t-test kullanın.
- Karşı dengeleme ile birden fazla bağlam kullanırken, aynı deneysel durumun sonuçlarını bağlamlar arasında birleştirin.
NOT: Bu, aynı sıçanlardan oluşan gruplarla sonuçlanacak, iki grup için eşleştirilmiş bir t-testi kullanarak ve ikiden fazla grup için tekrarlanan varyans analizi (ANOVA) kullanılarak konu içinde karşılaştırmaya olanak sağlayacaktır.
(1)
Representative Results
Burada, lister hooded suşu ve vahşi tip Lister Hooded sıçanlara dört kez geri tepilmiş Long-Evans suşu ile erkek tirozin hidroksilaz (Th)-Cre transgenik sıçanlar13 kullanılarak tanımlanan hem güçlü hem de zayıf kodlama protokolleri için temsili sonuçlar gösterilmiştir. Bu sıçan hattı optogenetik içeren gelecekteki çalışmalarda kullanılacağı için Th-Cre transgenik sıçanlar kullanılmıştır. Her protokol kullanılarak, bellek 1 ve 24 saat gecikmelerle test edildi. 1 h'deki testler kısa süreli belleği gösterirken, 24-h testleri uzun süreli belleği gösterir. Kodlama tercihi için dışlama değeri, beş testten (güçlü ve zayıf kodlama protokolleri) elde edilen birleşik veriler [%50,8 ± (%2,10×,8)] kullanılarak protokolde açıklandığı gibi hesaplanmıştır. Bu değerlerin üzerinde ve altında kodlama tercihi olan sıçanlar ilgili testlerin analizlerinin dışında tutulmuştu.
Güçlü kodlama deneyleri için 16 sıçan, zayıf kodlama deneyleri için ise 19 sıçan kullanılmıştır. Güçlü kodlama denemeleri sırasında (3 × 5 dk kodlama; Şekil 4A), her iki nesne için de anlamlı bir tercih yoktu (52.0 ± %1.9, n = 16, t15 = 1.1, p = 0.29; tek örnekli t-test ve şans düzeyi). Bu güçlü kodlama protokolü, nesnenin yeni konumda tercihine yol açtı, hem 1-h hem de 24-h gecikmeli testlerde şans seviyesinden (%50) önemli ölçüde daha yüksek olan ortalama yüzde keşfi açısından gösterildiği gibi (1-h bellek, 77,9 ± %2,4, n = 8, t7 = 11,8, p < 0,001; 24-h bellek, 65.2 ± %5.3, n = 8, t7 = 2.8, p = 0.025; tek örnekli t-test ve şans seviyesi). 1-h ve 24-h bellek arasında anlamlı bir fark yoktu (p = 0.056; unmamış Welch'in t-test).
Zayıf kodlama denemeleri sırasında (20 dk kodlama; dört bağlamdan birikmiş sonuçlar; Şekil 4B), her iki nesne için de anlamlı bir tercih yoktu (51,1 ± %1,0, n = 66, t65 = 1,2, p = 0,24; tek örnekli t-test ve şans düzeyi). Bu zayıf kodlama protokolü, 1-h gecikmeli testlerde şans seviyesine kıyasla yeni konumdaki nesnenin tercihinde önemli bir artış sağlamıştır, ancak 24-h gecikme değil (dört bağlamdan birleşik veriler; 1-h bellek, 66,7 ± %2,0, n = 32, t31 = 8,2, p < 0,001; 24-h bellek, 49,6 ± %2,6, n = 34, t33 = 0,16, p = 0,87; tek örnekli t-test ve şans seviyesi). 1-h ve 24-h gecikmeli testlerdeki performans arasında önemli bir fark vardı (1-h bellek: n = 32, 24-h bellek: n = 34, t61.5 = 5.2, p < 0.001; unmamış Welch'in t-testi).
