Summary
Gli acidi fenolici sono importanti sostanze fitochimiche presenti nei cereali integrali. Possiedono proprietà bioattive come le funzioni protettive antiossidanti. Questo lavoro mirava a riportare un metodo generalizzato per l'identificazione dell'HPLC, la stima del contenuto fenolico totale e la determinazione della capacità antiossidante degli acidi fenolici nei cereali e nei legumi.
Abstract
Gli acidi fenolici sono una classe di composti organici che portano sia un gruppo fenolico che un gruppo carbossilico. Si trovano nei cereali e si concentrano nella crusca dei cereali o nel rivestimento dei semi dei legumi. Possiedono proprietà antiossidanti che hanno generato molto interesse di ricerca negli ultimi anni, sulle loro potenziali funzioni antiossidanti protettive per la salute. Questo lavoro presenta un metodo generalizzato per l'estrazione di acidi fenolici solubili liberi da cereali integrali e l'analisi della loro capacità antiossidante. Sono stati utilizzati cinque campioni di cereali integrali comprendenti due cereali (grano e mais giallo) e tre legumi (fagiolo, fagiolo e soia). I grani venivano macinati in farina e i loro acidi fenolici solubili liberi estratti usando metanolo acquoso. I composti sono stati quindi identificati utilizzando un cromatografo liquido ad alta pressione (HPLC). Il metodo Folin-Ciocalteu è stato utilizzato per determinare il loro contenuto fenolico totale, mentre le loro capacità antiossidanti sono state determinate utilizzando i saggi DPPH radical scavenging, Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) e oxygen radical absorbance capacity (ORAC). Gli acidi fenolici identificati includevano acidi vanillico, caffeico, p-cumarico e ferulico. L'acido vanillico è stato identificato solo nel fagiolo mentre l'acido caffeico è stato identificato solo nel fagiolo. L'acido p-cumarico è stato identificato nel mais giallo, nel fagiolo e nella soia, mentre l'acido ferulico è stato identificato in tutti i campioni. L'acido ferulico era l'acido fenolico predominante identificato. La concentrazione totale di acidi fenolici nei campioni è diminuita nel seguente ordine: soia > fagiolo > mais giallo = fagiolo > grano. La capacità antiossidante totale (somma dei valori dei saggi DPPH, TEAC e ORAC) è diminuita come segue: soia > fagiolo > mais giallo = fagiolo di mucca > grano. Questo studio ha concluso che l'analisi HPLC e i saggi DPPH, TEAC e ORAC forniscono informazioni utili sulla composizione dell'acido fenolico e sulle proprietà antiossidanti dei cereali integrali.
Introduction
Gli acidi fenolici sono tra i più importanti fitochimici studiati nelle piante a causa del ruolo vitale che svolgono nella difesa delle piante contro le infezioni erbivore e fungine, oltre a mantenere il supporto strutturale e l'integrità nei tessuti vegetali 1,2. Sono abbondanti nella crusca di cereali e nel rivestimento di semi di legumi3. Strutturalmente, sono divisi in due gruppi: gli acidi idrossibenzoici (Figura 1) e gli acidi idrossicinnamici (Figura 2). Gli acidi idrossibenzoici comuni nei cereali e nei legumi includono acido gallico, p-idrossibenzoico, 2,4-diidrossibenzoico, protocatechuico, vanillico e siringico, mentre gli acidi idrossicinnamici comuni includono gli acidi caffeico, p-cumarico, ferulico e sinapico3. Gli acidi fenolici possiedono anche proprietà antiossidanti poiché sono in grado di eliminare i radicali liberi, che causano irrancidimento ossidativo nei grassi, e avviare e propagare lo stress ossidativo indotto dai radicali nei sistemi fisiologici 4,5. A causa di questo ruolo fisiologico vitale come antiossidanti, sono oggetto di recenti ricerche. Questo perché se consumati come componenti di alimenti vegetali, possono esercitare una protezione antiossidante.
