Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2, 1,2
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

Summary

Hier beschrijven we de stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor RIBO-seq bij bacteriën. Sequencing van de bibliotheken die volgens deze richtlijnen zijn opgesteld, resulteert in voldoende gegevens voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat we presenteren is eenvoudig, maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en duurt zeven dagen van lysis tot het verkrijgen van bibliotheken.

Abstract

De ribosoomprofileringstechniek (RIBO-seq) is momenteel het meest effectieve hulpmiddel voor het bestuderen van het proces van eiwitsynthese in vivo. Het voordeel van deze methode, in vergelijking met andere benaderingen, is het vermogen om de vertaling te controleren door de positie en het aantal ribosomen op een mRNA-transcript nauwkeurig in kaart te brengen.

In dit artikel beschrijven we de opeenvolgende stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor de RIBO-seq-methode bij bacteriën, waarbij we de details benadrukken die relevant zijn voor de planning en uitvoering van het experiment.

Aangezien de RIBO-seq afhankelijk is van intacte ribosomen en gerelateerde mRNAs, is de belangrijkste stap een snelle remming van de vertaling en adequate desintegratie van cellen. Daarom raden we filtratie en flash-freezing in vloeibare stikstof voor celoogst aan met een optionele voorbehandeling met chlooramfenicol om vertaling in bacteriën te stoppen. Voor de desintegratie stellen we voor bevroren cellen te slijpen met mortel en stamper in aanwezigheid van aluminiumoxide om de celwand mechanisch te verstoren. In dit protocol is sucrosekussen of een sucrose gradiënt ultracentrifugatie voor monose zuivering niet vereist. In plaats daarvan wordt mRNA-scheiding met polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) gevolgd door de ribosomale voetafdruk excisie (28-30 nt-band) toegepast en levert bevredigende resultaten op. Dit vereenvoudigt de methode grotendeels en vermindert de tijd- en uitrustingsvereisten voor de procedure. Voor de voorbereiding van de bibliotheek raden we aan om de in de handel verkrijgbaar kleine RNA-kit voor Illumina-sequencing van New England Biolabs te gebruiken, volgens de richtlijnen van de fabrikant met een zekere mate van optimalisatie.

De resulterende cDNA-bibliotheken bieden de juiste hoeveelheid en kwaliteit die nodig zijn voor de volgende generatie sequencing (NGS). Sequencing van de bibliotheken die volgens het beschreven protocol zijn voorbereid, resulteert in 2 tot 10 mln uniek in kaart gebrachte leespunten per monster die voldoende gegevens opleveren voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat wij presenteren is snel en relatief eenvoudig en kan worden uitgevoerd met standaard laboratoriumapparatuur.

Introduction

De ribosoomprofileringstechniek (RIBO-seq) is ontwikkeld in het laboratorium van Jonathan Weissman aan de Universiteit van Californië, San Francisco1. In vergelijking met andere methoden die worden gebruikt om genexpressie op translationeel niveau te bestuderen, richt RIBO-seq zich op elke ribosoombinding aan mRNA en geeft informatie over de locatie en het relatieve aantal ribosomen op een transcript. Het maakt het mogelijk om het proces van eiwitsynthese in vivo te volgen en kan een enkele codonresolutie en nauwkeurigheid bieden, waardoor de ribosoomdichtheid op zowel het individuele mRNA als langs het hele transcriptoom in de cel kan worden meten. Aan de basis van de RIBO-seq techniek ligt het feit dat het ribosoom tijdens de vertaling het mRNA molecuul bindt en zo het begraven fragment van het transcript beschermt tegen een ribonuclease spijsvertering. Bij toevoeging van de ribonuclease wordt het onbeschermde mRNA verteerd en blijven de fragmenten omsloten door ribosomen - meestal van ~ 28-30 nt lang - intact. Deze fragmenten, ribosomale voetafdrukken (RF) genoemd, kunnen vervolgens worden geïsoleerd, gesequenced en toegewezen aan het transcript waaruit ze afkomstig zijn, wat resulteert in de detectie van de exacte positie van de ribosomen. In feite wordt het ribosoomvermogen om mRNA-fragmenten te beschermen sinds de jaren zestig gebruikt om ribosomale bindings - en vertaalinitiatieplaatsen (TIS)2,3,4te bestuderen . Met de vooruitgang in diepe sequencingtechnologie is RIBO-seq echter een gouden standaard geworden voor vertaalmonitoring5 die, door de ribosoombetrokkenheid, een genoombrede informatie over eiwitsynthese kan bieden6. Ribosoomprofilering vulde de technologische kloof die bestond tussen het kwantificeren van het transcriptoom en het proteoom6.

Om ribosoomprofilering uit te voeren, moeten we celllysaat verkrijgen van het organisme dat onder de onderzochte omstandigheden was gegroeid. Het verstoren van deze omstandigheden tijdens het verzamelen en lyse van cellen kan onbetrouwbare gegevens opleveren. Om dit te voorkomen, worden vaak vertaalremmers, snel oogsten en vlamvriezen in vloeibare stikstof gebruikt. Cellen kunnen worden gelyseerd door cryogene slijping in een mechanische homogenisator zoals een mengmolen7,8 of een kraalklopper9, en door trituratie door een pipet10 of met een naald11. De lysisbuffer kan vlak voor of kort na verpulvering van de cellen worden toegevoegd. In ons protocol gebruiken we vloeibare stikstof om mortel en stamper voor tekoelen, evenals aluminiumoxide als een zachtere benadering van verstoring van de bacteriële celwand, die voorkomt dat RNA-schaar vaak wordt aangetroffen wanneer methoden zoals sonificatie worden toegepast. Na verpulvering voegen we een ijskoude lysisbuffer toe aan de gekoelde inhoud van de mortel. Selectie van een geschikte lysisbuffer is belangrijk voor het verkrijgen van de beste resolutie van ribosomale voetafdrukken. Aangezien de ionische sterkte zowel de RF-grootte als de precisie van het leesframe beïnvloedt, wordt momenteel aanbevolen om lysisbuffers met een lage ionische sterkte en buffercapaciteit te gebruiken, zelfs als blijkt dat de buffersamenstelling geen invloed heeft op de ribosomale bezetting op mRNAs11,12. Belangrijke componenten van de lysisbuffer zijn magnesiumionen, waarvan de aanwezigheid dissociatie van de ribosomale subeenheden voorkomt en spontane conformatieveranderingen in de bacteriële ribosomen11,13remt . Calciumionen spelen ook een belangrijke rol en zijn essentieel voor de activiteit van microkokkennuclease (MNase) die wordt gebruikt in de bacteriële ribosoomprofileringsmethode14. Toevoeging van guanosine 5′-[β,γ-imido]trifosfaat (GMP-PNP), een niet-hydrolyzable analoog van GTP, samen met chlooramfenicol remt de vertaling tijdens lysis15.

Wanneer het lysaat wordt verkregen, wordt het verduidelijkt door centrifugeren en verdeeld in twee porties, elk voor een RIBO-seq en een totale mRNA-sequencing (RNA-seq) met hoge doorvoer, omdat ze tegelijkertijd worden uitgevoerd (figuur 1). RNA-seq biedt een referentiepunt waarmee gegevens van zowel RIBO-seq als RNA-seq tijdens gegevensanalyse kunnen worden vergeleken. Het onderzochte vertaaloom wordt gedefinieerd door normalisatie van ribosomale voetafdrukken naar mRNA-overvloed16. Gegevens van RNA-seq kunnen ook helpen bij het identificeren van kloon- of sequencingartefacten17.

