Summary

Un metodo generalizzato per determinare la composizione dell'acido fenolico solubile libero e la capacità antiossidante di cereali e legumi

Published: June 10, 2022
doi:

Summary

Gli acidi fenolici sono importanti sostanze fitochimiche presenti nei cereali integrali. Possiedono proprietà bioattive come le funzioni protettive antiossidanti. Questo lavoro mirava a riportare un metodo generalizzato per l’identificazione dell’HPLC, la stima del contenuto fenolico totale e la determinazione della capacità antiossidante degli acidi fenolici nei cereali e nei legumi.

Abstract

Gli acidi fenolici sono una classe di composti organici che portano sia un gruppo fenolico che un gruppo carbossilico. Si trovano nei cereali e si concentrano nella crusca dei cereali o nel rivestimento dei semi dei legumi. Possiedono proprietà antiossidanti che hanno generato molto interesse di ricerca negli ultimi anni, sulle loro potenziali funzioni antiossidanti protettive per la salute. Questo lavoro presenta un metodo generalizzato per l’estrazione di acidi fenolici solubili liberi da cereali integrali e l’analisi della loro capacità antiossidante. Sono stati utilizzati cinque campioni di cereali integrali comprendenti due cereali (grano e mais giallo) e tre legumi (fagiolo, fagiolo e soia). I grani venivano macinati in farina e i loro acidi fenolici solubili liberi estratti usando metanolo acquoso. I composti sono stati quindi identificati utilizzando un cromatografo liquido ad alta pressione (HPLC). Il metodo Folin-Ciocalteu è stato utilizzato per determinare il loro contenuto fenolico totale, mentre le loro capacità antiossidanti sono state determinate utilizzando i saggi DPPH radical scavenging, Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) e oxygen radical absorbance capacity (ORAC). Gli acidi fenolici identificati includevano acidi vanillico, caffeico, p-cumarico e ferulico. L’acido vanillico è stato identificato solo nel fagiolo mentre l’acido caffeico è stato identificato solo nel fagiolo. L’acido p-cumarico è stato identificato nel mais giallo, nel fagiolo e nella soia, mentre l’acido ferulico è stato identificato in tutti i campioni. L’acido ferulico era l’acido fenolico predominante identificato. La concentrazione totale di acidi fenolici nei campioni è diminuita nel seguente ordine: soia > fagiolo > mais giallo = fagiolo > grano. La capacità antiossidante totale (somma dei valori dei saggi DPPH, TEAC e ORAC) è diminuita come segue: soia > fagiolo > mais giallo = fagiolo di mucca > grano. Questo studio ha concluso che l’analisi HPLC e i saggi DPPH, TEAC e ORAC forniscono informazioni utili sulla composizione dell’acido fenolico e sulle proprietà antiossidanti dei cereali integrali.

Introduction

Gli acidi fenolici sono tra i più importanti fitochimici studiati nelle piante a causa del ruolo vitale che svolgono nella difesa delle piante contro le infezioni erbivore e fungine, oltre a mantenere il supporto strutturale e l’integrità nei tessuti vegetali 1,2. Sono abbondanti nella crusca di cereali e nel rivestimento di semi di legumi3. Strutturalmente, sono divisi in due gruppi: gli acidi idrossibenzoici (Figura 1) e gli acidi idrossicinnamici (Figura 2). Gli acidi idrossibenzoici comuni nei cereali e nei legumi includono acido gallico, p-idrossibenzoico, 2,4-diidrossibenzoico, protocatechuico, vanillico e siringico, mentre gli acidi idrossicinnamici comuni includono gli acidi caffeico, p-cumarico, ferulico e sinapico3. Gli acidi fenolici possiedono anche proprietà antiossidanti poiché sono in grado di eliminare i radicali liberi, che causano irrancidimento ossidativo nei grassi, e avviare e propagare lo stress ossidativo indotto dai radicali nei sistemi fisiologici 4,5. A causa di questo ruolo fisiologico vitale come antiossidanti, sono oggetto di recenti ricerche. Questo perché se consumati come componenti di alimenti vegetali, possono esercitare una protezione antiossidante.

I cereali e i prodotti a base di cereali sono le principali fonti di cibo a base di carboidrati per l’uomo e gli animali in tutto il mondo6. I cereali includono grano, riso, mais (mais), orzo, triticale, miglio e sorgo. Tra questi, il mais è il più utilizzato, con un utilizzo globale stimato di 1.135,7 milioni di tonnellate nel 2019/2020, seguito dal grano con un utilizzo globale stimato di 757,5 milioni di tonnellate nello stesso periodo7. Gli alimenti a base di cereali sono grandi fonti di energia per i consumatori poiché sono ricche fonti di carboidrati. Forniscono anche alcune proteine, grassi, fibre, vitamine e minerali6. Oltre al loro valore nutrizionale, i cereali sono buone fonti di antiossidanti fitochimici, in particolare acidi fenolici, che hanno il potenziale per proteggere il sistema fisiologico dal danno ossidativo indotto dai radicali3. I legumi sono anche buone fonti di nutrienti e sono generalmente più ricchi di proteine rispetto ai cereali. Contengono anche vitamine e minerali e sono utilizzati nella preparazione di vari alimenti8. Inoltre, i legumi sono buone fonti di una varietà di antiossidanti fitochimici, tra cui acidi fenolici, flavonoidi, antociani e proantocianidine 9,10. Diverse varietà di cereali e legumi possono avere una diversa composizione di acido fenolico. C’è quindi la necessità di studiare la composizione dell’acido fenolico di cereali e legumi e delle loro varietà, al fine di conoscere i loro potenziali benefici per la salute rispetto agli antiossidanti fenolici.

Sono stati riportati numerosi saggi per misurare la quantità di acidi fenolici nei cereali e nei legumi e determinare le loro attività antiossidanti. I metodi più comuni di analisi per gli acidi fenolici integrali sono la spettrofotometria e la cromatografia liquida11. Lo scopo di questo lavoro era quello di dimostrare un metodo cromatografico liquido generalizzato ad alta pressione per determinare la composizione dell’acido fenolico solubile libero e metodi spettrofotometrici per determinare il contenuto fenolico totale e la capacità antiossidante di alcuni cereali integrali e legumi.

Protocol

1. Tipo di campioni Utilizzare cinque campioni di cereali integrali, comprendenti due cereali (ad esempio, grano duro e mais giallo) e tre legumi (ad esempio, fagiolo di mucca Blackeye, soia e fagiolo rosso) per questo studio. Macinare 50 g di ogni chicco in triplicati in farina, usando un macinino da caffè, e passarli attraverso un setaccio da 500 μm. Conservarli a -20 °C. 2. Preparazione del campione …

Representative Results

La Tabella 2 mostra gli acidi fenolici che sono stati identificati nei cereali e nei legumi. Sulla base degli standard autentici disponibili, quattro acidi fenolici sono stati identificati nei campioni e sono: acido vanillico, caffeico, p-cumarico e ferulico. L’acido vanillico è un acido idrossibenzoico mentre gli altri tre sono acidi idrossicinnamici. L’acido vanillico è stato identificato solo nel fagiolo di mucca Blackeye mentre l’acido caffeico è stato identificato solo nel fagiolo. <…

Discussion

I cereali integrali sono stati selezionati come cereali rappresentativi e legumi che trovano ampie applicazioni alimentari in tutto il mondo. Mentre possono esistere variazioni tra le cultivar di ciascun grano, l’obiettivo di questo studio è stato quello di dimostrare un metodo generalizzato per l’estrazione di acido fenolico libero e l’analisi per i cereali integrali. Il metodo di estrazione è stato modificato riducendo sostanzialmente la quantità di campioni e solventi, al fine di ridurre la quantità di sostanze ch…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono con gratitudine il supporto tecnico di Alison Ser e Hannah Oduro-Obeng, nonché il supporto al montaggio video di Janice Fajardo e Miguel del Rosario.

Materials

15 mL Falcon conical centrifuge tubes Fisher Scientific 05-527-90
2 mL Amber glass ID Surestop vial Thermo Scientific C5000-2W
2 mL Amber microcentrifuge tubes VWR 20170-084
2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) Sigma-Aldrich 440914-100G
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, Sigma Aldrich A1888-2G
2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) Sigma Aldrich D913-2
6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% Fluka Chemika 56510
9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps Thermo Scientific 60180-670
96 well flat bottom plates Fisher Scientific 12565501
Agilent BioTek ELx800 microplate reader Fisher Scientific BT-ELX800NB
Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System Fisher Scientific N/A
Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader Fisher Scientific N/A
Analytical balance SI-114 Denver Instrument SI-114.1
Autosampler, Waters 717 Plus Waters WAT078900
BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip BD 309657
Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 Millipore Sigma Z245143
Corning LSE Vortex Mixer Corning 6775
Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) Merck Millipore Ltd HVLP04700 
Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) Merck Millipore Ltd HVHP04700
Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL Eppendorf 3123000020
Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL Eppendorf 3123000071
Eppendorf Research plus, 100-1000 µL Eppendorf 3123000063
Eppendorf Research plus, 10-100 µL Eppendorf 3123000047
Ethyl acetate, HPLC grade Fisher Chemical E195-4
Ferulic acid standard Sigma Aldrich 128708-5G
Fluorescein Fisher Scientific AC119245000
Folin & Ciocalteu phenol reagent Sigma Aldrich F9252
Formic acid, 99% Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a 27048-0010
Gallic acid standard Sigma G7384
High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 Waters 960402
Methanol, HPLC grade Fisher Chemical A452-4
Micro pipet tips, 0.5-10 µL Fisherbrand 21-197-2F
Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge Thermo Scientific 75002435
Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL Sartorius 728240
Photodiode array detector, Waters 2996 Waters 720000350EN
Pipet tips, 1000 µL VWR 83007-382
Pipet tips, 1-5 mL VWR 82018-840
Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% Sigma Aldrich 216224-100G
Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) Fisher Scientific P288-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P285-500
PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom Corning 4321-250
Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ Thermo Scientific 17326-103030
Roto evaporator, IKA RV 10 IKA  0010005185
Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous Fisher Chemical S263-1
Sodium chloride (NaCl) Mallinckrodt AR® 7581
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) Fisher Scientific BP332-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) Fisher bioreagents BP329-500
Standardization pipet tips 0-200µL Fisherbrand 02-681-134
Syringe Driven Filter unit (0.22 µm)  Millex®-GV SLGVR04NL
Target micro-serts vial insert (400 µL) Thermo Scientific C4011-631
Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) Millipore ZRQSVP030

References

  1. Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
  2. Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
  3. Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
  4. Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
  5. Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
  6. Beverly, R. L., Motarjemi, Y. . Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).
  7. FAO. Food Outlook – Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , (2020).
  8. Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
  9. Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
  10. Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
  11. Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
  12. AOAC. . Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).
  13. Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
  14. Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).
  15. Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
  16. Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  17. Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
  18. Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
  19. Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
  20. Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
  21. Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
  22. Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
  23. Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).

Play Video

Cite This Article
Apea-Bah, F. B., Drawbridge, P., Beta, T. A Generalized Method for Determining Free Soluble Phenolic Acid Composition and Antioxidant Capacity of Cereals and Legumes. J. Vis. Exp. (184), e62467, doi:10.3791/62467 (2022).

View Video