Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

В пробирке Трехмерный анализ ангиогенеза с использованием эмбриональных стволовых клеток мыши для моделирования сосудистых заболеваний и тестирования лекарств

Published: May 11, 2021 doi: 10.3791/62554
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

Summary

В этом анализе используются эмбриональные стволовые клетки мыши, дифференцированные в эмбриоидные тела, культивируемые в геле 3D-коллагена, для анализа биологических процессов, которые контролируют прорастающий ангиогенез in vitro. Методика может быть применена для тестирования лекарств, моделирования заболеваний, а также для изучения конкретных генов в контексте делеций, которые являются эмбрионально летальными.

Abstract

Последние достижения в области индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и технологий редактирования генов позволяют разрабатывать новые модели заболеваний на основе клеток человека для программ открытия фенотипических лекарств (PDD). Хотя эти новые устройства могут более точно предсказывать безопасность и эффективность исследуемых препаратов на людях, их разработка в клинике по-прежнему в значительной степени зависит от данных о млекопитающих, в частности, от использования моделей болезней мышей. Таким образом, параллельно с моделями заболеваний органоидов человека или «орган-на-чипе» разработка соответствующих моделей мышей in vitro является неудовлетворенной потребностью для оценки прямых сравнений эффективности и безопасности лекарств между видами и в условиях in vivo и in vitro . Здесь описан анализ прорастания сосудов, в котором используются эмбриональные стволовые клетки мыши, дифференцированные в эмбриоидные тела (БЭ). Васкуляризированные БЭ, культивируемые на 3D-коллагеновом геле, развивают новые кровеносные сосуды, которые расширяются, процесс, называемый прорастающим ангиогенезом. Эта модель резюмирует ключевые особенности прорастающего ангиогенеза in vivo - образования кровеносных сосудов из ранее существовавшей сосудистой сети, включая отбор клеток кончика эндотелия, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, управление клетками, формирование трубок и рекрутирование клеток фремиссии. Он поддается скринингу на лекарства и гены, модулирующие ангиогенез, и показывает сходство с недавно описанными трехмерными (3D) сосудистыми анализами, основанными на технологиях iPSC человека.

Introduction

За последние три десятилетия открытие лекарств на основе мишеней (TDD) широко использовалось фармацевтической промышленностью при открытии лекарств. TDD включает в себя определенную молекулярную мишень, играющую важную роль в заболевании, и опирается на разработку относительно простых систем клеточных культур и считывания для скрининга лекарств1. Наиболее типичные модели заболеваний, используемые в программах TDD, включают традиционные методы культивирования клеток, такие как раковые клетки или иммортализированные клеточные линии, выращенные в искусственных средах и нефизиологических субстратах. Несмотря на то, что многие из этих моделей предоставили жизнеспособные инструменты для выявления успешных кандидатов на лекарства, использование таких систем может быть сомнительным из-за их низкой актуальности для болезней2.

Для большинства заболеваний основные механизмы действительно сложны, и часто обнаруживается, что различные типы клеток, независимые сигнальные пути и несколько наборов генов способствуют определенному фенотипу заболевания. Это также верно для наследственных заболеваний, где основной причиной является мутация в одном гене. С недавним появлением технологий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC) и инструментов редактирования генов теперь можно создавать 3D-органоиды и модели заболеваний органов на чипе, которые могли бы лучше повторять сложность человека in vivo 3,4. Развитие таких технологий связано с возрождением интереса к программам открытия фенотипических лекарств (PDD)1. PDD можно сравнить с эмпирическим скринингом, поскольку они не опираются на знание идентичности конкретной лекарственной мишени или гипотезу о ее роли в заболевании. В настоящее время все шире признается, что подход PDD вносит значительный вклад в открытие первых в своем классе лекарств5. Поскольку развитие технологий органоидов человека и «органов-на-чипе» все еще находится в зачаточном состоянии, ожидается, что модели iPSC (дополненные инновационными инструментами визуализации и машинного обучения6,7) предоставят в ближайшем будущем несколько новых сложных моделей клеточных заболеваний для скрининга лекарств и связанных с ними программ PDD для преодоления низкой производительности подхода TDD8, 9.

В то время как модели органоидов человека и «орган-на-чипе» могут дать важную информацию о сложности заболевания и идентификации новых лекарств, внедрение лекарств в новую клиническую практику также в значительной степени зависит от данных животных моделей для оценки их эффективности и безопасности. Среди них генетически модифицированные мыши, безусловно, являются наиболее предпочтительными моделями млекопитающих. У них есть много преимуществ, поскольку они имеют относительно короткое время генерации для млекопитающих, имеют много схожих фенотипов с болезнями человека и могут быть легко генетически манипулированы. Поэтому они широко используются в программах по открытию лекарств10. Тем не менее, преодоление разрыва между мышами и людьми остается важной задачей11. Разработка моделей мышей in vitro, эквивалентных человеческим органоидам и моделям «орган-на-чипе», может, по крайней мере, частично восполнить этот пробел, поскольку это позволит проводить прямые сравнения эффективности и безопасности лекарств между данными о мышах in vivo и людях in vitro .

