تلطيخ السيتوبلازمية Ca²⁺ مع فلوو-4/AM في لب التفاح

Summary

تم تحميل البروتوبلاستات المعزولة لخلايا لب التفاح بكاشف فلوري للكالسيوم للكشف عن تركيز Ca²⁺ السيتوبلازمي.

Abstract

Cytosolic Ca^{2 +} يلعب دورا رئيسيا في تطوير النبات. تصوير الكالسيوم هو الأسلوب الأكثر تنوعا للكشف عن التغيرات الديناميكية في Ca^{2 +} في السيتوبلازم. في هذه الدراسة، حصلنا على بروتوبلاستس قابلة للحياة من خلايا اللب عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. تم احتضان البروتوبلاست المعزول مع كاشف الفلورسنت صغير الجزيء (Fluo-4/AM) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. المسابير الفلورية ملطخة بنجاح cytosolic Ca^{2 +} ولكن لم تتراكم في vacuoles. La³⁺، مانع قناة Ca^{2 +} ، انخفض كثافة الفلورية السيتوبلازمية. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام Fluo-4/AM للكشف عن التغيرات في السيتوسوليك Ca²⁺ في لحم الفاكهة. باختصار، نقدم طريقة لعزل البروتوبلاست بشكل فعال من خلايا اللحم في الفاكهة والكشف عن Ca²⁺ عن طريق تحميل كاشف فلوري الكالسيوم صغير الجزيء في السيتوبلازم لخلايا اللب.

Introduction

Ca^{2 +} يلعب دورا هاما في نقل إشارة النبات والتمثيل الغذائي^1،2. علاوة على ذلك ، فإنه ينظم سمات جودة الفاكهة^3،4، بما في ذلك صلابة ، محتوى السكر ، والتعرض للاضطرابات الفسيولوجية أثناء التخزين^5،6. السيتوبلازمية Ca^{2 +} يلعب دورا هاما في نقل الإشارات وينظم نمو النبات والتنمية⁷. اضطراب التوازن الكالسيوم الخلوي يمكن أن تحفز حفرة مريرة في التفاح⁸، مرض بقعة بنية اللون في الكمثرى⁹، وتعفن السرة في الطماطم¹⁰، مما يؤثر على جودة الفاكهة ويسبب خسائر اقتصادية شديدة^3،11. التصوير بالكالسيوم لديه ما يكفي من الدقة المكانية والزمنية وهو وسيلة هامة^{لمراقبة ديناميات} Ca 2 + في الخلايا الحية^12،13.

في الوقت الحاضر ، هناك طريقتان رئيسيتان لتصوير الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا الحية: واحدة تستخدم مسابير فلورية كيميائية صغيرة جزيئية¹⁴، والأخرى هي مستشعر ترميز الجينات (GECI)^15،16. نظرا لصعوبة إنشاء نظام معدل وراثيا مستقر في أشجار الفاكهة وتطوير الفاكهة لفترة أطول ، فإن GECI_S غير مناسب لتصوير الفاكهة Ca^{2 +} fluorescence.

مسابير الفلورسنت جزيء صغير مثل فلوو-4/AM لها ميزة خاصة: شكلها إستر AM (الخلية نفاذية أستوكسي ميثيل استر مشتق) يمكن بسهولة الجزء الأكبر تحميلها في الخلايا الحية دون الحاجة إلى الترافيكتيون، مما يجعلها مرنة وسريعة وغير سامة للخلايا¹⁷. فلوو-4/AM يمكن تحميلها بنجاح في أنبوب حبوب اللقاح من Pyrus pyrifolia¹⁸ وبيتونيا،¹⁹ وكذلك في خلايا الحراسة²⁰ والشعر الجذر من Arabidopsis²¹.

في الوقت الحاضر، وهناك تقارير قليلة عن تلطيخ مضان الكالسيوم من خلايا اللب²². كعنصر معدني مهم، يلعب الكالسيوم دورا رئيسيا في نمو ومراقبة جودة ثمار الأشجار مثل التفاح. ومن المسلم به عالميا أشجار التفاح كنوع اقتصادي مهم، والتفاح تعتبر الغذاء الصحي²³. في هذه الدراسة، حصلنا على protoplasts قابلة للحياة من لب فاكهة التفاح من خلال التحلل المائي الأنزيمي ومن ثم تحميل الكواشف الفلورية جزيء صغير في السيتوبلازم للكشف عن Ca^{2 +}.

