Färgning av cytoplasmic Ca²⁺ med Fluo-4/AM i Äppelmassa

Summary

Isolerade protoplaster av äppelmassa celler laddades med en kalcium fluorescerande reagens för att upptäcka cytoplasmic Ca^{2 +} koncentration.

Abstract

Cytosolic Ca²⁺ spelar en nyckelroll i växtutvecklingen. Kalciumavbildning är den mest mångsidiga metoden för att upptäcka dynamiska förändringar i Ca²⁺ i cytoplasman. I denna studie erhöll vi livskraftiga protoplaster av massaceller genom enzymatisk hydrolys. Isolerade protoplaster inkuberades med småmolekylen fluorescerande reagens (Fluo-4/AM) i 30 min vid 37 °C. Fluorescerande sonder framgångsrikt färgade cytosolic Ca^{2 +} men ackumulerades inte i vacuoles. La^{3 +}, en Ca^{2 +} kanalblockerare, minskad cytoplasmisk fluorescensintensitet. Dessa resultat tyder på att Fluo-4/AM kan användas för att upptäcka förändringar i cytosolic Ca²⁺ i fruktköttet. Sammanfattningsvis presenterar vi en metod för att effektivt isolera protoplaster från köttceller i frukten och upptäcka Ca^{2 + genom} att ladda ett kalcium fluorescerande reagens med små molekyler i cytoplasman i massaceller.

Introduction

Ca^{2 +} spelar en viktig roll i växtsignaltransduktion och metabolism^1,2. Vidare reglerar det fruktkvalitetsegenskaper^3,4, inklusive hårdhet, sockerhalt och mottaglighet för fysiologiska störningar under^{lagring 5,6}. Cytoplasmic Ca²⁺ spelar en viktig roll i signaltransduktion och reglerar växttillväxt och utveckling⁷. Störningar av cellulär kalciumhomeostas kan inducera bitter grop i äpplen^8,brun fläcksjukdom hos päron⁹, och navelrot i tomater¹⁰, vilket påverkar fruktkvaliteten och orsakar allvarliga ekonomiska förluster^3,11. Kalciumavbildning har tillräcklig rumslig och tidsmässig upplösning och är en viktig metod för att observera Ca^{2 + dynamik} i levande^{celler 12,13}.

För närvarande finns det två huvudmetoder för intracellulär kalciumavbildning i levande celler: den ena använder kemiska småmolekylära fluorescerande^{sonder 14}, och den andra är genkodningssensorn (GECI)^15,16. Med tanke på svårigheten att etablera ett stabilt transgent system i fruktträd och längre fruktutveckling är GECI_S olämpligt för frukt Ca^{2 +} fluorescensavbildning.

Småmolekylära fluorescerande sonder som Fluo-4/AM har en särskild fördel: deras AM-esterform (cellpermeabel acetoxymethylesterderivat) kan lätt bulklastas i levande celler utan behov av transfection, vilket gör den flexibel, snabb och icke-cytotoxisk¹⁷. Fluo-4/AM kan framgångsrikt laddas i pollenröret i Pyrus pyrifolia¹⁸ och Petunia,¹⁹ samt i skyddsceller^{20 och} rothår av Arabidopsis²¹.

För närvarande finns det få rapporter om kalcium fluorescens färgning av massa celler²². Som ett viktigt mineralelement spelar kalcium en nyckelroll i tillväxten och kvalitetskontrollen av trädfrukter som äpplen. Äppelträd är globalt erkända som en viktig ekonomisk art, och äpplen anses vara en hälsosam mat²³. I denna studie erhöll vi livskraftiga protoplaster från äppelfruktmassa genom enzymatisk hydrolys och laddade sedan småmolekyls fluorescerande reagenser i cytoplasman för att upptäcka Ca^{2 +}.

Protocol

1. Protoplast extraktion

1. Förbered den grundläggande lösningen: 20 mM CaCl_2,5 mM 2-(N-morpholino)etanesulfonsyra och 0,4 M D-sorbitol.
   OBS: Baslösningens pH-tal justerades till 5,8 med 0,1 M Tris-buffert, filtrerades genom 0,22 μm vattenlösliga filter och lagrades vid 4 °C.
2. Förbered den enzymatiska lösningen: Blanda 0,3%(w/v) Macerozyme R-10 och 0,5%(w/v) cellulase R-10 med den grundläggande lösningen.
3. Tillsätt 0,5 ml enzymatisk lösning i ett 1,5 ml centrifugeringsrör. Välj ett friskt och moget äpple. Skiva sedan massan i 10 x 5 x 1 mm³ storlek (Figur 1A-1C).
4. Placera äppelfruktmassabitarna i ett 1,5 ml centrifugeringsrör som innehåller enzymatisk lösning och stäng sedan röret (Figur 1D).
5. Inkubera röret vid 28 °C i 1 timme och skaka vid 70 varv/min i en skakapparat i mörker.
6. Tvätta massabitarna. Aspirera på all enzymatisk lösning och tillsätt sedan 0,5 ml av grundlösningen.
7. Centrifugera vid 300 x g i 2 min vid rumstemperatur.
8. För att få en protoplastupphängning, aspirera lösningen från botten av centrifugröret(figur 1E).

2. Färgning av kalciumjonfärgning med små molekyler

1. Förbered fluo-4/AM lastlösningen med 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 och 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS:80 mM Na₂HPO_4,1,36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄och 26 mM KCI) i ett 1:1:2-förhållande.
2. Tillsätt 1 μL Fluo-4/AM lastlösning till 99 μL av protoplastfjädringen som finns i 1,5 ml centrifuger. Se till att den slutliga koncentrationen av fluorescerande färgämne är 5 μM. Blanda lösningen och stäng sedan röret.
3. La³⁺ behandling: Förbered 100 μM La³⁺ lösning med 98 μL protoplastupphängning, 1 μL 10 mM La³⁺och 1 μL Fluo-4/AM lastlösning. Blanda lösningen och stäng röret.
4. Inkubera i 30 min vid 37 °C i mörker.
5. Tvätta protoplasterna genom centrifugering vid 300 x g i 2 min vid rumstemperatur. Aspirera 70 μL av lösningen och tillsätt 70 μL av grundlösningen.
6. Inkubera protoplastupphängningen vid 37 °C i 30 min för att helt avesterera.
7. Aspirera 15 μL av protoplastupphängningen och droppa på en glidning.
8. Observera under ett fluorescensmikroskop(kompletterande figur S1).
   OBS: Använd en färgkamera med hög känslighet, dvs. 3,2 MP (2048 x 1536) CMOS-sensor med 3,45 μm pixelupplösning.
9. Välj GFP-kanalen för avbildning (20x). Ställ in ljusstyrkan på 0,5.
   OBS: Belysningen är justerbara LED-ljuskuber med en integrerad hårdbelagd filteruppsättning. Excitation våglängden av Fluo-4/AM är 490 nm.

3. Protoplast livsduglighetsanalys

1. Förbered fluoresceindiaktatet (FDA) lagerlösning: Lös upp FDA i aceton tills den slutliga koncentrationen är 1 mg/ml.
2. Förbered FDA-arbetslösningen med 1 μL av stamlösningen och 99 μL aceton.
3. Tillsätt 1 μL FDA-arbetslösning till 99 μL protoplastupphängning. Blanda lösningen genom att leda upp och ner och stäng sedan röret.
   OBS: Den slutliga koncentrationen av FDA är 100 μg/L.
4. Fläck vid rumstemperatur i 5 min i mörkret.
5. Förbered bilderna och observera under ett fluorescensmikroskop.
6. Välj GFP-kanal för bildbehandling (Bild 1F).

4. Bildanalys

1. Analysera de förvärvade bilderna med hjälp av bildanalys och kalkylprogram (t.ex. Image-Pro Plus och Excel 2010).
2. Välj två vertikala diametrar från protoplasterna för att beräkna fluorescensintensiteten (kompletterande figur S2). Mät fluorescensintensiteten hos alla protoplaster under olika behandlingar mättes. För slutlig bearbetning, använd fotoredigeringsprogram.

5. Statistisk analys

1. Utföra statistisk analys med hjälp av statistisk programvara (kompletterande figur S3). Uppgifterna presenteras i Mean ± SD. Studentens t-testanvändes för att analysera skillnaderna mellan de experimentella grupperna.

Representative Results

Enligt det protokoll som beskrivs ovan använde vi den enzymatiska metoden för att erhålla livskraftiga protoplaster från massan (Figur 1). Vissa protoplaster hade vacuoles, medan andra inte. Medan protoplasterna inte uppvisade någon fluorescens när Ca^{2 +} fluorescerande indikatorn inte laddades i dem. När Fluo-4/AM laddades in i protoplasterna blev cytoplasman, men inte vacuole, fluorescerande (figur 2). Detta resultat anges att Fluo-4/AM framgångsrikt färgas Ca²⁺ i cytoplasman och att ingen compartmentalization observerades²⁴. Protoplasts var färgas med FDA för 5 min och visade cytoplasmic fluorescens. Detta indikerade att hög temperatur (37 °C) inte påverkar protoplastens livskraft.

La³⁺, en blockerande agent för Ca^{2 +} kanal²⁵, lades till när Fluo-4 / AM laddades i protoplaster. Vid 100 μM minskade La³⁺ kalciumfluorescensintensiteten (figur 3).

Figur 1:Protoplaster som erhållits genom enzymatisk hydrolys. B)Protoplaster extraherades från massabitar. (C)Massan skars i 10 × 5 × 1 mm³ stycken. (D) Massabitar placerades i centrifugrör som innehöll 0,5 ml enzymlösning. (E) Protoplaster. Pilspetsar pekar på protoplasten och pilarna anger vakuolen i protoplasten. (F) Protoplaster var fläckade med FDA i 5 min vid rumstemperatur. (Denna siffra har ändrats från referens ²² [Trädgårdsforskning: Lastning av kalciumfluorescerande sonder i protoplaster för att detektera kalcium i köttvävnadscellerna i Malus domestica]. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Bild 2:Lastning av Fluo-4/AM och La³⁺ i protoplasterna. (A) Kontroll: Intakt protoplast utan laddad fluorescerande sond. (B) Protoplaster laddade med Fluo-4/AM. (C) La³⁺ tillsattes när protoplasterna laddades med Fluo-4/AM. Den slutliga koncentrationen av La³⁺ var 100 μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Statistisk analys av fluorescensintensiteten i protoplasterna. Ange signifikant skillnad enligt Studentens t-test(P <0.001). Lodräta staplar ± SD. Varje datapunkt representerar medelvärdet av 20 protoplaster. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande figur S1: Fluorescensmikroskop. A)Fluorescensmikroskopets övergripande utseende. (B) Inställningssida. Välj 20x mål, GFP-kanal och justera ljusstyrkan jämnt till 0,5. (C)Fluorescens excitation region. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: Steg som används för att beräkna ca²⁺ fluorescensintensitet vid protoplast av fruktcell. Fluorescensintensitetsenheter som används i denna studie är baserade på tidigare^{rapporter 26,27,28,29}. Beräkningsprocessen är följande: (A) Öppna protoplast fluorescensbilden i programvaran. Klicka på mätverktyget. Välj Profilrad på den nedrullningsbara menyn. (B) Välj Cirkel i fönstret Radprofil. Använd denna dragning en ellips vid protoplasten. (C) I fönstret Radprofil väljer du nu | Exportera data (D) Kontrollera att det tomma kalkylbladet öppnas och importera data genom att klicka på Dataexport. Använd funktionen "genomsnittlig" för att beräkna den genomsnittliga fluorescensintensiteten. Varje behandling upprepades tre gånger med mer än 20 protoplaster vardera. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande siffra S3: Datastatistiken utfördes med hjälp av programvara för statistisk analys. Klistra in data i tabellen och klicka på Analysera för dataanalys. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S4: Extraktion av protoplaster från massan av andra sorter av äpplen. A)Dounan. (B)Honungschips. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

I denna studie erhölls livskraftiga protoplaster genom enzymatisk hydrolys. Observera att den här metoden kräver färska äpplen. Detta protokoll möjliggör snabb isolering av ett stort antal protoplaster från fruktmassa för användning i forskningsstudier. Tillämpligheten av denna metod är inte begränsad till "Fuji". Protoplasterna i äppelmassan "Dounan" och "Honey Crisp" kan också extraheras genom samma protokoll (kompletterande figur S4). Protoplastlösningen efter enzymolys innehåller cellskräp, vilket förbättrades något jämfört med tidigare metoder. Som ett viktigt cellmaterial kan äppelmassa protoplaster användas för cellproteinuttrycksteknik, encellig sekvensering och annan forskning.

Det finns många metoder för kemisk fluorescerande reagensfärgning i växtceller³⁰. Till exempel laddades Fluo-3/AM vid låg temperatur (4 °C), så att den skulle komma in i rotspetscellerna³¹. Fluo-3/AM kan också laddas vid hög temperatur (37 °C) i pollenröret³². Fluo-4/AM har framgångsrikt laddats i pollenröret i Pyrus pyrifolia (25 °C i 15 min)¹⁸ och rothåret i Arabidopsis (4 °C i 30 min)³³. Dessa metoder är dock inte lämpliga för färgning av äppelmassa protoplaster. I denna studie laddade vi framgångsrikt fluorescerande sonder i protoplaster vid hög temperatur (37 °C). Dessutom är den nuvarande metoden enkel, snabb, exakt och påverkar inte protoplast vitalitet. Ett kritiskt steg i den föreslagna metoden är att tvätta de färgade protoplasterna och inkubera dem i 30 minuter. Efter färgning ska protoplasterna tvättas. Tvättningen kommer att minska bakgrundsfluorescensen under observationen så att protoplasternas fluorescensintensitet kan räknas mer exakt. Inkubera i 30 minuter så att fler sonder kan laddas i protoplasterna. Observera att det är viktigt att undvika ljusexponering under lastningen.

La³⁺ är ett viktigt verktyg för att studera Ca^{2 +}. Det binder till Mg^{2 +} katalytisk plats på det cytoplasmiska membranet Ca^{2 +}- ATPase, vilket hämmar den stadiga omsättningen av Ca^{2 +}- ATPase och blockerar Ca^{2 +} transmembran fungerar³⁴. La³⁺ behandling minskade cytoplasmic Ca^{2 +}, och Fluo-4/AM kan återspegla denna förändring, exklusive störning av andra divalent cations och verifiera genomförbarheten av kemiska fluorescens reagenser.

Även om denna inläsningsmetod erbjuder fler fördelar än andra metoder, måste den fortfarande förbättras ytterligare för att omvandla dataresultat. Här uppskattade vi det relativa cytoplasmiska Ca^{2 + -innehållet} genom att upptäcka fluorescensvärdet av protoplaster, vilket är kvalitativa data snarare än kvantitativa. Därför är det särskilt viktigt att översätta färgningsresultaten till specifikt cytoplasmiskt Ca^{2 + -innehåll} i framtida studier, vilket kan ge en forskningsbas för att analysera frukt Ca^{2 +} signalering.

Sammanfattningsvis kan den metod som beskrivs häri upptäcka cytoplasmic Ca²⁺ i äppelmassaceller, vilket ger tekniskt stöd för relaterade studier av fruktmassa-cell kalcium.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.