Здесь описан анализ прорастания сосудов в эмбриоидных телах мышей (БЭ). Кровеносные сосуды состоят из эндотелиальных клеток (внутренняя оболочка стенок сосудов), клеток стенки (клетки гладких мышц сосудов и перициты)12. Этот протокол основан на дифференцировке мышиных эмбриональных стволовых клеток (мЭСК) в васкуляризированные БЭ с использованием висячих капель, которые повторяют de novo эндотелиальные клетки и дифференцировку клеток фрески13,14. ЭСК мышей могут быть легко установлены в культуре из изолированных бластоцист мыши на 3,5-й день, имеющих различный генетический фон15. Они также предоставляют возможности для клонального анализа, отслеживания происхождения и могут быть легко генетически обработаны для создания моделей заболеваний13,16.

Поскольку кровеносные сосуды питают все органы, неудивительно, что многие заболевания, если не все, связаны с изменениями в микроциркуляторном русле. При патологических состояниях эндотелиальные клетки могут принимать активированное состояние или могут стать дисфункциональными, что приводит к гибели клеток или миграции из кровеносных сосудов. Это может привести к чрезмерному ангиогенезу или разрежению сосудов, может вызвать аномальный кровоток и дефектный барьер кровеносных сосудов, что приводит к экстравазации иммунных клеток и воспалению12,17,18,19. Таким образом, исследования по разработке лекарств, модулирующих кровеносные сосуды, высоки, и уже было выявлено множество молекулярных игроков и концепций для терапевтического нацеливания. В этом контексте описанный протокол особенно подходит для построения моделей заболеваний и для тестирования лекарств, поскольку он повторяет ключевые особенности ангиогенеза прорастания in vivo, включая отбор эндотелиальных клеток кончика и стебля, миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, руководство эндотелиальными клетками, формирование трубок и рекрутирование клеток фремиссии. Он также демонстрирует сходство с недавно описанными 3D-сосудистыми анализами, основанными на технологиях iPSCчеловека 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Медиаподготовка и культура mESC

  1. Приготовьте кондиционированную среду +/- (CM+/-), используя добавку 1x среда Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) с 10% (об./об.) инактивированной теплом фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,05 мМ β-меркаптоэтанола, 1x заменимых аминокислот (NEAA 1x), 2 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия.
  2. Приготовьте кондиционированную среду +/+ (CM+/+) с использованием добавки CM+/- среды с фактором ингибирования лейкемии (LIF) (1,500 ЕД/мл) и 0.1 мМ β-меркаптоэтанола.
  3. Приготовьте кондиционированную среду +/+ в присутствии двух ингибиторов (CM+/+ 2i) с использованием добавки CM+/+ среды с 1 мкМ PD0325901 и 3 мкМ CHIR99021.
  4. Приготовьте 0,1% раствор желатина, смешав 25 мл предварительно подогретого 2% раствора желатина с 500 мл фосфатно-буферного физиологического раствора без кальция и магния (DPBS).
  5. Приготовьте 10-кратный буфер трипсина и версенфосфата (TVP 10x), смешав трипсин (2,5%) с TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 мМ ЭДТА, 0,01% куриной сыворотки, 0,01% трипсина (2,5%) в H2O) (соотношение 1:10, объем/об.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отфильтруйте все растворы через поровый фильтр 0,22 мкм. Храните питательную среду при температуре -20 °C в течение длительного времени, а другие реагенты храните при температуре 4 °C до 3 недель (см. Таблицу материалов).
  6. Покройте две 12-луночные пластины для культивирования клеток 0,1% раствором желатина (500 мкл на лунку) и инкубируйте их в течение 30 мин в инкубаторе CO 2 (37 °C, 5% CO2, влажная атмосфера).
  7. Вымойте пластины с желатиновым покрытием PBS и добавьте 500 мкл среды CM+/-.
  8. Разморозьте два флакона по 1 x 106 криоконсервированных облученных эмбриональных фибробластов мыши (MEF) при 37 ° C и перенесите клеточную суспензию в коническую трубку с 5 мл среды CM +/-.
  9. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Аспирируют среду и осторожно ресуспендируют клеточную гранулу в 12 мл среды CM+/- в концентрации 1,67 х10,5 клеток на мл.
  10. Высевают 500 мкл суспензии MEF в 12-луночную клеточную культуральную пластину (2,4 x 10,5 клеток на см 2 ) и инкубируют пластину в течение ночи (o / n) в инкубаторе CO 2.
  11. Разморозьте один флакон криоконсервированных мЭСК (1 x 106) в среде CM+/+ 2i.
  12. Засейте суспензию mESC на предварительно промытую 12-луночную пластину с MEF в 1 мл среды CM+/+ 2i и перенесите планшет в инкубатор CO2 . Ежедневно обновляйте средство.
  13. При слиянии 70% промойте колонии mESC с помощью DPBS. Добавьте 150 мкл теплого 10-кратного буфера TVP и инкубируйте при RT в течение 30 с, чтобы инициировать ферментативную диссоциацию.
  14. Осторожно удалите буфер TVP, ресуспендируйте клетки в 1 мл среды CM+/+ 2i и диссоциируйте колонии на отдельные клетки путем осторожного пипетирования.
  15. Пропустите клетки, перенеся их на новую 12-луночную пластину для культивирования клеток с MEF (коэффициент расщепления: 1:3-1:5). Аккуратно перемешайте, чтобы распределить клетки и инкубировать в инкубаторе CO2 .
  16. Освежите питательную среду (2-3 мл) и ежедневно наблюдайте за ростом/морфологией клеток. Повторяйте последовательное прохождение с 70% слиянием каждые 2 дня. Переключитесь на среду CM+/+ в течение двух пассажей, прежде чем начать дифференцировку клеток.