Protocol

1. استخراج بروتوبلاست

1. إعداد الحل الأساسي: 20 م م كل₂، 5 م 2 -(N-morpholino) حمض الإيثانسولفونيك، و 0.4 M D-sorbitol.
   ملاحظة: تم ضبط درجة الحموضة للمحلول الأساسي إلى 5.8 مع 0.1 متر تريس العازلة، وتصفيتها من خلال 0.22 ميكرومتر مرشحات للذوبان في الماء، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
2. إعداد الحل الأنزيمي: مزيج 0.3٪ (ث / v) Macerozyme R-10 و 0.5٪ (ث / v) cellulase R-10 مع الحل الأساسي.
3. أضف 0.5 مل من المحلول الأنزيمي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. اختيار تفاحة صحية وناضجة. ثم شريحة اللب إلى 10 × 5 × 1 مم³ حجم (الشكل 1A-1C).
4. ضع قطع لب فاكهة التفاح في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل يحتوي على محلول إنزيمي ثم أغلق الأنبوب(الشكل 1D).
5. احتضان أنبوب في 28 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ويهتز في 70 دورة في الدقيقة في شاكر في الظلام.
6. غسل قطع اللب. أسبيرات جميع الحل الأنزيمي ومن ثم إضافة 0.5 مل من الحل الأساسي.
7. جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
8. للحصول على تعليق بروتوبلاست، يستنشق الحل من أسفل أنبوب الطرد المركزي(الشكل 1E).

2. جزيء صغير الكالسيوم أيون تلطيخ مضان

1. إعداد حل تحميل Fluo-4/AM مع 2 mM Fluo-4/AM و 20٪ F-127 و 10x فوسفات عازلة المالحة (PBS:80 mM Na₂HPO₄, 1.36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄, و 26 mM KCI) بنسبة 1:1:2.
2. أضف 1 ميكرولتر من محلول التحميل Fluo-4/AM إلى 99 ميكرولتر من التعليق الأولي الموجود في أنابيب الطرد المركزي التي يبلغ 1.5 مل. تأكد من أن التركيز النهائي للصبغة الفلورية هو 5 ميكرومتر.
3. La³⁺ العلاج: إعداد 100 ميكرومتر La³⁺ حل مع 98 ميكرولتر من تعليق بروتوبلاست, 1 ميكرولتر من 10 م لا^{3+ ,}و 1 ميكرولتر من Fluo-4/AM حل التحميل. خلط الحل وإغلاق الأنبوب.
4. حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في الظلام.
5. غسل البروتوبلاستات عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أسبيرات 70 ميكرولتر من الحل وإضافة 70 ميكرولتر من الحل الأساسي.
6. احتضان تعليق بروتوبلست في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى إزالة استريفي تماما.
7. أسبيرات 15 ميكرولتر من تعليق بروتوبلاست والتنقيط على الشريحة.
8. مراقبة تحت المجهر مضان (الشكل التكميلي S1).
   ملاحظة: استخدم كاميرا ملونة ذات حساسية عالية، أي مستشعر CMOS بدقة 3.45 ميكرومتر (2048 × 1536).
9. حدد قناة GFP للتصوير (20x). تعيين السطوع إلى 0.5.
   ملاحظة: الإضاءة هي مكعبات ضوء LED قابلة للتعديل مع مجموعة فلتر متكاملة مغلفة بقوة. الطول الموجي للإثارة فلوو-4/AM هو 490 نانومتر.

3. اختبار قابلية البقاء Protoplast

1. إعداد محلول الأسهم فلورسسين دياسيتين (ادارة الاغذية والعقاقير): حل ادارة الاغذية والعقاقير في الأسيتون حتى التركيز النهائي هو 1 ملغ / مل.
2. إعداد حل عمل ادارة الاغذية والعقاقير مع 1 ميكرولتر من محلول المخزون و 99 ميكرولتر من الأسيتون.
3. إضافة 1 ميكرولتر من حل عمل ادارة الاغذية والعقاقير إلى 99 ميكرولتر من تعليق بروتوبلاست. خلط الحل عن طريق pipetting صعودا وهبوطا ومن ثم إغلاق الأنبوب.
   ملاحظة: التركيز النهائي للادارة الاغذية والعقاقير هو 100 ميكروغرام / لتر.
4. وصمة عار في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام.
5. إعداد الشرائح ومراقبة تحت المجهر مضان.
6. حدد قناة GFP للتصوير (الشكل 1F).

4. تحليل الصور

1. تحليل الصور المكتسبة باستخدام تحليل الصور وبرامج جداول البيانات (على سبيل المثال، Image-Pro Plus وExcel 2010).
2. حدد قطرين عموديين من الأسطح الأولية لحساب كثافة الفلورسينس(الشكل التكميلي S2). قياس كثافة الفلورية من جميع protoplasts تحت علاجات مختلفة تم قياسها. للمعالجة النهائية، استخدم برنامج تحرير الصور.

5. التحليل الإحصائي

1. إجراء تحليل إحصائي باستخدام البرامجالإحصائية (الشكل التكميلي S3). يتم تقديم البيانات في متوسط ± SD. تم استخدام اختبار الطالب لتحليلالاختلافات بين المجموعات التجريبية.

Representative Results

بعد البروتوكول المذكور أعلاه ، استخدمنا الأسلوب الأنزيمي للحصول على بروتوبلاست قابلة للحياة من اللب(الشكل 1). وكان بعض protoplasts vacuoles ، في حين أن البعض الآخر لا. في حين أن protoplasts أظهرت أي مضان عندما لم يتم تحميل مؤشر Ca^{2 +} الفلورسنت فيها. عندما تم تحميل Fluo-4/AM في protoplasts ، أصبح السيتوبلازم ، ولكن ليس الفسكول ، فلوريا(الشكل 2). وأشارت هذه النتيجة إلى أن فلوو-4/AM ملطخة بنجاح Ca²⁺ في السيتوبلازم وأنه لم يلاحظ أي تقسيم²⁴. كانت ملطخة Protoplasts مع ادارة الاغذية والعقاقير لمدة 5 دقائق وأظهرت مضان السيتوبلازمية. وهذا يشير إلى أن ارتفاع درجة الحرارة (37 درجة مئوية) لا يؤثر على قابلية البقاء على الثبات الأولي.

La^{3 +}، عامل حظر قناة Ca^{2 + 25}، تمت إضافته عندما تم تحميل Fluo-4 /AM في المنصات الأولية. في 100 ميكرومتر، انخفض لا³⁺ كثافة مضان الكالسيوم(الشكل 3).

الشكل 1: Protoplasts التي تم الحصول عليها عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. (أ) قطعة من تفاحة ناضجة. (ب)تم استخراج البروتوبلاستات من قطع اللب. (ج) تم قطع اللب إلى 10 × 5 × 1 ملم³ قطع. (د) وضعت قطع اللب في أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على محلول إنزيم 0.5 مل. (ه) بروتوبلاستس. تشير رؤوس الأسهم إلى البروتوبلاست، وتشير الأسهم إلى ال vacuole في البروتوبلاست. (F) كانت ملطخة Protoplasts مع ادارة الاغذية والعقاقير لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. (تم تعديل هذا الرقم من المرجع ²² [بحوث البستنة: تحميل مسابير الفلورسنت الكالسيوم في بروتوبلاستس للكشف عن الكالسيوم في خلايا الأنسجة اللحمية من مالوس domestica]. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تحميل فلوو -4/AM وLa³⁺ في بروتوبلاستس. (أ) التحكم: بروتوبلاست سليمة دون أي مسبار الفلورسنت تحميلها. (ب) بروتوبلاستات محملة فلوو-4/AM. (C) تمت إضافة لا^{3 +} عندما تم تحميل protoplasts مع فلوو-4/AM. وكان التركيز النهائي للLa^{3 +} 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3:التحليل الإحصائي لشدة الفلورسينس في المنصات الأولية. الإشارة إلى الفرق الكبير حسب اختبار الطالب (P<0.001). تشير الأشرطة العمودية إلى ± SD. تمثل كل نقطة بيانات متوسط 20 بروتوبلاست. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: المجهر الفلوري. (أ)المظهر العام للمجهر الفلوري. (ب) صفحة الإعدادات. حدد الهدف 20x وقناة GFP، واضبط السطوع بشكل موحد إلى 0.5. (ج) منطقة الإثارة الفلورية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: الخطوات المستخدمة لحسابكثافة Ca²⁺ الفلورية في بروتوبلاست من خلية الفاكهة. وحدات كثافة الفلورسينس المستخدمة في هذه الدراسة تستند إلى تقارير^{سابقة 26،27،28،29}. عملية الحساب هي على النحو التالي: (أ) فتح صورة فلورسينس protoplast في البرنامج. انقر على أداة القياس. من القائمة المنسدلة حدد خط الملف الشخصي. (B) حدد دائرة في إطار ملف تعريف الخط. باستخدام هذا الرسم القطع الناقص في protoplast. (C) في إطار التشكيل الجانبي سطر الآن حدد ملف | تصدير البيانات (D) تأكد من فتح جدول البيانات الفارغ واستيراد البيانات بالنقر فوق تصدير البيانات. استخدم الدالة "المتوسطة" لحساب متوسط كثافة الفلورسينس. تكرر كل علاج ثلاث مرات مع أكثر من 20 بروتوبلاست لكل منهما. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: أجريت إحصاءات البيانات باستخدام برامجيات التحليل الإحصائي. لصق البيانات في الجدول ثم انقر فوق تحليل لتحليل البيانات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S4: استخراج البروتوبلاستات من لب أصناف أخرى من التفاح. (أ)دونان. (ب) العسل كريسب. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

