Summary
Fenolzuren zijn belangrijke fytochemicaliën die aanwezig zijn in volle granen. Ze bezitten bioactieve eigenschappen zoals antioxiderende beschermende functies. Dit werk was gericht op het rapporteren over een gegeneraliseerde methode voor de HPLC-identificatie, schatting van het totale fenolgehalte en bepaling van de antioxidantcapaciteit van fenolzuren in granen en peulvruchten.
Abstract
Fenolzuren zijn een klasse van organische verbindingen die zowel een fenolgroep als een carbongroep dragen. Ze worden gevonden in granen en concentreren zich in de zemelen van granen of zaadlaag van peulvruchten. Ze bezitten antioxiderende eigenschappen die de afgelopen jaren veel onderzoeksinteresse hebben gegenereerd, over hun potentiële antioxidant beschermende gezondheidsfuncties. Dit werk presenteert een gegeneraliseerde methode voor de extractie van vrij oplosbare fenolzuren uit volle granen en analyse van hun antioxidantcapaciteit. Vijf volkoren monsters bestaande uit twee granen (tarwe en gele maïs) en drie peulvruchten (cowpea bonen, nierboon en sojabonen), werden gebruikt. De korrels werden gemalen tot meel en hun vrij oplosbare fenolzuren werden geëxtraheerd met behulp van waterige methanol. De verbindingen werden vervolgens geïdentificeerd met behulp van een hogedrukvloeistofchromatograaf (HPLC). De Folin-Ciocalteu-methode werd gebruikt om hun totale fenolgehalte te bepalen, terwijl hun antioxidantcapaciteiten werden bepaald met behulp van de DPPH-radical scavenging-capaciteit, Trolox-equivalente antioxidantcapaciteit (TEAC) en zuurstofradicaalabsorptiecapaciteit (ORAC) -testen. De geïdentificeerde fenolzuren omvatten vanilline-, cafeïne-, p-coumarine- en ferulazuren. Vanillic zuur werd alleen geïdentificeerd in cowpea, terwijl cafeïnezuur alleen werd geïdentificeerd in nierbonen. p-coumarinezuur werd geïdentificeerd in gele maïs, cowpea en sojabonen, terwijl ferulazuur in alle monsters werd geïdentificeerd. Ferulazuur was het overheersende fenolzuur dat werd geïdentificeerd. De totale concentratie van fenolzuren in de monsters daalde in de volgende volgorde: sojabonen > cowpea-bonen > gele maïs = nierboon > tarwe. De totale antioxidantcapaciteit (som van de waarden van DPPH-, TEAC- en ORAC-assays) daalde als volgt: sojabonen > nierboon > gele maïs = cowpea-bonen > tarwe. Deze studie concludeerde dat HPLC-analyse en DPPH-, TEAC- en ORAC-assays nuttige informatie bieden over de fenolzuursamenstelling en antioxiderende eigenschappen van volle granen.
Introduction
Fenolzuren behoren tot de belangrijkste fytochemicaliën die in planten worden bestudeerd vanwege de vitale rol die ze spelen bij de verdediging van planten tegen herbivore en schimmelinfecties, evenals het behoud van structurele ondersteuning en integriteit in plantenweefsels 1,2. Ze zijn overvloedig aanwezig in de zemelen van granen en zaadlaag van peulvruchten3. Structureel zijn ze verdeeld in twee groepen: de hydroxybenzoëzuren (figuur 1) en hydroxycinnamic zuren (figuur 2). De veel voorkomende hydroxybenzoëzuren in granen en peulvruchten omvatten galluszuur, p-hydroxybenzoïcum, 2,4-dihydroxybenzoïcum, protocatechuic, vanillic en syringinezuur, terwijl de gemeenschappelijke hydroxycinnaminezuren cafeïnezuur, p-coumarinezuur, ferulazuur en sinapiczuren omvatten3. Fenolzuren bezitten ook antioxiderende eigenschappen omdat ze vrije radicalen kunnen opruimen, die oxidatieve ranzigheid in vetten veroorzaken, en radicaal-geïnduceerde oxidatieve stress in fysiologische systemen initiëren en verspreiden 4,5. Vanwege deze vitale fysiologische rol als antioxidanten, zijn ze het onderwerp van recent onderzoek. Dit komt omdat wanneer ze worden geconsumeerd als componenten van plantaardig voedsel, ze antioxiderende bescherming kunnen uitoefenen.
Granen en graanproducten zijn belangrijke koolhydraatvoedselbronnen voor mens en dier wereldwijd6. Granen omvatten tarwe, rijst, maïs (maïs), gerst, triticale, gierst en sorghum. Onder hen is maïs de meest gebruikte, met een geschat wereldwijd gebruik van 1.135,7 miljoen ton in 2019/2020, gevolgd door tarwe met een geschat wereldwijd gebruik van 757,5 miljoen ton in dezelfde periode7. Graanproducten zijn geweldige energiebronnen voor consumenten, omdat ze rijke bronnen van koolhydraten zijn. Ze bieden ook wat eiwitten, vetten, vezels, vitamines en mineralen6. Naast hun voedingswaarde zijn granen goede bronnen van fytochemische antioxidanten, met name fenolzuren, die het potentieel hebben om het fysiologische systeem te beschermen tegen radicaal-geïnduceerde oxidatieve schade3. Peulvruchten zijn ook goede bronnen van voedingsstoffen en zijn over het algemeen hoger in eiwitten dan granen. Ze bevatten ook vitamines en mineralen en worden gebruikt bij de bereiding van verschillende voedingsmiddelen8. Bovendien zijn peulvruchten goede bronnen van een verscheidenheid aan fytochemische antioxidanten, waaronder fenolzuren, flavonoïden, anthocyanen en proanthocyanidinen 9,10. Verschillende soorten granen en peulvruchten kunnen een verschillende fenolzuursamenstelling hebben. Er is daarom de noodzaak om de fenolzuursamenstelling van granen en peulvruchten en hun variëteiten te bestuderen, om hun potentiële gezondheidsvoordelen met betrekking tot fenolische antioxidanten te kennen.
Een aantal testen zijn gerapporteerd voor het meten van de hoeveelheid fenolzuren in granen en peulvruchten en het bepalen van hun antioxiderende activiteiten. De meest voorkomende analysemethoden voor volkorenfenolzuren zijn spectrofotometrie en vloeistofchromatografie11. Het doel van dit werk was om een gegeneraliseerde hogedruk vloeistofchromatografische methode te demonstreren voor het bepalen van de vrij oplosbare fenolzuursamenstelling en spectrofotometrische methoden voor het bepalen van het totale fenolgehalte en de antioxidantcapaciteit van sommige volkoren granen en peulvruchten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Soort monsters
- Gebruik vijf volkorenmonsters, bestaande uit twee granen (bijv. Durumtarwe en gele maïs) en drie peulvruchten (bijv. Blackeye cowpea-boon, sojaboon en rode nierboon) voor deze studie.
- Maal 50 g van elk graan in drievoud tot bloem, met behulp van een koffiemolen, en laat ze door een zeef van 500 μm gaan.
- Bewaar ze bij -20 °C.
2. Monstervoorbereiding
-
Bepaling van het drogestofgehalte en uitdrukking van de drogestofbasis
OPMERKING: Bepaal het drogestofgehalte van elk monster in poedervorm volgens de methode van AOAC (2000)12.- Zet een geforceerde heteluchtoven aan en stel de temperatuur in op 130 °C.
- Droog droog droogmiddel (silicagel) gedurende 30 min tot 1 uur in de oven en breng de gedroogde silicagel over in een exsiccator.
- Weeg nauwkeurig 2 g van elk monster in een schoon, voorgedroogd en gewogen aluminium blik.
- Droog de gewogen monsters gedurende 1 uur bij 130 °C in een geforceerde heteluchtoven.
- Breng het gedroogde monster over naar de exsiccator en laat afkoelen tot omgevingstemperatuur.
- Weeg het gedroogde, afgekoelde monster en noteer het gewicht.
- Bereken het drogestofgehalte van elk monster als volgt:
- Druk elke parameter gemeten in drooggewicht uit met behulp van de volgende formule:
-
Fenolzuur extractie
OPMERKING: Extraheer de oplosbare vrije fenolverbindingen in de graanmonsters met behulp van een wijziging van de methode van Y. Qiu et al.5 die fenolextractie uit milligrammen volle granen mogelijk maakt.- Weeg nauwkeurig 100 mg van het volkorenmeelmonster rechtstreeks in een amberkleurige microcentrifugebuis met een capaciteit van 2 ml. De donkere kleur van de buis helpt blootstelling van het mengsel aan licht te voorkomen.
- Voeg 1 ml 80% waterige hplc-ethanol toe aan elk van de buizen die de monsters bevatten.
- Vortex kort om de methanoloplossing en de monsters te mengen.
- Soniceer de monsters gedurende 60 minuten om de vrij oplosbare fenolverbindingen te extraheren. Plaats een deksel over de monsters voor de duur van de ultrasoonapparaat voor extra bescherming tegen licht.
- Centrifugeer na ultrasoonapparaat het mengsel op 20.000 × g gedurende 5 minuten om de vaste residuen te bezinken en het supernatant bovenop te laten. Vrije fenolverbindingen zullen na centrifugeren aanwezig zijn in het supernatant.
- Breng het supernatant over in een schone microcentrifugebuis.
OPMERKING: Het supernatant moet worden gefilterd voordat het in het HPLC-instrument wordt geïnjecteerd. Om het supernatant te filteren, verwijdert u de zuiger van een spuit van 3 ml en bevestigt u een spuitfilter. Het filter mag een poriegrootte hebben van niet groter dan 0,22 μm. - Pipetteer ongeveer 0,4 ml van het supernatant in de bovenkant van de spuit. Plaats de zuiger opnieuw en duw de vloeistof door het filter in een HPLC-injectieflacon met een injectieflacon.
- Zodra het instrument is ingesteld om de methode uit te voeren die in het manuscript voor HPLC-analyse wordt beschreven, laadt u de injectieflacons in de carrousel om overeen te komen met de steekproeflijst.
- Verkrijg HPLC-chromatogrammen bij 320 nm en 280 nm die verschillende pieken laten zien die verschillende fenolverbindingen vertegenwoordigen.
- Kwantificeer hydroxycinnaminezuren met behulp van geschikte standaardcurven bij 320 nm, omdat ze maximale absorptie hebben bij deze golflengte. Kwantificeer volgens hetzelfde principe hydroxybenzoëzuren bij 280 nm.
- Bewaar de resterende extracten bij -20 °C voor andere analyses.
3. Fenolische samenstelling
- Gebruik een hogedrukvloeistofchromatograaf (Table of Materials) om de geëxtraheerde fenolverbindingen in de monsters te identificeren en te kwantificeren, gebaseerd op de methode van J. Xiang, F.B. Apea-Bah, V. U. Ndolo, M.C. Katundu en T. Beta 4.
- Bereid fenolzuurstandaarden voor (vanillinezuur, cafeïnezuur, p-coumarinezuur, ferulazuur en sinapic zuur) om samenstellende fenolverbindingen in de extracten te identificeren en te kwantificeren.
- Om dit te doen, weegt u 1 mg van elke standaard en lost u op in 1 ml 50% waterige methanol om 1.000 μg / ml van elke standaard te produceren.
- Meng gelijke volumes van alle vijf de standaarden in een amberkleurige centrifugebuis van 2 ml om een cocktail van normen te produceren, elk met een concentratie van 200 μg / ml.
- Bereid seriële verdunningen van de standaardcocktail door een volume in een nieuwe buis te nemen en met hetzelfde volume van het waterige methanoloplosmiddel te verdunnen.
- Herhaal de seriële verdunningen tot een concentratie van 3,125 μg/ml.
- Verdun ook elke standaard 40 keer afzonderlijk met het oplosmiddel om een concentratie van 25 μg/ml van elke standaard te verkrijgen.
- Stel de kolomtemperatuur in op 35 °C en de temperatuur van de monsteroven op 15 °C.
- Om mobiele fase A (0,1% waterig mierenzuur) te bereiden, brengt u 1 ml mierenzuur over in een maatkolf met een capaciteit van 1 L en voegt u water van HPLC-kwaliteit toe aan de 1 L-markering. Schud goed om te mengen.
- Om mobiele fase B (0,1% mierenzuur in methanol) te bereiden, brengt u 1 ml mierenzuur over in een maatkolf met een capaciteit van 1 L en voegt u methanol van HPLC-kwaliteit toe aan de 1 L-markering. Schud goed om te mengen.
- Pas de volumes indien nodig aan op de 1 L-markering.
- Filter beide mobiele fasen door een hydrofiel filhloorpapier van 0,45 μm.
- Injecteer voor de analyse 10 μL van elk extract of standaard (25 μg/ml standaarden en de standaard cocktails) in de omgekeerde fasekolom.
- Eluteer met de mobiele fasen volgens het lineaire gradiëntprogramma voor een run van 25 minuten als volgt: 0-3,81 min, 9% -14% B; 3,81-4,85 min, 14% -15% B; 4,85-5,89 min, 15% -15% B, 5,89-8,32 min, 15% -17% B; 8,32-9,71 min, 17% -19% B; 9,71-10,40 min, 19% -19% B; 10,40-12,48 min, 19% -26% B; 12,48-13,17 min, 16% -28% B; 13,17-14,21 min, 28% -35% B; 14,21-15,95 min, 35% -40% B; 15,95-16,64 min, 40% -48% B; 16,64-18,37 min, 48% -53% B; 18,37-22,53 min, 53% -70% B; 22,53-22,88 min, 70% -90% B; 22,88-25,00 min, 90% B.
- Vergelijk de retentietijden van chromatografische pieken verkregen voor de authentieke normen van concentraties 25 μg/ml, bij 280 nm en 320 nm, met die van de extracten, om de samenstellende fenolverbindingen in de monsters te identificeren.
- Plot kalibratiecurven voor de fenolzuurstandaardcocktails, met concentratie van de standaarden op de horizontale as en het piekgebied op de verticale as
- Gebruik de kalibratiecurven om de concentraties van de geïdentificeerde fenolverbindingen te schatten door de piekgebieden op het perceel te vergelijken met die van de geïdentificeerde verbindingen bij 280 nm en 320 nm zoals vermeld in de eerdere sectie.
4. Totaal fenolgehalte
OPMERKING: Bepaal het totale fenolgehalte van de extracten met behulp van de Folin-Ciocalteu-methode beschreven door F.B. Apea-Bah et al.13.
- Bereid ferulazuur- en galluszuurstandaarden voor binnen het concentratiebereik van 0,025 tot 0,150 mg/ml om kalibratiecurven in vergelijking uit te zetten voor de schatting van het totale fenolgehalte.
- Om dit te doen, weeg nauwkeurig 1 mg ferulazuur en galluszuurstandaarden in centrifugebuizen met een capaciteit van 2 ml.
- Voeg 1 ml 50% waterige methanol toe aan elke standaard en vortex om op te lossen, waardoor 1 mg / ml voorraad van elke standaard ontstaat.
- Bereid een reeks verdunningen van elke stamoplossing in een totaal van 500 μL.
- Pipetteer 18,2 μL van elk extract of standaard in een aparte put op een 96-well microplaat.
- Voeg 36,4 μL van 10% (v/v) waterig Folin-Ciocalteu-reagens toe aan elk extract of standaard.
- Voeg vervolgens 145,4 μL 700 mM natriumcarbonaat toe aan elk reactiemengsel.
- Incubeer de reactiemengsels in het donker bij kamertemperatuur (20-25 °C) gedurende 2 uur.
- Lees de absorptie op een microplaatlezer bij 750 nm.
- Zet kalibratiecurven van verandering in absorptie af tegen de concentratie van de fenolzuurstandaarden en gebruik ze om het totale fenolgehalte te schatten.
- Druk de resultaten uit als milligram ferulazuurequivalenten per gram gemalen monster (mg FAE/g) en milligram galluszuurequivalenten per gram gemalen monster (mg GAE/g) op basis van droog gewicht.
5. Antioxidant assays
OPMERKING: Bepaal de antioxidantcapaciteit van de graanextracten met behulp van de volgende drie assays: 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radicaal opruimcapaciteit; 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur (ABTS) radicaal opruimcapaciteit, die ook wel de Trolox equivalent antioxidant capaciteit (TEAC) wordt genoemd; en zuurstof radicalen absorptie capaciteit (ORAC).
- Voorbereiding van Trolox-normen voor standaardcurven
- Gebruik Trolox, een in water oplosbaar analoog van vitamine E, als standaard om de in vitro antioxidantcapaciteit van de volkorenextracten te schatten.
- Weeg nauwkeurig 1 mg Trolox in een buis van 15 ml. Los op in 4 ml 50% waterige methanol. Vortex om op te lossen om een stamoplossing van 1 mM (1000 μM) te bereiden.
- Bereid zes concentraties Trolox voor, dat wil zeggen 50, 100, 200, 400, 600 en 800 μM om standaardcurven uit te zetten voor de schatting van dpph-radicale opruimcapaciteit en Trolox-equivalente antioxidantcapaciteit (TEAC). Bereid op dezelfde manier 6,25, 12,5, 25 en 50 μM concentraties Trolox voor voor het schatten van het absorptievermogen van zuurstofradicalen (ORAC). Stel het totale volume van elke concentratie samen tot 500 μL zoals aangegeven in tabel 1.
- Verdunning van monsterextracten
- Verdun de monsterextracten met methanol voorafgaand aan de analyse. Hier werden gele maïs- en cowpea-extracten twee keer verdund, de tarwe en nierboon werden vijf keer verdund terwijl het soja-extract 10 keer werd verdund met methanol.
- Trolox equivalent antioxidant capaciteit (TEAC) test
- Meet de Trolox equivalent antioxidant capaciteit (TEAC) van de monsters met behulp van de methode eerder beschreven door F.B. Apea-Bah et al.14.
- Weeg 8,23 mg ABTS af in een schone amberkleurige centrifugebuis met een capaciteit van 2 ml.
- Weeg vervolgens 1,62 mg kaliumpersulfaat in een andere schone amberkleurige centrifugebuis met een capaciteit van 2 ml.
- Voeg 1 ml gedestilleerd water toe aan elk van hen en vortex om ze op te lossen.
OPMERKING: Dit resulteert in 16 mM ABTS-stamoplossing met 6 mM waterige kaliumpersulfaatoplossing. - Bereid de ABTS-stamoplossing door de ABTS- en kaliumpersulfaatoplossingen in gelijke volumes te mengen. De oplossing verandert onmiddellijk in een donkere kleur.
- Incubeer het reagensmengsel in het donker gedurende 12-16 uur.
- Verdun de ABTS-stamoplossing 30 keer met 200 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om de ABTS-werkoplossing te vormen. Voeg hiervoor 58 ml pbs van 200 mM toe aan 2 ml van de ABTS-voorraadoplossing. De werkoplossing bevat 0,27 mM ABTS en 0,1 mM kaliumpersulfaat.
- Plaats voor de analyse 10 μL van elk verdund extract of Trolox in een 96-well microplaat.
- Voeg 190 μL ABTS-werkoplossing toe aan elke put en incubeer de reactiemengsels gedurende 60 minuten.
- Meet de absorptie van de reactiemengsels bij 750 nm in een microplaatlezer.
- Gebruik de Trolox-standaarden in een concentratie van 100 tot 800 μmol/L om een kalibratiecurve uit te zetten.
- Schat de ABTS-capaciteit voor radicale opruiming uit de kalibratiecurve.
- Druk de resultaten uit als micromol Trolox-equivalenten per gram (μmol TE/g) monster op basis van droog gewicht.
- DPPH-test
OPMERKING: Bepaal de DPPH-capaciteit voor het opruimen van radicalen van de monsters met behulp van de methode die eerder is beschreven door F.B. Apea-Bah et al.13. De DPPH antioxidant assay vereist een radicaal-genererende verbinding, DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).- Weeg nauwkeurig 1,2 mg DPPH in een lege centrifugebuis met een capaciteit van 50 ml. Los de DPPH op in 30 ml methanol om een methanoloplossing van 60 μmol/l te bereiden.
OPMERKING: De DPPH-test test het vermogen van de monsterextracten om vrije radicalen geproduceerd door DPPH op te ruimen. - Voeg voor de analyse 5 μL van de monsterextracten of Trolox-oplossing toe aan de microplaatputten.
- Voeg vervolgens 195 μL van de 60 μmol/L DPPH methanoloplossing toe en incubeer gedurende 60 minuten.
- Meet de absorptie van het reactiemengsel bij 515 nm.
- Gebruik de Trolox-normen (50-800 μmol/L) om een kalibratiecurve uit te zetten, met de verandering in absorptie op de verticale as en de Trolox-concentraties op de horizontale as.
- Schat de DPPH-opruimcapaciteit op basis van de kalibratiecurve.
- Druk de resultaten uit als micromol Trolox-equivalenten per gram (μmol TE/g) monster op basis van droog gewicht.
- Weeg nauwkeurig 1,2 mg DPPH in een lege centrifugebuis met een capaciteit van 50 ml. Los de DPPH op in 30 ml methanol om een methanoloplossing van 60 μmol/l te bereiden.
- Absorptievermogen zuurstofradicaal
- Bepaal de zuurstofradicalenabsorptiecapaciteit (ORAC) van de monsters op basis van de methode van F.B. Apea-Bah et al.13.
- Bereid om te beginnen Trolox-normen voor van concentraties 6,25, 12,5, 25 en 50 μM uit een Trolox-standaardvoorraadoplossing van 1.000 μM in 75 mM kaliumfosfaat (K2HPO4 / KH2PO4) buffer.
- Om dit te doen, weeg 1 mg Trolox poeder en los op in 4 ml van de bufferoplossing onder ultrasoonapparaat om een 1.000 μM stamoplossing te bereiden.
- Neem vervolgens 50 μL van de stamoplossing in een centrifugebuis met een capaciteit van 2 ml en verdun met 950 μL bufferoplossing om 1.000 μL 50 μM Trolox-oplossing te verkrijgen.
- Pipetteer 500 μL van de 50 μM-oplossing in een nieuwe buis en verdun met een gelijk volume buffer om een Trolox-oplossing van 25 μM te verkrijgen.
- Herhaal de seriële verdunning van de 25 μM om 12,5 μM te verkrijgen en herhaal vervolgens op dezelfde manier de verdunning van 12,5 μM om 6,25 μM te verkrijgen.
- Bereid passende verdunningen van de monsterextracten.
- Verdun de gele maïs- en cowpea-extracten 20 keer, de tarwe- en nierbonenextracten 50 keer en het soja-extract 100 keer met de bufferoplossing.
- Breng 200 μL van elk monster of Trolox standaard over in de putten van een zwarte 96-well microplaat voor automatisch pipetteren.
- Vul vervolgens de drie reagenstanks die bij de ORAC-apparatuur zijn geleverd, met het volgende: (1) de bufferoplossing; (2) 0,816 nM fluoresceïne in de buffer; en (3) 153 mM van 2,2′-azobis(2-amidinopropaan) dihydrochloride (AAPH) in buffer.
- Plaats ze in hun recipiënten voor automatisch pipetteren.
- Stel de ORAC-machine en het automatische pipetteersysteem in voor analyse, op basis van de standaardwerkprocedure.
- Stel voor de analyse het geautomatiseerde pipetteersysteem in om 25 μL van elk verdund extract of standaard over te brengen naar de putten van een heldere zwarte 96-well microplaat.
- Voeg vervolgens automatisch 150 μL 0,816 nM fluoresceïne toe in buffer.
- Incubeer het reactiemengsel bij 37 °C gedurende 15 minuten in de ORAC-machine.
- Voeg daarna automatisch 25 μL van de AAPH toe aan elk reactiemengsel.
- Incubeer ze bij 37 °C gedurende 50 minuten in de ORAC-machine.
- Stel de ORAC-machine in om het fluorescentieverval te meten, gedurende de incubatietijd, bij excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 485 nm en 520 nm.
- Zet na de metingen een Trolox-standaardcurve uit, met Trolox (6,25-50 μM) op de horizontale as en fluorescentieverval op de verticale as.
- Schat het absorptievermogen van zuurstofradicalen van de extracten uit de Trolox-standaardcurve.
- Druk de resultaten uit als μmol TE/g monster op basis van drooggewicht.
- Statistische analyse
- Presenteer alle resultaten als middel ± standaarddeviatie van ten minste drievoud.
- Voer variantieanalyse (ANOVA) uit om het effect van het korreltype op de responsvariabelen te bepalen.
- Wanneer er significante verschillen bestaan bij p < 0,05, gebruik dan het kleinste significante verschil (LSD) om de gemiddelden te vergelijken.
- Voer Pearson-correlatieanalyse uit om de relatie tussen het fenolgehalte en de antioxidantcapaciteiten te schatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 2 toont de fenolzuren die werden geïdentificeerd in de granen en peulvruchten. Op basis van beschikbare authentieke normen werden vier fenolzuren geïdentificeerd in de monsters en dat zijn: vanillic, caffeic, p-coumaric en ferulazuren. Vanillinezuur is een hydroxybenzoëzuur terwijl de andere drie hydroxycinnamic zuren zijn. Vanillic zuur werd alleen geïdentificeerd in Blackeye cowpea bean, terwijl cafeïnezuur alleen werd geïdentificeerd in nierboon. p-Coumarinezuur werd geïdentificeerd in gele maïs, cowpea-bonen en sojabonen. De concentratie varieerde tussen 7,57 en 12,48 μg / g meel op basis van droog gewicht, waarbij gele maïs de laagste waarde had terwijl soja de hoogste waarde had. Ferulazuur was het enige fenolzuur dat in alle monsters werd geïdentificeerd. De concentratie varieerde tussen 5,69 en 41,76 μg/g meel op basis van droog gewicht. Van de monsters was de ferulazuurconcentratie het hoogst in sojabonen gevolgd door cowpea-bonen, terwijl tarwe, gele maïs en nierboon vergelijkbare waarden hadden (tabel 2). Toen alle fenolzuurconcentraties voor elk monster werden opgeteld, daalden hun waarden in de volgende volgorde: sojabonen > cowpea-bonen > gele maïs = nierboon > tarwe.
Tabel 3 toonde het totale fenolgehalte (TPC) en de antioxidantcapaciteit van de granen en peulvruchten. De antioxidantcapaciteit bestond uit DPPH radical scavenging capacity, TEAC en ORAC. De optelsom van deze drie waarden gaf dus de totale antioxidantcapaciteit van de monsters. TPC werd zowel gemeten in ferulazuurequivalent als galluszuurequivalent voor vergelijkingsdoeleinden. De TPC varieerde tussen 1,16 en 2,78 mg FAE/g meel en 0,63 tot 1,48 mg GAE/g meel, op basis van droog gewicht. Ongeacht de equivalente eenheid daalde de TPC van de monsters in de volgende volgorde: sojabonen > tarwe = gele maïs = nierboon > cowpea-boon.
De dpph-capaciteit voor radicale opruiming van de monsters varieerde van 4,48 tot 14,87 μmol TE/g meel op basis van droog gewicht. Sojabonen hadden de hoogste DPPH-opruimcapaciteit, gevolgd door nierboon, terwijl gele maïs en cowpea-bonen vergelijkbare waarden hadden. Tarwe had het laagste vermogen om het DPPH-radicaal op te ruimen. De Trolox equivalent antioxidant capaciteit (TEAC) van de monsters varieerde tussen 12,82 en 57,24 μmol TE/g meel op basis van droog gewicht. Nogmaals, soja had de hoogste TEAC-waarde, gevolgd door nierboon en vervolgens tarwe, terwijl gele maïs en cowpea-bonen vergelijkbaar lage TEAC-waarden hadden. De zuurstofradicaalabsorptiecapaciteit van de monsters lag tussen 0,35 en 1,67 μmol TE/g meel op basis van droog gewicht, waarbij de graankorrels de laagste waarde hadden terwijl sojabonen de hoogste waarde hadden. Toen alle antioxidantcapaciteiten werden opgeteld, daalden hun waarden in de monsters in de volgende volgorde: sojabonen > nierboon > gele maïs = cowpea-boon > tarwe.
Er was een sterke positieve correlatie tussen de twee TPC-waarden en de waarden voor TEAC, ORAC en totale antioxidantcapaciteit (TAC) (tabel 4). Er was echter een zwakke correlatie tussen de TPC-waarden en DPPH.
Figuur 1: Hydroxybenzoëzuren in granen en peulvruchten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Hydroxycinnaminezuren in granen en peulvruchten. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Tabel 1: Bereiding van Troloxconcentraties voor DPPH- en ABTS-standaardcurven. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Fenolzuurgehalte van sommige volkoren granen en peulvruchten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Totaal fenolgehalte (TPC) en antioxidantcapaciteit van sommige volkoren granen en peulvruchten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Pearson correlatiematrix voor het totale fenolgehalte en de antioxidantcapaciteit van sommige granen en peulvruchten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De volle granen werden geselecteerd als representatieve graankorrels en peulvruchten die wereldwijd brede voedseltoepassingen vinden. Hoewel er variaties kunnen bestaan tussen cultivars van elk graan, was de focus van deze studie om een gegeneraliseerde methode voor vrije fenolzuurextractie en analyse voor volle granen aan te tonen. De extractiemethode werd gewijzigd door de hoeveelheden monsters en oplosmiddelen aanzienlijk te verminderen, om de hoeveelheid chemicaliën die bij dergelijke experimenten in het milieu zouden vrijkomen, te verminderen. De modificatie maakt ook fenolische extractie uit milligram hoeveelheden volle granen mogelijk.
HPLC-analyse produceert een chromatogram van de samenstellende fenolzuren in het monster. Elke chromatografische piek die een fenolzuur vertegenwoordigt, kan worden geïdentificeerd door de retentietijd ervan, op een vooraf gedefinieerde golflengte, te vergelijken met die van authentieke fenolzuurstandaarden. Ultraviolette (UV) detectoren worden normaal gesproken gebruikt om fenolzuren binnen het UV-golflengtebereik te identificeren. Hydroxybenzoëzuren worden meestal geïdentificeerd tussen 254-280 nm, terwijl hydroxycinnamic zuren meestal worden geïdentificeerd tussen 300-330 nm15. Fotodiode array detectoren kunnen worden gebruikt om het volledige UV-zichtbare golflengtebereik te scannen en zijn bijzonder nuttig bij het bepalen van de UV-zichtbare spectra van verbindingen die aanwezig zijn in monsters die nooit zijn bestudeerd. R. J. Robbins en S. R. Bean15 rapporteerden de volgende golflengten voor maximale absorptie, voor respectievelijk vanillinezuur, cafeïnezuur, p-coumarinezuur en ferulazuur: 260 nm; 325 nm; 310 nm; 325 nm. De HPLC-identificatiemethode is normaal gesproken aanvaardbaar voor monsters met een bekende fenolzuursamenstelling, waarvan de retentietijden en UV-spectrale gegevens eerder zijn vastgesteld. Dit is belangrijk omdat sommige verbindingen kunnen co-elueren wanneer er geen goede scheiding op de kolom wordt bereikt. Voor monsters met een onbekende fenolzuursamenstelling wordt naast de authentieke identificatienormen een massaspectrometer gebruikt. Gepubliceerde literatuur biedt nuttige informatie over fenolverbindingen die eerder zijn geïdentificeerd in het onderzochte monster of in vergelijkbare monsters 3,9,14. Het is vermeldenswaard dat tijdens HPLC-analyse fenolzuurpieken in het chromatogram alleen identificeerbaar zijn wanneer authentieke normen beschikbaar zijn voor vergelijking. Er kunnen dus andere pieken zijn die niet identificeerbaar zijn zonder hun overeenkomstige normen. Dit is een beperking met HPLC-analyse die kan worden overwonnen wanneer de HPLC is gekoppeld aan een massaspectrometer. Daarom zal de totale concentratie van gekwantificeerde fenolzuren afhangen van het aantal geïdentificeerde fenolzuren.
De Folin-Ciocalteu-methode, die voor het eerst werd gepubliceerd door V. L. Singleton en J. A. Rossi (1965) 16 , is een op elektronenoverdracht gebaseerde test die wordt gebruikt om de TPC van een analyt17 te schatten. Het is gebaseerd op het vermogen van de analyt om fosfolybdaat-fosfotungstaat in een alkalisch medium te verminderen, waardoor het van geel naar een donkerblauwe oplossingwordt omgezet 18. De absorptie van de resulterende oplossing kan dan worden gemeten bij 765 nm19. Het reagens is niet specifiek voor fenolverbindingen alleen, maar kan reageren met verschillende andere verbindingen met reducerende eigenschappen zoals thiolen, reducerende suikers en sommige aminozuren (bijv. Tyrosine). Daarom wordt gesuggereerd dat TPC kan worden gebruikt om de reducerende eigenschap van een monster of analyt17 te schatten. Tijdens de fenolextractie worden de meeste interfererende verbindingen uitgesloten en aangezien fenolverbindingen de meest alomtegenwoordige fytochemicaliën zijn, blijft de Folin-Ciocalteu-test een nuttige methode om de TPC van een monster te schatten. In de meeste monsters waarvan de fenolsamenstelling niet bekend is, wordt galluszuur standaard gebruikt om een kalibratiecurve te tekenen voor het schatten van de TPC. Niet alle monsters bevatten echter galluszuur. In de huidige studie gebruikten we ferulazuur om de resultaten te vergelijken met die van galluszuur. Een T-test met twee monsters toonde aan dat TPC bepaald als ferulazuurequivalent significant hogere waarden had dan TPC uitgedrukt als een galluszuurequivalent. Aangezien we bevestigden dat ferulazuur aanwezig is in alle monsters op basis van onze HPLC-analyse en andere gerapporteerde resultaten, zouden we meer neigen naar het uitdrukken van de TPC-resultaten als een ferulazuurequivalent. Het is nuttig om TPC uit te drukken ten opzichte van een overheersende fenolverbinding in het monster.
Met behulp van drie verschillende antioxidanttests werd waargenomen dat de verschillende granen anders reageerden in hun vermogen om vrije radicalen op te ruimen. DPPH radical scavenging capacity en TEAC assay zijn gebaseerd op electron transfer (ET) mechanisme, terwijl de ORAC assay is gebaseerd op waterstofatoom transfer (HAT) mechanisme20. Daarom geeft het combineren van de drie testen een betere indicatie van de antioxidantcapaciteit van een monster. Het is vermeldenswaard dat de ORAC-test het vermogen van een monster meet om het fysiologisch relevante peroxylradicaal op te ruimen, dat in een fysiologisch systeem lipideperoxidatie kan veroorzaken die verband houdt met schuimcelvorming en atherogenese21,22. Aan de andere kant gebruiken DPPH- en TEAC-assays radicalen die niet fysiologisch relevant zijn. Hun gebruiksgemak maakt ze echter nuttig als snelle methoden om de radicale opruimcapaciteit van een monster te schatten. ORAC-assay is ook goed te vergelijken met andere in vitro of ex vivo antioxidant assays die cellen en DNA gebruiken als biomarkers23.
Alle hierboven beschreven methoden voor de extractie en identificatie van vrije fenolzuren, schatting van het totale fenolgehalte en bepaling van antioxiderende eigenschappen zijn niet gestandaardiseerd. Verschillende fabrikanten van vloeistofchromatografische kolommen bevelen verschillende gradiëntelutiesystemen van oplosmiddelen aan om fenolzuren te scheiden voor hun identificatie. Hoewel de Folin-Ciocalteu-methode de meest voorkomende is voor het schatten van het totale fenolgehalte van monsters, voeren verschillende laboratoria deze test anders uit. Hetzelfde kan gezegd worden over de antioxidant methoden. Daarom is harmonisatie van deze methoden noodzakelijk om de vergelijking van de resultaten tussen laboratoria te bevorderen. Er is ook behoefte aan de ontwikkeling van robuuste voorspellende modellen die de fenolzuursamenstelling kunnen relateren aan de antioxiderende eigenschappen die worden gemeten door deze belangrijke analysemethoden.
Uit deze studie wordt geconcludeerd dat de gebruikte oplosmiddelextractiemethode effectief is bij het extraheren van vrij oplosbare fenolzuren uit het meel van volkoren granen en peulvruchten, waardoor de identificatie en kwantificering ervan wordt vergemakkelijkt. De HPLC-methode maakt identificatie en kwantificering van vrij oplosbare fenolzuren in volkorenextracten mogelijk, op voorwaarde dat er authentieke vergelijkingsnormen zijn. Met behulp van de drie verschillende antioxidantmethoden: DPPH, TEAC en ORAC, kunnen de antioxidantcapaciteiten van vrij oplosbare fenolextracten uit volle granen effectief worden bepaald op basis van de mechanismen voor overdracht van waterstofatomen en elektronenoverdracht. Deze studie bevestigt verder dat volle granen verschillen in hun fenolzuursamenstelling en antioxidantcapaciteiten. De correlatieanalyse toont aan dat de gemeten antioxidantcapaciteiten gerelateerd zijn aan de samenstellende fenolzuren in de volkoren vrije oplosbare extracten. Hoewel zowel TEAC als DPPH vrije radicalen opruimen door elektronenoverdrachtsmechanisme, correleerden ze anders met TPC. Het verschil in gedrag van verschillende antioxidant assays vereist de noodzaak om de antioxidantcapaciteit van monsters te bepalen met behulp van een verscheidenheid aan assays. Van de vijf onderzochte volle granen heeft soja de hoogste fenolzuurconcentratie en dienovereenkomstig de hoogste antioxidantcapaciteit. De studie toont ook aan dat volkorenvrije oplosbare fenolzuren kunnen worden geëxtraheerd en hun antioxiderende capaciteiten kunnen worden bestudeerd in slechts 1 ml waterige methanolische oplossing, waardoor de hoeveelheid laboratoriumchemicaliën die in het milieu vrijkomen, wordt verminderd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van mevrouw Alison Ser en mevrouw Hannah Oduro-Obeng, evenals de ondersteuning voor videobewerking door mevrouw Janice Fajardo en de heer Miguel del Rosario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L. Encyclopedia of Food Safety. Motarjemi, Y. 3, Academic Press. 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook - Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , Rome, Italy. (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. Official Methods of Analysis. 17th edn. , Association of Official Analytical Chemists. Gaithersburg, MD, USA. (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, Pt A 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
