Summary
Los protoplastos aislados de células de pulpa de manzana se cargaron con un reactivo fluorescente de calcio para detectar la concentración citoplasmática de Ca2+.
Abstract
El Ca2+ citosólico juega un papel clave en el desarrollo de las plantas. La imagen de calcio es el método más versátil para detectar cambios dinámicos en Ca2+ en el citoplasma. En este estudio, obtuvimos protoplastos viables de células pulpares por hidrólisis enzimática. Los protoplastos aislados se incubaron con el reactivo fluorescente de molécula pequeña (Fluo-4/AM) durante 30 min a 37 °C. Las sondas fluorescentes tiñeron con éxito el Ca2+ citosólico pero no se acumularon en las vacuolas. La3+,un bloqueador de los canales de Ca2+, disminuyó la intensidad de la fluorescencia citoplasmática. Estos resultados sugieren que Fluo-4 / AM se puede utilizar para detectar cambios en ca2 + citosólico en la pulpa de la fruta. En resumen, presentamos un método para aislar eficazmente los protoplastos de las células de la carne de la fruta y detectar Ca2+ cargando un reactivo fluorescente de calcio de molécula pequeña en el citoplasma de las células pulpares.
Introduction
Ca2+ juega un papel importante en la transducción de señales y el metabolismode las plantas 1,2. Además, regula los rasgos de calidad de la fruta3,4, incluida la dureza, el contenido de azúcar y la susceptibilidad a los trastornos fisiológicos durante el almacenamiento5,6. El Ca2+ citoplasmático juega un papel importante en la transducción de señales y regula el crecimiento y desarrollo de las plantas7. La alteración de la homeostasis del calcio celular puede inducir hueso amargo en manzanas8,enfermedad de manchas marrones en peras9y pudrición umbilical en tomates10,afectando la calidad de la fruta y causando graves pérdidas económicas3,11. Las imágenes de calcio tienen suficiente resolución espacial y temporal y es un método importante para observar la dinámica de Ca2+ en células vivas12,13.
En la actualidad, hay dos métodos principales para la obtención de imágenes de calcio intracelular en células vivas: uno emplea sondas fluorescentes químicas de pequeño molecular14, y el otro es el sensor de codificación de genes (GECI)15,16. Dada la dificultad de establecer un sistema transgénico estable en los árboles frutales y un desarrollo más largo de la fruta, GECIS no es adecuado para la obtención de imágenes de fluorescencia Ca2+ de la fruta.
Las sondas fluorescentes de moléculas pequeñas como Fluo-4/AM tienen una ventaja particular: su forma de éster AM (derivado del acetoximetilo éster permeable a las células) puede cargarse fácilmente a granel en las células vivas sin necesidad de transfección, lo que la hace flexible, rápida y no citotóxica17. Fluo-4 / AM podría cargarse con éxito en el tubo de polen de Pyrus pyrifolia18 y Petunia,19, así como en las células de guardia20 y el vello de la raíz de Arabidopsis21.
En la actualidad, hay pocos informes sobre la tinción de fluorescencia de calcio de las células pulpares22. Como elemento mineral importante, el calcio juega un papel clave en el crecimiento y control de calidad de los frutos de los árboles como las manzanas. Los manzanos son reconocidos mundialmente como una especie económica importante, y las manzanas se consideran un alimento saludable23. En este estudio, obtuvimos protoplastos viables de pulpa de fruta de manzana a través de hidrólisis enzimática y luego cargamos reactivos fluorescentes de moléculas pequeñas en el citoplasma para detectar Ca2 +.
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Protocol
1. Extracción de protoplastos
- Preparar la solución básica: 20 mM De CaCl2, 5 mM de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico y 0,4 M de D-sorbitol.
NOTA: El pH de la solución básica se ajustó a 5,8 con tampón Tris de 0,1 M, se filtró a través de filtros solubles en agua de 0,22 μm y se almacenó a 4 °C. - Preparar la solución enzimática: Mezclar 0,3% (p/v) Macerozyme R-10 y 0,5% (p/v) celulasa R-10 con la solución básica.
- Añadir 0,5 ml de solución enzimática en un tubo centrífugo de 1,5 ml. Elige una manzana sana y madura. Luego corte la pulpa en 10 x 5 x 1 mm3 tamaño (Figura 1A-1C).
- Coloque las piezas de pulpa de fruta de manzana en un tubo de centrífuga de 1,5 ml que contenga solución enzimática y luego cierre el tubo (Figura 1D).
- Incubar el tubo a 28 °C durante 1 h, agitando a 70 rpm/min en un agitador en la oscuridad.
- Lavar los trozos de pulpa. Aspire toda la solución enzimática y luego agregue 0.5 ml de la solución básica.
- Centrifugadora a 300 x g durante 2 min a temperatura ambiente.
- Para obtener una suspensión de protoplasto, aspire la solución desde la parte inferior del tubo de la centrífuga (Figura 1E).
2. Tinción de fluorescencia de iones de calcio de molécula pequeña
- Prepare la solución de carga Fluo-4/AM con 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 y solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS:80 mM Na2HPO4, 1.36 M NaCI, 20 mM KH2PO4y 26 mM KCI) en una proporción de 1:1:2.
- Añadir 1 μL de solución de carga fluo-4/AM a 99 μL de la suspensión de protoplasto presente en los tubos centrífugos de 1,5 ml. Asegúrese de que la concentración final del colorante fluorescente sea de 5 μM. Mezcle la solución y luego cierre el tubo.
- Tratamiento La3+: Preparar 100 μM La3+ solución con 98 μL de la suspensión protoplasta, 1 μL de 10 mM La3+y 1 μL de solución de carga Fluo-4/AM. Mezcle la solución y cierre el tubo.
- Incubar durante 30 min a 37 °C en la oscuridad.
- Lavar los protoplastos por centrifugación a 300 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Aspire 70 μL de la solución y agregue 70 μL de la solución básica.
- Incubar la suspensión de protoplastos a 37 °C durante 30 min para desesterrificar completamente.
- Aspirar 15 μL de la suspensión del protoplasto y gotear sobre un portaobjetos.
- Observar bajo un microscopio de fluorescencia (Figura suplementaria S1).
NOTA: Utilice una cámara a color con alta sensibilidad, es decir, un sensor CMOS de 3,2 MP (2048 x 1536) con una resolución de píxeles de 3,45 μm. - Seleccione el canal GFP para la obtención de imágenes (20x). Establezca el brillo en 0.5.
NOTA: La iluminación son cubos de luz LED de intensidad ajustable con un conjunto de filtros recubiertos de dureza integrados. La longitud de onda de excitación de Fluo-4/AM es de 490 nm.
3. Ensayo de viabilidad de Protoplast
- Prepare la solución de diacetato de fluoresceína (FDA): Disuelva la FDA en acetona hasta que la concentración final sea de 1 mg / ml.
- Prepare la solución de trabajo de la FDA con 1 μL de la solución de almacenamiento y 99 μL de acetona.
- Añadir 1 μL de solución de trabajo fda a 99 μL de suspensión de protoplastos. Mezcle la solución mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo y luego cierre el tubo.
NOTA: La concentración final de la FDA es de 100 μg/L. - Mancha a temperatura ambiente durante 5 min en la oscuridad.
- Prepare las diapositivas y observe bajo un microscopio de fluorescencia.
- Seleccione el canal GFP para la obtención de imágenes(Figura 1F).
4. Análisis de imágenes
- Analice las imágenes adquiridas utilizando software de análisis de imágenes y hojas de cálculo (por ejemplo, Image-Pro Plus y Excel 2010).
- Seleccione dos diámetros verticales de los protoplastos para calcular la intensidad de fluorescencia (Figura suplementaria S2). Se midió la intensidad de fluorescencia de todos los protoplastos bajo diferentes tratamientos. Para el procesamiento final, utilice el software de edición de fotos.
5. Análisis estadístico
- Realizar análisis estadísticos utilizando software estadístico(Figura suplementaria S3). Los datos se presentan en Media ± SD. Se utilizó la prueba tdel estudiante para analizar las diferencias entre los grupos experimentales.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, utilizamos el método enzimático para obtener protoplastos viables de la pulpa (Figura 1). Algunos protoplastos tenían vacuolas, mientras que otros no. Mientras que los protoplastos no exhibieron fluorescencia cuando el indicador fluorescente Ca2 + no se cargó en ellos. Cuando Fluo-4/AM se cargó en los protoplastos, el citoplasma, pero no la vacuola, se volvió fluorescente (Figura 2). Este resultado indicó que Fluo-4/AM tiñó con éxito Ca2+ en el citoplasma y que no se observó compartimentación24. Los protoplastos se tiñeron con fda durante 5 minutos y mostraron fluorescencia citoplasmática. Esto indicó que la alta temperatura (37 °C) no afecta la viabilidad del protoplasto.
La3+,un agente bloqueador del canal25 de Ca2+,se agregó cuando Fluo-4/AM se cargó en protoplastos. A 100 μM, La3+ disminuyó la intensidad de fluorescencia de calcio (Figura 3).
Figura 1: Protoplastos obtenidos por hidrólisis enzimática. (A) Se cortó un trozo de una manzana madura. (B) Los protoplastos se extrajeron de piezas de pulpa. (C) La pulpa se cortó en 10 × 5 × 1 mm3 piezas. (D) Las piezas de pulpa se colocaron en tubos de centrífuga que contenían una solución enzimática de 0,5 ml. (E) Protoplastos. Las puntas de flecha apuntan al protoplasto, y las flechas indican la vacuola en el protoplasto. (F) Los protoplastos se tiñeron con la FDA durante 5 minutos a temperatura ambiente. (Esta figura ha sido modificada a partir de la referencia 22 [Horticulture research: Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica]. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Carga de Fluo-4/AM y La3+ en los protoplastos. (A) Control: Protoplasto intacto sin ninguna sonda fluorescente cargada. (B) Protoplastos cargados con Fluo-4/AM. (C) La3+ se añadió cuando los protoplastos se cargaron con Fluo-4/AM. La concentración final de La3+ fue de 100 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis estadístico de la intensidad de fluorescencia en los protoplastos. Indicar diferencia significativa según la prueba tde Student (P <0.001). Las barras verticales indican ± SD. Cada punto de datos representa la media de 20 protoplastos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Microscopio de fluorescencia. (A) La apariencia general del microscopio de fluorescencia. (B) Página de configuración. Seleccione el objetivo 20x, el canal GFP y ajuste uniformemente el brillo a 0.5. (C) Región de excitación por fluorescencia. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Pasos utilizados para calcular laintensidad de fluorescencia de Ca2+ en el protoplasto de la célula frutal. Las unidades de intensidad de fluorescencia utilizadas en este estudio se basan en informes anteriores26,27,28,29. El proceso de cálculo es el siguiente: (A) Abra la imagen de fluorescencia del protoplasto en el software. Haga clic en la herramienta Medir. En el menú desplegable, seleccione Línea de perfil. (B) Seleccione Círculo en la ventana Perfil de línea. Usando esto dibuje una elipse en el protoplasto. (C) En la ventana Perfil de línea, seleccione Ahora | Exportar datos (D) Asegúrese de que se abre la hoja de cálculo en blanco e importe los datos haciendo clic en Exportar datos. Utilice la función "promedio" para calcular la intensidad promedio de fluorescencia. Cada tratamiento se repitió tres veces con más de 20 protoplastos cada uno. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Las estadísticas de datos se realizaron utilizando software de análisis estadístico. Pegue los datos en la tabla y haga clic en Analizar para el análisis de datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S4: Extracción de protoplastos de la pulpa de otras variedades de manzanas. (A) Dounan. (B) Miel crujiente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En este estudio, se obtuvieron protoplastos viables por hidrólisis enzimática. Tenga en cuenta que este método requiere manzanas frescas. El presente protocolo permite el aislamiento rápido de un gran número de protoplastos de pulpa de fruta para su uso en estudios de investigación. La aplicabilidad de este método no se limita a 'Fuji'; los protoplastos de la pulpa de manzana de 'Dounan' y 'Honey Crisp' también se pueden extraer a través del mismo protocolo(Figura suplementaria S4). La solución de protoplasto después de la enzimólisis contiene restos celulares, que mejoraron un poco en comparación con los métodos anteriores. Como material celular esencial, los protoplastos de pulpa de manzana se pueden utilizar para la tecnología de expresión de proteínas celulares, la secuenciación de una sola célula y otras investigaciones.
Existen muchos métodos con respecto a la tinción química de reactivos fluorescentes en células vegetales30. Por ejemplo, Fluo-3/AM se cargó a baja temperatura (4 °C), de modo que entraría en las celdas de la punta de la raíz31. Fluo-3/AM también se puede cargar a alta temperatura (37 °C) en el tubo polínico32. Fluo-4/AM se ha cargado con éxito en el tubo polínico de Pyrus pyrifolia (25 °C durante 15 min)18 y en el vello radicular de Arabidopsis (4 °C durante 30 min)33. Sin embargo, estos métodos no son adecuados para teñir protoplastos de pulpa de manzana. En este estudio, cargamos con éxito sondas fluorescentes en protoplastos a alta temperatura (37 °C). Además, el método actual es simple, rápido, preciso y no afecta la vitalidad del protoplasto. Un paso crítico en el método propuesto es lavar los protoplastos teñidos e incubarlos durante 30 minutos. Después de la tinción, los protoplastos deben lavarse. El lavado reducirá la fluorescencia de fondo durante la observación para que la intensidad de fluorescencia de los protoplastos se pueda contar con mayor precisión. Incubar durante 30 minutos para permitir que se carguen más sondas en los protoplastos. Tenga en cuenta que es esencial evitar la exposición a la luz durante la carga.
La3+ es una herramienta importante para estudiar Ca2+. Se une al sitio catalítico Mg2+ en la membrana citoplasmática Ca2+-ATPasa, inhibiendo así el recambio en estado estacionario de Ca2+-ATPasa y bloqueando el funcionamiento transmembrana Ca2+ 34. El tratamiento con La3+ redujo el Ca2+citoplasmático, y Fluo-4/AM podría reflejar este cambio, excluyendo la interferencia de otros cationes divalentes y verificando la viabilidad de los reactivos químicos de fluorescencia.
Aunque este método de carga ofrece más ventajas que otros métodos, aún debe mejorarse aún más en la transformación de los resultados de los datos. Aquí, estimamos el contenido relativo de Ca2+ citoplasmático mediante la detección del valor de fluorescencia de los protoplastos, que son datos cualitativos en lugar de cuantitativos. Por lo tanto, es particularmente importante traducir los resultados de la tinción en un contenido específico de Ca2+ citoplasmático en estudios futuros, lo que podría proporcionar una base de investigación para analizar la señalización de Ca2+ de la fruta.
En resumen, el método descrito en este documento puede detectar Ca2+ citoplasmático en células de pulpa de manzana, proporcionando así soporte técnico para los estudios relacionados de calcio de pulpa de fruta.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Mejora de Variedades Agrícolas de la Provincia de Shandong (2019LZGC007) y el equipo de innovación de árboles frutales del sistema de tecnología de la industria agrícola moderna de Shandong (SDAIT-06-05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
| CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
| Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
| D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
| F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
| FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
| Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
| Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
| Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
| Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |
References
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