I cereali e i prodotti a base di cereali sono le principali fonti di cibo a base di carboidrati per l'uomo e gli animali in tutto il mondo6. I cereali includono grano, riso, mais (mais), orzo, triticale, miglio e sorgo. Tra questi, il mais è il più utilizzato, con un utilizzo globale stimato di 1.135,7 milioni di tonnellate nel 2019/2020, seguito dal grano con un utilizzo globale stimato di 757,5 milioni di tonnellate nello stesso periodo7. Gli alimenti a base di cereali sono grandi fonti di energia per i consumatori poiché sono ricche fonti di carboidrati. Forniscono anche alcune proteine, grassi, fibre, vitamine e minerali6. Oltre al loro valore nutrizionale, i cereali sono buone fonti di antiossidanti fitochimici, in particolare acidi fenolici, che hanno il potenziale per proteggere il sistema fisiologico dal danno ossidativo indotto dai radicali3. I legumi sono anche buone fonti di nutrienti e sono generalmente più ricchi di proteine rispetto ai cereali. Contengono anche vitamine e minerali e sono utilizzati nella preparazione di vari alimenti8. Inoltre, i legumi sono buone fonti di una varietà di antiossidanti fitochimici, tra cui acidi fenolici, flavonoidi, antociani e proantocianidine 9,10. Diverse varietà di cereali e legumi possono avere una diversa composizione di acido fenolico. C'è quindi la necessità di studiare la composizione dell'acido fenolico di cereali e legumi e delle loro varietà, al fine di conoscere i loro potenziali benefici per la salute rispetto agli antiossidanti fenolici.
Sono stati riportati numerosi saggi per misurare la quantità di acidi fenolici nei cereali e nei legumi e determinare le loro attività antiossidanti. I metodi più comuni di analisi per gli acidi fenolici integrali sono la spettrofotometria e la cromatografia liquida11. Lo scopo di questo lavoro era quello di dimostrare un metodo cromatografico liquido generalizzato ad alta pressione per determinare la composizione dell'acido fenolico solubile libero e metodi spettrofotometrici per determinare il contenuto fenolico totale e la capacità antiossidante di alcuni cereali integrali e legumi.
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Protocol
1. Tipo di campioni
- Utilizzare cinque campioni di cereali integrali, comprendenti due cereali (ad esempio, grano duro e mais giallo) e tre legumi (ad esempio, fagiolo di mucca Blackeye, soia e fagiolo rosso) per questo studio.
- Macinare 50 g di ogni chicco in triplicati in farina, usando un macinino da caffè, e passarli attraverso un setaccio da 500 μm.
- Conservarli a -20 °C.
2. Preparazione del campione
-
Determinazione del contenuto di sostanza secca ed espressione della base del peso secco
NOTA: Determinare il contenuto di sostanza secca di ciascun campione in polvere secondo il metodo AOAC (2000)12.- Accendere un forno a convezione forzata e impostare la temperatura a 130 °C.
- Essiccare essiccante (gel di silice) nel forno per 30 minuti a 1 ora e trasferire il gel di silice essiccato in un essiccatore.
- Pesare accuratamente 2 g di ciascun campione in una lattina di alluminio pulita, pre-essiccata e pesata.
- Asciugare i campioni pesati a 130 °C per 1 ora in un forno a convezione forzata.
- Trasferire il campione essiccato all'essiccatore e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
- Pesare il campione essiccato e raffreddato e registrarne il peso.
- Calcolare il contenuto di sostanza secca di ciascun campione come segue:
- Esprimere ogni parametro misurato in base al peso secco utilizzando la seguente formula:
-
Estrazione dell'acido fenolico
NOTA: Estrarre i composti fenolici liberi solubili nei campioni di grano utilizzando una modifica del metodo di Y. Qiu et al.5 che consente l'estrazione fenolica da quantità di milligrammi di cereali integrali.- Pesare accuratamente 100 mg del campione di farina integrale direttamente in un tubo microcentrifuga di colore ambrato da 2 mL di capacità. Il colore scuro del tubo aiuta a prevenire l'esposizione della miscela alla luce.
- Aggiungere 1 mL di metanolo acquoso di grado HPLC all'80% a ciascuna delle provette contenenti i campioni.
- Vortice brevemente per mescolare la soluzione di metanolo e i campioni.
- Sonicare i campioni per 60 minuti per estrarre i composti fenolici solubili liberi. Metti una copertura sopra i campioni per tutta la durata della sonicazione per una maggiore protezione dalla luce.
- Dopo la sonicazione, centrifugare la miscela a 20.000 × g per 5 minuti per sedimentare i residui solidi lasciando il surnatante in cima. Composti fenolici liberi saranno presenti nel surnatante dopo la centrifugazione.
- Trasferire il surnatante in un tubo microcentrifuga pulito.
NOTA: Il surnatante deve essere filtrato prima di essere iniettato nello strumento HPLC. Per filtrare il surnatante, rimuovere lo stantuffo di una siringa da 3 ml e collegare un filtro a siringa. Il filtro deve avere una dimensione dei pori non superiore a 0,22 μm. - Pipettare circa 0,4 mL del surnatante nella parte superiore della siringa. Reinserire lo stantuffo e spingere il liquido attraverso il filtro in un flaconcino HPLC contenente un flaconcino.
- Una volta che lo strumento è stato impostato per eseguire il metodo delineato nel manoscritto per l'analisi HPLC, caricare le fiale nel carosello per corrispondere all'elenco dei campioni.