Grup düzeyindeki bellek, 24-h gecikme testinde şans düzeyinde performansa göre indekslendiği gibi gözlenmedi, ancak bireysel varyasyonlar gösterdi. Zayıf ve hafızasız durumlar için bu yüksek varyasyon(örneğin,24-h testi) nesnelerin daha rastgele keşfi nedeniyle yaygın olarak gözlenmiştir. Bu nedenle, sıçanların performansını bireysel olarak yorumlamamak önemlidir. Bunun yerine, tek tek veri noktalarının dağıtımı, testin güvenilir sonucu olarak grup ortalaması ile birlikte kullanılabilir. Kodlama ne kadar güçlü olursa, sıçanların davranışı o kadar düzgün hale gelir ve güçlü kodlama protokolü için Şekil 4A'da gözlemlenebileceği gibi istatistiksel öneme ulaşmak için gereken sıçan sayısı o kadar az olur. Buna karşılık, zayıf koşullar için güvenilir sonuçlar elde etmek için daha büyük gruplara ihtiyaç vardır (Şekil 4B).
Şekil 4: Güçlü ve zayıf kodlamadan sonra bellek performansı. (A) Güçlü kodlama denemesi (3 × 5 dk kodlama) ve ardından 1-h veya 24-h test denemeleri. Kodlama denemeleri sırasında her iki nesne için de önemli bir tercih yoktu (n = 16). Güçlü kodlama, şans seviyesine kıyasla hem 1-h hem de 24-h gecikmeleri olan testlerde yeni konumdaki nesne için önemli ölçüde artan bir tercih üretti (1-h ve 24-h bellek: n = her grupta 8). Gruplar arasında önemli bir fark yoktu. (B) Zayıf kodlama denemesi (20 dk kodlama) ve ardından 1-h veya 24-h test denemeleri. Kodlama denemeleri sırasında grup olarak her iki nesne için de önemli bir tercih yoktu (n = 66). Zayıf kodlama, testteki yeni konumdaki nesneyi şans düzeyine kıyasla 1-h, ancak 24-h gecikme ile önemli ölçüde artırdı (1-h bellek: n = 32; 24-h bellek: n = 34). 1-h ve 24-h gecikmeli testlerde performans arasında önemli bir fark vardı. Sonuçlar dört bağlamdan birikmiş. Tek tek veri noktaları nokta olarak sunulur. Tüm çubuklar, nesnenin yeni konumdaki keşif yüzdesini SEM ± ortalama olarak gösterir. *p < 0,05, ***p < 0,001; tek örnekli t-test ve şans seviyesi (%50, kesik çizgi). ###p < 0.001; ns, önemli değil; Welch'in test testinineşlenmemiş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu yerleşik protokolün önemli bir avantajı, aynı sıçan kohortları ile dört ayrı bağlam (Şekil 1C) kullanılarak dört kez gerçekleştirilebilmesidir. Şekil 5'te gösterilen sonuçlar, iki deneysel grupla (1-h ve 24-h bellek grupları) karşı dengeyi kullanmanın olası bir yolunu göstermektedir. İki grup iki bağlam (bağlam 1 ve 2) üzerinde dengelendi ve bu iki ek bağlamda tekrarlandı (bağlam 3 ve 4; Şekil 5A). Dört bağlamdan elde edilen sonuçlar, her bir bağlamdaki tercih ile şans düzeyi karşılaştırılarak her deney grubunun belleğinin değerlendirildiği Şekil 5B,D'deayrı ayrı sunulur (1-h bellek: Bağlam 1, 69,9 ± %3,6, n = 9, t8 = 5,5, s < 0,001; Bağlam 2, 65.6 ± %3.9, n = 9, t8 = 4.0, p = 0.004; Bağlam 3, 65.2 ± %3.8, n = 7, t6 = 4.0, p = 0.007; Bağlam 4, 65.3 ± %5.6, n = 7, t6 = 2.7, p = 0.035; 24-h bellek: Bağlam 1, 45.1 ± 6.4%, n = 9, t8 = 0.77, p = 0.46; Bağlam 2, 49.1 ± %4.9, n = 9, t8 = 0.18, p = 0.86; Bağlam 3, 57.2 ± %4.1, n = 8, t7 = 1.7, p = 0.12; Bağlam 4, 47.6 ± %4.7, n = 8, t7 = 0.52, p = 0.62; tek örnekli t-test ve şans seviyesi).
1, 2 ve 4. bağlamlarda, grupların konu arası karşılaştırması 1-h ve 24-h bellek (1-h bellek ile 24-h bellek arasında önemli farklar ortaya koydu: Bağlam 1, t12.7 = 3.4, p = 0.005; Bağlam 2, t15.2 = 2.6, p = 0.019; Bağlam 3, t13.0 = 1.4, p = 0.17; Bağlam 4, t12.2 = 2.4, p = 0.032; ödenmemiş Welch'in t-testi). Verilerin daha iyi temsili ve konu içinde karşılaştırılması için, iki dengelenmiş bağlamdan elde edilen sonuçlar birleştirildi (Şekil 5C,E). Kombine deney grupları tekrar tek tek şans seviyesi ile karşılaştırıldı (Bağlam 1 ve 2 birleştirilmiş: 1-h bellek, 67,8 ± %2,6, n = 18, t17 = 6,7, s < 0,001; 24 saat bellek, 47,1 ± %3,9, n = 18, t17 = 0,74, p = 0,47; Bağlam 3 ve 4 birleştirilmiş: 1-h bellek, 65,3 ± %3,3, n = 14, t13 = 4,7, s < 0,001; 24 saat bellek, 52,4 ± %3,2, n = 16, t15 = 0,73, p = 0,48; tek örnekli t-test ve şans seviyesi). Daha sonra deney grupları birbirleriyle karşılaştırıldı.
Her iki bağlam çiftinde de, konu içi karşılaştırmalarla ortaya çıkan gruplar arasında önemli farklılıklar vardı (1-h bellek ile 24-h bellek: Bağlam 1 ve 2 birleştirilmiş, t16 = 3.5, p = 0.003; Bağlam 3 ve 4 birleştirilmiş, t13 = 2.4, p = 0.032; eşleştirilmiş t-test). İki dengelenmiş oturum için bağlam 1 ve 4 kullanılarak zayıf kodlama protokolünde vahşi tip Lister Hooded sıçanlarla da karşılaştırılabilir sonuçlar elde edildi (veriler gösterilmedi). Sonuçların tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği, her veri kümesi tek yönlü ANOVA kullanılarak karşılaştırılarak doğrulanmıştır. Dört bağlam arasında anlamlı bir fark saptı (1-h bellek: F3,28 = 0,31, p = 0,81; 24-h bellek: F3,30 = 0,99, p = 0,41). Bu nedenle, bu protokoldeki talimatlara uyulacağı göz önüne alındığında, nesne konumu testi, tekrarların minimum etkisiyle güvenilir bir şekilde tekrarlanabilir.
Şekil 5: zayıf kodlama protokolünün sonuçlarını iki seans boyunca dengelenmiş iki deneysel grupla sunmanın ve analiz etmenin farklı yolları. (A) İki deneysel grupla (1-h ve 24-h bellek grupları) iki seans boyunca denge için deneysel tasarım (bağlam 1 ve 2). Karşı dengeleme iki ek oturumda tekrarlandı (bağlam 3 ve 4). (B ve D) Her bağlamdan ve deney gruplarından elde edilen sonuçlar, şans düzeyi ve birbirleri ile ayrı ayrı karşılaştırıldı. Dört bağlamda da, 1-h gecikmeli testlerde nesnenin yeni konumdaki tercihi şans seviyesine göre önemli ölçüde artırıldı [Bağlam 1 ve 2: n = grup başına 9 (B); Bağlam 3 ve 4: n = Grup başına 7 (D)]. 24-h gecikme testlerinde, nesnenin yeni konumdaki tercihi şanstan farklı değildi (Bağlam 1 ve 2: n = grup başına 9; Bağlam 3 ve 4: n = Grup başına 8). Deneysel grupların 1, 2 ve 4 bağlamlarındaki tercihleri arasında önemli bir fark vardı, ancak konu karşılaştırması ile ortaya çıkan bağlam 3 değil. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; tek örnekli t-test ve şans seviyesi (%50, kesik çizgi). #p < 0.05; ##p < 0.01; ns, önemli değil; Welch'in test testinineşlenmemiş. (C ve E) Sonuçlar, iki dengelenmiş bağlamdaki deneysel grupları birleştirdikten sonra sunulur [Bağlam 1 ve 2 birleştirilmiş, n = grup başına 17 (C); Bağlam 3 ve 4 birleştirilmiş, n = grup başına 14 (E)]. Her iki bağlam çiftinde de 1-h gecikmeli, ancak 24 saat gecikmeli testlerde nesnenin roman konumundaki tercihi şans düzeyine göre önemli ölçüde artırıldı. Deneysel grupların konu içi karşılaştırması, her iki bağlam çiftinde de 1-h ve 24-h gecikmeleri olan testlerde yeni konumdaki nesne tercihleri arasında önemli farklılıklar olduğunu ortaya koydu. s < 0.001; tek örnekli t-test ve şans seviyesi (%50, kesik çizgi). #p < 0.05, ##p < 0.01; eşleştirilmiş t-test. Tek tek veri noktaları nokta olarak sunulur. Tüm çubuklar, SEM'± ortalama olarak nesnenin yeni konumdaki keşif yüzdesini gösterir.
