Färbung des Cytoplasma Ca²⁺ mit Fluo-4/AM in Apfelzellstoff

Summary

Isolierte Protoplasten von Apfelpulpazellen wurden mit einem kalziumfluoreszierenden Reagenz beladen, um eine zytoplasmatische^{Ca2+-Konzentration} nachzuweisen.

Abstract

Zytosolisches Ca²⁺ spielt eine Schlüsselrolle bei der Pflanzenentwicklung. Die Calcium-Bildgebung ist die vielseitigste Methode, um dynamische Veränderungen von Ca²⁺ im Zytoplasma zu erkennen. In dieser Studie erhielten wir lebensfähige Protoplasten von Pulpazellen durch enzymatische Hydrolyse. Isolierte Protoplasten wurden mit dem niedermolekularen fluoreszierenden Reagenz (Fluo-4/AM) für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die fluoreszierenden Sonden färbten erfolgreich zytosolisches Ca^2+, sammelten sich aber nicht in Vakuolen an. La³⁺, ein Ca²⁺ Kanalblocker, verringerte die zytoplasmatische Fluoreszenzintensität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fluo-4 / AM verwendet werden kann, um Veränderungen des zytosolischen Ca²⁺ im Fruchtfleisch zu erkennen. Zusammenfassend stellen wir eine Methode vor, um Protoplasten effektiv aus Fleischzellen der Frucht zu isolieren und Ca²⁺ nachzuweisen, indem ein niedermolekulares Calciumfluoreszenzreagenz in das Zytoplasma von Pulpazellen geladen wird.

Introduction

Ca²⁺ spielt eine wichtige Rolle bei der signaltransduktion und im Stoffwechsel^1,2. Darüber hinaus reguliert es die Fruchtqualitätsmerkmale^3,4 , einschließlich^Härte,Zuckergehalt und Anfälligkeit für physiologische Störungen während der Lagerung^5,6. Cytoplasmatisches Ca²⁺ spielt eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion und reguliert das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen⁷. Störung der zellulären Calciumhomöostase kann bittere Gruben in Äpfeln⁸, Braunfleckenkrankheit in Birnen⁹und Nabelschnurfäule in Tomaten¹⁰induzieren , die die Fruchtqualität beeinträchtigen und schwere wirtschaftliche Verluste verursachen^3,11. Die Calciumbildgebung hat eine ausreichende räumliche und zeitliche Auflösung und ist eine wichtige Methode zur Beobachtung der Ca²⁺ Dynamik in lebenden Zellen^12,13.

Derzeit gibt es zwei Hauptmethoden für die intrazelluläre Kalziumbildgebung in lebenden Zellen: Eine verwendet chemische kleinmolekulare Fluoreszenzsonden¹⁴und die andere ist der Genkodierungssensor (GECI)^15,16. Angesichts der Schwierigkeit, ein stabiles transgenes System in Obstbäumen und einer längeren Fruchtentwicklung aufzubauen, ist GECI_S für die Fluoreszenzbildgebung von Früchten Ca²⁺ ungeeignet.

Niedermolekulare Fluoreszenzsonden wie Fluo-4/AM haben einen besonderen Vorteil: Ihre AM-Esterform (zelldurchlässiges Acetoxymethylesterderivat) kann ohne Transfektion leicht in lebende Zellen geladen werden, was sie flexibel, schnell und nicht zytotoxisch macht¹⁷. Fluo-4/AM konnte erfolgreich in die Pollenröhre von Pyrus pyrifolia¹⁸ und Petunia,¹⁹ sowie in die Schließzellen²⁰ und Wurzelhaare von Arabidopsis²¹geladen werden.

Derzeit gibt es nur wenige Berichte über die Calciumfluoreszenzfärbung von Zellstoffzellen²². Als wichtiger Mineralstoff spielt Kalzium eine Schlüsselrolle beim Wachstum und der Qualitätskontrolle von Baumfrüchten wie Äpfeln. Apfelbäume sind weltweit als wichtige Wirtschaftsart anerkannt, und Äpfel gelten als gesundes Lebensmittel²³. In dieser Studie erhielten wir lebensfähige Protoplasten aus Apfelfruchtfleisch durch enzymatische Hydrolyse und luden dann niedermolekulare fluoreszierende Reagenzien in das Zytoplasma, um Ca²⁺nachzuweisen.

Protocol

1. Protoplastenextraktion

1. Bereiten Sie die Basislösung vor: 20 mM CaCl_2,5 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure und 0,4 M D-Sorbit.
   HINWEIS: Der pH-Wert der Basislösung wurde mit 0,1 M Tris-Puffer auf 5,8 eingestellt, durch 0,22 μm wasserlösliche Filter filtriert und bei 4 °C gelagert.
2. Bereiten Sie die enzymatische Lösung vor: Mischen Sie 0,3% (w / v) Macerozym R-10 und 0,5% (w / v) Cellulase R-10 mit der Basislösung.
3. 0,5 ml enzymatische Lösung werden in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Pflücken Sie einen gesunden und reifen Apfel. Dann schneiden Sie das Fruchtfleisch in 10 x 5 x 1 mm³ Größe (Abbildung 1A-1C).
4. Die Fruchtfleischstücke in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit enzymatischer Lösung geben und dann das Röhrchen schließen (Abbildung 1D).
5. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 28 °C für 1 h und schütteln Sie es mit 70 U / min in einem Shaker im Dunkeln.
6. Waschen Sie die Zellstoffstücke. Saugen Sie die gesamte enzymatische Lösung ab und fügen Sie dann 0,5 ml der Basislösung hinzu.
7. Zentrifuge bei 300 x g für 2 min bei Raumtemperatur.
8. Um eine Protoplastensuspension zu erhalten, saugen Sie die Lösung vom Boden des Zentrifugenröhrchens ab (Abbildung 1E).

2. Niedermolekulare Calciumionenfluoreszenzfärbung

1. Bereiten Sie die Fluo-4/AM-Ladelösung mit 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 und 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS:80 mM_Na2HPO_4,1,36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄und 26 mM KCI) im Verhältnis 1:1:2 vor.
2. 1 μL Fluo-4/AM-Ladelösung wird zu 99 μL der Protoplastensuspension in den 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen hinzugefügt. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration des Fluoreszenzfarbstoffs 5 μM beträgt. Mischen Sie die Lösung und schließen Sie dann die Tube.
3. La³⁺ Behandlung: Bereiten Sie 100 μM La³⁺ Lösung mit 98 μL der Protoplastensuspension, 1 μL von 10 mM La³⁺und 1 μL Fluo-4/AM-Ladelösung vor. Mischen Sie die Lösung und schließen Sie die Tube.
4. 30 min bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
5. Waschen Sie die Protoplasten durch Zentrifugation bei 300 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie 70 μL der Lösung an und fügen Sie 70 μL der Basislösung hinzu.
6. Inkubieren Sie die Protoplastensuspension bei 37 °C für 30 min, um sie vollständig zu entestern.
7. 15 μL der Protoplastensuspension absaugen und auf einen Objektträger tropfen.
8. Unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten (Ergänzende Abbildung S1).
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Farbkamera mit hoher Empfindlichkeit, d. h. 3,2 MP (2048 x 1536) CMOS-Sensor mit 3,45 μm Pixelauflösung.
9. Wählen Sie den GFP-Kanal für die Bildgebung (20x). Stellen Sie die Helligkeit auf 0,5 ein.
   HINWEIS: Beleuchtung ist einstellbare Intensität LED-Lichtwürfel mit einem integrierten hart beschichteten Filterset. Die Anregungswellenlänge von Fluo-4/AM beträgt 490 nm.

3. Protoplast-Lebensfähigkeitstest

1. Bereiten Sie die Fluoresceindiacetat (FDA) Stammlösung vor: FDA in Aceton auflösen, bis die Endkonzentration 1 mg / ml beträgt.
2. Bereiten Sie die FDA-Arbeitslösung mit 1 μL der Stammlösung und 99 μL Aceton vor.
3. Fügen Sie 1 μL FDA-Arbeitslösung zu 99 μL Protoplastensuspension hinzu. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren nach oben und unten und schließen Sie dann das Rohr.
   HINWEIS: Die Endkonzentration der FDA beträgt 100 μg/L.
4. Bei Raumtemperatur 5 min im Dunkeln einfärben.
5. Bereiten Sie die Objektträger vor und beobachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop.
6. Wählen Sie den GFP-Kanal für die Bildgebung aus (Abbildung 1F).

4. Bildanalyse

1. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder mit Bildanalyse- und Tabellenkalkulationssoftware (z. B. Image-Pro Plus und Excel 2010).
2. Wählen Sie zwei vertikale Durchmesser aus den Protoplasten aus, um die Fluoreszenzintensität zu berechnen (Ergänzende Abbildung S2). Messung der Fluoreszenzintensität aller Protoplasten unter verschiedenen Behandlungen wurde gemessen. Für die endgültige Verarbeitung verwenden Sie eine Fotobearbeitungssoftware.

5. Statistische Auswertung

1. Führen Sie statistische Analysen mit statistischer Software durch (Ergänzende Abbildung S3). Die Daten werden in Mittelwert ± SD dargestellt. Der t-Testdes Schülers wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen den experimentellen Gruppen zu analysieren.

Representative Results

Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir die enzymatische Methode verwendet, um lebensfähige Protoplasten aus der Pulpa zu erhalten (Abbildung 1). Einige Protoplasten hatten Vakuolen, andere nicht. Während die Protoplasten keine Fluoreszenz zeigten, wenn der Ca²⁺ Fluoreszenzindikator nicht in sie geladen wurde. Wenn Fluo-4/AM in die Protoplasten geladen wurde, wurde das Zytoplasma, aber nicht die Vakuole, fluoreszierend (Abbildung 2). Dieses Ergebnis zeigte, dass Fluo-4/AM erfolgreich Ca²⁺ im Zytoplasma gefärbt hat und dass keine Kompartimentierung beobachtet wurde²⁴. Protoplasten wurden 5 min lang mit fda gefärbt und zeigten zytoplasmatische Fluoreszenz. Dies deutete darauf hin, dass hohe Temperaturen (37 °C) die Lebensfähigkeit des Protoplasten nicht beeinträchtigen.

La³⁺, ein Blockiermittel des Ca^{2+ Kanals 25}, wurde hinzugefügt, als Fluo-4/AM in Protoplasten geladen wurde. Bei 100 μM verringerte La³⁺ die Calciumfluoreszenzintensität (Abbildung 3).

Abbildung 1: Protoplasten, die durch enzymatische Hydrolyse gewonnen werden. (A) Aus einem reifen Apfel wurde ein Stück geschnitten. (B) Protoplasten wurden aus Zellstoffstücken extrahiert. (C) Das Fruchtfleisch wurde in 10 × 5 × 1 mm³ Stück geschnitten. (D) Zellstoffstücke wurden in Zentrifugenröhrchen mit 0,5 ml Enzymlösung gelegt. (E) Protoplasten. Pfeilspitzen zeigen auf den Protoplasten, und Pfeile zeigen die Vakuole im Protoplasten an. (F) Protoplasten wurden mit FDA für 5 min bei Raumtemperatur gefärbt. (Diese Abbildung wurde gegenüber Referenz ²² [Gartenbauforschung: Laden von Calciumfluoreszenzsonden in Protoplasten zum Nachweis von Kalzium in den Fleischgewebezellen von Malus domestica]modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Laden von Fluo-4/AM und La³⁺ in die Protoplasten. (A) Kontrolle: Intakter Protoplast ohne belastete Fluoreszenzsonde. (B) Protoplasten, die mit Fluo-4/AM beladen sind. (C) La³⁺ wurde hinzugefügt, als die Protoplasten mit Fluo-4/AM beladen wurden. Die endgültige Konzentration von La³⁺ betrug 100 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Statistische Analyse der Fluoreszenzintensität in den Protoplasten. Geben Sie einen signifikanten Unterschied gemäß dem t-Testdes Schülers an (P <0,001). Vertikale Balken zeigen ± SD an. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 20 Protoplasten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Fluoreszenzmikroskop. (A) Das Gesamtbild des Fluoreszenzmikroskops. (B) Einstellungsseite. Wählen Sie 20x Objektiv, GFP-Kanal und passen Sie die Helligkeit gleichmäßig auf 0,5 an. (C) Fluoreszenzanregungsregion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Schritte zur Berechnung der Ca²⁺ Fluoreszenzintensität am Protoplasten der Fruchtzelle. Die in dieser Studie verwendeten Fluoreszenzintensitätseinheiten basieren auf früheren Berichten^26,27,28,29. Der Berechnungsprozess ist wie folgt: (A) Öffnen Sie das Protoplastenfluoreszenzbild in der Software. Klicken Sie auf das Messwerkzeug. Wählen Sie im Dropdown-Menü Profilzeileaus. (B) Wählen Sie im Fenster Linienprofil die Option Kreis aus. Ziehen Sie damit eine Ellipse am Protoplasten. (C) Wählen Sie nun im Fenster Linienprofil datei | Daten exportieren (D) Stellen Sie sicher, dass die leere Tabelle geöffnet ist, und importieren Sie Daten, indem Sie auf Datenexportklicken. Verwenden Sie die Funktion "Durchschnitt", um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität zu berechnen. Jede Behandlung wurde dreimal mit jeweils mehr als 20 Protoplasten wiederholt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Die Datenstatistik wurde mit einer statistischen Analysesoftware durchgeführt. Fügen Sie die Daten in die Tabelle ein und klicken Sie auf Zur Datenanalyse analysieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Extraktion von Protoplasten aus dem Fruchtfleisch anderer Apfelsorten. (A) Dounan. (B) Honig knusprig. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

In dieser Studie wurden lebensfähige Protoplasten durch enzymatische Hydrolyse gewonnen. Beachten Sie, dass diese Methode frische Äpfel erfordert. Das vorliegende Protokoll ermöglicht die schnelle Isolierung einer großen Anzahl von Protoplasten aus Fruchtfleisch für den Einsatz in Forschungsstudien. Die Anwendbarkeit dieser Methode ist nicht auf "Fuji" beschränkt; die Protoplasten des Apfelmarks von 'Dounan' und 'Honey Crisp' können ebenfalls über dasselbe Protokoll extrahiert werden (Ergänzende Abbildung S4). Die Protoplastenlösung nach der Enzymolyse enthält Zelltrümmer, die im Vergleich zu früheren Methoden etwas verbessert wurden. Als essentielles Zellmaterial können Apfelzellstoffprotoplasten für die Zellproteinexpressionstechnologie, einzellige Sequenzierung und andere Forschungen verwendet werden.

Es gibt viele Methoden zur chemischen Fluoreszenzreagenzfärbung in Pflanzenzellen³⁰. Zum Beispiel wurde Fluo-3/AM bei einer niedrigen Temperatur (4 °C) geladen, so dass es in die Wurzelspitzenzellen³¹eindringen würde. Fluo-3/AM kann auch bei hoher Temperatur (37 °C) in das Pollenrohr³²geladen werden. Fluo-4/AM hat erfolgreich in das Pollenrohr von Pyrus pyrifolia (25 °C für 15 min)¹⁸ und das Wurzelhaar von Arabidopsis (4 °C für 30 min)³³geladen. Diese Methoden eignen sich jedoch nicht zum Färben von Apfelpulpa-Protoplasten. In dieser Studie haben wir erfolgreich fluoreszierende Sonden bei hoher Temperatur (37 °C) in Protoplasten geladen. Darüber hinaus ist die vorliegende Methode einfach, schnell, genau und beeinträchtigt nicht die Vitalität der Protoplasten. Ein kritischer Schritt in der vorgeschlagenen Methode besteht darin, die gefärbten Protoplasten zu waschen und sie für 30 Minuten zu inkubieren. Nach dem Färben sollten die Protoplasten gewaschen werden. Das Waschen reduziert die Hintergrundfluoreszenz während der Beobachtung, so dass die Fluoreszenzintensität der Protoplasten genauer gezählt werden kann. 30 Minuten inkubieren, damit mehr Sonden in die Protoplasten geladen werden können. Beachten Sie, dass es wichtig ist, Lichteinwirkung während der Beladung zu vermeiden.

La³⁺ ist ein wichtiges Werkzeug für das Studium von Ca²⁺. Es bindet an die^Mg2+ katalytische Stelle auf der zytoplasmatischen^{Membran Ca2+}-ATPase, wodurch der steady-state-Umsatz von^Ca2+-ATPase gehemmt und die^Ca2+ Transmembranfunktion^{blockiert wird 34}. Die Behandlung mit La³⁺ reduzierte das zytoplasmatische Ca²⁺, und Fluo-4/AM könnte diese Veränderung widerspiegeln, indem die Interferenz anderer zweiwertiger Kationen ausgeschlossen und die Machbarkeit chemischer Fluoreszenzreagenzien überprüft wird.

Obwohl diese Lademethode mehr Vorteile bietet als andere Methoden, muss sie bei der Transformation von Datenergebnissen noch weiter verbessert werden. Hier schätzten wir den relativen zytoplasmatischen Ca^2+-Gehalt, indem wir den Fluoreszenzwert von Protoplasten detektierten, bei dem es sich eher um qualitative Daten als um quantitative Daten handelt. Daher ist es besonders wichtig, die Färbeergebnisse in zukünftigen Studien in einen spezifischen zytoplasmatischen Ca^2+-Gehalt zu übersetzen, der eine Forschungsgrundlage für die Analyse der Frucht-Ca2+-Signalgebung bieten könnte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Methode zytoplasmatisches^Ca2+ in Apfelpulpeszellen nachweisen kann und damit technische Unterstützung für die damit verbundenen Studien von Fruchtfleischzellkalzium bietet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.