- Ottenere cromatogrammi HPLC a 320 nm e 280 nm che mostrano picchi distinti che rappresentano diversi composti fenolici.
- Utilizzando curve standard appropriate, quantificare gli acidi idrossicinnamici a 320 nm poiché hanno la massima assorbanza a questa lunghezza d'onda. Con lo stesso principio, quantificare gli acidi idrossibenzoici a 280 nm.
- Conservare gli estratti rimanenti a -20 °C per altre analisi.
3. Composizione fenolica
- Utilizzare un cromatografo liquido ad alta pressione (Table of Materials) per identificare e quantificare i composti fenolici estratti nei campioni, sulla base del metodo di J. Xiang, F.B. Apea-Bah, V. U. Ndolo, M.C. Katundu e T. Beta 4.
- Preparare standard di acido fenolico (acido vanillico, acido caffeico, acido p-cumarico, acido ferulico e acido sinapico) per identificare e quantificare i composti fenolici costituenti negli estratti.
- Per fare questo, pesare 1 mg di ogni standard e sciogliere in 1 mL di metanolo acquoso al 50% per produrre 1.000 μg / mL di ogni standard.
- Mescolare volumi uguali di tutti e cinque gli standard in un tubo centrifugo ambrato da 2 ml per produrre un cocktail di standard, ciascuno con una concentrazione di 200 μg / mL.
- Preparare le diluizioni seriali del cocktail standard prendendo un volume in un nuovo tubo e diluendo con lo stesso volume del solvente acquoso di metanolo.
- Ripetere le diluizioni seriali fino ad una concentrazione di 3,125 μg/mL.
- Inoltre, diluire separatamente ogni standard 40 volte con il solvente per ottenere una concentrazione di 25 μg/mL di ciascuno standard.
- Impostare la temperatura della colonna a 35 °C e la temperatura del forno campione a 15 °C.
- Per preparare la fase mobile A (acido formico acquoso allo 0,1%), trasferire 1 mL di acido formico in un matraccio volumetrico da 1 L di capacità e aggiungere acqua di grado HPLC al marchio 1 L. Agitare bene per mescolare.
- Per preparare la fase B mobile (acido formico allo 0,1% in metanolo), trasferire 1 mL di acido formico in un matraccio tarato da 1 L e aggiungere metanolo di grado HPLC al marchio 1 L. Agitare bene per mescolare.
- Se necessario, regolare i volumi al segno di 1 L.
- Filtrare entrambe le fasi mobili attraverso una carta da filtro idrofila da 0,45 μm.
- Per l'analisi, iniettare 10 μL di ciascun estratto o standard (standard 25 μg/mL e cocktail standard) sulla colonna inversa.
- Elute con le fasi mobili secondo il programma di gradiente lineare per una corsa di 25 minuti come segue: 0-3,81 min, 9%-14% B; 3,81-4,85 min, 14%-15% B; 4,85-5,89 min, 15%-15% B, 5,89-8,32 min, 15%-17% B; 8,32-9,71 min, 17%-19% B; 9,71-10,40 min, 19%-19% B; 10,40-12,48 min, 19%-26% B; 12,48-13,17 min, 16%-28% B; 13,17-14,21 min, 28%-35% B; 14,21-15,95 min, 35%-40% B; 15,95-16,64 min, 40%-48% B; 16,64-18,37 min, 48%-53% B; 18,37-22,53 min, 53%-70% B; 22,53-22,88 min, 70%-90% B; 22.88-25.00 min, 90% B.
- Confrontare i tempi di ritenzione dei picchi cromatografici ottenuti per gli standard autentici di concentrazioni 25 μg/mL, a 280 nm e 320 nm, con quelli degli estratti, al fine di identificare i composti fenolici costituenti nei campioni.
- Tracciare le curve di calibrazione per i cocktail standard di acido fenolico, con concentrazione degli standard sull'asse orizzontale e l'area di picco sull'asse verticale
- Utilizzare le curve di calibrazione per stimare le concentrazioni dei composti fenolici identificati, confrontando le aree di picco sul grafico con quelle dei composti identificati a 280 nm e 320 nm come menzionato nella sezione precedente.
4. Contenuto fenolico totale
NOTA: Determinare il contenuto fenolico totale degli estratti utilizzando il metodo Folin-Ciocalteu descritto da F.B. Apea-Bah et al.13.
- Preparare gli standard di acido ferulico e acido gallico entro l'intervallo di concentrazione da 0,025 a 0,150 mg / mL per tracciare le curve di calibrazione in confronto, per la stima del contenuto fenolico totale.
- Per fare ciò, pesare accuratamente 1 mg ciascuno di acido ferulico e acidi gallici in tubi centrifughi da 2 ml di capacità.
