Manchando o Ca²⁺ Citoplasmado com Fluo-4/AM em Celulose de Maçã

Summary

Protoplastias isolados de células de celulose de maçã foram carregados com um reagente fluorescente de cálcio para detectar concentração de Ca²⁺ citoplasmática.

Abstract

O Cítosol Ca²⁺ desempenha um papel fundamental no desenvolvimento das plantas. A imagem de cálcio é o método mais versátil para detectar alterações dinâmicas no Ca²⁺ no citoplasma. Neste estudo, obtivemos protoplastos viáveis de células polpais por hidrólise enzimática. Protoplastias isolados foram incubados com o reagente fluorescente de pequenas moléculas (Fluo-4/AM) por 30 min a 37 °C. As sondas fluorescentes mancharam com sucesso o Ca²⁺ citosol, mas não se acumularam em vacúolos. La³⁺, um bloqueador de canal Ca^2+, diminuiu a intensidade de fluorescência citoplasmática. Esses resultados sugerem que o Fluo-4/AM pode ser usado para detectar alterações no Ca²⁺ citosolico na carne de fruta. Em resumo, apresentamos um método para isolar efetivamente protoplastos das células carníolas da fruta e detectar o Ca²⁺ carregando um reagente fluorescente de cálcio de pequenas moléculas no citoplasma das células de polpa.

Introduction

O Ca²⁺ desempenha um papel importante na transdução de sinal vegetal e no metabolismo^1,2. Além disso, regula os traços de qualidade da fruta^3,4, incluindo dureza, teor de açúcar e suscetibilidade a distúrbios fisiológicos durante o armazenamento^5,6. O Ca²⁺ citoplasmado desempenha um papel importante na transdução de sinais e regula o crescimento e o desenvolvimento das plantas⁷. A perturbação da homeostase de cálcio celular pode induzir o poço amargo nas maçãs⁸, doença da mancha marrom nas peras⁹e podridão umbilical no tomate¹⁰, afetando a qualidade da fruta e causando severas perdas econômicas^3,11. A imagem de cálcio tem resolução espacial e temporal suficiente e é um método importante para observar a dinâmica ca²⁺ em células vivas^12,13.

Atualmente, existem dois métodos principais para a imagem intracelular de cálcio em células vivas: um emprega sondas fluorescentes químicas de pequeno porte molecular¹⁴, e o outro é o sensor de codificação genética (GECI)^15,16. Dada a dificuldade de estabelecer um sistema transgênico estável em árvores frutíferas e desenvolvimento de frutas mais longas, o GECI_S é inadequado para a imagem de fluorescência ca²⁺ frutífera.

Sondas fluorescentes de pequenas moléculas como o Fluo-4/AM têm uma vantagem particular: sua forma de éster AM (derivado de éster acetoximetila permeável celular) pode ser prontamente carregada em massa em células vivas sem a necessidade de transfecção, o que a torna flexível, rápida e não citotóxica¹⁷. Fluo-4/AM poderia ser carregado com sucesso no tubo de pólen de Pyrus pyrifolia¹⁸ e Petúnia,^19, bem como em células de guarda²⁰ e cabelo raiz de Arabidopsis²¹.

Atualmente, há poucos relatos sobre a coloração da fluorescência de cálcio das células^{de polpa 22}. Como elemento mineral importante, o cálcio desempenha um papel fundamental no crescimento e controle de qualidade de frutos das árvores, como maçãs. As macieiras são reconhecidas mundialmente como uma espécie econômica importante, e as maçãs são consideradas um alimento saudável²³. Neste estudo, obtivemos protoplastos viáveis da polpa de frutas de maçã através da hidrólise enzimática e, em seguida, carregamos reagentes fluorescentes de pequenas moléculas no citoplasma para detectar Ca²⁺.

Protocol

1. Extração de protoplastia

1. Prepare a solução básica: 20 mM CaCl₂, 5 mM 2-(N-morpholino)ácido estilesullfônico e 0,4 M D-sorbitol.
   NOTA: O pH da solução básica foi ajustado para 5,8 com tampão tris de 0,1 M, filtrado através de filtros solúveis em água de 0,22 μm e armazenado a 4 °C.
2. Prepare a solução enzimática: Misture 0,3%(w/v) Macerozyme R-10 e 0,5%(w/v) cellulase R-10 com a solução básica.
3. Adicione 0,5 mL de solução enzimática em um tubo centrífuga de 1,5 mL. Escolha uma maçã saudável e madura. Em seguida, corte a polpa em tamanho de 10 x 5 x 1 mm³ (Figura 1A-1C).
4. Coloque as peças de polpa de frutas de maçã em um tubo centrífuga de 1,5 mL contendo solução enzimática e, em seguida, feche o tubo(Figura 1D).
5. Incubar o tubo a 28 °C por 1h, tremendo a 70 rpm/min em um agitador no escuro.
6. Lave os pedaços de polpa. Aspire toda a solução enzimática e adicione 0,5 mL da solução básica.
7. Centrifugar a 300 x g por 2 min a temperatura ambiente.
8. Para obter uma suspensão protoplasta, aspire a solução a partir da parte inferior do tubo de centrífuga(Figura 1E).

2. Coloração de fluorescência de íons de cálcio de pequena molécula

1. Prepare a solução de carregamento Fluo-4/AM com Fluo-4/AM de 2 mM, 20% F-127, e 10x salina tamponada com fosfato (PBS:80 mM Na₂HPO₄, 1,36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄e 26 mM KCI) em uma proporção de 1:1:2.
2. Adicione 1 μL de solução de carregamento Fluo-4/AM a 99 μL da suspensão protoplasta presente nos tubos de centrífugas de 1,5 mL. Certifique-se de que a concentração final do corante fluorescente é de 5 μM. Misture a solução e feche o tubo.
3. Tratamento^{La 3+:} Prepare a solução 100 μM La³⁺ com 98 μL da suspensão protoplasta, 1 μL de 10 mM La³⁺e 1 μL de solução de carregamento Fluo-4/AM. Misture a solução e feche o tubo.
4. Incubar por 30 min a 37 °C no escuro.
5. Lave os protoplastos por centrifugação a 300 x g por 2 min a temperatura ambiente. Aspire 70 μL da solução e adicione 70 μL da solução básica.
6. Incubar a suspensão do protoplasto a 37 °C por 30 min para desestárrio completamente.
7. Aspire 15 μL da suspensão protoplasta e gotejamento em um slide.
8. Observar sob um microscópio de fluorescência(Figura Suplementar S1).
   NOTA: Use uma câmera colorida com alta sensibilidade, ou seja, sensor CMOS de 3,2 MP (2048 x 1536) com resolução de pixels de 3,45 μm.
9. Selecione o canal GFP para imagem (20x). Coloque o brilho em 0,5.
   NOTA:A iluminação é de cubos de luz LED de intensidade ajustável com um conjunto integrado de filtro revestido de força. O comprimento de onda de excitação do Fluo-4/AM é de 490 nm.

3. Ensaio de viabilidade protoplasta

1. Prepare a solução de estoque fluoresceína (FDA): Dissolver a FDA em acetona até que a concentração final seja de 1 mg/mL.
2. Prepare a solução de trabalho da FDA com 1 μL da solução de estoque e 99 μL de acetona.
3. Adicione 1 μL de solução de trabalho fda a 99 μL de suspensão protoplasta. Misture a solução pipetando para cima e para baixo e, em seguida, feche o tubo.
   NOTA: A concentração final da FDA é de 100 μg/L.
4. Mancha à temperatura ambiente por 5 minutos no escuro.
5. Prepare os slides e observe sob um microscópio de fluorescência.
6. Selecione o canal GFP para imagem(Figura 1F).

4. Análise de imagem

1. Analise as imagens adquiridas utilizando análise de imagens e software de planilha (por exemplo, Image-Pro Plus e Excel 2010).
2. Selecione dois diâmetros verticais dos protoplastos para calcular a intensidade da fluorescência(Figura Suplementar S2). Medida a intensidade de fluorescência de todos os protoplastos em diferentes tratamentos foi medida. Para processamento final, use software de edição de fotos.

5. Análise estatística

1. Realizar análise estatística utilizando software estatístico(Figura Suplementar S3). Os dados são apresentados em Média ± SD. O teste tdo aluno foi utilizado para analisar as diferenças entre os grupos experimentais.

Representative Results

Seguindo o protocolo descrito acima, utilizou-se o método enzimático para obter protoplastos viáveis da polpa (Figura 1). Alguns protoplastos tinham vacuoles, enquanto outros não. Enquanto os protoplastos não apresentaram fluorescência quando o indicador fluorescente Ca²⁺ não foi carregado neles. Quando o Fluo-4/AM foi carregado nos protoplastos, o citoplasma, mas não o vacuole, tornou-se fluorescente(Figura 2). Este resultado indicou que o Fluo-4/AM manchou com sucesso o Ca²⁺ no citoplasma e que não foi observada compartimentação²⁴. Os protoplastos foram manchados com FDA por 5 minutos e apresentaram fluorescência citoplasmática. Isso indicou que a alta temperatura (37 °C) não afeta a viabilidade do protoplasto.

La³⁺, um agente de bloqueio do canal Ca^{2+ 25,}foi adicionado quando o Fluo-4/AM foi carregado em protoplastos. A 100 μM, La³⁺ diminuiu a intensidade de fluorescência de cálcio(Figura 3).

Figura 1: Protoplastas obtidas por hidrólise enzimática. (A) Uma peça foi cortada de uma maçã madura. (B) Os protoplastos foram extraídos de pedaços de polpa. (C) A polpa foi cortada em 10 × 5 × 1 mm³ peças. (D) As peças de polpa foram colocadas em tubos de centrífugas contendo solução de enzima de 0,5 mL. Protoplastos. Pontas de flecha apontam para o protoplasto, e setas indicam o vacuole no protoplasto. (F) Os protoplastos foram manchados com FDA por 5 minutos em temperatura ambiente. (Esta figura foi modificada a partir da referência ²² [Pesquisa de horticultura: Carregando sondas fluorescentes de cálcio em protoplastos para detectar cálcio nas células de tecido carnítrico de Malus domestica]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Carregar Fluo-4/AM e La³⁺ nos protoplastos. (A) Controle: Protoplasta intacta sem qualquer sonda fluorescente carregada. (B) Protoplastas carregados com Fluo-4/AM. (C) La³⁺ foi adicionado quando os protoplastos foram carregados com Fluo-4/AM. A concentração final de La³⁺ foi de 100 μM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise estatística da intensidade da fluorescência nos protoplastos. Indicar diferença significativa conforme teste tdo Aluno (P <0,001). As barras verticais indicam ± SD. Cada ponto de dados representa a média de 20 protoplastos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: microscópio de fluorescência. (A) A aparência geral do microscópio de fluorescência. (B) Página de configurações. Selecione o objetivo de 20x, canal GFP e ajuste uniformemente o brilho para 0,5. (C) Região de excitação da fluorescência. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S2: Passos utilizados para calcular aintensidade de fluorescência Ca²⁺ no protoplasto da célula frutífera. As unidades de intensidade de fluorescência utilizadas neste estudo baseiam-se nos relatórios anteriores^26,27,28,29. O processo de cálculo é o seguinte: (A) Abra a imagem de fluorescência protoplasta no software. Clique na ferramenta Medir. No menu suspenso selecione Linha de perfil. (B) Selecione o círculo na janela Perfil da linha. Usando este desenho uma elipse no protoplasto. (C) Na janela Perfil de linha agora selecione Arquivo | Dados de exportação (D) Certifique-se de que a planilha em branco seja aberta e importe dados clicando na Exportaçãode Dados . Use a função 'média' para calcular a intensidade média da fluorescência. Cada tratamento foi repetido três vezes com mais de 20 protoplastos cada. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S3: As estatísticas de dados foram realizadas por meio de software de análise estatística. Cole os dados na tabela e clique em Analisar dados. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S4: Extração de protoplastos da polpa de outras variedades de maçãs. Dounan. MelCrocante. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

Neste estudo, protoplastos viáveis foram obtidos por hidrólise enzimática. Observe que este método requer maçãs frescas. O presente protocolo permite o rápido isolamento de um grande número de protoplastos da polpa de frutas para uso em estudos de pesquisa. A aplicabilidade deste método não se limita a 'Fuji'; os protoplastos da polpa de maçã de 'Dounan' e 'Honey Crisp' também podem ser extraídos através do mesmo protocolo(Figura Suplementar S4). A solução protoplasta após a enzima contém detritos celulares, que foi um pouco melhorado em comparação com os métodos anteriores. Como material celular essencial, os protoplastos de polpa de maçã podem ser usados para a tecnologia de expressão de proteína celular, sequenciamento unicelular e outras pesquisas.

Existem muitos métodos relativos à coloração de reagentes fluorescentes químicos nas células^{vegetais 30}. Por exemplo, o Fluo-3/AM foi carregado a uma temperatura baixa (4 °C), de tal forma que entraria nas células de ponta^{raiz 31}. Fluo-3/AM também pode ser carregado a uma alta temperatura (37 °C) no tubo de pólen³². Fluo-4/AM carregou com sucesso no tubo de pólen de Pyrus pyrifolia (25 °C por 15 min)¹⁸ e o cabelo raiz de Arabidopsis (4 °C por 30 min)³³. No entanto, esses métodos não são adequados para coloração de protoplastos de polpa de maçã. Neste estudo, carregamos com sucesso sondas fluorescentes em protoplastos a uma alta temperatura (37 °C). Além disso, o método atual é simples, rápido, preciso e não afeta a vitalidade do protoplasto. Um passo crítico no método proposto é lavar os protoplastas manchados e incuba-los por 30 minutos. Após a coloração, os protoplastos devem ser lavados. A lavagem reduzirá a fluorescência de fundo durante a observação para que a intensidade da fluorescência dos protoplastos possa ser contada com mais precisão. Incubar por 30 minutos para permitir que mais sondas sejam carregadas nos protoplastos. Note que é essencial evitar a exposição à luz durante o carregamento.

La³⁺ é uma ferramenta importante para estudar Ca²⁺. Liga-se ao sítio catalítico Mg²⁺ na membrana citoplasmática Ca²⁺-ATPase, inibindo assim a rotatividade de estado estável de Ca²⁺-ATPase e bloqueando o ca²⁺ transmembrano funcionando³⁴. O tratamento^{la 3+} reduziu a citoplasmática Ca²⁺, e Fluo-4/AM poderia refletir essa mudança, excluindo a interferência de outros cáingos divalentos e verificando a viabilidade de reagentes de fluorescência química.

Embora este método de carregamento ofereça mais vantagens do que outros métodos, ele ainda precisa ser melhorado na transformação dos resultados dos dados. Aqui, estimamos o teor relativo de Ca²⁺ citoplasmicos detectando o valor da fluorescência dos protoplastos, que são dados qualitativos e não quantitativos. Por isso, é particularmente importante traduzir os resultados da coloração em conteúdo específico do Ca²⁺ citoplasmica em estudos futuros, o que poderia fornecer uma base de pesquisa para análise da sinalização do Fruto Ca^2+.

Em resumo, o método descrito aqui pode detectar ca²⁺ citoplasmica em células de polpa de maçã, fornecendo suporte técnico para os estudos relacionados de cálcio de células de polpa de frutas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.