في هذه الدراسة ، تم الحصول على protoplasts قابلة للحياة عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. لاحظ أن هذا الأسلوب يتطلب التفاح الطازج. ويسمح هذا البروتوكول بالعزل السريع لعدد كبير من المواد الأولية عن لب الفاكهة لاستخدامها في الدراسات البحثية. ولا يقتصر تطبيق هذه الطريقة على 'فوجي'؛ بل إن المسألة هي أن المسألة لا تقتصر على 'فوجي'؛ بل هي مسألة لا يمكن أن تكون كذلك. ويمكن أيضا أن تستخرج من خلال بروتوكول واحد(الشكل التكميلي S4)البروتوبلاستس من لب التفاح من 'دونان' و 'العسل كريسب'). يحتوي محلول البروتوبلاست بعد انزيموليسيس على حطام الخلية ، والذي تم تحسينه إلى حد ما مقارنة بالطرق السابقة. كمادة الخلية الأساسية، يمكن استخدام البروتوبلستات لب التفاح لتكنولوجيا التعبير عن بروتين الخلية، وتسلسل خلية واحدة، وغيرها من البحوث.

هناك العديد من الطرق فيما يتعلق الكيميائية الفلورسنت تلطيخ في الخلايا النباتية³⁰. على سبيل المثال، تم تحميل Fluo-3/AM في درجة حرارة منخفضة (4 درجة مئوية)، بحيث أنه سيدخل خلايا الطرف الجذر³¹. فلو-3/AM يمكن أيضا تحميلها في درجة حرارة عالية (37 درجة مئوية) في أنبوب حبوب اللقاح³². فلوو-4/AM قد حملت بنجاح في أنبوب حبوب اللقاح من Pyrus pyrifolia (25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة)¹⁸ والشعر الجذر من Arabidopsis (4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة)³³. ومع ذلك، هذه الأساليب ليست مناسبة لتلطيخ لب التفاح protoplasts. في هذه الدراسة، قمنا بتحميل بنجاح مسابير الفلورسنت في بروتوبلاستس في درجة حرارة عالية (37 درجة مئوية). بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطريقة الحالية بسيطة وسريعة ودقيقة ، ولا تؤثر على حيوية البروتوبلاست. خطوة حاسمة في الطريقة المقترحة هي غسل البروتوبلاست الملون واحتضانها لمدة 30 دقيقة. بعد تلطيخ، يجب غسلها protoplasts. الغسيل سوف يقلل من مضان الخلفية أثناء المراقبة بحيث يمكن حساب كثافة الفلورية من البروتوبلاست بشكل أكثر دقة. احتضان لمدة 30 دقيقة للسماح بتحميل المزيد من المسابير في البروتوبلاست. لاحظ أنه من الضروري تجنب التعرض للضوء أثناء التحميل.

La³⁺ هو أداة هامة لدراسة Ca^{2 +}. فإنه يربط إلى موقع Mg^{2 +} الحفاز على الغشاء السيتوبلازمي Ca^{2 +}- ATPase ، وبالتالي تثبيط دوران ثابت للدولة من Ca^{2 +}- ATPase ومنع Ca^{2 +} transmembrane يعمل³⁴. La³⁺ العلاج خفض السيتوبلازمية Ca²⁺، وFluo-4/AM يمكن أن تعكس هذا التغيير، باستثناء تدخل الكاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى والتحقق من جدوى الكواشف الفلورية الكيميائية.

على الرغم من أن أسلوب التحميل هذا يوفر مزايا أكثر من الطرق الأخرى، إلا أنه لا يزال بحاجة إلى مزيد من التحسين في تحويل نتائج البيانات. هنا، قمنا بتقدير محتوى السيتوبلازمي Ca²⁺ النسبي من خلال الكشف عن قيمة الفلورية للبلاستات الأولية، وهي بيانات نوعية وليست كمية. لذلك ، من المهم بشكل خاص ترجمة نتائج التلطيخ إلى محتوى محدد من السيتوبلازم Ca^{2 +} في الدراسات المستقبلية ، والتي يمكن أن توفر أساسا بحثيا لتحليل إشارات الفاكهة Ca²⁺ .

باختصار، يمكن للطريقة الموصوفة هنا الكشف عن السيتوبلازمية Ca²⁺ في خلايا لب التفاح، وبالتالي توفير الدعم التقني للدراسات ذات الصلة من الكالسيوم في خلايا لب الفاكهة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.