- Aggiungere 1 mL di metanolo acquoso al 50% a ciascuno standard e vortice per dissolvere, producendo 1 mg / mL di stock di ogni standard.
- Preparare una serie di diluizioni da ogni soluzione madre per un totale di 500 μL.
- Pipettare 18,2 μL di ogni estratto o standard in un pozzo separato su una micropiastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 36,4 μL di reagente acquoso Folin-Ciocalteu al 10% (v/v) a ciascun estratto o standard.
- Quindi, aggiungere 145,4 μL di 700 mM di carbonato di sodio a ciascuna miscela di reazione.
- Incubare le miscele di reazione al buio a temperatura ambiente (20-25 °C) per 2 ore.
- Leggere l'assorbanza su un lettore di micropiastre a 750 nm.
- Tracciare le curve di calibrazione della variazione dell'assorbanza rispetto alla concentrazione degli standard di acido fenolico e utilizzarle per stimare il contenuto fenolico totale.
- Esprimere i risultati come milligrammi equivalenti di acido ferulico per grammo di campione macinato (mg FAE/g) e milligrammi di acido gallico equivalente per grammo di campione macinato (mg GAE/g) in peso secco.
5. Saggi antiossidanti
NOTA: Determinare la capacità antiossidante degli estratti di grano utilizzando i seguenti tre saggi: capacità di scavenging radicale del 2,2-difenil-1-fotorilidazile (DPPH); Capacità di scavenging radicale dell'acido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-solfonico( ABTS), che è anche chiamata capacità antiossidante equivalente a Trolox (TEAC); e capacità di assorbimento dei radicali dell'ossigeno (ORAC).
- Preparazione degli standard Trolox per curve standard
- Utilizzare Trolox, un analogo idrosolubile della vitamina E, come standard per stimare la capacità antiossidante in vitro degli estratti di cereali integrali.
- Pesare accuratamente 1 mg di Trolox in un tubo da 15 ml. Sciogliere in 4 ml di metanolo acquoso al 50%. Vortice per dissolvere per preparare una soluzione madre di 1 mM (1000 μM).
- Preparare sei concentrazioni di Trolox, ovvero 50, 100, 200, 400, 600 e 800 μM per tracciare curve standard per la stima della capacità di scavenging dei radicali DPPH e della capacità antiossidante equivalente di Trolox (TEAC). Allo stesso modo, preparare le concentrazioni 6.25, 12.5, 25 e 50 μM di Trolox per stimare la capacità di assorbimento dei radicali dell'ossigeno (ORAC). Portare il volume totale di ciascuna concentrazione a 500 μL come mostrato nella Tabella 1.
- Diluizione di estratti campione
- Diluire gli estratti del campione con metanolo prima dell'analisi. Qui, gli estratti di mais giallo e fagiolo sono stati diluiti due volte, il grano e il fagiolo sono stati diluiti cinque volte mentre l'estratto di soia è stato diluito 10 volte con metanolo.
- Test della capacità antiossidante equivalente (TEAC) di Trolox
- Misurare la capacità antiossidante equivalente a Trolox (TEAC) dei campioni utilizzando il metodo descritto in precedenza da F.B. Apea-Bah et al.14.
- Pesare 8,23 mg di ABTS in un tubo di centrifuga ambrato pulito da 2 ml di capacità.
- Quindi, pesare 1,62 mg di persolfato di potassio in un altro tubo di centrifuga ambrato pulito da 2 ml di capacità.
- Aggiungere 1 mL di acqua distillata a ciascuno di essi e vortice per dissolverli.
NOTA: Ciò si traduce in 16 mM di soluzione madre abTS con 6 mM di soluzione acquosa di persolfato di potassio. - Preparare la soluzione madre ABTS mescolando le soluzioni abTS e di persolfato di potassio in volumi uguali. La soluzione cambierà immediatamente in un colore scuro.
- Incubare la miscela di reagenti al buio per 12-16 ore.
- Diluire la soluzione madre ABTS 30 volte con 200 mM di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), per formare la soluzione di lavoro ABTS. Per fare ciò, aggiungere 58 mL di PBS da 200 mM a 2 mL della soluzione madre ABTS. La soluzione di lavoro conterrà 0,27 mM ABTS e 0,1 mM di persolfato di potassio.
- Per l'analisi, posizionare 10 μL di ciascun estratto diluito o Trolox in una micropiastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 190 μL di soluzione di lavoro ABTS a ciascun pozzo e incubare le miscele di reazione per 60 minuti.
- Misurare l'assorbanza delle miscele di reazione a 750 nm in un lettore di micropiastre.
- Utilizzare gli standard Trolox in una concentrazione compresa tra 100 e 800 μmol/L per tracciare una curva di calibrazione.
- Stimare la capacità di scavenging radicale ABTS dalla curva di calibrazione.
- Esprimere i risultati come micromole Trolox equivalenti per grammo (μmol TE/g) campione in base al peso secco.
- Saggio DPPH
NOTA: Determinare la capacità di scavenging radicale DPPH dei campioni utilizzando il metodo descritto in precedenza da F.B. Apea-Bah et al.13. Il test antiossidante DPPH richiede un composto che genera radicali, DPPH (2,2-difenil-1-picrilidazil).- Pesare accuratamente 1,2 mg di DPPH in un tubo centrifugo vuoto da 50 ml di capacità. Sciogliere il DPPH in 30 ml di metanolo per preparare una soluzione metanolica da 60 μmol/L.
NOTA: Il test DPPH verifica la capacità degli estratti campione di eliminare i radicali liberi prodotti dal DPPH. - Per l'analisi, aggiungere 5 μL degli estratti campione o della soluzione di Trolox nei pozzetti delle micropiastre.
- Quindi, aggiungere 195 μL della soluzione metanolica DPPH da 60 μmol/L e incubare per 60 min.
- Misurare l'assorbanza della miscela di reazione a 515 nm.
- Utilizzare gli standard Trolox (50-800 μmol/L) per tracciare una curva di calibrazione, con la variazione dell'assorbanza sull'asse verticale e le concentrazioni di Trolox sull'asse orizzontale.
- Stimare la capacità di scavenging DPPH dalla curva di calibrazione.
- Esprimere i risultati come micromole Trolox equivalenti per grammo (μmol TE/g) campione in base al peso secco.
- Pesare accuratamente 1,2 mg di DPPH in un tubo centrifugo vuoto da 50 ml di capacità. Sciogliere il DPPH in 30 ml di metanolo per preparare una soluzione metanolica da 60 μmol/L.
- Capacità di assorbimento dei radicali dell'ossigeno
- Determinare la capacità di assorbimento dei radicali dell'ossigeno (ORAC) dei campioni in base al metodo di F.B. Apea-Bah et al.13.
- Per iniziare, preparare gli standard Trolox di concentrazioni 6,25, 12,5, 25 e 50 μM da una soluzione madre standard Trolox da 1.000 μM in tampone di fosfato di potassio da 75 mM (K2HPO4/KH2PO4).
- Per fare ciò, pesare 1 mg di polvere di Trolox e sciogliere in 4 mL della soluzione tampone sotto sonicazione per preparare una soluzione madre da 1.000 μM.
- Quindi, prendere 50 μL della soluzione madre in un tubo centrifugo da 2 mL di capacità e diluire con 950 μL di soluzione tampone per ottenere 1.000 μL di soluzione Trolox da 50 μM.
- Pipettare 500 μL della soluzione da 50 μM in un nuovo tubo e diluire con uguale volume di tampone per ottenere una soluzione trolox da 25 μM.
- Ripetere la diluizione seriale dei 25 μM per ottenere 12,5 μM, quindi ripetere allo stesso modo la diluizione di 12,5 μM per ottenere 6,25 μM.
- Preparare le opportune diluizioni degli estratti campione.
- Diluire gli estratti di mais giallo e fagiolo 20 volte, gli estratti di grano e fagiolo 50 volte e l'estratto di soia 100 volte con la soluzione tampone.
- Trasferire 200 μL di ciascun campione o standard Trolox nei pozzetti di una micropiastra nera a 96 pozzetti per il pipettaggio automatico.
- Quindi, riempire i tre serbatoi di reagenti forniti con l'apparecchiatura ORAC, con quanto segue: (1) la soluzione tampone; (2) 0,816 nM fluoresceina nel tampone; e (3) 153 mM di 2,2′-azobis(2-amidinopropano) dicloridrato (AAPH) in tampone.
- Mettili nei loro recipienti per il pipettaggio automatico.
- Impostare la macchina ORAC e il sistema di pipettaggio automatico per l'analisi, in base alla procedura operativa standard.
- Per l'analisi, impostare il sistema di pipettaggio automatizzato per trasferire 25 μL di ciascun estratto diluito o standard ai pozzetti di una micropiastra nera a 96 pozzetti a fondo trasparente.
- Quindi, aggiungere automaticamente 150 μL di 0,816 nM di fluoresceina nel tampone.
- Incubare la miscela di reazione a 37 °C per 15 minuti nella macchina ORAC.
- Successivamente, aggiungere automaticamente 25 μL di AAPH a ciascuna miscela di reazione.
- Incubarli a 37 °C per 50 minuti nella macchina ORAC.
- Impostare la macchina ORAC per misurare il decadimento della fluorescenza, durante il periodo di incubazione, a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 485 nm e 520 nm, rispettivamente.
- Dopo le misurazioni, tracciare una curva standard trolox, con Trolox (6,25-50 μM) sull'asse orizzontale e decadimento di fluorescenza sull'asse verticale.
- Stimare la capacità di assorbimento dei radicali dell'ossigeno degli estratti della curva standard di Trolox.
- Esprimere i risultati come campione μmol TE/g in base al peso secco.
- Analisi statistica
- Presentare tutti i risultati come mezzi ± deviazione standard di almeno triplicati.
- Eseguire l'analisi della varianza (ANOVA) per determinare l'effetto del tipo di granulosità sulle variabili di risposta.
- Laddove esistano differenze significative a p < 0,05, utilizzare la differenza meno significativa (LSD) per confrontare i mezzi.
- Eseguire l'analisi di correlazione di Pearson per stimare la relazione tra il contenuto fenolico e le capacità antiossidanti.
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Representative Results
La Tabella 2 mostra gli acidi fenolici che sono stati identificati nei cereali e nei legumi. Sulla base degli standard autentici disponibili, quattro acidi fenolici sono stati identificati nei campioni e sono: acido vanillico, caffeico, p-cumarico e ferulico. L'acido vanillico è un acido idrossibenzoico mentre gli altri tre sono acidi idrossicinnamici. L'acido vanillico è stato identificato solo nel fagiolo di mucca Blackeye mentre l'acido caffeico è stato identificato solo nel fagiolo. L'acido p-cumarico è stato identificato nel mais giallo, nel fagiolo di mucca e nella soia. La sua concentrazione variava tra 7,57 e 12,48 μg / g di farina a secco, con il mais giallo che aveva il valore più basso mentre la soia aveva il valore più alto. L'acido ferulico era l'unico acido fenolico che è stato identificato in tutti i campioni. La sua concentrazione variava tra 5,69 e 41,76 μg/g di farina a secco. Tra i campioni, la concentrazione di acido ferulico era più alta nella soia seguita dal fagiolo di mucca mentre il grano, il mais giallo e il fagiolo renale avevano valori comparabili (Tabella 2). Quando tutte le concentrazioni di acido fenolico sono state riassunte per ciascun campione, i loro valori sono diminuiti nel seguente ordine: soia > fagiolo > mais giallo = fagiolo > grano.
La Tabella 3 ha mostrato il contenuto fenolico totale (TPC) e la capacità antiossidante dei cereali e dei legumi. La capacità antiossidante comprendeva la capacità di scavenging dei radicali DPPH, TEAC e ORAC. La somma di questi tre valori ha quindi dato la capacità antiossidante totale dei campioni. Il TPC è stato misurato sia in equivalente acido ferulico che in equivalente acido gallico ai fini del confronto. Il TPC variava tra 1,16 e 2,78 mg di farina FAE/g e da 0,63 a 1,48 mg di farina GAE/g, in base al peso secco. Indipendentemente dall'unità equivalente, il TPC dei campioni è diminuito nel seguente ordine: soia > grano = mais giallo = fagiolo > fagiolo di fagiolo.
La capacità di scavenging radicale DPPH dei campioni variava tra 4,48 e 14,87 μmol TE/g di farina su base di peso secco. La soia aveva la più alta capacità di scavenging DPPH, seguita dal fagiolo, mentre il mais giallo e il fagiolo di mucca avevano valori comparabili. Il grano aveva la più bassa capacità di scovare il radicale DPPH. La capacità antiossidante equivalente trolox (TEAC) dei campioni variava tra 12,82 e 57,24 μmol TE / g di farina su base di peso secco. Ancora una volta, la soia aveva il più alto valore di TEAC, seguita dal fagiolo renale e poi dal grano, mentre il mais giallo e il fagiolo di fagiolo avevano valori TEAC relativamente bassi. La capacità di assorbimento dei radicali dell'ossigeno dei campioni era compresa tra 0,35 e 1,67 μmol TE / g di farina sulla base del peso secco, con i cereali che avevano il valore più basso mentre la soia aveva il valore più alto. Quando tutte le capacità antiossidanti sono state riassunte, i loro valori nei campioni sono diminuiti nel seguente ordine: soia > fagiolo > mais giallo = fagiolo di mucca > grano.
C'è stata una forte correlazione positiva tra i due valori TPC e i valori per TEAC, ORAC e capacità antiossidante totale (TAC) (Tabella 4). Tuttavia, c'era una debole correlazione tra i valori TPC e DPPH.
Figura 1: Acidi idrossibenzoici identificati nei cereali e nei legumi. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 2: Acidi idrossicinnamici identificati nei cereali e nei legumi. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Tabella 1: Preparazione delle concentrazioni di Trolox per le curve standard DPPH e ABTS. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Contenuto di acido fenolico di alcuni cereali integrali e legumi. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Contenuto fenolico totale (TPC) e capacità antiossidante di alcuni cereali integrali e legumi. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Matrice di correlazione di Pearson per il contenuto fenolico totale e le capacità antiossidanti di alcuni cereali e legumi. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
I cereali integrali sono stati selezionati come cereali rappresentativi e legumi che trovano ampie applicazioni alimentari in tutto il mondo. Mentre possono esistere variazioni tra le cultivar di ciascun grano, l'obiettivo di questo studio è stato quello di dimostrare un metodo generalizzato per l'estrazione di acido fenolico libero e l'analisi per i cereali integrali. Il metodo di estrazione è stato modificato riducendo sostanzialmente la quantità di campioni e solventi, al fine di ridurre la quantità di sostanze chimiche che verrebbero rilasciate nell'ambiente quando tali esperimenti vengono condotti. La modifica consente anche l'estrazione fenolica da quantità di milligrammi di cereali integrali.
L'analisi HPLC produce un cromatogramma degli acidi fenolici costituenti nel campione. Ogni picco cromatografico che rappresenta un acido fenolico, può essere identificato confrontando il suo tempo di ritenzione, ad una lunghezza d'onda predefinita, con quello degli autentici standard dell'acido fenolico. I rivelatori ultravioletti (UV) sono normalmente utilizzati per identificare gli acidi fenolici all'interno dell'intervallo di lunghezze d'onda UV. Gli acidi idrossibenzoici sono solitamente identificati tra 254-280 nm mentre gli acidi idrossicinnamici sono solitamente identificati tra 300-330 nm15. I rivelatori a matrice di fotodiodi possono essere utilizzati per scansionare l'intera gamma di lunghezze d'onda UV-visibili e sono particolarmente utili per determinare gli spettri UV-visibili di composti presenti in campioni che non sono mai stati studiati. R. J. Robbins e S. R. Bean15 hanno riportato le seguenti lunghezze d'onda per il massimo assorbimento, rispettivamente per acido vanillico, acido caffeico, acido p-cumarico e acido ferulico: 260 nm; 325 nm; 310 nm; 325 nm. Il metodo di identificazione HPLC è normalmente accettabile per i campioni di composizione di acido fenolico noto, i cui tempi di ritenzione e i dati spettrali UV sono stati precedentemente stabiliti. Questo è importante perché alcuni composti possono co-eluire quando non si ottiene una buona separazione sulla colonna. Per i campioni di composizione di acido fenolico sconosciuto, viene utilizzato uno spettrometro di massa in aggiunta agli standard autentici per l'identificazione. La letteratura pubblicata fornisce informazioni utili sui composti fenolici che sono stati precedentemente identificati nel campione in studio o in campioni simili 3,9,14. Vale la pena notare che durante l'analisi HPLC, i picchi di acido fenolico nel cromatogramma sono identificabili solo quando sono disponibili standard autentici per il confronto. Potrebbero quindi esserci altri picchi che non saranno identificabili senza i loro standard corrispondenti. Questa è una limitazione con l'analisi HPLC che può essere superata quando l'HPLC è accoppiato a uno spettrometro di massa. Pertanto, la concentrazione totale di acidi fenolici quantificati dipenderà dal numero di acidi fenolici identificati.
Il metodo Folin-Ciocalteu, pubblicato per la prima volta da V. L. Singleton e J. A. Rossi (1965)16 , è un saggio basato sul trasferimento di elettroni utilizzato per stimare il TPC di un analita17. Si basa sulla capacità dell'analita di ridurre il fosfomolibdato-fosfotungstato in un mezzo alcalino, convertendolo così da giallo a una soluzione blu scuro18. L'assorbanza della soluzione risultante può quindi essere misurata a 765 nm19. Il reagente non è specifico per i soli composti fenolici, ma può reagire con diversi altri composti con proprietà riducenti come tioli, zuccheri riducenti e alcuni amminoacidi (ad esempio, tirosina). Pertanto, si suggerisce che il TPC potrebbe essere utilizzato per stimare la proprietà riducente di un campione o di un analita17. Durante l'estrazione fenolica, la maggior parte dei composti interferenti sono esclusi e poiché i composti fenolici sono i fitochimici più onnipresenti, il saggio Folin-Ciocalteu rimane un metodo utile per stimare il TPC di un campione. Nella maggior parte dei campioni la cui composizione fenolica non è nota, l'acido gallico viene utilizzato come standard per disegnare una curva di calibrazione per la stima del TPC. Tuttavia, non tutti i campioni conterranno acido gallico. Nel presente studio, abbiamo usato l'acido ferulico per confrontare i suoi risultati con quelli dell'acido gallico. Un T-test a due campioni ha mostrato che il TPC determinato come equivalente in acido ferulico aveva valori significativamente più alti del TPC espresso come equivalente di acido gallico. Dal momento che abbiamo confermato che l'acido ferulico è presente in tutti i campioni sulla base della nostra analisi HPLC e di altri risultati riportati, propendiamo maggiormente per esprimere i risultati TPC come equivalente di acido ferulico. È utile esprimere TPC rispetto a un composto fenolico costituente predominante nel campione.