Discussion
Nesne konumu görevi, daha önce açıklandığı gibi uzamsal belleği araştırmak için çeşitli çalışmalarda kullanılabilir. Kurulumun esnekliği, farklı güçlü yönlerin kısa ve uzun vadeli belleğinin modelilmesini sağlar ve düşük bir maliyetle kolayca uygulanabilir. Ancak, protokolde sonuçları etkileyebilecek birçok parametre olduğundan ve farklı çalışmalar bu parametrelerde biraz değiştiğinden6, görevi ilk kez başarıyla uygulamakta zorluklarla karşılaşabilirsiniz. Yukarıdaki protokol, okuyuculara bu süreçte sorunsuz bir şekilde rehberlik etmeyi amaçlamaktadır. Görevin yüksek yanıtlanabilirlikle başarılı bir şekilde uygulanmasında önemli olabilecek diğer önemli adımlar aşağıda tartışılacaktır.
Nesne konumu deneyleri çalıştırırken kodlama/test oturumu genellikle odak noktası olsa da, işleme ve alışkanlık protokolleri, sonucun bozulmamış doğal sıçan davranışına bağlı olduğu bu tür davranışsal testlerin sonucu üzerinde derin bir etkiye sahiptir14,15. Bu nedenle, kodlama/test oturumundan önceki adımlar, sıçan davranışını ve hafızasını etkileyebileceğinden ve sonuç olarak son sonuçları etkileyebileceğinden dikkatli bir şekilde tasarlanmalıdır. Sıçanların deneyciye aşina olması ve görev, doğal davranış sergileme olasılığını artırırken stres faktörlerinin etkisini en aza indirecek şekilde iyi bir kullanım ve alışkanlık seviyesi8. Protokolde belirtildiği gibi, sıçan suşu ev tesisinde tutulursa, elleçleme yavruların sütten tutulması kadar erken başlayabilir. Önceki deneyime dayanarak (veriler gösterilmedi) ve önceki birkaç çalışmadan16,17, bu erken kullanım, takip eden aylarda düşük kaygı ve gelişmiş merakla sonuçlanır.
Nesne konumu görevi yalnızca sıçanların içsel keşif dürtüsüne bağlı olduğundan, sıçanlar keşfetmeye istekli değilse veya 'neofobik davranış' olarak adlandırılan yeniye yaklaşmak için isteksizse beklenen davranış kolayca engellenebilir1. Bu nedenle, çalışmanın özel ihtiyaçlarına göre kapsamlı bir kullanım ve alışkanlık protokolünün dahil edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu protokol minimum gereksinim kılavuzu olarak kullanılabilir ve daha fazla adım uygulanabilir(örneğin,çalışma daha sonraki bir aşamada enjeksiyonları içerecekse, enjeksiyon prosedürlerine ve belirli tutma pozisyonuna alışmak gerekir). Suş ve deneysel sıçanların yaşı diğer iki etkili faktördür ve yetersiz sonuçlardan kaçınmak için bir deney planlamadan önce düşünülmelidir. Farklı sıçan suşları farklı davranışlara ve temel anksiyete seviyelerine sahip olabilir18,19,20 ve bu nedenle, kullanılan zorlanmaya bağlı olarak protokolde özel ayarlama gerekebilir.