2. Формирование ЭБ в висячей капле

  1. Приготовьте свежую среду для дифференцировки мезодермы, дополнив среду CM+/- основным фактором роста фибробластов (bFGF) (50 нг·мл-1) и костным морфогенетическим белком 4 (BMP-4) (5 нг·мл-1) и держите его при температуре 4 °C до использования.
  2. Покройте одну лунку 6-луночного планшета для культивирования клеток 500 мкл 0,1% раствора желатина и поместите его в инкубатор CO2 на 30 мин.
  3. Вымойте пластины с желатиновым покрытием PBS и добавьте 500 мкл среды CM+/-.
  4. Чтобы получить чистую популяцию мЭСК, трипсинизируют пластину для культивирования клеток 10-кратным буфером TVP в течение 30 с при ЛТ, ресуспендируют клетки в среде дифференцировки мезодермы объемом 1 мл, а затем переносят их в 6-луночную пластину, покрытую желатином, в течение 30 мин, позволяя МЭФ прикрепляться, пока мЭСК остаются в суспензии.
  5. Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра Нойбауэра и красителя трипанового синего для исключения живых/мертвых клеток.
  6. Центрифугируют клетки при 200 x g в течение 5 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в среде дифференцировки мезодермы до достижения 4,55 x 104 клеток на мл.
  7. Наполните дно посуды из полистирола с низкой насадкой 94 мм 15 мл стерильной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре чашки с висячими каплями (1,6 x 105 клеток в 3,52 мл среды) потребуются для тестирования одного конкретного состояния с использованием 3D-анализа прорастающего ангиогенеза.
  8. Перенесите клеточную суспензию в стерильный пластиковый резервуар и загрузите в четыре положения многоканальной пипетки 22 мкл клеточной суспензии на канал (1 x10,3 клетки на 22 мкл капли).
  9. Поднимите и переверните крышку посуды диаметром 94 мм и поставьте ее на чистую поверхность шкафа внутренней стороной вверх.
  10. Нанесите 40 капель клеточной суспензии на внутреннюю поверхность каждой крышки. Осторожно переверните крышку без помех и положите ее обратно на блюдо так, чтобы капли были обращены к воде.
  11. Инкубируйте посуду в инкубаторе CO2 . Считайте, что это день дифференциации 0. Выдерживайте пластины в течение 4 дней до образования ЭБ.

3. Конкурсный анализ положения ячейки наконечника

  1. Культивируют одну флуоресцентную и одну нефлуоресцентную линию mESC, как описаноранее 13. В качестве примера используются мЭСК 7ACS/EYFP, помеченные желтым цветом, и мЭСК R1.
  2. Приготовьте мозаичные ЭБ, смешав равные количества двух линий mESC (соотношение 1:1), и инкубируйте подвесные чашки в инкубаторе CO 2, как описано на шаге2 .

4. Плавающая культура БЭ для дифференцировки сосудов

  1. Перед сбором ЭБ из висячих капель подготовьте следующее.
    1. Приготовьте 5% раствор агара вН2О и стерилизуйте его автоклавированием (20 мин при 120 °С).
    2. Используйте теплый 5% раствор агара для приготовления среды G-MEM BHK-21, содержащей 1% агара, и быстро налейте 3 мл в одну из 60-миллиметровых полистирольных посуд. Дайте агару застыть в течение 1 часа при RT. Храните посуду при температуре 4 °C до использования.
  2. Приготовьте свежую 2-кратную среду для сосудистой дифференцировки, дополнив среду CM+/- bFGF (100 нг·мл-1) и VEGF-A (50 нг·мл-1). Хранить средство при температуре 4 °C до использования.
  3. Соберите висячие капли в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000 и удалите надосадочную жидкость через несколько минут после осаждения EB.
  4. Ресуспендировать БЭ в 3 мл 2-кратной среды для сосудистой дифференцировки, перенести суспензию ЭБ в одну суспензию, покрытую агаром, равномерно распределить БЭ, чтобы избежать агрегации.
  5. Инкубируйте чашки в инкубаторе CO 2 и обновляйте среду каждые2 дня до 9-го дня, используя 1x среду для сосудистой дифференцировки в присутствии bFGF (50 нг·мл-1) и VEGF-A (25 нг·мл-1).
  6. В качестве альтернативы добавляют тромбоцитарный фактор роста-BB (PDGF-BB) (10 нг · мл -1 на 4-й день и 5 нг · мл-1 на 6-й и 8-й день) в сосудистую дифференцировочную среду, чтобы стимулировать дифференцировку клеток стенки.

5. Анализ проточной цитометрии

  1. Соберите 9-дневные ЭБ в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000 и промойте их один раз теплым PBS.
  2. Добавьте 1 мл среды G-MEM BHK-21, содержащей 0,2 мг·мл-1 коллагеназы А, и инкубируйте клетки в инкубаторе CO2 в течение 5 минут.
  3. Диссоциируйте ЭБ, аккуратно пипетируя вверх и вниз пипеткой P1000.
  4. Остановите активность коллагеназы, добавив 1 мл холодной среды G-MEM BHK-21 с 10% FBS.
  5. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 мин при RT.
  6. Ресуспендируют клетки в 500 мкл PBS с 2% FBS.
  7. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра Нойбауэра.
  8. Ресуспендировать 400 000 клеток в 100 мкл PBS с 2% FBS на одно условие окрашивания.
  9. Инкубируют клетки в течение 45 мин при 4 °C со следующими антителами: конъюгированным антителом PECAM-1 против мыши APC (клон MEC13.3) и конъюгированным антителом против мыши CD45 (клон 30-F11) или антителами контроля изотипа.
  10. Дважды промойте клетки 1 мл PBS, содержащего 2% FBS.
  11. Ресуспендируют клетки, чтобы достичь конечной концентрации 5 x10,6 клеток на мл.
  12. Отфильтруйте ячейки с помощью пробирки из полистирола с круглым дном и защелкивающейся крышкой сетчатого фильтра.
  13. Проанализируйте 20 000 событий PECAM-1 (+) с помощью проточной цитометрии.

6.3D Анализ прорастающего ангиогенеза и иммунофлюоресцентное окрашивание

  1. На 9-й день приготовьте среду для прорастания, добавив 10% FBS (об./об.), bFGF (50 нг·мл-1), VEGF-A (25 нг·мл-1), человеческий рекомбинантный эритропоэтин (hEPO) (20 нг·мл-1), человеческий интерлейкин-6 (IL-6) (10 нг·мл-1), 0,05 мМ β-меркаптоэтанол, NEAA (1x), L-глютамин (1x), пируват натрия (1x), коллаген крысиного хвоста I типа (1,25 мг·мл-1), и NaOH (3,1 мМ) в среду GMEM BHK-1.
  2. Чтобы избежать гелеобразования коллагена, поддерживайте среду для проращивания на льду до использования.
  3. Чтобы оценить эффект проангиогенных молекул, добавьте выбранное лекарство или носитель в среду для прорастания в выбранной концентрации.
  4. Соберите 9-дневные ЭБ из одной чашки агара диаметром 60 мм в коническую пробирку объемом 15 мл (эквивалентно одному условию) и удалите надосадочную жидкость через несколько минут после осаждения.
  5. Накройте дно чашки для культур диаметром 35 мм 1 мл прорастающей среды и инкубируйте при 37 ° C в течение 5 минут, чтобы вызвать гелеобразование.
  6. Ресуспендируют ЭБ в 2 мл среды для холодного проращивания.
  7. Перенесите суспензию в культуральную чашку диаметром 35 мм, покрытую первым слоем проращивающей среды.
  8. Распределите ЭБ по всей тарелке и убедитесь, что они находятся на равном расстоянии друг от друга. Инкубируйте чашку в инкубаторе CO2 . Формирование первого ростка происходит в течение 24-48 часов.
  9. На 12-й день коллагеновый гель, содержащий ЭБ, осторожно переносится на предметное стекло (75 х 26 мм) с помощью шпателя.
  10. Удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки (P1000) и обезвоживайте гель, положив поверх геля марлевый лист нейлонового льна и впитывающие фильтрующие карты (гелевую промокательную бумагу). Надавите, поместив груз (250 г) на 2 мин. Осторожно снимите нейлоновую / фильтровальную бумагу и дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе в течение 30 минут при RT.
  11. Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS в течение 5 минут при RT.
  12. Исправьте ЭБ раствором цинка (см. Таблицу материалов) о/при 4 °C. В качестве альтернативы можно закрепить мозаичные флуоресцентные ЭБ параформальдегидом (ПФА) (4%) o/n при 4 °C в темноте.
  13. Снимите фиксатор. Промойте предметные стекла пять раз с помощью PBS в течение 5 минут при RT.
  14. Пермеабилизируйте ЭБ в PBS, содержащий 0,1% Triton-X100, в течение 15 мин при ЛТ.
  15. Удалите раствор для пермеабилизации. Промойте предметные стекла пять раз с помощью PBS в течение 5 минут.
  16. Инкубируйте ЭБ в блокирующем буфере (PBS с 2% бычьим сывороточным альбумином, BSA) в течение 1 ч при ЛТ.
  17. Чтобы окрасить эндотелиальные ростки, используйте первичное антитело против мыши против PECAM-1 крысы (разведение 1:100) в блокирующем буфере o/n при 4 ° C.
  18. Промойте предметные стекла пять раз с помощью PBS в течение 5 минут.
  19. Инкубируйте предметные стекла с вторичным антителом Alexa 555 против крыс в блокирующем буфере (разведение 1:250) и, при необходимости, с FITC-конъюгированным антителом против α-SMA в блокирующем буфере (разведение 1:250) для окрашивания клеток росписи в течение 2 ч при RT в темноте.
  20. Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS в течение 5 минут и один раз с H20 перед их установкой.

7. Конфокальная визуализация, морфометрический и количественный анализ эндотелиальных ростков БЭ