Figure 1
Figuur 1. Schema's van mRNA monstervoorbereiding voor RIBO-seq en RNA-seq. Voor ribo-seq bibliotheekvoorbereiding, wordt RNA verteerd met MNase (A), gevolgd door de grootteselectie van RF van ~28-30 nt lengte (B); voor RNA-seq is RNA geïsoleerd (C), uitgeput van rRNA (D), en het resulterende mRNA wordt willekeurig gefragmenteerd in fragmenten van verschillende lengtes (E). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De eerste stappen van de monstervoorbereidingsprocedure voor RIBO-seq en RNA-seq verschillen enigszins (figuur 1). Voor de ribosomale profilering moet het lysaat worden verteerd door een specifiek endonuclease om de mRNA-moleculen af te voeren die niet door de ribosomen worden beschermd. In standaardprotocollen worden de verkregen monosomen teruggewonnen door een sucrosekussen ultracentrifugatie of een sucrose gradiënt ultracentrifugatie8,14. In dit artikel laten we zien dat deze stap niet nodig is om RF te isoleren die nodig is voor de RIBO-seq in bacteriën, ook voor eukaryotische cellen18, en dat de grootteselectie van de juiste lengte mRNA-fragmenten uit de polyacrylamidegel voldoende is.

Voor RNA-seq wordt mRNA verkregen door de uitputting van rRNA uit het totale RNA - rRNA moleculen hybridiseren naar de biotinylated oligonucleotide sondes die zich binden aan de streptavidin gecoate magnetische kralen. De rRNA-oligonucleotide-kraalcomplexen worden vervolgens met een magneet uit het monster verwijderd , wat resulteert in een rRNA-uitgeput monster19,20. De gezuiverde mRNA-moleculen worden vervolgens willekeurig gefragmenteerd door alkalische hydrolyse. De verkregen fragmenten van mRNA en de ribosomale voetafdrukken worden omgezet in cDNA-bibliotheken en voorbereid op diepe sequencing (figuur 2). Dit omvat eindreparatie die nodig is na alkalische hydrolyse (voor mRNA) en enzymatische vergisting (voor RF): defosforylatie van 3' uiteinden gevolgd door fosforylering van 5' uiteinden. De volgende stappen zijn adapters ligatie en de omgekeerde transcriptie om cDNA-inserts te maken die zijn omlijst door sequenties die nodig zijn voor de volgende generatie sequencing (NGS) met behulp van het Illumina-platform. De laatste fase van de voorbereiding van de bibliotheek is een PCR-reactie waarbij de constructies worden versterkt en geëtiketteerd met monsterspecifieke barcodes om multiplexing en sequencing van verschillende monsters op één kanaal mogelijk te maken. Voor de sequencing worden de kwaliteit en kwantiteit van de bibliotheken beoordeeld door de hooggevoelige DNA-on-chip elektroforese. cDNA-bibliotheken met de juiste parameters kunnen vervolgens worden samengevoegd en gesequenced. Sequencing kan worden uitgevoerd op verschillende Illumina-platforms, zoals MiSeq, NextSeq of HighSeq, afhankelijk van het aantal bibliotheken, de vereiste leeslengte en sequencingdiepte. Na sequencing wordt de bio-informatische analyse uitgevoerd.

Figure 2
Figuur 2. Bibliotheek voorbereiding. Bibliotheekvoorbereiding omvat de eindreparatie, adapters ligatie, omgekeerde transcriptie en versterking met barcodering. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De ribosoomprofilering is een universele methode die eenvoudig kan worden aangepast en aangepast aan de wetenschappelijke vraag. Oorspronkelijk werd het gebruikt in gist1, maar kort daarna werd het toegepast op bacteriële cellen21 evenals eukaryotische modelorganismen, waaronder muis10, zebravis22, fruitvlieg23 en Arabidopsis thaliana24. Het werd ook gebruikt voor het bestuderen van verschillende ribosoomtypen: cytoplasmatisch, mitochondriaal25,26 en chloroplast27,28. In eukaryoten wordt RIBO-seq gewoonlijk aangepast en verfijnd om specifieke aspecten van vertaling te onderzoeken, waaronder initiatie10,11,29,30,31,32, verlenging1,10,11,31,33, ribosoomstalling 33 en exterieurverandering33. De meeste wijzigingen betreffen het gebruik van verschillende vertaalremmers. Bij bacteriën zijn analoge studies echter moeilijk uit te voeren vanwege het gebrek aan remmers met het vereiste werkingsmechanisme34. De meest gebruikte vertaalremmer bij bacteriën is chlooramfenicol (CAM) dat zich bindt aan het peptidyltransferasecentrum (PTC) en de juiste positionering van het aminoacyl-tRNA in de A-site voorkomt. Als gevolg hiervan voorkomt CAM de vorming van een peptidebinding die leidt tot het arresteren van de langwerpige ribosomen35. Andere voorbeelden van vertaalremmers bij bacteriën zijn tetracycline (TET)36, retapamulin (RET)34 en Onc11237 die zijn gebruikt om vertaalinitiatieplaatsen te onderzoeken. TET, dat de toediening van tRNA aan het ribosoom voorkomt door direct te overlappen met de anticodonstamlus van tRNA op de A-site, werd oorspronkelijk toegepast om de resultaten van de CAM-behandeling te verifiëren, omdat het beide antibiotica zijn die de verlenging van de vertaling remmen38. TET bleek primaire TIS te detecteren, maar kon interne TIS36niet onthullen . RET bindt in de PTC van het bacteriële ribosoom en voorkomt de vorming van de eerste peptidebinding door te interfereren met een elongator aminoacyl-tRNA in de A-site. Het toepassen van RET resulteert in ribosomen arrestatie op zowel primaire als interne TISs34. Onc112, een proline-rijk antimicrobieel peptide, bindt in de uitgangstunnel en blokkeert aminoacyl-tRNA binding in de ribosomale A-site. Als gevolg hiervan voorkomt Onc112 dat initiatiecomplexen de verlengingsfase37ingaan .

De belangrijkste informatie die ribosoomprofilering biedt, is de ribosomdichtheid en hun positie op het mRNA. Het werd met succes toegepast om differentiële genexpressie op het niveau van vertaling te onderzoeken in verschillende groeiomstandigheden1,6, translationele efficiëntie1,38,39 te meten en vertaalregelgebeurtenissen zoals ribosomale pauze10te detecteren . RIBO-seq maakt het ook mogelijk om de vertaling van geannoteerde ncRNA, pseudogenen en ongeannoteerde kleine open leeskaders (ORF) te ontdekken die leiden tot de identificatie van nieuwe en/of zeer korte eiwitcoderingsgenen10,12,22,30,37. In dergelijke gevallen kan RIBO-seq de annotatie van het genoom verfijnen en verbeteren. Met zijn hoge gevoeligheid voor de identificatie van vertaalde ORF 's en zijn kwantitatieve aard kan ribosoomprofilering ook dienen als proxy voor de proteoombepaling of bij het helpen van proteomicsstudies31,34,39. Door TIS in kaart te brengen, onthult ribosoomprofilering N-terminaal verlengde en afgeknotte isovormen van bekende eiwitten10,32. RIBO-seq werd ook aangepast om co-translationele vouwen van eiwitten14,21,24 te bestuderen. Deze methode maakt het meten van reksnelheden1,10,39 of decoderingssnelheden van individuele codons6 mogelijk en helpt bij het ontwikkelen van kwantitatieve vertaalmodellen17. De ribosoomprofileringsmethode is ook in staat om mechanistische inzichten te geven in de ribosoomonderbreking bij bacteriën7,15,17, frameshifting40, stop-codon readthrough21, beëindiging / recyclingdefecten41,42 en ribosomale conformatieveranderingen33 bij eukaryoten. RIBO-seq werd ook aangepast om het effect van specifieke trans-acterende factoren op vertalingen zoals miRNAs6 en RNA-bindende eiwitten in eukaryoten16,43teonderzoeken . Het is echter belangrijk om te erkennen dat het experimentele ontwerp en de verkregen resolutie van RIBO-seq bepalend zijn voor de hoeveelheid informatie die kan worden geëxtraheerd uit de resulterende sequencinggegevens12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Monsterverzameling