Bu protokolün, Lister Hooded suşu ve vahşi tip Lister Hooded sıçanlara dört kez geri tepilmiş Long-Evans suşu ile Th-Cre transgenik sıçanlarla iyi çalıştığı doğrulanmıştır. Davranış deneylerinde sıçanlar için mantıksal olarak ideal bir başlangıç yaşı yaklaşık 12 hafta20, ancak türler arası değişkenlik ve görevin özel gereksinimleri dikkate alınmalıdır. Ayrıca, çalışmanın ilgisini çekiyorsa, gelişmekte olan sıçanları kullanmak da mümkün olabilir, ancak protokolde düzenlemeler gerekebilir ve burada kapsam dahil değildir. Bununla birlikte, belirli bir yaştaki sıçanın bu görevi başarıyla yerine getirmek için gereken bilişsel işlevleri geliştirip geliştirmediğini düşünmek önemlidir. Bunu araştıran bir çalışma21, yetişkin sıçanlarda gözlemlendiği gibi, sadece doğum sonrası 38. Burada sunulan protokol, ilk kodlama/test seansının başında 15-16 haftalık sıçanlar kullanılarak başarılı oldu. Daha önce, aynı güçlü kodlama protokolü, yeterince genç yaşta kullanım ve alışkanlık eksikliği nedeniyle en uygun alışkanlık seviyesine ulaşamayan 23 haftalık sıçanları kullanırken olumsuz sonuçlara karşı yetersiz üretti. Bu sıçanlar ya şans seviyesinden farklı bir performans gösteremediler ya da aslında, yerinden edilmiş nesneler yerine kararlı nesneleri tercih etme açısından gözlemlendiği gibi yeniliğe karşı nefret gösterdiler (veriler gösterilmedi). Bu sonuçlar, yaşın ve kullanım alışkanlığının zamanlamasının, alışkanlığın etkinliği üzerinde bir etkisi olabileceğine ve sonuç olarak, testlerde endişeli ve neofobik davranışların gözlemlenmesine katkıda bulunabileceğine dair kanıtlar samaktadır.
Burada, nesne konumu görevinde güçlü veya zayıf kodlama sağlayan iki farklı protokol özetlenir. Bu protokollerin oluşturulması sırasında, tek uzun denemeler sırasında(örneğin, 20 dakikalık kodlama) 5-10 dakikalık keşiflerden sonra nesnelere olan ilginin azaldığı ve sıçanların sonunda keşfetmeyi bıraktığı gözlendi. Bu, nesne konumlarının daha zayıf belleğiyle sonuçlanır. Kodlama denemelerini kısa dinlenme süreleriyle(örneğin, 3 x 5 dakikalık kodlama) bir kodlama protokolü bunun üstesinden gelir ve denemeler boyunca yüksek keşiflere yol açar. Bu nedenle, aktif keşif süresi ve bu iki kodlama protokolünün farklı düzeni, 3 x 5 dakikalık kodlamadan sonra 20 dakikalık kodlama protokollerinden daha güçlü olan belleğin gücünü etkiler. Benzer sonuçlar, tek deneme ile aralanmış deneme protokolleri ile biraz farklı süreler kullanılarak da elde edilebilir ve çalışmanın ve sıçan suşunun ihtiyaçlarına uygun ayarlamalar yapılabilir.
Odada sadece dış ipuçları bulunan düz beyaz bir açık alan kullanan protokollerin aksine, burada sunulan protokol, öğrenmek için daha fazla zaman gerektiren farklı bağlamlara ve labirent içi ipuçlarına sahip bir arena kullanır. Bu nedenle, kodlama denemesinden önce protokole bir bağlam alışkanlığı adımı eklenmesi önerilir. Bu, sıçanların alışkanlık sırasında her bağlamın mekansal bir haritasını oluşturmasına ve aşağıdaki kodlama denemesinin süresini azaltmasına izin verecektir, çünkü sıçanların sadece bu haritayla ilgili olarak nesnelerin konumlarını kodlamaları gerekecektir. Ayrıca, bağlam alışkanlığı, sıçanların 3B uzamsal ipuçları gibi her bağlamdaki olası herhangi bir dikkat dağıtıcıya alışmasını ve takip edilecek kodlama / test oturumunda nesne keşfi dışındaki davranışları en aza indirmesini sağlayacaktır. Çeşitli seviyelerden(yani çok çeşitli nesne konum kombinasyonlarından (sayaçlar) ve nesne yer değiştirme yönüne) oluşan kapsamlı bir karşı dengeleme yönteminin uygulanmasıyla, arenanın köşelerindeki ışık yoğunluğu ve duvar renklerindeki/desenlerindeki farklılıklar nedeniyle yükselebilecek istenmeyen tercihler en aza indirilmiş olur.
Kodlama/test oturumları arasındaki yanıtlanabilirliği artırmak ve yinelemenin etkisini en aza indirmek için görevi tekrarlarken çeşitli faktörler göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, aynı bağlamı kullanarak yinelenen oturumların gerçekleştirilmesiyle ortaya çıkabileceği uzamsal belleğin birikmesini önlemek için farklı bağlamların (kodlama/test oturumlarının tekrar sayısı kadar) tasarlanması gerekir. Bunu başarmak için, farklı renk ve desenlerde değiştirilebilir duvarlara sahip bir aparat kullanılmıştır (Şekil 1B, C). Duvarlara asılan farklı duvarlar ve 3D nesneler (oyuncaklar veya farklı renk ve şekillerdeki küçük günlük öğeler gibi, bkz. protokol ve Şekil 1C),sıçanların bağlamlarıyla ilgili olarak nesne konumlarını öğrenmek için potansiyel olarak kullandıkları mekansal ipuçları ve yer işaretleridir. Bir testin taşınan nesne için tercih üretememesi durumunda, bağlamın bu parametrelerini (duvar tasarımı ve uzamsal ipuçları) değiştirmek düşünülebilir. Alternatif olarak, bu protokolde olduğu gibi kare bir arena yerine nesne konumu görevleri için dikdörtgen veya dairesel şekilli bir arena kullanılabilir. Dairesel arenaların, köşeli arenalarda sıklıkla gözlenen köşe tercihleri22'yi ortadan kaldırdığı bildirilmektedir ve bu nedenle, özellikle yüksek anksiyeteli bir sıçan veya fare zorlanması ile uğraşırken faydalı olabilir. Bu protokolde dört farklı bağlam oluşturma gereksinimleri dörtgen bir şekille en uygun şekilde çalışsa da, dairesel bir arena da bazı ayarlamaların ardından işlevsel hale getirilebilir.
İkincisi, her kodlama/ test seansı arasındaki aralıklar, sıçanların her seferinde aynı ilgi seviyesini koruyacak şekilde belirlenmeli ve yoğun bir tekrar programından kaynaklanan kümülatif öğrenme riskinden kaçınılmalıdır. Genellikle, kodlama ve test denemeleri arasındaki gecikme süresinin en az iki katı bir aralık yeterlidir ve daha uzun aralıklar ikiden fazla tekrar için daha elverişlidir. Bu, 24-h testten sonra en az 48-h aralığı bir veya iki tekrar için yeterli olsa da, dört tekrar için 1 haftalık bir aralık kullanılması önerilir. Şekil 5'teki sonuçlar ve ANOVA kullanılarak yapılan karşılaştırmada belirtildiği gibi, görev dört kez başarıyla tekrarlanabilir. Buna dayanarak, belirlenen protokol dört deneysel koşulu dengelemek için kullanılabilir. Deneysel grupların sayısı, kodlama/deneme oturumlarının farklı bağlamlardaki tekrarlarının sayısını belirler. Şekil 5'teki sonuçlar, protokolü iki deneysel grupla kullanmanın olası bir yolunu temsil eder. Gruplar iki oturumda dengelendi ve aynı koşullar iki ek oturumda (doğrulama amacıyla) tekrarlandı. İkinci dengelenmiş oturumlar kümesi, yeni koşulları dengelemek için de kullanılabilir. Benzer şekilde, sırasıyla üç veya dört dengelenmiş seans kullanılarak üç veya dört deneysel koşul karşılaştırılabilir.
Bu gibi durumlarda, bağlamlar protokolde açıklanan zıt özellikleri barındıracak şekilde tasarlanmalıdır. Dengelenmiş tasarımın, uzun süreli bir etki veya hasar bırakabilecek farmakolojik bir müdahale gibi ek manipülasyonların kullanılacağı deneyler için uygun olmayabileceği dikkat çekicidir. Testlerin etkinliğini ve cevaplanabilirliğini korumak için deney buna göre tasarlanmalıdır. Tekrarlanan testlerden elde edilen veriler, Şekil 5'tegösterildiği gibi çeşitli şekillerde sunulabilir ve analiz edilebilir. İlk analiz için, her bağlamdaki deneysel gruplar, önemli bir tercihi belirlemek için tek örnekli t-test kullanılarak şans seviyesiyle ayrı ayrı karşılaştırılabilir (Şekil 5B,D). Bu, verileri hızlı bir şekilde anlamak için yararlı olabilir, ancak grupların yalnızca dolaylı bir karşılaştırmasını sağlar. Bu nedenle, iki veya daha fazla grubu karşılaştırmak için, veriler sırasıyla iki örnekli t-testleri (eşleştirilmiş veya eşleşmemiş) veya ANOVA kullanılarak analiz edilmelidir. Bu, tek bir kodlama/test oturumu içindeki grupların konu karşılaştırması ( Şekil4A ve Şekil 5B,D) veya iki (veya daha fazla) dengelenmiş bağlamdan grupların konu içi karşılaştırması şeklinde olabilir (Şekil 5C,E). İkinci yöntem, özellikle daha önce açıklandığı gibi, davranıştaki rastgelelik nedeniyle yüksek varyansla sonuçlanan zayıf bellek koşullarıyla uğraşırken şiddetle tavsiye edilir.
Dengelenmiş bağlamları birleştirmek, grubun davranışını en az varyasyonla güvenilir bir şekilde görselleştirmek için gereken daha büyük gruplara yol açar. Dengelenmiş oturumlarda tekrarları olan bir protokol kullanarak, sıçan sayısında aynı istatistiksel güce sahip tek bir test kullanılarak gerekli olan sayının yaklaşık üçte birine bir azalma beklenebilir. Genellikle, dengelenmiş seanslar için 7 ila 15 sıçan aralığında (toplam) ve etki boyutu ve gücü 0,8'den büyük olan tek bir seans için 20 ila 50 sıçan (grup başına 10 ila 25) aralığında örnek boyutları yeterlidir. İhtiyaç duyulan hayvan sayısının azalması ve bu protokolü kullanarak her hayvandan edindiğimiz bilgilerdeki artış hem çalışmayı rafine ediyor hem de hayvanların araştırmalarda etik kullanımlarının 3R ilkelerine hizmet ediyor. Bu adımda, güçlü bir hafıza ile eşlik etmeyen rastgele sıçan davranışının hem düşük hem de şans üstü bireysel güçlü tercihlerle sonuçlanabileceğini, ancak grup ortalamasının şanstan önemli ölçüde farklı olmayan bir tercihte bulunduğunu akılda tutmak önemlidir. Bireysel veriler dikkatle yorumlanmalıdır. Bir grup içindeki tek tek veri noktalarının dağılımı da sonuçların yorumlanabilir. Şekil 4 ve Şekil 5'te görüldüğü gibi, dağılım belleğin gücüne bağlı olarak değişir. Genel olarak, burada sunulan protokol, kısa süreli ve/veya uzun süreli uzamsal belleği modellemek için tekrarlarla nesne konumu görevini uygulamak için kolayca takip edilebilir. Basit ve esnek eğitim protokolü ve daha fazla manipülasyon uygulama olasılığı, bu görevi popüler bir seçim haline getirir. Protokoldeki bu değişiklikler, bellek edinme, birleştirme ve geri çağırma gibi belirli adımların araştırılmasını sağlar.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O'Hara ve David Bett'e anlayışlı yorum ve öneriler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Erasmus+ (G.B. ve L.N.'ye) tarafından desteklendi; Aarhus Üniversitesi Sağlık Enstitüsü (K.H.'ye); Novo Nordisk Vakfı Genç Araştırmacı Ödülü 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) ve PROMEMO - Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı (DNRF133) tarafından finanse edilen bir Mükemmeliyet Merkezi olan Promemo - Center for Proteins in Memory (T.T.'ye).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
| Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
| Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
| Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
| Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
| Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
| Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |
References
- Hughes, R. N. Neotic preferences in laboratory rodents: issues, assessment and substrates. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (3), 441-464 (2007).
- Blaser, R., Heyser, C. Spontaneous object recognition: a promising approach to the comparative study of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 183 (2015).
- Dix, S. L., Aggleton, J. P. Extending the spontaneous preference test of recognition: evidence of object-location and object-context recognition. Behavioral Brain Research. 99 (2), 191-200 (1999).
- Barker, G. R., Warburton, E. C. When is the hippocampus involved in recognition memory. Journal of Neuroscience. 31 (29), 10721-10731 (2011).
- Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
- Gulinello, M., et al. Rigor and reproducibility in rodent behavioral research. Neurobiology of Learning and Memory. 165, 106780 (2019).
- Rudeck, J., Vogl, S., Banneke, S., Schonfelder, G., Lewejohann, L. Repeatability analysis improves the reliability of behavioral data. PLoS One. 15 (4), 0230900 (2020).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
- Migues, P. V., et al. Blocking synaptic removal of GluA2-containing AMPA receptors prevents the natural forgetting of long-term memories. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3481-3494 (2016).
- Maingret, N., Girardeau, G., Todorova, R., Goutierre, M., Zugaro, M. Hippocampo-cortical coupling mediates memory consolidation during sleep. Nature Neuroscience. 19 (7), 959-964 (2016).
- Chao, O. Y., de Souza Silva, M. A., Yang, Y. M., Huston, J. P. The medial prefrontal cortex - hippocampus circuit that integrates information of object, place and time to construct episodic memory in rodents: Behavioral, anatomical and neurochemical properties. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 113, 373-407 (2020).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
- Witten, I. B., et al. Recombinase-driver rat lines: tools, techniques, and optogenetic application to dopamine-mediated reinforcement. Neuron. 72 (5), 721-733 (2011).
- Costa, R., Tamascia, M. L., Nogueira, M. D., Casarini, D. E., Marcondes, F. K. Handling of adolescent rats improves learning and memory and decreases anxiety. Journal of the American Association for Labaratory Animal Science. 51 (5), 548-553 (2012).
- Schmitt, U., Hiemke, C. Strain differences in open-field and elevated plus-maze behavior of rats without and with pretest handling. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 59 (4), 807-811 (1998).
- Kosten, T. A., Kim, J. J., Lee, H. J. Early life manipulations alter learning and memory in rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (9), 1985-2006 (2012).
- Denenberg, V. H., Grota, L. J. Social-seeking and novelty-seeking behavior as a function of differential rearing histories. Journal of Abnormal and Social Psychology. 69 (4), 453-456 (1964).
- Clemens, L. E., Jansson, E. K., Portal, E., Riess, O., Nguyen, H. P. A behavioral comparison of the common laboratory rat strains Lister Hooded, Lewis, Fischer 344 and Wistar in an automated homecage system. Genes, Brain, and Behavior. 13 (3), 305-321 (2014).
- Ennaceur, A., Michalikova, S., Bradford, A., Ahmed, S. Detailed analysis of the behavior of Lister and Wistar rats in anxiety, object recognition and object location tasks. Behavioral Brain Research. 159 (2), 247-266 (2005).
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936-946 (2006).
- Contreras, M. P., Born, J., Inostroza, M. The expression of allocentric object-place recognition memory during development. Behavioral Brain Research. 372, 112013 (2019).
- Yaski, O., Eilam, D. How do global and local geometries shape exploratory behavior in rats. Behavioral Brain Research. 187 (2), 334-342 (2008).