  1. Получение изображений иммуноокрашенных ЭБ с высоким разрешением путем слияния в фокальной плоскости (z-стекирование) с помощью конфокального микроскопа. Используйте объектив с 10-кратным увеличением для получения изображения целых ЭБ.
  2. Проанализируйте изображения, полученные с помощью ImageJ, для оценки морфологии и количественной оценки характеристик положительных эндотелиальных ростков PECAM-1 в соответствии с установленными методами количественной оценки13,14,21.
    1. Рассчитайте среднее количество эндотелиальных ростков на ЭБ, вручную подсчитав общее количество ростков на отдельные ЭБ.
    2. Измерьте длину отдельных ростков с помощью инструмента рисования ImageJ. Определите основание эндотелиального ростка, начиная с области ядра БЭ, и вручную проведите линию до конца кончика ростка.
    3. Рассчитайте среднее количество ячеек верхушки на росток, вручную подсчитав количество клеток кончиков на отдельный росток, а затем рассчитайте среднее значение на ЭБ.
    4. Рассчитайте ориентацию филоподии, вручную определив ось родительского ростка, и измерьте острый угол между ними с помощью программного инструмента угла ImageJ. Рассчитайте количество ростков с ориентацией >50° и разделите его на общее количество ростков интересующего ЭБ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Углы всегда находились в диапазоне от 0° до 90°.
  3. Получение изображений иммуноокрашенных БЭ с высоким разрешением с помощью конфокального микроскопа. Используйте объектив с 40-кратным увеличением для получения изображений с высоким разрешением отдельных эндотелиальных ростков.
  4. Количественно оцените покрытие сосудов положительными ЕС-ростками PECAM-1, окруженными положительными MC α-SMA, с помощью программного обеспечения ImageJ.
    1. Разделите объединенные изображения на отдельные красный и зеленый каналы.
    2. Преобразуйте изображения в двоичную форму.
    3. Измерьте общую клеточную площадь ростка, занятую отдельно PECAM-1 (эндотелиальные клетки, помеченные красным цветом) и α-SMA (настенные клетки, помеченные зеленым цветом) положительными клетками.
    4. Сгенерируйте объединенное изображение с помощью функции калькулятора изображений и оператора AND. Измерьте общую площадь ячейки изображения. Чтобы рассчитать охват, разделите площадь колокализованного изображения на площадь двоичного изображения PECAM-1.
  5. Чтобы проанализировать клеточную конкуренцию за положение эндотелиальных клеток верхушки / стебля ростков, разработанных мозаичными ЭБ, вручную оцените количество верхушечных клеток и отметьте их генотипическое происхождение на основе сигнала флуоресценции. Рассчитайте средние значения на EB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Обзор протокола анализа прорастания кровеносных сосудов показан на рисунке 1. Девятидневные БЭ, полученные из трех независимых линий 129 / Ola mESC (Z / Red, R1 и E14), были ферментативно диссоциированы на отдельные клетки с использованием коллагеназы A. Клетки окрашивали для PECAM-1 и анализировали с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS), как описано. Все клеточные линии демонстрировали надежную эндотелиальную дифференцировку, и никаких различий в их способности дифференцироваться в эндотелиальные клетки не наблюдалось. Все клеточные линии продуцировали около 10,5% ± 1,3% эндотелиальных клеток (рис. 2А). Также были количественно определены уровни экспрессии маркеров PAN-эндотелиальных клеток в популяциях клеток PECAM-1 (+). Уровни экспрессии мРНК всех проанализированных маркеров (Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2 и Cdh5) были сопоставимы между клеточными линиями и экспериментами, что подтверждает надежность протокола дифференцировки (рис. 2B). Популяции клеток PECAM-1 (+) экспрессировали только очень низкие уровни мРНК артериальных (Notch1 и Efnb2) или венозных (Couptf2 и Ephb4) маркеров, поддерживающих относительно незрелое состояние эндотелиальных клеток, которые были сгенерированы протоколом (рис. 2C).

Затем была продемонстрирована способность модели EB прорастания сосудов проводить скрининг препаратов, модулирующих ангиогенез (рис. 3). Были протестированы DC101 и DAPT (N-[N-(3,5-дифторфенацетил)-лаланил]-S-фенилглицин t-бутиловый эфир). Эти соединения широко используются у мышей для соответствующего блокирования ангиогенеза путем ингибирования активности VEGFR2 или для стимулирования дифференцировки эндотелиальных кончиковых клеток и образования плотного сосудистого сплетения путем нацеливания на передачу сигналов Notch (рис. 3A). Сигнальные пути VEGF и Notch являются ключевыми регуляторами прорастающего ангиогенеза in vivo. Оценивали влияние различных концентраций DC101 и DAPT в ЭБ, покрытых коллагеном I. Высокие дозы DC101 в диапазоне от 6 до 30 мг · L-1 ингибировал как количество, так и длину ростков сосуда, в то время как DAPT оказывал противоположные эффекты в дозе 1 мкмоль· L-1 (рис. 3B-C). Также представлены изображения с большим увеличением ростков сосудов, окрашенных для PECAM-1 ЭБ, культивируемых в присутствии DAPT (рис. 3D). DAPT даже при низких дозах в пределах 0,5-1 мкмоль· L-1 сильно увеличил количество клеток эндотелия с ростками сосудов, которые имели неправильный фенотип (рис. 3D-F). Высокая доза DAPT также приводила к слиянию сосудов и образованию крупных и плоских участков эндотелиальных клеток без организации (рис. 3А). Результаты подтвердили способность модели тестировать препараты, которые либо способствуют, либо ингибируют ангиогенез.

Чтобы подтвердить, что эта модель подходит для имитации сосудистых заболеваний, предоставляются конфокальные изображения ЭБ, полученные из мЭСК Acvrl1+/- . Ген Acvrl1 кодирует ALK1 (активиновую рецептороподобную киназу 1), рецептор, специфически экспрессируемый в эндотелиальных клетках, который в случае мутации отвечает за развитие редкого сосудистого заболевания с ангиодисплазией, называемого наследственной геморрагической телеангиэктазией (HHT). Изображение эндотелиальных ростков Acvrl1 +/- с большим увеличением показало, что у них было больше клеток кончика эндотелия и больше ветвей на росток, которые находились под случайными углами относительно родительских сосудов. Они подтвердили in vitro неправильный фенотип, наблюдаемый у мышей с HHT (рис. 4).

