Summary
利 什曼原虫 感染中与吞噬作用相关的机制仍然知之甚少。在这里，我们描述了评估 利什曼原虫 与宿主细胞相互作用期间发生的早期事件的方法。
Abstract
吞噬作用是一个精心策划的过程，涉及不同的步骤：识别，结合和内化。专业吞噬细胞通过吞噬作用吸收 利什曼原虫 寄生虫，包括通过多个宿主细胞受体识别寄生虫表面上的配体。 利什曼原虫 与巨噬细胞膜的结合通过补体受体1型（CR1）和补体受体3型（CR3）和模式识别受体发生。脂磷聚糖（LPG）和63 kDa糖蛋白（gp63）是参与巨噬细胞 - 利什曼原虫 相互作用的主要配体。在宿主细胞受体最初识别寄生虫配体之后，寄生虫在寄生液泡内化，存活并繁殖。 利什曼原虫诱导的液泡的成熟过程涉及从细胞内囊泡中获取分子，包括单体G蛋白Rab 5和Rab 7，溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1），溶酶体相关膜蛋白2（LAMP-2）和微管相关蛋白1A / 1B-轻链3（LC3）。
在这里，我们描述了使用共聚焦显微镜评估 利什曼原虫 与宿主细胞相互作用期间发生的早期事件的方法，包括（i）结合（ii）内化和（iii）吞噬体成熟。通过增加围绕这些感染结果决定因素的知识体系，我们希望提高对 利什曼原虫 感染发病机制的理解，并支持最终寻找新的化疗靶点。
Introduction
利什曼病是一种被忽视的热带病，由 利什曼原虫属的原生动物寄生虫引起，导致脊椎动物宿主的广泛临床表现，包括皮肤利什曼病、皮肤黏膜利什曼病和内脏利什曼病1。世界卫生组织（WHO）估计，超过10亿人处于危险之中，每年报告的新病例超过100万2。
利什曼原虫 属是专性细胞内原生动物，在宿主细胞内存活，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞3. 利什曼原虫 - 巨噬细胞相互作用是一个复杂的过程，通过直接相互作用或通过涉及补体受体的调理作用涉及多个宿主细胞受体和寄生虫配体4，5。经典的表面受体，如CR1，CR3，甘露糖 - 岩藻糖，纤连蛋白，Toll样和清道夫受体，介导寄生虫附着到巨噬细胞6，7，8。这些受体识别 利什曼原虫表面的分子，包括63 kDa糖蛋白（gp63）和糖脂脂脂磷酸聚糖（LPG）9。这些是前鞭毛虫表面最丰富的分子，在破坏宿主免疫反应中起着至关重要的作用，有利于在哺乳动物细胞中建立寄生虫感染10。在寄生虫表面配体与巨噬细胞受体结合后，F-肌动蛋白积聚在哺乳动物细胞表面，在寄生虫被吞噬时围绕它们。随后，这导致形成寄生虫诱导的隔室，称为寄生液泡（PV），其呈现吞噬溶酶体特征11。一旦进入这些吞噬溶酶体，寄生虫就会经历生存和繁殖所必需的几种改变3。
PV的生物发生是一种高度调控的膜运输过程，对这种病原体12的细胞内存活至关重要。该区室的形成是由吞噬体和宿主内吞途径的区室之间的连续融合事件引起的。经典细胞生物学研究表明，PV的成熟涉及单体G蛋白Rab 5和Rab 7蛋白的获取，这主要与早期和晚期内体成熟有关，分别是13。此外，这些区室获取溶酶体相关膜蛋白1和2（LAMP 1，LAMP 2），溶酶体膜的主要蛋白质成分和微管相关蛋白1A / 1B-轻链3（LC3），自噬体标记物14。尽管有明显的相似性，但PV形成15，16 的动力学和这些区室的形态因 利什曼原虫 物种而异。例如，由 墨西哥乳杆菌 或 亚马逊乳杆菌 引起的感染诱导形成含有大量寄生虫的大隔室17。相比之下，其他物种，如 巴西乳杆菌 和 婴儿乳杆菌， 形成较小的液泡，通常每个液泡18中只含有一到两个寄生虫。
尽管对宿主细胞-利什曼原虫 相互作用有这种了解，但由宿主受体和寄生虫配体之间接触引发的初始事件尚未完全阐明。已知这些事件是寄生虫感染结果的决定因素，并且取决于寄生虫种类，招募以识别寄生虫的宿主细胞受体的类型以及巨噬细胞信号通路的激活19，20。因此，必须鉴定参与 利什曼原虫诱导的PV的生物发生的分子，并确定这些分子在感染建立和结果中的作用。在这里，我们描述了一种监测 利什曼原虫吞噬过程中发生的早期事件的方法，包括结合，内化，吞噬体形成和成熟。这项工作有助于澄清PLC，Akt，Rab5，Rab7和LC3参与由不同 利什曼原虫 物种诱导的PP的形成。重要的是，该方案可用于研究参与PV成熟的其他蛋白质的参与。未来的研究将扩大利 什曼原虫 - 宿主细胞相互作用所涉及的机制的知识，并有助于设计新的化疗策略。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
细胞是在国家研究伦理委员会批准程序后从健康供体获得的（ID：94648218.8.0000.0040）。
1. 细胞培养
- 人单核细胞来源的巨噬细胞
注意：要获得用于 体外 分化为巨噬细胞的人单核细胞，请从健康供体收集血液并纯化D.英语和B.R.Andersen21描述的外周血单核细胞（PBMC）。- 收集外周血（50毫升）后，将其倒入肝素化管中，然后在室温下在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中以1：1稀释血液。将稀释的肝素化血液轻轻地放在先前分布的密度梯度培养基的顶部。
- 在24°C下以252× g 离心管30分钟以避免溶血。
注意：设置离心机断裂以避免梯度层混合。离心后，从底部到顶部形成不连续的梯度层：红细胞，密度梯度培养基，PBMC环和血浆。 - 将位于密度梯度介质和等离子体层之间的PBMC环转移到新管中，并用PBS填充以洗去多余的密度梯度介质。
- 洗涤细胞一次，并在4°C下以190×g离心10分钟。
- 弃去上清液并将沉淀重悬于1mL完全RPMI培养基中。
- × 在500 mL罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）中，在500 mL中补充25 mM N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙烷磺酸]（HEPES），2 g / L碳酸氢钠，2 mM谷氨酰胺，20g / mL环丙沙星和10%灭活胎牛血清（FBS）（完全RPMI培养基）中，在24孔板中在37°C下5%CO2 下，7天，使单核细胞分化成巨噬细胞通过附着力。
- 全血细胞增多糖-1 培养物
- 在75 cm 2培养瓶中的10mL完全RPMI培养基中以2×10 5个细胞的浓度生长THP-1 细胞系。
- 在37°C的5%CO2 下将细胞培养物在37°C下保持7天。
- 在4°C下以720×g离心细胞10分钟，并将沉淀重悬于完全RPMI培养基中。
- 在诺伊鲍尔腔室中计数细胞。
- 在含有100nM醋酸间苯二酚醛（PMA）的500μL完全RPMI培养基中，在37°C下在5 %CO2 下以每孔2×10 5个细胞的浓度在13mm玻璃盖玻片上平板细胞，以允许THP1细胞分化为巨噬细胞。
- 三天后，用0.9%NaCl溶液洗涤两次细胞以除去含有PMA的培养基。
- 在开始实验之前，将分化的THP-1细胞在37°C的无PMA完全RPMI培养基中在5%CO2 下再孵育2天。
2. 寄生虫培养物和细胞追踪器红色染色
注意：要通过荧光显微镜观察寄生虫，请使用细胞追踪器红色荧光染料（CMTPX）进行染色。或者，其它标记物，包括羧基荧光素，可以按照制造商的说明使用或组成性表达GFP、RFP或其它荧光报告基因的促凝子。用于感染细胞的寄生虫是从不超过7个传代的前鞭毛虫轴烯培养物中获得的处于静止生长阶段的寄生虫。
- 种植利什曼原虫属 在含有5 mL施耐德培养基的细胞培养瓶中，每1，000μL培养基中以1×10 5个寄生虫预吸，并补充50μg/ mL庆大霉素和10%FBS。
- 在24°C的生化需氧量（B.O.D.）中孵育寄生虫轴作用培养物后，在Neubauer室中进行每日计数。检查寄生虫形态（薄，细长）和活动能力5天。当两个间隔8小时的连续计数显示相似的数量时，将寄生虫视为处于静止生长阶段。
- 在达到生长的固定阶段时，将寄生虫在4mL的0.9%NaCl溶液中与1μM CMTPX在37°C下在5%CO2 下孵育15分钟，避免与光接触。
- 以1：1的比例加入FBS，并将寄生虫悬浮液再孵育1分钟。
- 用PBS洗涤寄生虫三次，然后在1，781×g下离心10分钟。
- 将寄生虫沉淀重悬于1，000μLRPI完全培养基中。
- 在纽鲍尔腔室中计数寄生虫。
3. 利什曼原虫 与巨噬细胞结合的评估
- 在具有13mm玻璃盖玻片的24孔板上，将2×10个5 THP-1细胞或人单核细胞来源的巨噬细胞放入每孔500μL完全RPMI培养基中。
- 在37°C下在5%CO2 下培养细胞24小时。
- 用0.9%NaCl溶液洗涤细胞两次，并在4°C的完全RPMI培养基中孵育10分钟。
- 按照A.L.Petersen22 所述，以10：1的比例加入固定相前促构子与孔板，然后在4°C下以720×g离心5分钟。
- 在4°C下孵育5分钟。
- 用0.9%NaCl溶液洗涤细胞两次，以除去任何非内化的促凝物。
- 将细胞在室温下固定在4%多聚甲醛中15分钟。
- 将盖玻片与15 mM NH4Cl在室温下孵育15分钟。
- 用 PBS 0.15% 牛血清白蛋白 （BSA） 洗涤三次。在室温下与封闭溶液（PBS中3%BSA）孵育1小时。
- 用PBS洗涤三次，然后在室温下用0.15%PBS-皂苷透化15分钟。
- 在室温下加入鬼臼蛋白（稀释1：1，200）1小时，避光。
- 使用安装介质安装盖玻片。
- 使用63×/1.4物镜通过共聚焦荧光显微镜获取图像。
4. 巨噬细胞吞噬利 什曼原虫 的评估
- 在具有13mm玻璃盖玻片的24孔板上，将2×10个5 THP-1细胞或人单核细胞来源的巨噬细胞放入每孔500μL完全RPMI培养基中。
- 在37°C下在5%CO 2下培养细胞24小时。
- 在0.9%NaCl溶液中洗涤细胞两次，并在4°C下在24孔板中的完全RPMI培养基中孵育10分钟。
- 加入A.L.彼得森22描述的固定相利什曼原虫属，以10：1（寄生虫：宿主细胞）的比例，然后在4°C下以720×g离心10分钟。
- 将细胞在4°C下孵育5分钟。
- 用0.9%NaCl溶液洗涤细胞两次，以除去任何非内化的促凝物。
- 将细胞在37°C的补充RPMI培养基中孵育1小时。
- 用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。
- 使用首选安装介质安装盖玻片。
- 使用100×/ 1.4物镜在荧光显微镜下的随机场中计数不少于400个细胞。
5. 利什曼原虫 诱导的液泡成熟度的评估
注意：THP-1细胞转染应按照梅斯、威蒂格和洛科夫斯基 23的描述进行。在这里，我们总结了该协议，并进行了最小的修改。核切片是一种特定的转染方法，需要核切片器。作为替代方法，可以使用脂质切除胺24 和慢病毒转导25转染细胞。
- 为了研究利什曼原虫诱导的PV的生物发生，用PLC26，27，Akt26，27，Rab 5 28，29，30或Rab 728，29，31质粒转染THP1细胞。
注意：该方法可用于转染THP-1细胞与上述基因以外的其他基因。 - 在含有10mL完全RPMI培养基的1.5 ×10 7 7中接种THP-1细胞，其中补充100 ng / mL PMA和50μM 2-巯基乙醇48小时。
- 在0.9%NaCl溶液中洗涤细胞一次。
- 使用非酶促细胞解离溶液分离细胞，并在室温下离心（250×g）5分钟。
- 将THP-1细胞重悬于1 mLRPI培养基中，并在诺伊鲍尔腔室中进行计数。
- 在室温下再次以250×g离心THP-1细胞10分钟。弃去上清液。
- 将2×106 个细胞重悬于100μL细胞核向量溶液中，并与编码目标蛋白质的0.5μg质粒一起孵育，用荧光蛋白标记。
- 将含有THP-1细胞和核酸的悬浮液转移到细胞核比色皿中。
- 使用细胞核细胞切除程序Y-001转染THP1细胞。
- 回收转染的细胞（2x106）并在500μLRPMI培养基中接种在24孔板上，用13mm玻璃盖玻片（4孔/转染）。
- 将THP-1细胞在37°C的完全RPMI培养基中孵育0.5，2，4，6，12和24小时。
- 重复步骤 3.13 和 3.13。
6. LC3招募到 利什曼原虫 属PP的评估
注意：自噬膜标记物LC3可用于研究吞噬体是否存在自噬特征。在感染期间，可以使用抗LC3抗体对抗LC3抗体进行免疫标记细胞来评估利什曼原虫诱导的PV的LC3募集，如先前由C.R.S.Dias33描述的那样。
- 在500μL完全RPMI培养基中，在具有13mm玻璃盖玻片的24孔板上，将2×10个5 THP-1细胞或人单核细胞来源的巨噬细胞。
- 在37°C下在5%CO 2下培养细胞24小时。
- 在0.9%NaCl溶液中洗涤细胞两次，并在完全的RPMI培养基中孵育。
- 加入A.L.彼得森22描述的固定相利什曼原虫属前鞭毛虫以10：1（寄生虫：宿主细胞）的比例，并在4°C下以720×g离心细胞5分钟。
- 在37°C下孵育30分钟或4小时。然后洗涤两次并固定细胞，以评估在感染的早期阶段将LC3募集到 利什曼原虫诱导的PV膜中。
- 或者，为了评估在感染后期PV膜的LC3募集，在感染4小时时洗涤另一个巨噬细胞组两次，以除去任何未内化的前突。将受感染的细胞在完全RPMI培养基中再孵育12小时和24小时，最后洗涤两次并固定。
注意：固定的细胞可以保存在PBS或0.9%NaCl溶液中，在4°C下直到标记。
- 或者，为了评估在感染后期PV膜的LC3募集，在感染4小时时洗涤另一个巨噬细胞组两次，以除去任何未内化的前突。将受感染的细胞在完全RPMI培养基中再孵育12小时和24小时，最后洗涤两次并固定。
- 在室温下，在0.1%曲拉通X-100，1%BSA，20%正常山羊血清，6%脱脂奶粉和50%FBS中同时阻断和透化固定细胞20分钟。
- 将细胞与在室温下在PBS中稀释的抗LC3抗体（1：200）孵育2小时。
注意：作为免疫染色的阴性对照，一组细胞应与来自一抗来源的动物的免疫球蛋白G（IgG）一起孵育，其浓度与用于一抗的浓度相当。 - 在室温下用0.9%NaCl溶液洗涤细胞三次。
- 在室温下用AlexaFluor 488偶联的山羊抗兔IgG（1：500）或优选的荧光染料偶联二抗孵育细胞1小时。
- 在室温下用0.9%NaCl溶液洗涤细胞三次。
- 使用首选安装介质安装盖玻片。
- 使用63x/1.4物镜通过共聚焦荧光显微镜获取图像。
7. 共聚焦显微镜采集和斐济定量
注意：获取免疫荧光图像应使用共聚焦激光扫描显微镜进行。要达到更好的分辨率，请使用油浸式63x物镜。
- 将13毫米玻璃盖玻片置于室温下，并在采集前至少30分钟保护它们免受光线照射。
- 用吸收性组织清洁盖玻片。
- 在物镜上加入一滴浸油，然后加入载玻片。
- 向上移动物镜，直到油接触到滑块。
- 观察并调整显微镜上的焦点，并选择带油的63x物镜。
- 打开徕卡程序并调整 488、552 和 405 波长的激光器。
- 选择图像分辨率 1，024 x 1，024。
- 单击“ 实时 ”按钮，设置 Z 堆栈，然后按“ 开始 ”选项。然后，再次执行此操作并按“ 结束 ”按钮。我们建议切片厚度为20μm，以获得具有良好分辨率的共聚焦图像。
- 等待图像采集，然后在徕卡工具中选择“最大投影”选项。
- 保存实验。
- 将 lif 或 tiff 格式的图像导出到计算机，然后打开斐济程序。
- 打开试验并使用超堆栈设置视图堆栈。然后选择单独打开文件并拼接磁贴。
- 在斐济工具栏中选择“空手”工具，然后手动仔细跟踪单元格。
- 按“ 分析 ”按钮并测量以可视化荧光强度。
- 对每组的每个单元格重复此过程。
- 保存测量值并将其导出到电子表格编辑器。
- 将此数据添加到统计分析程序中并进行统计分析。
8. 统计分析
注意：对于数据分析和图形，请使用统计分析程序。
- 打开程序。
- 插入获得的数据并测试正态性参数。
- 对于具有正态分布的数据，请使用学生 t 检验，对于非参数检验，请使用曼-惠特尼检验。
- 当 p 值 小于 0.05 时，考虑具有统计显著性差异的数据。
- 准备表示数据的图形，包括中心趋势度量（平均值或中位数）和变异度量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本报告旨在评估从呈现 巴西乳杆菌 -LCL或 巴西乳杆菌-DL形式的CL的患者中分离出的巴西 乳杆菌吞噬过程中发生的早期事件。我们首先评估了 人单核细胞来源的巨噬细胞对 巴西猪笼草-LCL或巴西猪笼草-DL的结合和吞噬作用。数据显示， 巴西乳杆菌-LCL和 巴西乳杆菌-DL与巨噬细胞的结合相似（图1）。此外，没有观察到宿主细胞对 巴西乳杆菌-LCL和 巴西乳杆菌-DL吞噬作用的差异（图2）。最后，我们将LC3的募集与 巴西乳杆菌-LCL或 巴西乳杆菌-DL在感染细胞中的PV进行了比较。在感染30分钟，4和12小时后，我们在 巴西乳杆菌- LCL和 巴西乳杆菌 - DL感染的巨噬细胞中观察到LC3修饰的PV的相似百分比（图3）。这些代表性结果表明， 巴西乳杆菌-LCL和 巴西乳杆菌-DL在PP的结合、吞噬作用和生物发生过程中与巨噬细胞的相互作用相似，涉及LC3募集。
图 4显示了代表用PLC-GFP，拉布5-GFP，拉布7-GFP质粒有效转染的THP-1细胞的显微图像。
图 1.巴西乳杆菌-LCL和巴西乳杆菌-DL与人巨噬细胞结合的评价。人单核细胞来源的巨噬细胞感染了巴西乳杆菌-LCL-或巴西乳杆菌-DL。在4°C下10分钟后，通过共聚焦显微镜评估结合。（A）巴西乳杆菌-LCL或巴西乳杆菌-DL（用CMTPX标记，红色）与巨噬细胞（用鬼肽标记，绿色）的共聚焦显微镜图像。对于共聚焦显微镜，细胞核用DAPI（蓝色）标记。箭头描绘了利什曼原虫与巨噬细胞的结合。（B）利什曼原虫与巨噬细胞结合的百分比。每组共分析30个细胞。数据表示以五份为单位进行的一个实验的每个重复（未配对t检验，p>0.05）。请点击此处查看此图的大图。
图 2.人巨噬 细胞对巴西乳杆菌-LCL和 巴西乳杆菌-DL吞噬作用的评价。 将人单核细胞衍生的巨噬 细胞与巴西乳杆菌-LCL或 巴西乳杆菌-DL在4°C下孵育10分钟，然后在37°C下再孵育1小时。 然后通过荧光显微镜通过计数总共400个细胞来分析细胞。（A）被 巴西乳杆菌-LCL或巴西乳杆菌-DL感染的人巨噬 细胞的共聚焦显微镜图像。对于共聚焦显微镜，细胞核用DAPI（蓝色）标记。箭头描绘了 利什曼原虫 寄生虫核。（B） 利什曼原虫 吞噬作用的百分比。圆圈表示一个实验的每个重复数据，一式三份（不成对 的t 检验， p >0.05）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3.评估由 巴西猪笼草 s-LCL 或巴西乳 杆菌-DL 诱导的巨噬细胞中 LC3 募集到 PV。 感染人单核细胞来源的巨噬细胞，然后用抗LC3抗体染色30分钟，4和12小时（A）巴西 猪笼草s-LCL或 巴西乳杆菌-DL感染的巨噬细胞的共聚焦显微镜图像用抗LC3标记，然后是与Alexa Fluor 488偶联的二级抗兔IgG抗体（绿色）。对于共聚焦显微镜，细胞核用DAPI（蓝色）标记;（B） 用 LC3-II修饰的 巴西猪笼草s-LCL或巴西乳杆菌-DL诱导的PV的百分比。每组共分析30个细胞。圆圈对应于分析的每个随机选择的字段（未配对 的t 检验， p >0.05）。 请点击此处查看此图的大图。
图 4.表达 PLC、拉布5 或拉布7 的 THP-1 细胞。 在分化成巨噬细胞后，THP-1细胞接受核感染，每个目的基因与GFP荧光探针偶联：PLC，Rab5和Rab7。随后，这些细胞被固定，用DAPI（蓝色）染色细胞核，并使用63x / 1.4物镜在共聚焦显微镜下观察。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
利什曼原虫 - 巨噬细胞相互作用是一个复杂的过程，涉及几个可能影响疾病发展的步骤5。为了更好地了解未被置 信化的利什曼原虫 和宿主细胞相互作用所涉及的机制，我们描述了一种方案，该方案采用共聚焦荧光显微镜来评估 利什曼原虫 感染早期至晚期的吞噬作用。使用涉及两个或多个荧光团的荧光技术来研究细胞生物学机制，包括免疫标记和荧光标记蛋白的表达，使我们能够分析几种蛋白质的位置，以及同时评估细胞形态。这些方法提供的优势使它们成为监测病原体 - 宿主细胞相互作用的最佳工具34。
为了更好地理解涉及不同颗粒的吞噬过程，在分子水平35上分析这个高度动态的过程至关重要。为此，共聚焦荧光显微镜已经使用了几十年，并且已被证明是通过确定内化颗粒的数量或已知参与宿主 - 病原体相互作用早期阶段的蛋白质类型来量化吞噬作用的绝佳工具34。本研究建议使用共聚焦显微镜来分析从不同临床形式（LCL和DL）患者中分离出的 巴西乳杆菌 吞噬过程中发生的事件。该技术使我们能够研究表达特定荧光蛋白的细胞，包括PLC，Akt，Rab 5和Rab 7，并随后评估这些蛋白质参与 利什曼原虫 分离物的吞噬作用，以确定与不同感染结果相关的元素。
本研究采用原代巨噬细胞和THP1细胞来评估巴西 乳杆菌 在感染早期阶段的吞噬作用。目前描述的方案也可用于研究其他吞噬细胞在 利什曼原体 属中的吞噬作用，包括树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞系和来自人类外周血的嗜中性粒细胞。在寄生虫内化过程中，F-肌动蛋白的动态变化发生在细胞膜表面11处。然后，我们使用吞噬作用36的特定标记物标记位于细胞膜中的蛋白质，例如荧光PLC，这使我们能够观察 利什曼原虫 与宿主细胞的结合阶段，如图 4所示。用荧光标记物（如CMTPX或CSFE）染色寄生虫对于通过免疫荧光评估寄生虫与宿主细胞的结合也至关重要。值得注意的是，该测定需要仔细执行：i）在室温（25°C）下使用洗涤溶液轻轻洗涤盖玻片，否则，样品可能会损坏;ii）精确制备试剂稀释液;iii）保护样品免受光照34。
配置为最佳激光激发波长的共聚焦显微镜能够获得高质量的样品图像。标记的细胞可以在4°C的黑暗中储存数周或冷冻直至分析时。使用共聚焦显微镜来评估吞噬作用受到长时间暴露和高强度激光束的限制，这可能会损坏样品，并且在某些情况下，导致图像35，37中的高水平背景检测。
在本研究中，我们没有使用实时成像来跟踪 利什曼原虫 属的吞噬作用，而是通过在感染的几个早期时间（30分钟，4小时和12小时）固定细胞来进行动力学研究。必须考虑的是，实时成像提供了一些优点，例如有可能分析无数细胞过程（包括吞噬作用）的空间和时间动态，以及捕获静态图像中无法观察到的细节34。然而，实时成像要求细胞在整个实验过程中保持健康，包括在显微室中控制温度，pH和氧气条件。重要的是要注意，这不能在世界各地的几个实验室可靠地进行。
所描述的核感染方案已证明在THP-1细胞的转染中有效，正如M.B.梅斯，B.维蒂格和S.洛科夫斯基 23之前报道的那样。在此过程中，轻轻分离细胞以避免细胞损伤或细胞活力丧失至关重要。根据我们的经验，我们建议在进行转染之前使用非酶促细胞解离溶液将细胞从平板上分离出来。原始方案23 的作者指出，该程序的主要局限性是在细胞核感染过程中需要悬浮，并且不充分的分离会导致压力。尽管存在这些限制，但该方案确实允许可靠的转染，在不损失细胞活力的情况下达到90%的成功转染率。
使用一组内吞标记物（包括PLC，Akt，Rab5和Rab7）表征PV对于提高我们对 利什曼原虫 吞噬作用的理解至关重要。鉴定参与PV生物发生的新蛋白质并全面表征这些区室可以阐明 利什曼原体 感染期间巨噬细胞反应的差异。我们的研究结果对利 什曼原虫 感染结果的知识体系的贡献无疑将促进我们对 利什曼原虫 感染发病机制的理解，并支持最终寻找新的化疗靶点。值得注意的是，该技术还可以扩展到其他类型的研究，包括细菌，酵母菌的感染或珠子被许多类型的细胞吞噬38，39。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
资助者在研究设计、数据收集或分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
Acknowledgments
我们感谢巴西菲奥克鲁斯巴伊亚的贡萨洛·莫尼兹研究所和显微镜系的援助。这项工作得到了国际志愿者协会-FIOCRUZ号79700287000的支持，P.S.T.V.持有CNPq（305235/2019-2）的研究生产力补助金。质粒由加利福尼亚州多伦多大学的毛里西奥·特雷比兹尼克提供。作者要感谢安德里斯·沃尔特的英语语言修订和手稿文案编辑帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
References
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A.
- World Health Organization.
- Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
- Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
- Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
- Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
- Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
- Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
- Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
- Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
- Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
- Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
- Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
- Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
- Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
- Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
- Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
- Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
- English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
- Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
- Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
- Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
- Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
- Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
- Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
- Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
- Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
- Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D.
- Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
- Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G.
- Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).