Utilizzando tre diversi saggi antiossidanti, è stato osservato che i diversi cereali hanno risposto in modo diverso nelle loro capacità di eliminare i radicali liberi. La capacità di scavenging radicale DPPH e il test TEAC si basano sul meccanismo di trasferimento di elettroni (ET), mentre il saggio ORAC si basa sul meccanismo di trasferimento di atomi di idrogeno (HAT)20. Pertanto, la combinazione dei tre saggi fornisce una migliore indicazione della capacità antiossidante di un campione. Vale la pena notare che, il test ORAC misura la capacità di un campione di eliminare il radicale perossile fisiologicamente rilevante, che, in un sistema fisiologico, può causare perossidazione lipidica correlata alla formazione di cellule di schiuma e all'aterogenesi21,22. D'altra parte, i saggi DPPH e TEAC utilizzano radicali che non sono di rilevanza fisiologica. Tuttavia, la loro facilità d'uso li rende utili come metodi rapidi per stimare la capacità di scavenging radicale di un campione. Il test ORAC si confronta anche bene con altri saggi antiossidanti in vitro o ex vivo che utilizzano cellule e DNA come biomarcatori23.
Tutti i metodi sopra descritti per l'estrazione e l'identificazione degli acidi fenolici liberi, la stima del contenuto fenolico totale e la determinazione delle proprietà antiossidanti non sono standardizzati. Diversi produttori di colonne cromatografiche liquide raccomandano diversi sistemi di eluizione a gradiente di solventi per separare gli acidi fenolici per la loro identificazione. Sebbene il metodo Folin-Ciocalteu sia il più comune per stimare il contenuto fenolico totale dei campioni, diversi laboratori eseguono questo test in modo diverso. Lo stesso si può dire dei metodi antiossidanti. Vi è quindi la necessità di armonizzare questi metodi per promuovere il confronto interlaboratorio dei risultati. C'è anche la necessità di sviluppare robusti modelli predittivi in grado di mettere in relazione la composizione dell'acido fenolico con le proprietà antiossidanti misurate con questi importanti metodi di analisi.
Da questo studio si conclude che il metodo di estrazione con solvente utilizzato è efficace nell'estrarre acidi fenolici solubili liberi dalla farina di cereali integrali e legumi, facilitando così la loro identificazione e quantificazione. Il metodo HPLC consente l'identificazione e la quantificazione degli acidi fenolici solubili liberi negli estratti integrali, a condizione che esistano standard autentici per il confronto. Utilizzando i tre diversi metodi antiossidanti: DPPH, TEAC e ORAC, le capacità antiossidanti degli estratti fenolici solubili liberi da cereali integrali possono essere efficacemente determinate in base ai meccanismi di trasferimento dell'atomo di idrogeno e di trasferimento di elettroni. Questo studio conferma ulteriormente che i cereali integrali differiscono nella loro composizione di acido fenolico e nelle capacità antiossidanti. L'analisi di correlazione dimostra che le capacità antiossidanti misurate sono correlate agli acidi fenolici costituenti negli estratti solubili privi di cereali integrali. Sebbene sia TEAC che DPPH eliminino i radicali liberi mediante meccanismo di trasferimento di elettroni, sono correlati in modo diverso con TPC. La differenza nei comportamenti dei diversi saggi antiossidanti richiede la necessità di determinare la capacità antiossidante dei campioni utilizzando una varietà di saggi. Tra i cinque cereali integrali studiati, la soia ha la più alta concentrazione di acido fenolico e di conseguenza la più alta capacità antiossidante. Lo studio dimostra anche che gli acidi fenolici solubili privi di cereali integrali possono essere estratti e le loro capacità antiossidanti studiate in appena 1 ml di soluzione metanolica acquosa, riducendo così la quantità di sostanze chimiche di laboratorio rilasciate nell'ambiente.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine il supporto tecnico di Alison Ser e Hannah Oduro-Obeng, nonché il supporto al montaggio video di Janice Fajardo e Miguel del Rosario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
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