При формировании химерных ЭБ, содержащих дифференцированные флуоресцентно меченные mESC и mESC определенного генотипа, включается альтернативный протокол для изучения процесса выбора кончика эндотелия (рис. 5A-C). Конфокальное изображение помеченных PECAM-1 ростков сосудов определило генотипическое происхождение ведущих клеток эндотелия (рис. 5B). Смеси линии mESC (желтый флуоресцентный белок) дикого типа в соотношении 1:1 с одной немеченой линией mESC дикого типа последовательно приводили к равному вкладу каждой популяции в ведущие эндотелиальные концевые клетки (рис. 5C).

Этот протокол также подходит для количественной оценки покрытия настенных клеток ростка сосуда. БЭ, которые подвергаются ангиогенезу, были зафиксированы и окрашены для PECAM-1 (эндотелиальные клетки, красные) и для α-гладкомышечного актина (α-SMA) (настенные клетки, зеленые) (рис. 5D). Изображение с большим увеличением показало, как один отдельный росток сосуда был окружен клетками фрески (рис. 5E, слева). Двоичное преобразование было выполнено после разделения цветовых каналов (рис. F-G) для количественной оценки соотношения PECAM-1 (+) сосуда, покрытого ячейками фрески α-SMA (+), с использованием программного обеспечения ImageJ (рис. 5H).

Figure 1
Рисунок 1: Хронология протокольных процедур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Характеристика ЭК, полученных на основе сосудистой дифференцировки mESC внутри БЭ. (A) Проточный цитометрический анализ экспрессии CD31 из 9-дневных БЭ и количественное определение процента клеток Pecam-1 (+). (B-D) уровни экспрессии мРНК Pecam-1, Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2, Cdh5, Notch1, EfnB2, Couptf2 и EphB4 в отсортированных эндотелиальных клетках 9-дневных БЭ. Столбцы погрешности представляют собой среднюю ± стандартную ошибку среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: 3D-анализ прорастающего ангиогенеза для тестирования лекарств. (A) Конфокальные изображения трех репрезентативных ЭБ, окрашенных для Pecam-1 (белые эндотелиальные клетки), обработанных только носителем, DAPT (0,5 мкмоль · L-1, 1,0 мкмоль· L-1, 5,0 мкмоль· L-1) или DC101 (3 мг· L-1, 6 мг· L-1, 30 мг· Л-1). В) Количественная оценка числа ростков на ЭБ. С) Количественная оценка длины ростка. (D) На верхней левой панели большое увеличение эндотелиального ростка, показывающее сложность сети и точку ветвления, считая два разных слоя из одного и того же ЭБ, на нижней левой панели схематическое изображение, представляющее метод измерения ориентации эндотелиального ростка. На верхней правой панели большое увеличение эндотелиальных ростков только из носителя и на нижней правой панели большое увеличение эндотелиальных ростков из DAPT (0,5 мкмоль · L-1) условие. е) количественная оценка количества верхушечных клеток на один росток. (F) Количественная оценка процентной доли филоподий в пределах угла >50°. Все столбцы представляют собой средние значения ± SEM и p из непарного одностороннего теста ANOVA. ns = незначимый, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 и ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Дефектное прорастание сосудов при наследственной геморрагической телеангиэктазии БЭ. На верхней панели конфокальные изображения репрезентативных 12-дневных БЭ из генотипов Acvrl1+/+ и Acvrl1+/-, окрашенных для Pecam-1 (белые эндотелиальные клетки). На нижней панели большое увеличение эндотелиальных ростков Acvrl1 +/- (белая рамка с верхней панели), показывающее многочисленные кончиковые клетки (красные стрелки), точки ветвей эндотелия (синие точки) и прорастающий фенотип неправильного направления (зеленые стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Изучение положения клеток кончика/стебля и созревания сосудов с использованием 3D-анализа прорастания. (A) Конфокальное изображение репрезентативной химерной БЭ 12-дневной давности, полученное из клеточной линии дикого типа R1, смешанной 1:1 с клеточной линией дикого типа 7ACS/EYFP, окрашенной для Pecam-1 (красные эндотелиальные клетки). Красными стрелками обозначены наконечники клеток из линии клеток R1, а зелеными стрелками обозначены ячейки кончиков из линии клеток 7ACS/EYFP. (B) Большое увеличение эндотелиального ростка, показывающее распределение эндотелиальных клеток R1 и 7ACS/EYFP вдоль ростка. (C) Количественная оценка относительного генотипирования верхушечных клеток из репрезентативных БЭ дикого типа. (D) Конфокальное изображение репрезентативного 12-дневного БЭ, окрашенного на Pecam-1 (красные эндотелиальные клетки) и α-SMA (зеленые, настенные клетки). (E) Большое увеличение эндотелиального ростка (белая прямоугольная пунктирная рамка от D), показывающее взаимодействие фрески и эндотелиальных клеток. (Ф-Г) Изображения цветного эндотелиального ростка и связанные с ними бинарные трансформированные изображения. (H) Двоичное изображение совместного локализованного окрашивания Pecam-1 и α-SMA. Соотношение ростков эндотелиальных клеток, покрытых клетками фрески. Все столбцы представляют собой среднее значение ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает объективный, надежный и воспроизводимый 3D-анализ прорастания сосудов на основе EB, который поддается скринингу лекарств и генов, модулирующих ангиогенез. Этот метод имеет преимущества по сравнению со многими широко используемыми двумерными (2D) анализами с использованием культур эндотелиальных клеток, таких как эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC), для мониторинга миграции (анализ боковых царапин или анализ камеры Бойдена)22,23 или пролиферации (подсчет количества клеток, обнаружение синтеза ДНК, обнаружение маркеров пролиферации или метаболические анализы)24 В этом уникальном смысле он позволяет изучать дифференцировку как эндотелиальных, так и стеновых клеток и их организацию в сосудистую сеть, имитирующую ключевые этапы прорастающего ангиогенеза. Эти этапы включают отбор клеток кончика эндотелия, пролиферацию клеток стебля, пространственную ориентацию и миграцию ростка сосуда, а также рекрутирование клеток фрески в зарождающийся кровеносный сосуд25. Он также предлагает преимущества для многих 3D-моделей ангиогенеза. Фибриновый шарик 26,27 или анализ коллагенового геля28,29,30, имитирующий тубулогенез, обычно используют HUVEC или эндотелиальные клетки, образующие колониеобразующие эндотелии (ECFC-EC), поскольку они имеют высокую скорость пролиферации, но не подходят для первичных эндотелиальных клеток мыши, которые трудно поддерживать в культуре. Эксплантат31 сетчатки ex vivo или анализ32 васкуляризированных микроорганов могут хорошо повторять все этапы образования кровеносных сосудов, но они имеют сложные экспериментальные процедуры и не подходят для высокопроизводительного лекарственного или генетического скрининга. Это также верно для анализа аортального кольца ex vivo 33,34 и для многих анализов in vivo, таких как опухоль, имплантированная мышам, или исследования потери функции у мышей, которые часто имеют высокую стоимость и трудности в получении большого количества данных35. Этот протокол также хорошо дополняет аналогичные анализы ангиогенеза in vitro с использованием человеческих ИПСК, что позволяет сравнивать данные мыши и человека. Хотя важно отметить, что эндотелиальные клетки, полученные из ИПСК человека, демонстрируют меньшую способность к прорастанию, чем клетки мыши36,37.

Разработанный здесь метод также имеет некоторые ограничения. Он не может оценить влияние потока жидкости на созревание кровеносных сосудов, проницаемость сосудов и не производит зарождающийся кровеносный сосуд в определенной тканевой среде по сравнению с последними микрофабрикатами, которые находятся в стадии разработки. Действительно, технологии «орган-на-чипе», сочетающие микрофлюидику с тканевой инженерией, могут обеспечить культивируемым эндотелиальным клеткам микроокружение, аналогичное микроокружению in vivo38,39. Микрофлюидные системы содержат правильный состав внеклеточного матрикса и предназначены для получения механических сигналов, таких как напряжение сдвига. Некоторые из них предназначены для включения настенных клеток и других поддерживающих клеток данной ткани или могут генерировать химические градиенты. Они содержат сети заполненных жидкостью каналов микронного масштаба, которые похожи по размеру и структуре на кровеносные капилляры. Технологии «орган-на-чипе» также позволяют количественно определять конкретные сосудистые функции, включая проницаемость и трансэндотелиальное электрическое сопротивление. Несмотря на то, что технологии «орган-на-чипе» являются многообещающими, они выходят далеко за рамки исследовательского опыта большинства биологических лабораторий, по-прежнему нуждаются в надлежащей стандартизации и требуют специализированных методов изготовления. Коммерциализация производства технологии «орган-на-чипе» только начинается, и в настоящее время эти системы считаются непомерно дорогими для фармацевтических компаний40,41.

Есть несколько важных шагов, которые следует принять во внимание. Используйте высококачественные клетки, которые надежно экспрессируют общепринятые маркеры (Nanog, Oct4, Sox2 и SSEA-1) плюрипотентного состояния. Важно тщательно следить за их ростом, формой клеток mES, а также за размером и морфологией колоний mES. Поскольку кариотипическая стабильность является стохастической в культивируемых клетках, необходима ее переоценка после обширного пассажа. Рекомендуется использовать продукты, уже протестированные для культивирования mESC, и тестировать кормушки MEF, сыворотку плода телята и все химические соединения для нескольких пассажей, чтобы определить, сохраняют ли мЭСК свои клеточные свойства или дифференцируются или приобретают эпибластический фенотип. Среду следует ежедневно обновлять, и нельзя допускать, чтобы колонии mESC становились слишком большими и плотными. Наконец, mESCs необходимо культивировать, по крайней мере, для двух пассажей без 2i перед дифференцировкой, чтобы обеспечить наилучший выход эндотелиальных клеток.

Дифференцировка эндотелия включает два важных этапа: формирование БЭ методом висячей капли и их культивирование в условиях флоатинга в присутствии среды для сосудистой дифференцировки13,14. Движение подвесных тарелок должно быть сведено к минимуму, чтобы добиться равномерной агрегации клеток. Количество мЭСК, используемых для формирования агрегата, в большинстве случаев колеблется в пределах 800-1000 клеток, но, возможно, потребуется оптимизировать, если мЭСК имеют другой генетический фон, чем 129/ола, чтобы обеспечить оптимальную дифференцировку в васкуляризированные БЭ. При культивировании в условиях плавания ЭБ необходимо тщательно распределять и избегать движения, которое способствует слипанию БЭ.

Наконец, БЭ культивируются в геле коллагена I с образованием ростков сосудов. Ангиогенная среда должна быть свежеприготовленной и после смешивания с коллагеном I должна поддерживаться на льду, чтобы избежать спонтанного гелеобразования. В случае тестирования лекарств лекарства добавляются в холодную смесь в нужной концентрации на этом этапе. Регулировка рН с помощью NaOH перед ресуспендированием ЭБ имеет решающее значение, в противном случае кислотность коллагена вызовет токсичность клеток. Наконец, ЭБ должны быть распределены на равном расстоянии друг от друга, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты.

В заключение, этот метод представляет собой 3D-анализ прорастания сосудов на основе mESC, который обладает необходимой надежностью и масштабируемостью для использования для генетического скрининга, как недавно описано Elling U. et al. Это создало большой гаплобанк геми/гомозиготных мутантов mESC16 и для программы открытия фенотипических лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), ведущей программы стипендиатов Марии Склодовской-Кюри COFUND и Ассоциации Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Milipore, Merck 805740 Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
Agar Noble Difco, BD Pharmigen 214220
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG Life technologies A21434
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) BD Biosciences 551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone  R35-95) BD Biosciences 553932
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope ZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) Peprotech 450-33
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R Beckman Coulter 392932
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) Telstar 133H401001
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm Marienfeld 640211
Cell culture dishes 60 x 15mm Corning 353802
Cell culture dishes, 35 x 10 mm Corning 353801
Cell culture plates 12-well Corning 3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Biorad 1855196
Chicken serum Sigma-Aldrich C5405
CHIR-99021 (CT99021) HCl Selleckchem S2924
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg Corning 354249
Collagenase A Roche 10103586001
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 Leica
Cover glasses, 24 × 50 mm Vwr 631-0146
DAPT γ?secretase inhibitor Sigma Aldrich D5942
DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone BioXcell BP0060
DC101 isotype rat IgG1 BioXcell BP0290
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438-5X Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Gibco, Thermofisher scientific 14200067
EDTA 40 mM Gibco, Thermofisher scientific 15575-038
Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum Gibco, Thermofisher scientific 16141-079 Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year
Eppendorf Microcentrifuge 5415R Eppendorf AG  Z605212
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) Roche 11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units  1 mL) Milipore, Merck ESG1107
Falcon tubes 15 mL Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mL Greiner Bio-0ne 227270
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 Greiner Bio-One 739288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 Greiner Bio-One 771288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 Greiner Bio-One 740288
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) Sigma Aldrich F3777
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) Biolegend 400605
Fluorscent mounting media DAKO S3023
Gascompress Cutisoft 45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 cm Bsn Medical 45844_00
Gel blotting paper, Grade GB003 Whatman WHA10547922
Gelatin solution, type B Sigma-Aldrich G1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM) Gibco, Thermofisher scientific 21710082
IHC Zinc Fixative BD Pharmigen 550523
IncuSafe CO2 Incubator PHCBi MCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6) Roche 11138600001
L-Glutamine 200 mM Gibco, Thermofisher scientific 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco, Thermofisher scientific 11140035
Microscope slide box Kartell Labware 278
Microscope slide, Starfrost Knittel glass VS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer Qiagen QT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer Qiagen QT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00114576
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts  (2 M) Gibco, Thermofisher scientific A24903 Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) ATCC SCRC-1033 Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)].
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)].
Mouse embryonic stem cells line E14 Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001).
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) ATCC SCRC-1011 Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)].
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-1000
PD0325901 Selleckchem S1036
PDGF-BB, Recombinant Human Peprotech 100-14B
Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse BD Biosciences 550274
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) Gibco, Thermofisher scientific 15140122
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile Greiner Bio-One 633181
Pipetboy acu 2 Integra-Biosciences 155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200G Gilson F144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G Gilson F167360
Recombinant Human BMP-4 Protein R&D Systems 314-BP
RNeasy Plus mini Kit QIAGEN 74134
Serological pipettes, 10 mL Greiner Bio-One 607 180
Serological pipettes, 25 mL Greiner Bio-One 760 180
Serological pipettes, 5 mL Greiner Bio-One 606 180
Sodium hydroxide (NaOH) Merck 106498
Sodium pyruvate 100 mM Gibco, Thermofisher scientific 11360039
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap Corning 352235
Thermal cycler, T100 Biorad 1861096
Triton X-100 (BioXtra) Sigma Aldrich T9284
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco, Thermofisher scientific 15250061
Trypsin (2.5%) Gibco, Thermofisher scientific 15090046
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL Corning 430758
VEGFA165 , recombinant murine Peprotech 450-32
Water, Sterile Fresenius-Kabi B230531
Waterbath, Lab-Line Digital Thermo Fischer Scientific 18052A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  3. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).
  4. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  5. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
  6. Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
  7. Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
  8. Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
  9. Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).
  10. Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
  11. Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
  12. Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).
  13. Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
  14. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
  15. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  16. Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
  17. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  18. Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
  19. Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
  20. van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).
  21. Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
  22. Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
  23. Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
  24. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  25. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
  26. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
  27. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
  28. Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
  29. Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
  30. Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
  31. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  32. Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
  33. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
  34. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  35. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
  36. Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
  37. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
  38. Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).
  39. Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).
  40. Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17 (2020).
  41. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 171 эмбриональные стволовые клетки мыши прорастающий ангиогенез спецификация эндотелиальных клеток созревание сосудов тестирование лекарств моделирование заболеваний
<em>В пробирке</em> Трехмерный анализ ангиогенеза с использованием эмбриональных стволовых клеток мыши для моделирования сосудистых заболеваний и тестирования лекарств
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Galaris, G., Thalgott, J. H.,… More

Galaris, G., Thalgott, J. H., Teston, E., Lebrin, F. P. G. In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing. J. Vis. Exp. (171), e62554, doi:10.3791/62554 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter