Summary
Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.
Abstract
I recenti progressi nelle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e nelle tecnologie di modifica genetica consentono lo sviluppo di nuovi modelli di malattia basati su cellule umane per programmi di scoperta di farmaci fenotipici (PDD). Sebbene questi nuovi dispositivi possano prevedere la sicurezza e l'efficacia dei farmaci sperimentali negli esseri umani in modo più accurato, il loro sviluppo in clinica dipende ancora fortemente dai dati dei mammiferi, in particolare l'uso di modelli di malattia murina. Parallelamente ai modelli di malattia organoide umana o organo-on-chip, lo sviluppo di pertinenti modelli murini in vitro è quindi un'esigenza insoddisfatta per valutare l'efficacia diretta dei farmaci e i confronti di sicurezza tra specie e condizioni in vivo e in vitro . Qui viene descritto un saggio di germinazione vascolare che utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi (EB). Gli EB vascolarizzati coltivati su gel di collagene 3D sviluppano nuovi vasi sanguigni che si espandono, un processo chiamato angiogenesi che germoglia. Questo modello riassume le caratteristiche chiave dell'angiogenesi in vivo che germoglia la formazione dei vasi sanguigni da una rete vascolare preesistente, compresa la selezione delle cellule della punta endoteliale, la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali, la guida cellulare, la formazione del tubo e il reclutamento delle cellule murali. È suscettibile di screening per farmaci e geni che modulano l'angiogenesi e mostra somiglianze con saggi vascolari tridimensionali (3D) recentemente descritti basati su tecnologie iPSC umane.
Introduction
Negli ultimi tre decenni, la scoperta di farmaci basata sul bersaglio (TDD) è stata ampiamente utilizzata nella scoperta di farmaci dall'industria farmaceutica. TDD incorpora un bersaglio molecolare definito che svolge un ruolo importante in una malattia e si basa sullo sviluppo di sistemi di coltura cellulare relativamente semplici e letture per lo screening dei farmaci1. La maggior parte dei modelli di malattia tipici utilizzati nei programmi TDD includono metodi tradizionali di coltura cellulare come cellule tumorali o linee cellulari immortalizzate coltivate all'interno di ambienti artificiali e substrati non fisiologici. Sebbene molti di questi modelli abbiano fornito strumenti validi per identificare farmaci candidati di successo, l'uso di tali sistemi può essere discutibile a causa della loro scarsa rilevanza per la malattia2.
Per la maggior parte delle malattie, i meccanismi sottostanti sono infatti complessi e vari tipi di cellule, vie di segnalazione indipendenti e più set di geni sono spesso trovati per contribuire a uno specifico fenotipo di malattia. Questo vale anche per le malattie ereditarie in cui la causa primaria è una mutazione in un singolo gene. Con il recente avvento delle tecnologie delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e degli strumenti di modifica genetica, è ora possibile generare organoidi 3D e modelli di malattia organ-on-chip che potrebbero ricapitolare meglio la complessità umana in vivo 3,4. Lo sviluppo di tali tecnologie è associato a una rinascita dell'interesse per i programmi di scoperta di farmaci fenotipici (PDD)1. La PDD può essere paragonata allo screening empirico, in quanto non si basano sulla conoscenza dell'identità di uno specifico bersaglio farmacologico o su un'ipotesi sul suo ruolo nella malattia. L'approccio PDD è ora sempre più riconosciuto per contribuire fortemente alla scoperta di farmaci di prima classe5. Poiché lo sviluppo delle tecnologie organoidi umane e organ-on-chip è ancora agli inizi, si prevede che i modelli iPSC (integrati con strumenti innovativi di imaging e apprendimento automatico6,7) forniranno, nel prossimo futuro, molteplici nuovi modelli di malattia basati su cellule complesse per lo screening dei farmaci e i programmi PDD associati per superare la scarsa produttività dell'approccio TDD8, 9.
Mentre i modelli organoidi umani e organ-on-chip possono fornire importanti informazioni sulla complessità della malattia e sull'identificazione di nuovi farmaci, portare i farmaci nella nuova pratica clinica si basa fortemente anche sui dati provenienti da modelli animali per valutarne l'efficacia e la sicurezza. Tra questi, i topi geneticamente modificati sono sicuramente i modelli di mammiferi più preferiti. Hanno molti vantaggi in quanto hanno un tempo di generazione relativamente breve per i mammiferi, hanno molti fenotipi simili alle malattie umane e possono essere facilmente manipolati geneticamente. Sono quindi ampiamente utilizzati nei programmi di scoperta di farmaci10. Tuttavia, colmare il divario tra topi e umani rimane una sfida importante11. Lo sviluppo di modelli murini in vitro equivalenti agli organoidi umani e ai modelli organo-on-chip potrebbe colmare almeno parzialmente questa lacuna, in quanto consentirà confronti diretti dell'efficacia e della sicurezza dei farmaci tra i dati in vivo sul topo e quelli umani in vitro .
Qui viene descritto un test di germinazione vascolare nei corpi embrioidi di topo (EB). I vasi sanguigni sono composti da cellule endoteliali (rivestimento interno delle pareti dei vasi), cellule murali (cellule muscolari lisce vascolari e periciti)12. Questo protocollo si basa sulla differenziazione di cellule staminali embrionali di topo (mESC) in EB vascolarizzati utilizzando goccioline sospese che ricapitolano de novo la cellula endoteliale e la differenziazione delle cellule murali13,14. Le ESC di topo possono essere facilmente stabilite in coltura da blastocisti isolate di topo al giorno 3.5 con background genetico diverso15. Forniscono anche possibilità per l'analisi clonale, il tracciamento del lignaggio e possono essere facilmente manipolati geneticamente per generare modelli di malattia13,16.
Poiché i vasi sanguigni nutrono tutti gli organi, non sorprende che molte malattie, se non tutte, siano associate a cambiamenti nella microvascolarizzazione. In condizioni patologiche, le cellule endoteliali possono adottare uno stato attivato o possono diventare disfunzionali con conseguente morte delle cellule murali o migrazione lontano dai vasi sanguigni. Questi possono provocare un'eccessiva angiogenesi o rarefazione dei vasi, possono indurre un flusso sanguigno anormale e una barriera dei vasi sanguigni difettosa che porta a stravaso delle cellule immunitarie e infiammazione12,17,18,19. La ricerca per lo sviluppo di farmaci che modulano i vasi sanguigni è, quindi, elevata, e sono già stati identificati molteplici attori e concetti molecolari per il targeting terapeutico. In questo contesto, il protocollo descritto è particolarmente adatto per la costruzione di modelli di malattia e per test farmacologici in quanto riassume le caratteristiche chiave dell'angiogenesi in vivo che germoglia, tra cui la selezione delle cellule endoteliali della punta e del peduncolo, la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali, la guida delle cellule endoteliali, la formazione del tubo e il reclutamento delle cellule murali. Mostra anche somiglianze con saggi vascolari 3D recentemente descritti basati su tecnologie iPSC umane20.
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Protocol
1. Preparazione dei media e cultura del mESC
- Preparare il terreno condizionato +/- (CM+/-) utilizzando il supplemento 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) terreno con il 10% (vol/vol) di siero fetale bovino (FBS) inattivato dal calore, 0,05 mM β-mercaptoetanolo, 1x aminoacidi non essenziali (NEAA 1x), 2 mM L-glutammina e 1 mM di piruvato di sodio.
- Preparare il mezzo condizionato +/+ (CM+/+) utilizzando il mezzo CM+/- con fattore inibitorio della leucemia (LIF) (1.500 U/mL) e 0,1 mM β-mercaptoetanolo.
- Preparare il terreno condizionato +/+ in presenza di due inibitori (CM+/+ 2i) utilizzando il mezzo CM+/+ con 1 μM PD0325901 e 3 μM CHIR99021.
- Preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% mescolando 25 ml di soluzione di gelatina al 2% preriscaldata in 500 ml di soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio (DPBS).
- Preparare 10x tampone Trypsin Versene Phosphate (TVP 10x) mescolando Tripsina (2,5%) con TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% siero di pollo, 0,01% Tripsina (2,5%) in H2O) (rapporto 1:10, vol/vol).
NOTA: filtrare tutte le soluzioni attraverso un filtro per pori da 0,22 μm. Conservare il terreno di coltura a -20 °C per lungo tempo e conservare gli altri reagenti a 4 °C per un massimo di 3 settimane (vedere Tabella dei materiali). - Rivestire due piastre di coltura cellulare a 12 pozzetti con soluzione di gelatina allo 0,1% (500 μL per pozzetto) e incubarle per 30 minuti in un incubatore di CO 2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida).
- Lavare le piastre ricoperte di gelatina con PBS e aggiungere 500 μL di mezzo CM+/-.
- Scongelare due flaconcini di 1 x 106 fibroblasti embrionali di topo (MEF) irradiati crioconservati a 37 °C e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico con 5 mL di mezzo CM+/-.
- Centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Aspirare il terreno e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 12 ml di CM+/- terreno ad una concentrazione di 1,67 x 105 cellule per ml.
- Seminare 500 μL di sospensione di MEF in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti (2,4 x 105 cellule per cm 2) e incubare la piastra per una notte (o/n) in un incubatore di CO2.
- Scongelare un flaconcino di mESC crioconservate (1 x 106) in mezzo CM+/+ 2i.
- Seminare la sospensione di mESC su una piastra prelavata a 12 pozzetti con MEF in 1 mL di mezzo CM+/+ 2i e trasferire la piastra in un incubatore di CO2 . Aggiorna il mezzo ogni giorno.
- Al 70% di confluenza, lavare le colonie di mESC con DPBS. Aggiungere 150 μL di tampone TVP caldo 10x e incubare a RT per 30 s per avviare la dissociazione enzimatica.
- Rimuovere con cautela il tampone TVP, risospendere le cellule in 1 mL di mezzo CM+/+ 2i e dissociare le colonie in singole cellule mediante pipettaggio delicato.
- Far passare le cellule trasferendole in una nuova piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti con MEF (rapporto di scissione: 1:3-1:5). Mescolare delicatamente per distribuire le cellule e incubare in un incubatore di CO2 .
- Rinfrescare il terreno di coltura (2-3 ml) e osservare quotidianamente la crescita/morfologia cellulare. Ripetere il passaggio seriale al 70% di confluenza ogni 2 giorni. Passare al mezzo CM+/+ per due passaggi prima di iniziare la differenziazione cellulare.
2. Formazione di EB in goccia sospesa
- Preparare un nuovo mezzo di differenziazione del mesoderma integrando il terreno CM+/- con il fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) (50 ng·mL-1) e con la proteina morfogenetica ossea 4 (BMP-4) (5 ng·mL-1) e mantenerlo a 4 °C fino all'uso.
- Rivestire un pozzetto della piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con 500 μL di soluzione di gelatina allo 0,1% e metterlo in un incubatore di CO2 per 30 minuti.
- Lavare le piastre ricoperte di gelatina con PBS e aggiungere 500 μL di mezzo CM+/-.
- Per ottenere una popolazione pura di mESC, tripsinizzare la piastra di coltura cellulare con tampone TVP 10x per 30 s a RT, risospendere le cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione del mesoderma e quindi trasferirle sulla piastra a 6 pozzetti rivestita di gelatina per 30 minuti consentendo ai MEF di attaccarsi mentre i mESC rimangono in sospensione.
- Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 ml e contare le cellule utilizzando un emocitometro Neubauer e un colorante blu Trypan per un'esclusione di cellule vive / morte.
- Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel mezzo di differenziazione del mesoderma per raggiungere 4,55 x 104 cellule per ml.
- Riempire il fondo di piatti di polistirene a basso attacco da 94 mm con 15 ml di acqua sterile.
NOTA: Quattro piatti contenenti gocce appese (1,6 x 105 cellule in 3,52 ml di terreno) saranno necessari per testare una particolare condizione utilizzando il saggio di angiogenesi 3D sprouting. - Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio di plastica sterile e caricare quattro posizioni di una pipetta multicanale con 22 μL di sospensione cellulare per canale (1 x 103 celle per 22 μL di goccia).
- Sollevare e capovolgere il coperchio del piatto da 94 mm e posizionarlo sulla superficie pulita dell'armadio di flusso con il lato interno rivolto verso l'alto.
- Depositare 40 gocce della sospensione cellulare sulla superficie interna di ciascun coperchio. Capovolgere con attenzione il coperchio senza disturbi e riposizionarlo sul piatto, in modo che le gocce siano rivolte verso l'acqua.
- Incubare i piatti in un incubatore di CO2 . Considera questo come differenziazione giorno 0. Mantenere le piastre per 4 giorni per formare EB.
3. Saggio di competizione per la posizione della cellula della punta
- Coltura una linea mESC fluorescente e una non fluorescente come descritto in precedenza13. Ad esempio, vengono utilizzati mESC 7ACS/EYFP etichettati in giallo e mESC R1.
- Preparare gli EB a mosaico mescolando quantità uguali delle due linee mESC (rapporto 1:1) e incubare i piatti a goccia sospesi in un incubatore di CO 2 come descritto nella fase2 .
4. Coltura galleggiante di EBs per il differenziamento vascolare
- Prima di raccogliere gli EB dalle gocce sospese, preparare quanto segue.
- Preparare la soluzione di agar al 5% in H2O e sterilizzarla mediante autoclave (20 min a 120 °C).
- Utilizzare la soluzione calda di agar al 5% per preparare G-MEM BHK-21 terreno contenente l'1% di agar e versare rapidamente 3 ml in uno dei piatti di polistirene da 60 mm. Lasciare solidificare l'agar per 1 ora a RT. Conservare le stoviglie a 4 °C fino all'uso.
- Preparare un mezzo di differenziazione vascolare fresco 2x completando il mezzo CM+/- con bFGF (100 ng·mL-1) e VEGF-A (50 ng·mL-1). Conservare il fluido a 4 °C fino all'uso.
- Raccogliere le gocce sospese in un tubo conico da 15 mL utilizzando una pipetta P1000 e rimuovere il surnatante dopo alcuni minuti di sedimentazione EB.
- Risospendere gli EB in 3 mL di mezzo di differenziazione vascolare 2x, trasferire la sospensione EB in un piatto rivestito di agar e distribuire gli EB in modo omogeneo per evitare l'aggregazione.
- Incubare i piatti nell'incubatore CO 2 e rinfrescare il terreno ogni2 giorni fino al giorno 9 utilizzando 1x mezzo di differenziazione vascolare in presenza di bFGF (50 ng·mL-1) e VEGF-A (25 ng·mL-1).
- In alternativa, aggiungere il fattore di crescita derivato dalle piastrine-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 il giorno 4 e 5 ng·mL-1 il giorno 6 e il giorno 8) al mezzo di differenziazione vascolare per promuovere la differenziazione delle cellule murali.
5. Analisi della citometria a flusso
- Raccogliere gli EB di 9 giorni in un tubo conico da 15 mL utilizzando una pipetta P1000 e lavarli una volta con PBS caldo.
- Aggiungere 1 ml di terreno G-MEM BHK-21 contenente 0,2 mg·mL-1 di collagenasi A e incubare le cellule in un incubatore di CO2 per 5 minuti.
- Dissociare gli EB mediante pipettaggio delicato su e giù con una pipetta P1000.
- Interrompere l'attività della collagenasi aggiungendo 1 mL di terreno freddo G-MEM BHK-21 con FBS al 10%.
- Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT.
- Risospendere le cellule in 500 μL di PBS con FBS al 2%.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro Neubauer.
- Risospendere 400.000 cellule in 100 μL di PBS con FBS al 2% per condizione di colorazione.
- Incubare le cellule per 45 minuti a 4 °C con i seguenti anticorpi: APC coniugato ratto anti-topo PECAM-1 anticorpo (clone MEC13.3) e FITC coniugato ratto anti-topo CD45 (clone 30-F11) o anticorpi isotype control.
- Lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS contenente il 2% di FBS.
- Risospendere le cellule per raggiungere una concentrazione finale di 5 x 106 cellule per ml.
- Filtrare le celle utilizzando una provetta in polistirene a fondo rotondo, con un tappo a scatto per filtri cellulare.
- Analizzare 20.000 eventi PECAM-1 (+) mediante citometria a flusso.
6.3D Saggio di angiogenesi germinativa e colorazione con immunofluorescenza
- Al giorno 9, preparare un terreno di germinazione aggiungendo il 10% di FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), eritropoietina ricombinante umana (hEPO) (20 ng·mL-1), interleuchina-6 umana (IL-6) (10 ng·mL-1), 0,05 mM β-mercaptoetanolo, NEAA (1x), L-glutammina (1x), piruvato di sodio (1x), collagene della coda di ratto di tipo I (1,25 mg·mL-1), e NaOH (3,1 mM) al mezzo GMEM BHK-1.
- Per evitare la gelificazione del collagene, mantenere il mezzo di germinazione sul ghiaccio fino all'uso.
- Per valutare l'effetto delle molecole pro/anti-angiogeniche, aggiungere il farmaco o il veicolo selezionato al mezzo di germinazione alla concentrazione selezionata.
- Raccogliere EB di 9 giorni da una capsula di agar da 60 mm in un tubo conico da 15 ml (equivalente a una condizione) e rimuovere il surnatante dopo alcuni minuti di sedimentazione.
- Coprire il fondo di una capsula di coltura da 35 mm con 1 mL del terreno di germinazione e incubare a 37 °C per 5 minuti per indurre la gelificazione.
- Risospendere gli EB in 2 ml di terreno di germinazione a freddo.
- Trasferire la sospensione sul piatto di coltura da 35 mm rivestito con il primo strato di terreno di germinazione.
- Distribuire gli EB su tutta la piastra e assicurarsi che siano a una distanza uguale l'uno dall'altro. Incubare il piatto in un incubatore di CO2 . La prima formazione di germogli avviene entro 24-48 h.
- Al giorno 12, il gel di collagene contenente EB viene accuratamente trasferito su un vetrino (75 x 26 mm) utilizzando una spatola.
- Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta (P1000) e disidratare il gel posizionando un foglio di garza di lino di nylon e schede filtranti assorbenti (carta assorbente) sopra il gel. Applicare pressione posizionando un peso (250 g) per 2 min. Rimuovere con attenzione la carta da filtro in nylon e lasciare asciugare i vetrini all'aria per 30 minuti a RT.
- Lavare i vetrini tre volte con PBS per 5 minuti su RT.
- Fissare gli EB utilizzando una soluzione di zinco (vedi tabella dei materiali) o/n a 4 °C. In alternativa, fissare gli EB fluorescenti a mosaico con Paraformaldeide (PFA) (4%) o/n a 4 °C al buio.
- Rimuovere il fissativo. Lavare i vetrini cinque volte con PBS per 5 minuti su RT.
- Permeabilizzare gli EB in PBS contenenti lo 0,1% di Triton-X100 per 15 minuti a RT.
- Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione. Lavare i vetrini cinque volte con PBS per 5 minuti.
- Incubare gli EB nel tampone bloccante (PBS con 2% di albumina sierica bovina, BSA) per 1 ora a RT.
- Per colorare i germogli endoteliali, utilizzare un anticorpo primario anti-topo anti-PECAM-1 (diluizione 1:100) nel tampone o/n bloccante a 4 °C.
- Lavare i vetrini cinque volte con PBS per 5 minuti.
- Incubare i vetrini con l'anticorpo secondario Alexa 555 anti-ratto di capra nel tampone bloccante (diluizione 1:250) e, quando necessario, con l'anticorpo anti-α-SMA coniugato con FITC nel tampone bloccante (diluizione 1:250) per colorare le cellule murali per 2 ore a RT al buio.
- Lavare le guide tre volte con PBS per 5 minuti e una volta con H20 prima di montarle.
7. Imaging confocale, analisi morfometrica e quantitativa di germogli endoteliali EB
- Acquisire immagini ad alta risoluzione degli EB immunocolorati mediante fusione del piano focale (z-stacking) utilizzando un microscopio confocale. Usa l'obiettivo di ingrandimento 10x per visualizzare interi EB.
- Analizzare le immagini acquisite utilizzando ImageJ per valutare la morfologia e quantificare le caratteristiche dei germogli endoteliali PECAM-1 positivi secondo i metodi di quantificazione stabiliti13,14,21.
- Calcola il numero medio di germogli endoteliali per EB contando manualmente il numero totale di germogli per singoli EB.
- Misurare le singole lunghezze dei germogli utilizzando lo strumento di disegno ImageJ. Definire la base del germoglio endoteliale a partire dall'area centrale EB e tracciare manualmente una linea fino all'estremità della punta del germoglio.
- Calcolare il numero medio di cellule di punta per germoglio contando manualmente il numero di celle di punta per singolo germoglio e quindi calcolare la media per EB.
- Calcolare l'orientamento della filopodia determinando manualmente l'asse del germoglio genitore e misurare l'angolo acuto tra di essi utilizzando lo strumento angolare del software ImageJ. Calcola il numero di germogli con un orientamento >50° e dividilo per il numero totale di germogli dell'EB di interesse.
NOTA: Gli angoli variavano sempre da 0° a 90°.
- Acquisire immagini ad alta risoluzione degli EB immunocolorati utilizzando un microscopio confocale. Utilizza l'obiettivo di ingrandimento 40x per realizzare immagini ad alta risoluzione di singoli germogli endoteliali.
- Quantificare la copertura dei vasi dei germogli EC positivi a PECAM-1 circondati da MC positivi α-SMA utilizzando il software ImageJ.
- Dividi le immagini unite in canali rossi e verdi separati.
- Converti le immagini nella sua forma binaria.
- Misurare l'area cellulare totale del germoglio occupata separatamente da PECAM-1 (cellule endoteliali marcate in rosso) e da cellule positive α-SMA (cellule murali etichettate in verde).
- Generare l'immagine unita utilizzando la funzione calcolatrice di immagini e l'operatore AND. Misurare l'area cellulare totale dell'immagine. Per calcolare la copertura, dividere l'area dell'immagine colocalizzata per l'area dell'immagine binaria PECAM-1.
- Per analizzare la competizione cellulare per la posizione delle cellule endoteliali di punta / stelo dei germogli sviluppati dagli EB a mosaico, valutare manualmente il numero di cellule di punta e contrassegnare la loro origine genotipica in base al segnale di fluorescenza. Calcola i valori medi per EB.
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Representative Results
La panoramica del protocollo del test di germinazione dei vasi sanguigni è mostrata nella Figura 1. Gli EB di nove giorni derivati da tre linee mESC indipendenti 129/Ola (Z/Red, R1 ed E14) sono stati dissociati enzimaticamente in singole cellule usando la collagenasi A. Le cellule sono state colorate per PECAM-1 e analizzate mediante Fluorescence-activated cell sorting (FACS) come descritto. Tutte le linee cellulari hanno mostrato una robusta differenziazione endoteliale e non sono state osservate differenze nella loro capacità di differenziarsi in cellule endoteliali. Tutte le linee cellulari hanno prodotto circa il 10,5% ± l'1,3% delle cellule endoteliali (Figura 2A). Sono stati inoltre quantificati i livelli di espressione relativa dei marcatori cellulari PAN-endoteliali nelle popolazioni cellulari PECAM-1 (+). I livelli di espressione dell'mRNA di tutti i marcatori analizzati (Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2 e Cdh5) erano comparabili tra le linee cellulari e gli esperimenti, confermando la robustezza del protocollo di differenziazione (Figura 2B). Le popolazioni cellulari PECAM-1 (+) hanno espresso solo livelli molto bassi di mRNA di marcatori arteriosi (Notch1 ed Efnb2) o venosi (Couptf2 ed Ephb4) a sostegno dello stato relativamente immaturo delle cellule endoteliali generate dal protocollo (Figura 2C).
È stata quindi dimostrata la capacità del modello EB di germinazione vascolare di selezionare farmaci che modulano l'angiogenesi (Figura 3). Sono stati testati DC101 e DAPT (N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-Lalanyl]-S-fenylglycine t-butylester). Questi composti sono ampiamente utilizzati nei topi rispettivamente per bloccare l'angiogenesi inibendo l'attività di VEGFR2 o per promuovere la differenziazione delle cellule della punta endoteliale e la formazione di un denso plesso vascolare mirando alla segnalazione di Notch (Figura 3A). Entrambe le vie di segnalazione VEGF e Notch sono regolatori chiave dell'angiogenesi germinativa in vivo. Sono stati valutati gli effetti di varie concentrazioni di DC101 e DAPT in EB placcati in collagene I. Alte dosi di DC101 comprese tra 6 e 30 mg· L-1 ha inibito sia il numero che la lunghezza dei germogli del vaso mentre DAPT ha avuto effetti opposti alla dose di 1 μmol· L-1 (Figura 3B-C). Vengono inoltre fornite immagini ad alto ingrandimento dei germogli del vaso colorati per PECAM-1 di EB coltivati in presenza di DAPT (Figura 3D). DAPT anche a basse dosi comprese tra 0,5-1 μmol· L-1 ha fortemente aumentato il numero di cellule della punta endoteliale con germogli di vaso che avevano un fenotipo errata (Figura 3D-F). Alte dosi di DAPT hanno anche portato alla coalescenza dei vasi e alla formazione di aree cellulari endoteliali ampie e piatte senza organizzazione (Figura 3A). I risultati hanno confermato la capacità del modello di testare farmaci che promuovono o inibiscono l'angiogenesi.
Per confermare che questo modello è adatto per imitare le malattie vascolari, vengono fornite le immagini confocali delle EB derivate da Acvrl1+/- mESC. Il gene Acvrl1 codifica per ALK1 (Activin Receptor-like Kinase 1), un recettore specificamente espresso nelle cellule endoteliali che, se mutato, è responsabile dello sviluppo di una malattia rara vascolare con angiodisplasia denominata teleangectasia emorragica ereditaria (HHT). Un'immagine ad alto ingrandimento dei germogli endoteliali Acvrl1+/- ha rivelato che avevano più cellule della punta endoteliale e più rami per germoglio che erano ad angoli casuali rispetto ai vasi genitori. Questi hanno confermato in vitro un fenotipo errata come osservato nei topi HHT (Figura 4).
Formando EB chimerici che contengono mESC differenziate marcate fluorescentmente e mESC di un particolare genotipo, viene incluso un protocollo alternativo per studiare il processo di selezione della punta endoteliale (Figura 5A-C). Un'immagine confocale dei germogli di vaso marcati con PECAM-1 ha identificato l'origine genotipica delle principali cellule della punta endoteliale (Figura 5B). Le miscele di una linea mESC wild-type YFP (proteina fluorescente gialla) con rapporto 1:1 con una linea wild-type mESC non marcata hanno portato costantemente allo stesso contributo di ciascuna popolazione alle principali cellule della punta endoteliale (Figura 5C).
Questo protocollo è adatto anche per quantificare la copertura cellulare murale del germoglio del vaso. Gli EB sottoposti ad angiogenesi sono stati fissati e colorati per PECAM-1 (cellule endoteliali, rosse) e per α-Smooth Muscle Actin (α-SMA) (cellule murali, verde) (Figura 5D). Un'immagine ad alto ingrandimento ha rivelato come un singolo germoglio di vaso fosse circondato da celle murali (Figura 5E, a sinistra). La trasformazione binaria è stata eseguita dopo la separazione del canale di colore (Figura F-G) per quantificare il rapporto del vaso PECAM-1 (+) coperto da cellule murali α-SMA (+) utilizzando il software ImageJ (Figura 5H).
Figura 1: Cronologia delle procedure del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione delle EC derivate dal differenziamento vascolare delle mESC all'interno delle EB. (A) Analisi citometrica a flusso dell'espressione di CD31 da EBs di 9 giorni e quantificazione della percentuale di cellule Pecam-1 (+). (B-D) livelli di espressione dell'mRNA di Pecam-1, Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2, Cdh5, Notch1, EfnB2, Couptf2 ed EphB4 in cellule endoteliali selezionate da EB di 9 giorni. Le barre di errore rappresentano la media ± l'errore standard della media (SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Saggio di angiogenesi 3D per test antidroga. (A) Immagini confocali di tre EB rappresentativi colorati per Pecam-1 (cellule endoteliali bianche) trattati con il solo veicolo, DAPT (0,5 μmol· L-1, 1,0 μmol· L-1, 5,0 μmol· L-1) o DC101 (3 mg· L-1, 6 mg· L-1, 30 mg· L-1). (B) Quantificazione del numero di germogli per EB. (C) Quantificazione della lunghezza del germoglio. (D) Sul pannello in alto a sinistra, alto ingrandimento del germoglio endoteliale che mostra la complessità della rete e il punto di diramazione contando su due diversi strati dallo stesso EB, sul pannello in basso a sinistra un'illustrazione schematica che rappresenta il metodo di misurazione dell'orientamento del germoglio endoteliale. Sul pannello in alto a destra, alto ingrandimento dei germogli endoteliali dal solo veicolo e sul pannello in basso a destra, alto ingrandimento dei germogli endoteliali dal DAPT (0,5 μmol· L-1) condizione. (E) Quantificazione del numero di cellule di punta per germoglio. (F) Quantificazione della percentuale di filopodi entro un angolo >50°. Tutte le barre rappresentano i valori medi ± SEM e p dal test ANOVA unidirezionale non accoppiato. ns = non significativo, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 e ****p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Germogliamento di vasi difettosi negli EB ereditari di teleangectasie emorragiche. Sul pannello superiore, immagini confocali di EB rappresentativi di 12 giorni da genotipi Acvrl1+/+ e Acvrl1+/- colorati per Pecam-1 (cellule endoteliali bianche). Sul pannello inferiore, alto ingrandimento dei germogli endoteliali Acvrl1+/- (riquadro bianco dal pannello superiore) che mostrano numerose cellule della punta (frecce rosse), punti di ramificazione endoteliale (punti blu) e fenotipo di spuntamento errato (frecce verdi). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Studio della posizione delle cellule di punta/peduncolo e della maturazione dei vasi utilizzando il saggio di germinazione 3D. (A) Immagine confocale di un EB chimerico rappresentativo di 12 giorni costituito da linea cellulare wild-type R1 mista 1:1 con linea cellulare wild-type 7ACS/EYFP colorata per Pecam-1 (cellule endoteliali rosse). Le frecce rosse indicano le celle di punta della linea cellulare R1 e le frecce verdi indicano le celle della punta della linea cellulare 7ACS/EYFP. (B) Elevato ingrandimento di un germoglio endoteliale che mostra la distribuzione della cellula endoteliale R1 e 7ACS/EYFP lungo il germoglio. (C) Quantificazione delle cellule di punta relative di genotipizzazione da EB wild-type rappresentativi. (D) Immagine confocale di un EB rappresentativo di 12 giorni colorato per Pecam-1 (rosso, cellule endoteliali) e α-SMA (verde, cellule murali). (E) Alto ingrandimento di un germoglio endoteliale (riquadro punteggiato rettangolare bianco da D) che mostra l'interazione murale/cellula endoteliale. (F-G) Immagini del germoglio endoteliale colorato e delle immagini trasformate binarie associate. (H) Immagine binaria della colorazione Pecam-1 e α-SMA co-localizzata. Rapporto di germogli di cellule endoteliali coperti da cellule murali. Tutte le barre rappresentano la media ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un test imparziale, robusto e riproducibile basato sulla germinazione vascolare 3D basato su EB che è suscettibile di screening per farmaci e geni che modulano l'angiogenesi. Questo metodo offre vantaggi rispetto a molti saggi bidimensionali (2D) ampiamente utilizzati che utilizzano colture di cellule endoteliali come le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) per monitorare la migrazione (test di graffio laterale o il saggio della camera di Boyden)22,23 o proliferazione (conteggio del numero di cellule, rilevamento della sintesi del DNA, rilevamento di marcatori di proliferazione o saggi metabolici)24 In quanto consente in modo univoco lo studio della differenziazione delle cellule endoteliali e murali e della loro organizzazione in una rete vascolare che imita i passaggi chiave dell'angiogenesi germinativa. Questi passaggi includono la selezione delle cellule della punta endoteliale, la proliferazione delle cellule del gambo, l'orientamento spaziale e la migrazione del germoglio del vaso e il reclutamento di cellule murali nel vaso sanguigno nascente25. Offre anche vantaggi a molti modelli di angiogenesi 3D. Il saggio di fibrina26,27 o gel di collagene28,29,30 che imita la tubulogenesi comunemente usano HUVEC o cellule endoteliali derivate da colonie endoteliali (ECFC-EC) in quanto hanno un alto tasso proliferativo ma non sono adatte per le cellule endoteliali primarie di topo che sono difficili da mantenere in coltura. L'espianto ex vivo della retina31 o il test vascolarizzato dei microorgani32 possono ricapitolare bene tutte le fasi di formazione dei vasi sanguigni, ma hanno procedure sperimentali complesse e non sono adatti per lo screening genetico o di farmaci ad alto rendimento. Questo vale anche per il saggio dell'anello aortico ex vivo 33,34 e per molti saggi in vivo come tumori impiantati nei topi o studi sulla perdita di funzione nei topi che hanno spesso costi elevati e difficoltà nell'ottenere grandi quantità di dati 35. Questo protocollo integra anche saggi di angiogenesi in vitro simili che utilizzano iPSC umane consentendo confronti tra dati murini e umani. Sebbene sia importante notare che le cellule endoteliali umane derivate da iPSC mostrano meno capacità di germogliare rispetto alle cellule di topo36,37.
Il metodo sviluppato qui ha anche alcune limitazioni. Non può valutare gli effetti del flusso di fluido sulla maturazione dei vasi sanguigni, sulla permeabilità dei vasi sanguigni e non produce vasi sanguigni nascenti in un ambiente tissutale specifico rispetto ai recenti dispositivi microfabbricati che sono in fase di sviluppo. Infatti, le tecnologie organ-on-chip che combinano la microfluidica con l'ingegneria tissutale possono fornire alle cellule endoteliali in coltura un microambiente simile a quello in vivo38,39. I sistemi microfluidici contengono la corretta composizione della matrice extracellulare e sono progettati per produrre segnali meccanici come lo sforzo di taglio. Alcuni sono progettati per incorporare cellule murali e altre cellule di supporto di un determinato tessuto o possono generare gradienti chimici. Contengono reti di canali riempiti di fluido su scala micron che sono simili per dimensioni e struttura ai capillari sanguigni. Le tecnologie organ-on-chip consentono inoltre la quantificazione di specifiche funzioni vascolari, tra cui la permeabilità e la resistenza elettrica transendoteliale. Sebbene le tecnologie organ-on-chip offrano promesse, sono ben oltre l'esperienza di ricerca della maggior parte dei laboratori di biologia, hanno ancora bisogno di una standardizzazione adeguata e richiedono tecniche di fabbricazione specializzate. La commercializzazione della produzione di tecnologia organ-on-chip è solo all'inizio, e questi sistemi sono considerati proibitivi in termini di costi e tempi per le aziende farmaceutiche attualmente40,41.
Ci sono diversi passaggi critici che dovrebbero essere presi in considerazione. Utilizzare cellule di alta qualità che esprimano in modo robusto marcatori ben accettati (Nanog, Oct4, Sox2 e SSEA-1) dello stato pluripotente. È essenziale monitorare attentamente la loro crescita, la forma delle cellule mES e le dimensioni e la morfologia delle colonie di mES. Poiché la stabilità cariotipica è stocastica nelle cellule in coltura, è essenziale rivalutarla dopo un lungo passaggio. Si raccomanda di utilizzare prodotti già testati per la coltura di mESC e testare gli alimentatori MEF, il siero fetale di vitello e tutti i composti chimici per diversi passaggi per rilevare se le mESC mantengono le loro proprietà cellulari o se si differenziano o acquisiscono un fenotipo epiblastico. Il terreno dovrebbe essere rinfrescato quotidianamente e le colonie di mESC non dovrebbero diventare troppo grandi e dense. Infine, le mESC devono essere coltivate almeno per due passaggi senza 2i prima della differenziazione per garantire la migliore resa delle cellule endoteliali.
Il differenziamento endoteliale comprende due passaggi importanti: la formazione di EB utilizzando il metodo della goccia sospesa e la loro coltura in condizioni di galleggiamento in presenza di mezzo di differenziazione vascolare13,14. Il movimento dei piatti a goccia sospesi deve essere ridotto al minimo per ottenere un'aggregazione cellulare uniforme. Il numero di mESC utilizzate per formare un aggregato nella maggior parte dei casi, varia tra 800-1.000 cellule, ma potrebbe essere necessario ottimizzarlo se le mESC hanno un background genetico diverso da 129/ola per garantire una differenziazione ottimale in EB vascolarizzate. Quando coltivati in condizioni fluttuanti, gli EB devono essere distribuiti con cura ed evitare movimenti che favoriscano l'aggregazione dell'EB.
Gli EB vengono infine coltivati in gel di collagene I per formare germogli di vaso. Il terreno angiogenico deve essere preparato al momento e una volta miscelato con collagene I deve essere mantenuto su ghiaccio per evitare gelificazioni spontanee. In caso di test antidroga, i farmaci vengono aggiunti nella miscela fredda alla giusta concentrazione durante questa fase. Regolare il pH con NaOH prima di risospendere gli EB è fondamentale, altrimenti l'acidità del collagene causerà tossicità cellulare. Infine, gli EB dovrebbero essere distribuiti a equidistanza l'uno dall'altro per garantire risultati riproducibili.
In conclusione, questo metodo introduce un saggio di germinazione vascolare 3D basato su mESC che ha la robustezza e la scalabilità richieste per essere utilizzato per lo screening genetico come recentemente descritto da Elling U. et al. che ha generato una grande aplobanca di mutante emi/omozigote mESC16 e per il programma di scoperta di farmaci fenotipici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, e dall'Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ?secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
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