  1. Bereid een bacteriecultuur voor. Wij adviseren een kweekvolume van 100 ml per monster.
  2. Bereid apparatuur en reagentia voor het verzamelen van monsters: twee scoopula's per monster, steriele 0,45 μm gemengde cellulose-esters membraanfilters (MCE), 50 ml steriele buizen, vloeibare stikstof, 50 mg/ml chlooramfenicol in 70% (vol/vol) ethanol (optioneel). Prik het deksel van 50 ml buizen door om verdamping van vloeibare stikstof mogelijk te maken en de explosie van gesloten buizen te voorkomen. Decontaminaat scoopula's met laboratoriumwasmiddel en 70% ethanol.
  3. Verwarm de filterapparatuur en een van de scoopula's voor op de groeitemperatuur van de bacteriecultuur.
    OPMERKING: Wij adviseren een volledig glazen filterapparaat met een trechter, een fritted base, een gemalen voegkolf en een 47 mm Ø veerklem.
  4. Voeg vóór het oogsten van het monster chlooramfenicol toe aan de bacteriekweek tot de uiteindelijke concentratie van 100 μg/ml en incubeer 1 minuut (optioneel).
  5. Giet vloeibare stikstof in een steriele buis van 50 ml en plaats de tweede scoopula in de buis om af te koelen.
    voorzichtigheid! Vloeibare stikstof kan ervoor zorgen dat gesloten containers exploderen als gevolg van de drukverandering bij verdamping. Om dit te voorkomen, is het noodzakelijk om een paar gaten in het deksel van buizen van 50 ml te maken om vloeibare stikstofverdamping mogelijk te maken.
  6. Verzamel cellen door filtratie. Stop met filteren wanneer het medium door het membraan is gegaan, maar laat het filter niet volledig drogen.
  7. Verzamel bacteriële pellets door de cellen snel van de filterschijf te schrapen met behulp van een voorverwarmde scoopula. Plaats onmiddellijk de hele scoopula met de geoogste cellen in de 50 ml buis gevuld met vloeibare stikstof. De geoogste pellet moet volledig bedekt zijn met vloeibare stikstof.
  8. Laat de pellet goed invriezen en verwijder bevroren cellen met behulp van een eerder afgekoelde tweede scoopula. Sluit het doorboorde deksel en breng de buis over op -80°C. STOP-punt
    OPMERKING: Desinfecteer scoopula's na elke monsteroogst.

2. Cellysis

  1. Bereid 0,1 M GMP-PNP in 10 mM Tris pH 8, DNase I en 1,5 ml reactiebuizen voor op lysaten en houd ze op ijs. Koel de centrifuge af tot 4 °C.
  2. Bereid de lysisbuffer voor (20 mM TRIS pH 7,6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-mercaptoethanol, 5 mM CaCl2 en optioneel 1 mM chlooramfenicol). Aliquot 500 μL van de lysisbuffer per monster in 1,5 ml reactiebuizen en plaats ze op ijs.
  3. Ontsmet mortel en stamper met een laboratoriumwasmiddel en 70% ethanol en droog ze. Koel mortel en stamper door vloeibare stikstof in de mortel te gieten.
  4. Breng bevroren pellet over in de voorgekoelde mortel en maal deze tot een poeder. Voeg met een spatel ongeveer 1 volume aluminiumoxide toe en blijf malen. Houd mortel, stamper en cellen koel door indien nodig vloeibare stikstof te gieten, laat de inhoud van de mortel niet ontdooien.
  5. Voeg vlak voor het gebruik van de lysisbuffer GMP-PNP en DNase I toe aan de lysisbuffer aliquot tot de uiteindelijke concentratie van respectievelijk 2 mM en 100 U/ml. Breng de oplossing over in de mortel met cellen en aluminiumoxide en blijf malen. Laat het lysaat langzaam ontdooien tijdens het malen en breng het mengsel over in de voorgekoelde reactiebuis van 1,5 ml en plaats het onmiddellijk op ijs.
  6. Centrifugeer lysaten bij 20 000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng supernatanten over in nieuwe, voorgekoelde reactiebuizen van 1,5 ml en houd ze op ijs.
  7. Meet de RNA-concentratie in elk monster met een NanoDrop. Gebruik 1:10 verdunningen van monsters en 1:10 verdunning van de lysisbuffer in nucleasevrij water als blanco.
    OPMERKING: Houd er rekening mee dat chlooramfenicol een significante absorptie vertoont bij 260 nm.
  8. Verdeel elk lysaat in twee porties: één voor RIBO-seq (0,5 - 1 mg RNA) en de tweede voor RNA-seq (de rest).
  9. Reinig de monsters voor RNA-seq met behulp van een in de handel verkrijgde RNA-opruimset volgens het protocol van de fabrikant.
    OPMERKING: We raden aan om de Zymo RNA Clean & Concentrate -25 kit te gebruiken (zie tabel met materialen). We raden ook aan om 4,5 volumes ethanol (in vergelijking met monstervolume) toe te voegen aan de mix van monster en bindingsbuffer voor ribosomale voetafdrukken en gefragmenteerd mRNA, om de zuiveringsefficiëntie van korte RNA-fragmenten te verhogen.
  10. Bewaar de voor RNA-seq bestemde monsters bij -80 °C. De procedure voor RNA-seq gaat verder vanaf stap 5.

3. MNase vergisting van monsters voor RIBO-seq

  1. Voeg aan 1 mg RNA 3,8 μL 187,5 U/μL MNase toe in 10 mM Tris pH 8 en vul deze aan met een lysisbuffer tot het totale volume van 500 μL.
  2. Incubeer bij 25 °C, 300 RPM, gedurende 45 minuten in een thermomixer.
  3. Reinig de monsters met een in de handel verkrijg beschikbare RNA-opruimset (zoals in stap 2.9).
  4. Bewaar de monsters voor RIBO-seq bij -80 °C (STOP-punt) of ga verder met de maatkeuze.

4. Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) en grootte selectie van monsters voor RIBO-seq

  1. Bereid een 15% polyacrylamide-TBE gel met 8 M ureum en plaats deze in een tank met TBE buffer. Voorloop gedurende minimaal 10 minuten bij een constante spanning van 200 V.
  2. Meng monsters met TBE-Ureum Sample Buffer, denature op 95 °C gedurende 1 minuut en leg ze onmiddellijk op ijs.
  3. Was het ureum uit door de TBE-buffer met een spuit in gelputten te injecteren. Laad de monsters en laat één putruimte tussen hen over om elk monster te scheiden en kruisbesmetting te voorkomen. Gebruik 29 nt oligonucleotide en een mix van 26 nt en 32 nt oligonucleotiden als markers. Voer elektroforese uit bij een constante spanning van 180 V.
  4. Bereid steriele buffer voor op nachtelijke incubatie (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Bevlek de gel na elektroforese ongeveer 2-3 minuten in een SYBR Gold-bad en spoel de gel af met nucleasevrij water.
  6. Verwijder de gelfragmenten tussen 26 en 32 nt met de steriele naalden of de scheermesjes en plaats de gelfragmenten in afzonderlijke buizen van 1,5 ml voor elk monster. Vervang de naald of het scheermesje tussen de monsters.
  7. Voeg 200 μL van de nachtelijke incubatiebuffer toe aan elke reactiebuis.
  8. Incubeer de monsters 's nachts bij 10 °C, 1000 RPM in een thermomixer.
  9. Reinig de volgende dag de monsters zoals in stap 2.9. Elute de voetafdrukken in 80 μL nucleasevrij water.
  10. Bewaar de monsters bij -80 °C. STOP-punt. De procedure voor RIBO-seq wordt voortgezet vanaf stap 7.

5. Zuivering van bacterieel mRNA door rRNA-uitputting uit monsters voor RNA-seq

  1. Verwijder rRNA uit monsters met een bacteriële mRNA-zuiveringskit (bijv. Invitrogen MICROBExpress). Volg het protocol van de fabrikant.
  2. Reinig de monsters zoals in stap 2.9. Elute het mRNA in 50 μL nucleasevrij water.
  3. Bewaar de monsters voor RNA-seq bij -80 °C (STOP-punt) of ga door met alkalische fragmentatie.

6. Alkalische fragmentatie van monsters voor RNA-seq

  1. Bereid alkalische hydrolysebuffer voor (meng 220 μL van 0,1 M NaHCO3, 30 μL van 0,1 M Na2CO3 en 1 μL van 0,5 M EDTA). Meng 1 volume (50 μL) alkalische buffer met 1 volume (50 μL) van het monster en incubeer gedurende 25 minuten bij 95 °C.
  2. Voeg 5 μL 3 M NaOAc pH 5,5 toe om de reactie te stoppen.
  3. Reinig de monsters zoals in stap 2.9 en ontsmaak de monsters in 80 μL nucleasevrij water.
  4. Mogelijk STOP-punt: bewaar RNA-seq monsters bij -80 °C. We raden echter aan om direct naar stap 7 te gaan om onnodig bevriezen en ontdooien te voorkomen.

7. Defosforylatie en fosforylering van monsters voor zowel RNA- als RIBO-seq

  1. Voeg 10 μL 10x reactiebuffer PNK en 5 μL T4 PNK toe aan elk monster. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 °C om de 3'-uiteinden te defosforyleren.
  2. Voeg 3 μL atp van 1 mM toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C om de uiteinden van 5' te fosforyleren.
  3. Reinig de monsters zoals in stap 2.9, elute in 30 μL nucleasevrij water.
  4. Bewaar de monsters bij -80 °C. STOP-punt.

8. Bibliotheekvoorbereiding met behulp van NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set voor Illumina

  1. Bereid 100-1000 ng input RNA (verkregen mRNA-fragmenten en ribosomale voetafdrukken) in 6 μL nucleasevrij water en voeg 1 μL 3' SR Adapter toe. Incubeer volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Voeg 10 μL 3' Ligatiereactiebuffer (2X) en 3 μL 3' Ligation Enzyme Mix toe en incubeer gedurende 2,5 uur bij 37 °C, in plaats van 1 uur bij 25 °C zoals het protocol van de fabrikant aangeeft.
  3. Hybridiseer de Reverse Transcription Primer volgens het protocol van de fabrikant met een aangepast programma: 5 minuten bij 75 °C, 30 minuten bij 37 °C en vasthouden bij 4 °C.
  4. Ligateer de 5' SR Adapter. Volg het protocol van de fabrikant met één wijziging: voer de incubatie uit bij 37 °C gedurende 2,5 uur, in plaats van 1 uur bij 25 °C.
  5. Voer reverse transcriptie uit volgens het protocol van de fabrikant.
  6. Mogelijk STOP-punt: incubeer de monsters met gesynthetiseerde cDNAs bij 70 °C gedurende 15 minuten om de reverse transcriptase te inactiveren en op te slaan bij -80 °C. We raden echter aan om direct door te gaan naar de volgende stappen om onnodig bevriezen en ontdooien van de monsters te voorkomen.
  7. Bewaar de helft van elke cDNA-bibliotheek bij -80 °C als back-up.
  8. Voer PCR-versterking uit volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik de helft van de reactiemix. Bewaar de verkregen bibliotheken op -80 °C. STOP-punt.

9. Grootteselectie van cDNA-bibliotheken met PAGE

  1. Bereid 6% polyacrylamide-TBE gel en plaats deze in een tank met TBE buffer. Voorloop gedurende minimaal 10 minuten bij een constante spanning van 200 V.
  2. Meng de monsters met Gel Loading Dye, Blue (6X) en laad ze op de gel. Gebruik Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest als ladder. Voer in het begin elektroforese uit bij een constante spanning van 120 V om DNA in de gel te laten komen en verander vervolgens de spanning naar 180 V.
  3. Wanneer de elektroforese is voltooid, bevlekt u de gel ongeveer 2-3 minuten in een SYBR Gold-bad en spoelt u de gel af met nucleasevrij water.
  4. Accijnsgelfragmenten met de bibliotheken. Voor RNA-seq monsters accijns tussen 135-180 nt en voor RIBO-seq tussen 135-170 nt. Gebruik steriele naald of scheermes en plaats de gelfragmenten in afzonderlijke reactiebuizen van 1,5 ml. Vergeet niet om de naald of het scheermesje tussen de monsters te vervangen.
    OPMERKING: De adapters en barcode van NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set voor Illumina hebben in totaal 119 nt, wat de lagere excisie-cut-off bepaalt.
  5. Voeg 100 μL nucleasevrij water toe aan elk gelfragment.
  6. Incubeer de gelfragmenten 's nachts bij 10 °C, 450 RPM in een thermomixer.
  7. Reinig en concentreer de cDNA-bibliotheken met een commerciële DNA-opruimkit volgens het protocol van de fabrikant.
    OPMERKING: We raden aan om de Zymo DNA Clean & Concentrate -5 kit te gebruiken (zie materiaaltabel).
  8. Bewaar gezuiverde cDNA-bibliotheken bij -80 °C. STOP-punt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De hier gepresenteerde voorbeeldige resultaten werden verkregen in een studie die vertaalregulatie in sporulerende WT Bacillus-subtiliscellen onderzocht. Nachtculturen werden verdund tot OD600 gelijk aan 0,1 in 100 ml rijk medium en geïncubeerd bij 37 °C met krachtig schudden tot OD600 0,5-0,6 bereikte. Het rijke medium werd vervolgens vervangen door een minimaal medium om het sporulatieproces te induceren en de incubatie werd tot vier uur voortgezet. Cellen werden elk uur geoogst, te beginnen met T0 - sporulatie-inductie - wat resulteerde in vijf tijdpunten. Een minuut voor de oogst werden de culturen behandeld met chlooramfenicol zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Cellen werden verzameld door filtratie in een voorverwarmd glasfiltratiesysteem met behulp van 0,45 μm gemengde cellulose-estersmembraanfilters (MCE) en flash-frozen in vloeibare stikstof.

De hoeveelheid ribonucleïnezuur verkregen in het lysaat hangt af van groeiomstandigheden, kweekvolume en dichtheid. Volgens ons protocol levert 100 ml van de bacteriecultuur (Bacillus subtilis) gemiddeld 1-4 mg RNA op. Voorbeelden van lysaten verkregen uit het hierboven beschreven experiment zijn weergegeven in tabel 1.

RNA-concentratie [ng/μL] RNA-hoeveelheid [mg] A260/A280 A260/A230
WT0 5845 3.21 1.57 0.83
WT1 6275 3.45 1.58 0.79
WT2 3525 1.94 1.38 0.56
WT3 3717 2.04 1.37 0.61
WT4 1653 0.91 1.11 0.43

Tabel 1. RNA-concentratie en -hoeveelheid in representatieve monsters van B. subtilislysaten. De tabel bevat monsters van het wilde type (WT) B. subtilis die vóór de sporulatie-inductie (0) en één uur (1), twee (2), drie (3) of vier (4) uur na sporulatie-inductie zijn geoogst. Lysis werd uitgevoerd met 550 μL lysisbuffer die chlooramfenicol bevatte. Het valt op dat naarmate de sporulatie vordert, de hoeveelheid verkregen RNA afneemt.

Wanneer de hoeveelheid RNA lager is dan 1 mg, wordt 0,25 mg RNA gebruikt voor RIBO-seq in plaats van 1-0,5 mg en wordt de hoeveelheid MNase vervolgens respectievelijk aangepast. De representatieve hoeveelheid RNA en concentratie na nucleasevertering is weergegeven in tabel 2. De gemiddelde hoeveelheid RNA na vertering en reiniging is 50 μg van 0,5 mg RNA-input.

RNA-concentratie [ng/μL] RNA-hoeveelheid [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-R 1015 50.75 2.12 1.84
WT1-R 1157.4 57.87 2.10 2.19
WT2-R 847.2 42.36 2.10 2.00
WT3-R 983.6 49.18 2.09 2.16
WT4-R 206 10.30 2.13 1.00

Tabel 2. De hoeveelheid en concentratie RNA na nucleasevertering van de representatieve monsters voor RIBO-seq. De tabel bevat monsters van het wilde type (WT) B. subtilis die vóór sporulatie-inductie (0) en één uur (1), twee (2), drie (3) of vier (4) uur na sporulatie-inductie zijn geoogst; de letter "R" verwijst naar monsters voor RIBO-seq. Omdat de RNA-concentratie van het WT4-R-monster laag was, werd 0,25 mg RNA verteerd, terwijl 0,5 mg van het RNA voor de resterende monsters werd gebruikt voor het genereren van ribosomale voetafdrukken. De hoeveelheid MNase voor de spijsvertering was 178,125 U voor 0,25 mg RNA in WT4-R en 356,25 U voor 0,5 mg RNA in andere monsters. Na de vergisting werden de monsters gereinigd met de commerciële RNA clean-up kit en werd de ribonucleïnezuurconcentratie gemeten met de NanoDrop.

Na de MNase-spijsvertering wordt de grootteselectie uitgevoerd met behulp van PAGE. Een voorbeeld van een 15% TBE-ureum polyacrylamide gel met de verteerde monsters is weergegeven in figuur 3. Fragmenten van gel tussen 26 en 32 nt werden met een steriel scheermesje verwijderd en 's nachts in de nachtelijke incubatiebuffer geïncubeerd. De volgende dag werden ribosomale voetafdrukken schoongemaakt met de commerciële RNA-opruimkit.

Figure 3
Figuur 3. 15% TBE-ureum polyacrylamide gel met representatieve monsters na MNase spijsvertering. De figuur omvat monsters van het wilde type (WT) B. subtilis die zijn geoogst vóór sporulatie-inductie (0) en één uur (1), twee (2), drie (3) of vier (4) uur na sporulatie-inductie; de letter "R" verwijst naar monsters voor RIBO-seq. 15 μL gedenatureerde monsters werden in de gelputten geladen in volgorde: WT2-R, WT3-R, WT4-R, WT0-R, WT1-R en het resterende volume werd opgeslagen bij -80 °C als back-up. 29 nt oligonucleotide en een mengsel van 26 nt en 32 nt oligonucleotiden werden als markers gebruikt. Elektroforese werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven en de gel werd gekleurd in een SYBR Gold-bad. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Parallel aan de nucleasevertering werden de lysaten voor RNA-seq gereinigd met de commerciële RNA-opruimset en werden de verkregen concentraties RNA gemeten met NanoDrop. De representatieve resultaten zijn weergegeven in tabel 3. Na reiniging daalde de hoeveelheid ribonucleïnezuur tot 40-500 μg.

RNA-concentratie [ng/μL] RNA-hoeveelheid [μg] A260/A280 A260/A230
WT0-m 10274.1 513.70 2.14 2.35
WT1-m 10118.3 505.92 2.12 2.33
WT2-m 5599.7 279.98 2.15 2.29
WT3-m 6562.2 328.11 2.08 2.31
WT4-m 757 37.85 2.01 1.95

Tabel 3. RNA-hoeveelheid en concentratie van monsters voor RNA-seq na RNA-zuivering. De tabel bevat monsters van het wilde type (WT) B. subtilis die vóór sporulatie-inductie (0) en één uur (1), twee (2), drie (3) of vier (4) uur na sporulatie-inductie zijn geoogst; de letter "m" verwijst naar monsters voor RNA-seq (mRNA).

De verkregen RNA-concentraties van de monsters voor RNA-seq werden gebruikt om RNA-input voor rRNA-depletie te definiëren. 8 μg RNA uit elk RNA-seq-monster werd gebruikt met MICROBExpress bacteriële mRNA-zuiveringskit (zie tabel met materialen)volgens het protocol van de fabrikant en werd daarna gereinigd met de commerciële RNA-opruimkit. De representatieve resultaten van rRNA-uitputting zijn weergegeven in tabel 4.

RNA-concentratie [ng/μL] A260/A280 A260/A230 RNA-hoeveelheid [μg]
WT0-m 62.7 1.99 1.75 3.1
WT1-m 59.3 2.00 2.16 2.9
WT2-m 93.7 1.97 1.69 4.7
WT3-m 68.3 1.99 2.33 3.4
WT4-m 85.0 1.97 2.00 4.2

Tabel 4. De representatieve RNA-hoeveelheid en concentratie na rRNA-uitputting. De tabel bevat monsters van het wilde type (WT) B. subtilis die vóór sporulatie-inductie (0) en één uur (1), twee (2), drie (3) of vier (4) uur na sporulatie-inductie zijn geoogst; de letter "m" verwijst naar monsters voor RNA-seq. 8 μg RNA uit monsters voor RNA-seq werden gebruikt voor rRNA-uitputting en daarna gereinigd met een commerciële RNA-opruimset.

Vervolgens werd het verkregen mRNA gefragmenteerd door alkalische hydrolyse en gereinigd met een commerciële kit zoals beschreven in het protocol. De gefragmenteerde mRNA- en ribosomale voetafdrukken werden gedefosforyleerd aan de uiteinden van 3' en gefosforyleerd aan de uiteinden van 5' volgens het bovenstaande protocol. De monsters werden vervolgens gebruikt om cDNA-bibliotheken te bouwen voor Illumina-sequencing, zoals beschreven in het protocol. Figuur 4 toont een voorbeeld van een 6% polyacrylamide gel met de verkregen bibliotheken. Gelfragmenten in het bereik van 135-180 nt voor RNA-seq en 135-170 nt voor RIBO-seq werden verwijderd met steriele scheermesjes en 's nachts geïncubeerd in nucleasevrij water. Bibliotheken werden gereinigd met een commerciële DNA-opruimset en kwaliteit en kwantiteit werden beoordeeld door een hooggevoelige DNA-on-chip elektroforese met behulp van de Agilent 2100 Bioanalyzer.

Figure 4
Figuur 4. 6% polyacrylamide gel van cDNA bibliotheken voor en na grootte selectie. Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest werd gebruikt als ladder. 25 μL monsters werden in de volgende volgorde in de gel geladen: drie RIBO-seq-bibliotheken en zes RNA-seq-bibliotheken. De resterende hoeveelheden monsters werden opgeslagen bij -80 °C als back-up. Het cijfer omvat monsters van het wilde type (WT) B. subtilis die één uur (1), twee (2), drie (3) of vier (4) uur na sporulatie-inductie zijn geoogst; de letter "R" verwijst naar monsters voor RIBO-seq en de letter "m" verwijst naar monsters voor RNA-seq. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De voorbeelden van virtuele gelafbeeldingen en elektroferogrammen verkregen uit de Agilent 2100 Bioanalyzer zijn weergegeven in figuur 5. Banden en pieken die de RIBO-seq-bibliotheken vertegenwoordigen, zijn smaller en beter gedefinieerd in vergelijking met deze die RNA-seq-bibliotheken vertegenwoordigen. Volgens de on-chip elektroforese zijn bibliotheken ongeveer 150 bp lang, wat een verwachte bibliotheekgrootte is. De adapters en de barcode die worden gebruikt bij de voorbereiding van de bibliotheek zijn 119 nt lang en de inserts zijn ofwel 29-30 nt lang (voor RIBO-seq) of in een bereik tussen 25 en 50 nt (voor RNA-seq). De extra pieken dichter bij de 200 bp verkregen uit RIBO-seq bibliotheken kunnen wijzen op PCR-artefacten die kunnen worden weggegooid tijdens bioinformatische analyse wanneer de gegevens verkregen uit sequencing worden bijgesneden en rRNA/tRNA wordt gefilterd. De gemiddelde hoeveelheid DNA is 32 ng en levert voldoende hoeveelheid materiaal die nodig is voor de volgende generatie sequencing.

Figure 5
Figuur 5. De voorbeelden van elektroferogrammen en virtuele gelbeelden van een hooggevoelig DNA on-chip elektroforese. De figuur omvat monsters van het wilde type (WT) B. subtilis die zijn geoogst vóór sporulatie-inductie (0) en één uur (1), twee (2), drie (3) of vier (4) uur na sporulatie-inductie; de letter "R" verwijst naar RIBO-seq bibliotheken en de letter "m" verwijst naar RNA-seq bibliotheken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Na kwaliteitscontrole door de on-chip elektroforese werden bibliotheken samengevoegd voor single-end 50 bp sequencing op het Illumina's NextSeq500 platform (10 bibliotheken per kanaal, met een minimum van 350 mln leest per kanaal). Sequencing leverde 30-57 miljoen reads per sample op voor RNA-seq bibliotheken en 30-50 miljoen reads per sample voor RIBO-seq bibliotheken. Het trimmen van de adapters en sequenties van slechte kwaliteit resulteerde in 24-47 mln aflezingen per monster voor RNA-seq monsters en 25-50 mln aflezingen per monster voor RIBO-seq monsters. Mapping, uitgevoerd met STAR44,leverde 2,4-9,6 miljoen uniek in kaart gebrachte leesingen per monster op voor RNA-seq-monsters (die 8-16,8% van het totale aantal leeservaringen vormen) en 2,3-10,4 miljoen uniek in kaart gebrachte leeservaringen (7,7-22,1%) voor RIBO-seq monsters. De verkregen gegevens werden gecontroleerd op kwaliteitscontrole met FastQC45. Voorbeelden van de kwaliteitspercelen die FastQC voor de bijgesneden reeksen heeft geproduceerd , zijn weergegeven in figuur 6. De sequenties van de lengte van de interesse, die <32 nt voor RIBO-seq en <50 nt voor RNA-seq, presenteerden een zeer goede kwaliteit. De voorbeelden van plots van GC-gehalte en verdelingen van reekslengten over alle bijgesneden sequenties zijn weergegeven in figuur 7. De extra piek van 72% in gc-distributieplot van ribo-seq-bibliotheek kan mogelijk wijzen op rRNA-verontreiniging die tijdens bioinformatische analyse kan worden verwijderd door rRNA-filtratie46,47,48. De verdeling van de sequentielengtes is zeer smal voor RIBO-seq-bibliotheken, met een piek van 26-27 nt, terwijl de lengteverdeling voor RNA-seq-bibliotheken breder is en varieert tussen 15 en 50 nt.

Figure 6
Figuur 6. De voorbeelden van box-and-whisker plots van kwaliteitsscores op alle basissen voor RIBO-seq en RNA-seq bibliotheken na trimmen. De figuur omvat monsters van het wilde type (WT) B. subtilis die werden geoogst vóór sporulatie-inductie (0) en vier (4) uur na sporulatie-inductie; de letter "R" verwijst naar RIBO-seq monsters en de letter "m" verwijst naar RNA-seq samples. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 7
Figuur 7. De voorbeelden van plots van GC-inhoud en sequentielengteverdeling van alle sequenties voor RIBO-seq- en RNA-seq-bibliotheken na het bijsnijden. De figuur toont monsters van het wilde type (WT) B. subtilis die vier (4) uur na sporulatie-inductie zijn geoogst; de letter "R" verwijst naar monster voor RIBO-seq en de letter "m" verwijst naar monster voor RNA-seq. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Om te controleren of de RIBO-seq-gegevens informatie bieden over echte ribosomale voetafdrukken in plaats van willekeurige mRNA-fragmenten van de geselecteerde lengte, hebben we sequencinggegevens van RIBO-seq en RNA-seq vergeleken met RiboToolkit, een webserver voor RIBO-seq-gegevensanalyse49. Ribo-seq-gegevens vertonen een triplet periodiciteit en een hoge, smalle piek die overeenkomt met de initiërende ribosomen en het kenmerk van de RF zoals weergegeven in figuur 8A, die niet wordt waargenomen in de RNA-seq-gegevens (Figuur 8B). Bovendien onthulde het metagene-plot met de profielen van de gemiddelde dekking van RF- en mRNA-fragmenten op de coderingssequenties (CDS'en) een hoger percentage leesingen dat zoals verwacht aan de CDS'en in de RIBO-seq-dataset (figuur 8C) was toegewezen.

Figure 8
Figuur 8. Metagene periodiciteitsplots en gemiddelde dekking van RF- en mRNA-fragmenten op CDSs. Metagene profielen werden verkregen met RiboToolkit, een geïntegreerde webserver49. De lengte van CDS werd genormaliseerd tot een waarde van 1 en elke CDS werd verdeeld in 100 gelijke bakken. De figuur toont monsters van het wilde type (WT) B. subtilis die één (1) uur na sporulatie-inductie zijn geoogst; de letter "R" verwijst naar monster voor RIBO-seq en de letter "m" verwijst naar monster voor RNA-seq. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Om te vergelijken of het hier gepresenteerde RIBO-seq-protocol resultaten oplevert die vergelijkbaar zijn met die verkregen door standaardmethode voor RF-herstel (sucrose gradient ultracentrifugation), hebben we de sequencingresultaten van bibliotheken die volgens de twee methoden zijn voorbereid, parallel getrokken. De experimenten die de vertaalregulatie tijdens sporulatie in de WT B. subtilis onderzochten, werden uitgevoerd volgens het gepresenteerde RIBO-seq-protocol, evenals volgens het standaardprotocol dat monosomenherstel door een sucrose gradiënt ultracentrifugatie omvat. De resultaten van ribosoomdekkingsprofielen verkregen uit de twee experimenten zijn weergegeven in figuur 9. De visualisatie van in kaart gebrachte BF's lijkt sterk op elkaar tussen de twee experimenten en leverde vergelijkbare resultaten op bij bio-informatische analyse.

Figure 9
Figuur 9. De visualisatie van verkregen RF in kaart gebracht op het genoom. Het cijfer omvat RF verkregen uit wilde type B. subtilis geoogst vier uur na sporulatie inductie en bereid volgens het standaard protocol (WT4-R-s, bovenste paneel) of het gepresenteerde protocol (WT4-R, onderste paneel). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De belangrijkste technische uitdaging van de ribosoomprofilering is de noodzaak om de vertaling snel te remmen om een momentopname van ribosomen op mRNAs in een bepaalde fysiologische staat van belang vast te leggen. Om dit te bereiken, worden vertaalremmers, snel oogsten en vlamvriezen in vloeibare stikstof vaak gebruikt. Het toepassen van antibiotica is optioneel omdat ze artefacten kunnen veroorzaken. Chlooramfenicol is een veelgebruikt medicijn om langwerpige ribosomen in bacteriële RIBO-seq te arresteren. Het belet echter niet dat de initiatie wordt gestart, wat resulteert in een opeenhoping van ribosomen ongeveer zes codons stroomafwaarts van de plaats van inleiding tot de vertaling14. Bovendien kan het vermogen om de peptidyltransferasereactie te remmen afhankelijk zijn van de aard van de ribosomale P- en A-site substraten. Vermoedelijk arresteert CAM ribosomen effectiever met Gly, Ala, Ser, Cys of Thr als voorlaatste aminozuur van het ontluikende peptide17,38,50. Dit is de moeite waard om in overweging te nemen bij experimenteel ontwerp en bio-informatische analyse, vooral bij het bestuderen van ribosomale pauze17. Het is ook aangetoond dat CAM de translationele nauwkeurigheid beïnvloedt door een stop codon readthrough en frameshifting51te bevorderen. Toch is CAM-remming relatief snel en voldoende voor typisch RIBO-seq-onderzoek14 en veroorzaakt het geen verkeerde incorporatie51. Sommige van de artefacten veroorzaakt door antibiotica kunnen worden vermeden door de hoeveelheid van het medicijn te verhogen9. CAM-concentratie toegepast in ons protocol is de typische hoeveelheid die wordt gebruikt in RIBO-seq-experimenten7,14,21, maar de concentratie kan variëren voor verschillende micro-organismen en moet worden geoptimaliseerd voordat het monster wordt geoogst. Vanwege de mogelijkheid van het optreden van artefacten veroorzaakt door het toepassen van vertaalremmers, wordt aanbevolen om de behandeling van de remmer te vermijden als dit niet nodig is voor de onderzoeksvraag en als de snelle oogst mogelijk is14. Snelle celverzameling is cruciaal, vooral als het wordt uitgevoerd zonder de remmerbehandeling, omdat langdurig oogsten kan leiden tot een verlies van polysomen en/ of verandering in het vertaaloom als reactie op de veranderende omgevingsomstandigheden14. Daarom raden we aan om filtratie als oogstmethode te gebruiken, omdat deze kan worden uitgevoerd onder dezelfde of vergelijkbare omstandigheden als de kweekgroei, inclusief temperatuur en / of schudden. Tijdens de filtratie worden cellen die aan het filteroppervlak worden verzameld, voortdurend gespoeld met groeimedium, waardoor ze geen verschuivingen in celdichtheden, oxygenatie en niveau van aminozuren en andere voedingsstoffen kunnen waarnemen14. Filtratie is zachter en kan sneller zijn dan centrifugeren, als de dichtheid van de cultuur matig is, anders kan een groot aantal cellen de filterporiën verstoppen en het proces vertragen. Als er een kans is op een langdurige filtratie, raden we een chlooramfenicolvoorbehandeling van de cultuur aan, wat resulteert in een vertaalarrestatie en het mogelijk maakt om de oogsttijd te verlengen. Als filtratie moeilijk te voltooien wordt als gevolg van de verstopping van het filter, raden we aan om de filtratie te stoppen, de overtollige cultuur te verwijderen en de vriesfractie van de cultuur die op het filter is verzameld, te knipperen. We hebben waargenomen dat 50 ml dichte bacteriecultuur voldoende is om RIBO-seq uit te voeren. Het daaropvolgende vlamvriezen van cellen in vloeibare stikstof is de meest universele en effectieve benadering om onmiddellijk te stoppen met vertaling8,21,52.

Ribonucleasevertering is een cruciale stap die nodig is om RF van goede kwaliteit te verkrijgen. Het selecteren van het juiste enzym is belangrijk, omdat de ribosomale subeenheden bestaan uit RNA-moleculen die kunnen worden verteerd, waardoor de integriteit van het ribosoom wordt verstoord, rRNA-verontreiniging wordt veroorzaakt en RF44wordt vernietigd . Oorspronkelijk werd RNase I gebruikt voor de vertering van mRNA- en RF-generatie in eukaryoten1. Omdat dit enzym inactief leek in bacteriën, werd het vervangen door een microkokkennuclease (MNase) van Staphylococcus aureus21. Later werd getoond dat RNAse I in feite de spijsvertering van bacteriële monsters kan uitvoeren, maar MNase blijft vaak gebruikt voor dit doel53. Het nadeel van MNase ligt in de sequentiebias van zijn katalytische activiteit, die 30 keer verhoogd proximaal is tot A of T, wat resulteert in 80% van de mRNA-fragmenten die beginnen met A of T aan het 5′ einde14. Dit is echter overwonnen door de constatering dat het grootste deel van de variatie in lengte optreedt aan het 5′-uiteinde van RF, en het toewijzen van ribosoomdichtheid aan de 3′-end levert nauwkeurige en nauwkeurige informatie op over de ribosoompositie7. De MNase-activiteit wordt beïnvloed door de enzymconcentratie, pH en verteringstijd en moet voor elke nieuwe MNase-batch worden bepaald. Een verhoogde nucleaseactiviteit resulteert in verhoogde rRNA-besmetting, terwijl verminderde activiteit een minder nauwkeurig decolleté van ribosomale voetafdrukken veroorzaakt. Dit kan de totale opbrengst van RF in de grootte-selectieve gelzuiveringsprocedure verminderen en minder nauwkeurige informatie over ribosoomposities op mRNA14verstrekken. De vereiste hoeveelheid MNase moet dus zorgvuldig worden bepaald. Voor onze experimenten passen we 712,5 U microkokkennuclease per 1 mg RNA toe, terwijl de in de literatuur gerapporteerde concentratie varieert tussen 50 U38, 450 U34, 1000 U14 en 1500 U15,21,36 per 1 mg RNA. Zoals hierboven vermeld, vereist MNase de aanwezigheid van calciumionen voor zijn activiteit. In standaardprotocollen wordt EGTA, een chelaatvormer voor divalente ionen met een hogere affiniteit voor calcium in vergelijking met magnesium54,gebruikt voor het stoppen van de spijsvertering door calcium te binden en MNase te inactiveren. In ons protocol wordt de spijsverteringsreactie echter gestopt door RNA-reinigingskit direct na incubatie met het nuclease te gebruiken.

In standaardprotocollen is de volgende stap ribosomenterugwinning door een sucrosekussen ultracentrifugatie of een sucrose gradiënt ultracentrifugatie8,14. Een sucrose gradiëntcentrifugatie maakt de selectieve scheiding van de monosomen van de subeenheden en polysomen mogelijk, maar het vereist specifieke apparatuur zoals een verloopmixer en een ultracentrifuge. Ook is de doorvoer van deze methode beperkt tot 500-700 μL van het lysaat. Aan de andere kant, sucrose kussen ultracentrifugatie pellets de meeste ribosomale deeltjes, maakt de verwerking van meer dan dozijn milliliter lysaat mogelijk en is minder veeleisend in termen van de instrumentatie nodig. Beide benaderingen zijn echter lang omdat ze minimaal 4 tot 6,5 uur14 duren en een ultracentrifuge vereisen. In ons protocol wordt deze stap weggelaten omdat we direct overgaan tot maatselectie in 15% TBE-ureum polyacrylamide gel. De elektroforese wordt uitgevoerd onder denatureringsomstandigheden om de secundaire structuren van RNA te ontvouwen en intramoleculaire interacties te voorkomen. We gebruiken 26 nt, 29 nt en 32 nt oligonucleotiden als markers voor het exciseren van een smal bereik van ribosomale voetafdrukken. We gaan ervan uit dat de concentratie van de werkelijke RF aanzienlijk hoger is dan de potentiële verontreiniging met valse RF die als willekeurig wordt beschouwd, onbeschermd door de ribosoom mRNA- of rRNA-fragmenten van lengte in dat bereik. De resultaten verkregen met behulp van ons protocol toonden inderdaad een verrijkte fractie van de RF in het geselecteerde groottebereik. De kwaliteitscontrole met de Agilent 2100 Bioanalyzer toont RIBO-seq bibliotheken als één, goed gedefinieerde banden en pieken, in tegenstelling tot RNA-seq bibliotheken die worden gevisualiseerd als aanzienlijk bredere uitstrijkjes en pieken (Figuur 5). Ook verkregen Ribo-seq-gegevens vertonen triplet periodiciteit (figuur 8A), die niet wordt waargenomen in de RNA-seq-gegevens (figuur 8B). Bovendien vertonen de visualisaties van de verkregen RF die op het genoom is in kaart gebracht zeer vergelijkbare expressiepatronen, ongeacht de voetafdrukisolatiemethode die verder werd bevestigd in onze bioinformatische analyses (figuur 9). Toch zijn we ons ervan bewust dat valse RF kan toewijzen aan het genoom dat het verkregen signaal kan verstoren. Het feit dat valse RF willekeurig worden gegenereerd, impliceert echter dat ze zich niet op één plaats op het genoom mogen ophopen en daarom niet mogen resulteren in artefacten en vals resultaat. Ook moet worden opgemerkt dat er geen consensus bestaat in bacteriële studies over de grootte van BF 's die moeten worden geïsoleerd53,55 en dat het selecteren van alleen een subfractie van het lengtebereik kan leiden tot verkeerde interpretaties van de resultaten17. Er wordt gesuggereerd dat een breed scala aan lengtes die kenmerkend zijn voor bacteriële voetafdrukken een gevolg is van het prokaryotische ribosoomgedrag in plaats van de MNase-spijsvertering55. Complementaire interactie tussen het 3′ uiteinde van 16S rRNA in kleine ribosomale subeenheid en een Shine-Dalgarno motief in mRNA kan bijvoorbeeld resulteren in langere RF56. Gezien een breed scala aan lengtes van bacteriële voetafdrukken, Mohammad et al. aanbevolen om grootteselectie uit te voeren tussen 15 en 40 nt17,55. Dit moet leiden tot de isolatie van potentieel een hele reeks BF's en moet zorgen voor een uitgebreide weergave van ribosomen in verschillende stadia van de translationele cyclus. Vanwege de voortdurende discussie moet het excisiebereik zorgvuldig worden overwogen en het is belangrijk om te onthouden dat de onjuiste keuze sommige subfracties van RF kan uitsluiten en kan leiden tot bias in de daaropvolgende analyse.

Vanwege de grootteselectie die direct na de nucleasevertering wordt uitgevoerd en door het weglaten van de monosome isolatie door ultracentrifugatie, is ons protocol snel, relatief eenvoudig en kan het worden uitgevoerd met een standaard laboratoriumapparatuur. Met behulp van speciale kits voor het reinigen van het RNA en DNA zorgt de zuivering van mRNA en bibliotheekvoorbereiding voor standaardisatie en herhaalbaarheid. Het insappen van meer ethanol tijdens de RNA-reiniging verhoogt de zuiveringsefficiëntie van <200 nt RNA-fragmenten57. Wijzigingen in het bibliotheekpreparaat - verlenging van de incubatietijd en verhoging van de temperatuur tijdens ligatie van adapters - worden toegepast om de ligatie-efficiëntie voor gemethyleerd RNA, zoals rRNA, te verminderen en rRNA-verontreiniging te verminderen58. Ons protocol is gebruikt om vertaalregulatie in verschillende groeiomstandigheden (publicaties in voorbereiding) te onderzoeken, maar kan worden toegepast om andere aspecten van vertaling te bestuderen, zoals TIS-detectie of om genoomannotatie te verbeteren en proteomische studies te ondersteunen. Een aanvullende wijziging van het protocol, afhankelijk van de onderzoeksvraag, kan gemakkelijk worden opgenomen, bijvoorbeeld door het ribosoom te kruisen met het eiwit van belang of affiniteitszuivering van de ribosomen van belang, wat resulteert in de verrijkte fracties van ribosomen. Met ons protocol is de RIBO-seq procedure toegankelijker voor wetenschappers en kan zo nieuwe ontdekkingen stimuleren en ontwikkelingen in het veld versnellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

ALS wil graag de financiële steun van EMBO Installatiesubsidies IG 3914 en POIR erkennen. 04.04.00-00-3E9C/17-00 uitgevoerd in het kader van het Eerste TEAM-programma van de Stichting voor Poolse Wetenschap, medegefinancierd door de Europese Unie in het kader van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X TBE (powder) Invitrogen AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure Acros Organics 125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a. Chempur 114560600
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3881-500G
Chloramphenicol MP Biomedicals 190321
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free Roche 4716728001
EDTA disodium salt Fisher Scientific E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic POCH Avantor Performance Materials Poland S.A BA6480111
Filtration apparatus VWR Collection 511-0265 all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1) Rotiphorese 3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X New England Biolabs E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich G0635-25MG
labZAP A&A Biotechnology 040-500
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661-250G
MCE membrane fiter Alfatec Technology M47MCE45GWS pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification Invitrogen AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina New England Biolabs E7300S
Nuclease-Free Water Ambion AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs E7323A
RNA Clean & Concentrator -25 Zymo Research R1018
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Sodium carbonate Sigma-Aldrich 223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a. POCH Avantor Performance Materials Poland S.A 810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S11494
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England Biolabs B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x) Invitrogen LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9% AlfaAesar J65594
Triton X-100, 98% Acros Organics 327371000
Urea G.R. lach:ner 40096-AP0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346 (2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134 (2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114 (2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179 (2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886 (2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118 (2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106 (2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257 (2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819 (2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115 (2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6 (2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806 (2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678 (2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591 (2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

Tags

Biochemie Nummer 174
RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P.,… More

Kopik, N., Chrobak, O., Latoch, P., Kovalenko, M., Starosta, A. L. RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing. J. Vis. Exp. (174), e62544, doi:10.3791/62544 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter