Summary
Kraalbelasting introduceert eiwitten, plasmiden en deeltjes in aanhankelijke zoogdiercellen. Deze celbelastingstechniek is goedkoop, snel en heeft geen substantiële invloed op de gezondheid van cellen. Het is het meest geschikt voor live-cell imaging.
Abstract
Veel live-cell imaging-experimenten gebruiken exogene deeltjes (bijv. peptiden, antilichamen, kralen) om cellen te labelen of te functioneren. Het introduceren van eiwitten in een cel over het membraan is echter moeilijk. De beperkte selectie van huidige methoden worstelt met lage efficiëntie, vereist dure en technisch veeleisende apparatuur of functioneert binnen smalle parameters. Hier beschrijven we een relatief eenvoudige en kosteneffectieve techniek voor het laden van DNA, RNA en eiwitten in levende menselijke cellen. Kraalbelasting induceert een tijdelijke mechanische verstoring van het celmembraan, waardoor macromoleculen kunnen binnendringen in aanhankelijke, levende zoogdiercellen. Met minder dan 0,01 USD per experiment is het laden van kralen de goedkoopste methode voor het laden van cellen die beschikbaar is. Bovendien heeft het laden van kralen geen substantiële stress voor cellen of invloed op hun levensvatbaarheid of proliferatie. Dit manuscript beschrijft de stappen van de procedure voor het laden van kralen, aanpassingen, variaties en technische beperkingen. Deze methodologie is vooral geschikt voor beeldvorming van levende cellen, maar biedt een praktische oplossing voor andere toepassingen die de introductie van eiwitten, kralen, RNA of plasmiden in levende, aanhankelijke zoogdiercellen vereisen.
Introduction
Het laden van macromoleculen in zoogdiercellen vereist een methodologie waarmee ze het plasmamembraan van de cel kunnen passeren1. Verschillende methoden kunnen plasmiden in zoogdiercellen introduceren door transfectie, waaronder liposomale transfectie2 en diethylaminoethyl-dextran transfectie3. Methoden voor het laden van eiwitten of membraandoordringbare deeltjes in cellen zijn echter beperkter.
Verschillende technieken hebben deze moeilijke hindernis omzeild met behulp van verschillende strategieën. Ten eerste levert micro-injectie deeltjes via een micropipette af in levende cellen onder een microscoop4. Hoewel het misschien wel de meest gecontroleerde en minst invasieve methode is, is deze techniek relatief laag omdat cellen één voor één moeten worden geladen. Verder vereist micro-injectie gespecialiseerde apparatuur en is het technisch veeleisend.
Ten tweede is elektroporatie een manier om eiwitten in cellen te injecteren via spanningsgeïnduceerdemembraanverstoring 5,6,7. Deze methode vereist echter opnieuw gespecialiseerde, dure apparatuur en de schok kan celstress en mortaliteit veroorzaken. Verder moeten cellen vóór elektroporatie worden trypsiniseerd en vervolgens opnieuw worden geplateerd, waardoor het tijdsbestek wordt beperkt waarop cellen na elektroporatie kunnen worden onderzocht.
Ten derde kunnen celmembranen chemisch worden gemodificeerd voor tijdelijke, omkeerbare permeabilisatie8,9. Streptolysine-O-belasting brengt een endotoxine in celmembranen in, dat tijdelijke poriën vormt, waardoor exogene membraandoordringbare deeltjes, waaronder eiwitten en DNA-plasmiden, cellen kunnen binnendringen10. Na een herstel van 2 uur herstelt ongeveer de helft van de cellen deze poriën en stopt het internaliseren van deeltjes uit de oplossing. Deze techniek vereist echter een lange hersteltijd en is onverenigbaar met celtypen die endotoxinen niet kunnen verdragen.
Ten vierde laadt mechanische verstoring deeltjes in cellen door fysieke verstoring van het celmembraan11. Dit kan op meerdere manieren worden gedaan, waaronder krabben, schrapen en rollen van kralen bovenop cellen12,13. Al in 1987 werden kralen gebruikt om eiwitten mechanisch in cellen te laden14. Meer recent is de kralenbelastingstechniek geoptimaliseerd en aangepast buiten eiwitten om de belasting van plasmiden en RNA op te nemen, zoals hier beschreven.
Kraal laden is een eenvoudige, goedkope en snelle methode voor het laden van eiwitten en plasmiden in hechtende menselijke cellen. Glasparels worden kort bovenop cellen gerold, waardoor hun celmembraan tijdelijk wordt verstoord. Hierdoor kunnen deeltjes in oplossing binnendringen. Omdat het laden van kralen een laag rendement heeft, is het het meest geschikt voor experimenten met eencellige of eencellige microscopie. Kraalbelasting kan een breed scala aan eiwitten introduceren, waaronder gefragmenteerde antilichamen (Fab),15,16 gezuiverde eiwitten zoals scFvs,17 intrabodies,18,19of mRNA-coatingeiwitten, bijvoorbeeld MS2-coatingeiwit (MCP)20,21. Plasmide-expressievectoren kunnen ook aan de eiwitoplossing worden toegevoegd en tegelijkertijd22, 23,24, 25wordengeladen.
Naast eiwitten en plasmiden zijn moleculen zo groot als 250 nm polystyreenparels in cellen geïntroduceerd via kraalbelasting (persoonlijke communicatie). Het laden van kralen is ongelooflijk goedkoop, kost minder dan 0,01 USD per experiment in materialen en vereist geen extra dure apparatuur. De kosten worden verder verlaagd door het minimaliseren van het aantal sondes dat per experiment wordt gebruikt, omdat alleen de cellen in de centrale microwell met een diameter van 14 mm van een beeldvormingskamer worden geladen. Opgemerkt moet worden dat de beperkte laadruimte betekent dat het laden van kralen niet ideaal is voor het laden van bulkcellen.
Dit manuscript presenteert het proces van het laden van kralen, inclusief hoe het kralenbelastingsapparaat te construeren en een experiment uit te voeren. Het toont aan dat eiwitten, RNA en DNA in verschillende celtypen kunnen worden geladen en dat twee verschillende, tegelijkertijd met kralen geladen eiwitten sterk gecorreleerde cellulaire concentraties en een relatief lage variantie hebben. Ook worden variaties in het protocol besproken op basis van celtype en belasting van eiwit, plasmide of RNA. Hoewel wordt gedacht dat kralen het celmembraan perforeren en verstoren, maakt het kralenbelastingsproces, wanneer het op de juiste manier wordt uitgevoerd, slechts een klein aantal cellen los van de bodem van de beeldvormingskamer. Na een korte herstelperiode blijven cellen groeien en delen. Deze methodologie is ideaal voor live-cell microscopie-experimenten, waaronder single-molecule eiwit- en RNA-tracking, posttranslationele modificatiedetectie, observatie van dynamische cellulaire mechanismen of subcellulaire lokalisatiemonitoring15,16,22,26,27.
Protocol
1. Reinig, steriliseer en droog glasparels om klonteren te voorkomen en zorg voor een gelijkmatige verspreiding bovenop de cellen.
- Steriliseer ongeveer 5 ml glasparels in natriumhydroxide (NaOH). Meet de kralen in een conische buis van 50 ml. Voeg 25 ml van 2 M NaOH toe en meng voorzichtig met een shaker of rotator gedurende 2 uur.
- Decanteer de NaOH, met behoud van zoveel mogelijk kralen. Als de kralen in suspensie zijn, draai dan de buis met kralen kort in een centrifuge (1 min bij ~ 1000 × g, kamertemperatuur).
- Was de kralen grondig met water van celkweekkwaliteit totdat de pH neutraal is (gebruik een pH-teststrip op het eluent om een neutrale pH te bevestigen). Decanteer het waswater elke keer, zoals voorheen.
- Was de kralen grondig met 100% ethanol 2-3x. Decanteer de ethanol elke keer, zoals voorheen.
- Droog de kralen. Strooi de kralen tot een dun laagje in een steriele bak (zoals een petrischaaltje van 10 cm). Laat de container open en laat de kralen een nacht aan de lucht drogen in een bioveiligheidskast. Zorg ervoor dat de kralen volledig droog zijn door op de container te tikken of voorzichtig te schudden en te controleren of de kralen een zanderige textuur hebben zonder klonteren of schilferen.
- UV-steriliseer de droge kralen gedurende 15 min.
2. Monteer het kraalladerapparaat.
- Bevestig een stuk gaas (polypropyleen of gelijkwaardig materiaal, openingen van 105 μm om de kralen door te laten) om de volledige opening van de kralenkamer te bedekken met tape of het klemmen van het gaas tussen de mannelijke en vrouwelijke uiteinden van een metalen herbruikbare beeldvormingskamer (Figuur 1A).
- UV-steriliseer het apparaat gedurende 15 minuten. Voeg de kralen toe aan het apparaat en sluit het goed af met wasachtige film.
OPMERKING: Het is essentieel dat de kralen bij deze stap volledig schoon en droog zijn. Ze moeten los zijn en er zanderig uitzien zonder klonten. Als ze er niet zo uit zien, was en droog de kralen dan opnieuw en droog ze volledig. - Bewaar het apparaat in een afgesloten, droge container die is uitgedroogd door silicagel of een ander droogmiddelmedium. Als de kralen vochtig worden, wat zichtbaar zal zijn door het klonteren van kralen, droog en steriliseer de kraallader grondig en vervang deze door verse kralen.
OPMERKING: Al deze voorzorgsmaatregelen voorkomen dat schimmels of bacteriën op of rond de kralen in de kralenlader groeien. Het kralenladerapparaat kan op verschillende manieren worden gemaakt. Zie de details in de discussie.
3. Bereid glazen bodemkamers van aanhankelijke cellen voor.
- Zaadaanhangende zoogdiercellen op een glazen bodemkamer van 35 mm. Zorg ervoor dat de cellen ongeveer 80% confluent zijn op het moment van het laden van de kraal. (Zie tabel 1 voor meer informatie over verschillende celtypen en opmerkingen over de effectiviteit van het laden van kralen in verschillende celtypen.)
OPMERKING: Cellen kunnen alleen in de microwell in het midden van de kamer worden gezaaid om te besparen hoeveel cellen worden gebruikt. - Incubeer de cellen onder normale omstandigheden totdat ze volledig aan het glas hechten.
OPMERKING: Het is essentieel dat de celdichtheid hoog genoeg is en dat de cellen stevig aan het glas zijn gehecht. Als niet aan deze vereisten wordt voldaan, zullen cellen waarschijnlijk afbladderen tijdens het laden van kralen. De tijdlijn tussen celzaaien en het laden van kralen kan worden verlengd om een goede celadhesie en confluentie te garanderen.
4. Cellen voor het laden van kralen
OPMERKING: Was de cellen indien nodig kort met fosfaatbuffered saline (PBS) en voeg vervolgens 2 ml van het optimale medium toe. Incubeer gedurende ten minste 30 minuten.
- Maak een oplossing van 3-8 μL die de gewenste plasmiden, eiwitten en/of deeltjes bevat. Gebruik ~ 1 μg (0,1-1 pmol) van elk type plasmide en ~ 0,5 μg (0,01 nmol) eiwit, afhankelijk van de experimentele vereisten. Gebruik een buis met lage retentie voor eiwitten, zodat ze niet achterblijven op de buiswanden. Breng de oplossing tot een minimum van 3 μL met PBS en pas het oplossingsvolume aan om het hele gebied van de te laden cellen te coaten (d.w.z. de microwell van de kamer, figuur 1B).
- Meng de oplossing grondig door op en neer te pipetteren en/of de buis te vegen. Draai de oplossing kort naar de bodem van de buis in een microfuge op tafel.
- Breng de kraalbelastingsoplossing en de kamer van cellen over in een weefselkweekkap. Voer de resterende stappen in de weefselkweekkap uit met behulp van steriele techniek.
- Verwijder het medium uit de cellen en bewaar het tijdelijk in een steriele buis. Adem voorzichtig al het medium op van rond de randen van de kamer en kantel de kamer in een hoek van ongeveer 45 ° en verwijder de resterende druppel media in de middelste microwell. Zorg er tijdens het medium verwijderen voor dat de pipetpunt het glas niet raakt, wat kan leiden tot celafbladering en verlies. Ga snel naar de volgende stap, zodat de cellen niet lang droog zijn.
- Pipetteer voorzichtig de oplossing voor het laden van kralen op de glazen microruimte in het midden van de kamer. Optioneel: Incubeer met zacht schommelen gedurende ~ 30 s zonder de kamer volledig te laten opdrogen.
- Verspreid voorzichtig een monolaag van glasparels over de cellen, bij voorkeur met behulp van een kraallaadapparaat (figuur 1A). Zorg ervoor dat de kralen de cellen in de microwell met glazen bodem volledig bedekken.
- Knijp de kamer met twee vingers, tik hem tegen het kapoppervlak door hem ~ 2 inch op te tillen en stevig naar beneden te brengen. Gebruik een kracht die ongeveer gelijk is aan het laten vallen van het gerecht vanaf die hoogte. Herhaal dit voor een totaal van ~ 10 tikken.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de kranen de cellen niet substantieel afbladderen. Tikken kan worden geoptimaliseerd voor het celtype. Als cellen slecht laden, tik dan harder; Als er echter veel cellen afbladderen, tik dan lichter. - Voeg voorzichtig medium terug in de kamer door langzaam te pipetteren op de plastic kant van de kamer. Probeer eventuele zwevende kralen op te zuigen zonder de cellen te storen. Voeg bij deze stap meer voorverwarmde media toe als er te veel is verwijderd. Incubateer de cellen gedurende 0,5-2 uur in de incubator.
- UV-steriliseer de kraallader gedurende 15 minuten voordat u deze terugbrengt naar de opslag onder uitsicingsomstandigheden.
- Voeg kleurstof (bijv. DAPI- of HaloTag-ligandvlek, indien vereist door het experiment) toe aan de cellen volgens het door de fabrikant aanbevolen protocol.
- Was de cellen 3x met medium voordat u de afbeelding afbeeldt om de kralen en overtollige belastingscomponenten in de oplossing te verwijderen. Pipetteer niet rechtstreeks op cellen om te voorkomen dat ze afbladderen.
5. Beeldvorming van de met kralen geladen cellen
- Stel de cellen onmiddellijk in beeld of wanneer dit nodig is voor het experiment. Gebruik een microscoop die fluorescentie kan vastleggen (lasers of monochromatische lichtbron). Zorg ervoor dat de excitatiegolflengten geschikt zijn voor de gekozen fluorofoor of kleurstof (bijv. 488 nm golflengtelicht voor groen fluorescentie-eiwit (GFP)).
OPMERKING: Met kralen geladen eiwitten kunnen in beeld worden gebracht zodra de cellen zijn hersteld (zodra 30 minuten na het laden voor de hier beschreven cellijnen). Plasmide-expressie duurt ≥2 uur, afhankelijk van expressievectorelementen(figuur 1Cen verdere uitleg in de discussie). Beeldvorming van kralenbelaste cellen kan worden uitgevoerd op elke microscoop die is uitgerust met de juiste fluorescerende bronnen die zijn gekoppeld aan geladen sondes, een camera die fluorescentiebeelden kan vastleggen, zoals een elektronvermenigvuldigend ladingsgekoppeld apparaat (EMCCD) of een wetenschappelijke complementaire metaaloxide halfgeleider (sCMOS) camera, en een incubator om temperatuur, vochtigheid en koolstofdioxide te regelen. Voor een gids voor fluorescentiemicroscopie, zie 27.
Representative Results
De meest voorkomende toepassing van kraalbelasting is het introduceren van een of meer soorten eiwitten in aanhankelijke menselijke cellen. Om dit te illustreren, werden cellen geladen met een oplossing van een Cy3- en Alexa488-geconjugeerd Fab-eiwit. Hoewel niet elke cel in de microwell was geladen met kralen, hadden de cellen die werden geladen bijna altijd zowel Cy3- als Alexa488-gelabelde eiwitten samen(Figuur 2A). Volgens een eerdere schatting, wanneer 0,5 microgram Fab verdund in 4 microliter wordt geladen met kralen29, zoals in figuur 2A,wordt elke cel geladen met ongeveer 106 Fab-moleculen.
Plasmide DNA coderend voor GFP (1 μg plasmide DNA, 1,8 μL van een 557 ng/μL oplossing) en 0,5 μg Cy3-gelabelde Fab werd ook via kraalbelasting in cellen ingebracht en vervolgens uitgedrukt en gevisualiseerd(Figuur 2B). De GFP-fluorescentie gaf aan dat het GFP-coderende plasmide niet alleen in cellen werd geladen, maar ook tot expressie werd gebracht. In dezelfde cel kan het laden van kralen dus een eiwitsonde (bijv. Cy3-gelabeld Fab) en reporterplasmide (bijv. GFP) introduceren, zoals eerder in dit laboratorium werd uitgevoerd22,23,24. We stelden vast dat 40% van de cellen vol zat met Fab-eiwit en 21% van de met kralen geladen cellen het co-loaded plasmide tot expressie kwam, zoals weergegeven in de representatieve gezichtsvelden in figuur 2B. Meestal is elke kamer geladen met 1-2 μg plasmide, ongeveer dezelfde hoeveelheid als lipofectie.
Cellen met kralen beladen brengen sterk uiteenlopende niveaus van plasmiden tot expressie(figuur 2C,D). Om dit specifiek te meten, gebruikten we de Fisher Ratio-test om de verdelingen van eiwit- en plasmide-intensiteitsgegevens te vergelijken. De resultaten toonden aan dat hoewel eiwitten 1 en 2 vergelijkbare intensiteitsverdelingen hadden (p = ~ 1), elk eiwit een significant kleinere verdeling had dan het plasmide (p = 3,2e-6 en 1,8e-5). Hoewel dit te wijten kan zijn aan variabiliteit in het aantal plasmiden dat per cel wordt geladen, kan de grotere bron van variabiliteit voortkomen uit de vele stappen die nodig zijn voor plasmide-expressie die waarschijnlijk sterk variëren tussen cellen, inclusief geïmporteerd worden in de celkern, transcriptie en translatie. Daarentegen hadden de niveaus van met kralen geladen eiwitten een lichte cel-tot-celvariantie en de niveaus van twee gelijktijdig geladen eiwitten waren sterk met elkaar gecorreleerd (Figuur 2D,E).
Plasmide-expressie kan al 2-4 uur na het laden van de kraal worden gezien, maar kan later optreden, afhankelijk van wanneer optimale plasmide-expressie wordt verkregen. We raden aan om een tijdscursus uit te voeren om het beste expressievenster te bepalen voor een specifiek plasmide dat 2-24 uur na het laden van de kraal overspant. Dit kan worden gedaan in één kamer met beeldvorming met een lang tijdsbestek of door het laden en verspringen van meerdere kamers. Bead-loaded cellen blijven hechtend en zijn gezond genoeg om te groeien en te delen. Bead-geladen menselijke U2OS-cellen werden direct voor, direct na en 24 uur na het laden van kralen in beeld gebracht. Een goede kraalbelasting had bijna geen merkbaar effect op het aantal cellen of hun morfologie, zoals weergegeven in figuur 3A (links, midden).
Daarentegen is een slechte kraalbelasting met te veel kralen en overmatige tikkracht weergegeven in figuur 3B. Dit veroorzaakte veel celverlies (grote delen van het afdekglas zonder cellen en losse, zwevende, onscherp gemaakte cellen), slechte celmorfologie (cellen die naar boven afgerond en slecht gehecht lijken) en clusters van kralen die na het laden van de kraal op het dekglas achterbleven. Hoewel wordt gedacht dat cellen mechanische schade ondergaan tijdens het laden van kralen, groeiden en prolifereerden cellen in de goed met kralen geladen kamer, zoals blijkt uit het toegenomen aantal cellen 24 uur na het laden van kralen(figuur 3A,rechts). Het effect op de levensvatbaarheid van cellen kan worden beoordeeld door middel van verschillende assays, zoals een 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, om kralen geladen met mock-loaded cellen te vergelijken30. Verder tonen dit en eerder werk aan dat de met kralen geladen cellen celdeling ondergaan (Figuur 3C en Aanvullende Video 1), en de timing van mitose wordt niet beïnvloed door kraalbelasting31, wat dient als verder bewijs voor aanhoudende celgezondheid na het laden van kralen.
Kraalbelasting is een veelzijdige techniek, die plaats biedt aan verschillende aanhangende cellijnen en verschillende macromoleculen. Hier is deze variëteit aangetoond door RPE1- en HeLa-cellijnen te laden met Fab(Figuur 4A,B). Tabel 1 geeft verdere voorbeelden van het laden van kralen in verschillende cellijnen, in dit laboratorium en daarbuiten, en wijst op enkele van de genuanceerde verschillen tussen protocollen voor het laden van kralen uit andere laboratoria. Van belang is dat de diameter van glaskralen die worden gebruikt voor het laden sterk varieert tussen laboratoria, hoewel de meest efficiënte belasting werd gevonden voor kleine kralen met een diameter van 75 μm in verschillende cellijnen14. Verder is dit laboratorium ook begonnen met het laden van RNA (gegevens niet getoond). Figuur 4C toont een representatieve U2OS-celkraal geladen met een Cy5-RNA 9mer en Cy3-DNA 28mer samen.
Figuur 1: Kraal laadapparaat, techniek en tijdlijn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Kraalbelasting introduceert lage variabiliteit in eiwitconcentratie, maar hoge variabiliteit in plasmide-expressie. (A) Cellen werden geladen met 0,5 μg van elk van Alexa488-geconjugeerde anti-H3K27 acetyl Fab (groen) en Cy3-geconjugeerde anti-RNAPII-Serine 5-gefosforyleerde Fab (rood) in 4 μL kralenbelastingsoplossing. Cellen werden DAPI-gekleurd (blauw) en vervolgens onmiddellijk live-gebeeld. Schaalstaven = 20 μm. (B) Cellen werden geladen met 0,5 μg Fab-eiwit (Cy3-geconjugeerd anti-RNAPII-Serine 5-gefosforyleerd eiwit, rood) en 1 μg plasmidecodering supermap GFP-H2B (groen) in 4 μL kralenbelastingsoplossing. Na 24 uur werden cellen DAPI-gekleurd (blauw) en live in beeld gesteld. Schaalstaven = 30 μm. (C-E) Eiwit 1 (JF646-HaloLigand-gelabeld HaloTag-MCP), eiwit 2 (Cy3-geconjugeerd anti-FLAG Fab) en een plasmide dat codeerde voor EGFP (λN-EGFP-LacZ) werden samen in cellen geladen. De totale intensiteit in elk fluorescerend kanaal werd gemeten in een pleister van 1,3 x 1,3 μm in het cytoplasma van elke cel. N = 25 cellen. (C) Representatieve cellen die het met kralen geladen plasmide, λN-EGFP-LacZ, tot expressie brengen. Voor alle cellen werden dezelfde beeldvormende omstandigheden en intensiteiten gebruikt. Vlekken zijn aggregaten van het tot expressie gebrachte eiwit. Schaalstaven = 10 μm. (D) De grafiek toont de totale intensiteit van elke cel van eiwit 1, eiwit 2 of EGFP uitgedrukt uit het plasmide. Elk kanaal werd genormaliseerd naar de mediaan. Bonferroni-gecorrigeerde P-waarden werden berekend met de Fisher Ratio-test om te bepalen of de verdeling van eiwit- of plasmide-intensiteitsgegevens dezelfde variabiliteit heeft. Elk punt vertegenwoordigt een cel. (E) De totale intensiteiten voor beide eiwitten, eiwit 1 en het plasmide, of eiwit 2 en het plasmide, worden tegen elkaar uitgezet. Berekende R2-waarden worden weergegeven. Elk punt vertegenwoordigt een cel. Afkortingen: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; EGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; A.U. = willekeurige eenheden; MCP = MS2-vachteiwit; RNAPII = RNA polymerase II. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bead-loaded cellen blijven hechtend en zijn gezond genoeg om te groeien en te delen. (A) U2OS-cellen werden geladen met 0,5 μg Cy3-geconjugeerde anti-FLAG Fab in 4 μL kraalbelastingsoplossing. De cellen werden direct voor, direct na het laden van de kraal en 24 uur na het laden van de kraal in beeld gebracht. Oranje pijlen identificeren gebieden waar cellen afbladderden tijdens het laden van kralen. Schaalbalken = 2 mm. (B) Representatief beeld van U2OS-cellen die zijn geladen met componenten van (A) maar met hard tikken en te veel kralen. De rode pijl identificeert extra glasparels. Schaalbalk = 2 mm. (C) U2OS-cellen werden geladen met 1,5 μg van de 14,4 kbp plasmide smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 μg Cy3-geconjugeerde anti-FLAG Fab (groen), 130 ng HaloTag-MCP (magenta) in 8 μL kralenlaadoplossing. Vlak voor de beeldvorming werd de HaloTag gekleurd met JF646-HaloLigand. De MS2-stengellussen van het mRNA getranscribeerd uit het reporterplasmide worden gelabeld door MCP (magenta-vlekken) en FLAG-tagged vertaald reporter-eiwit wordt gelabeld door anti-FLAG Fab (groene colocalisatie naar mRNA). Volwassen Fab-gelabeld eiwit lokaliseert naar de kern. Deze cel werd 4-15 uur na het laden van de kraal in beeld gebracht. Gele pijlen identificeren de celkern voor en kernen na celdeling. Schaalbalken = 5 μm. Afkorting: MCP = MS2 coat protein. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Variaties in het celtype laadmateriaal van het kraalbelastingsprotocol. (A-B) RPE1 (A) en HeLa (B) cellen werden geladen met 1,5 μg van een nucleair Fab-eiwit (anti-RNAPII-Serine 5-fosforylering) in 4 μL laadoplossing. De kern van elke cel (nuc) en cytoplasma (cyto) zijn gemarkeerd. Cellen werden 6 uur na het laden van kralen in beeld gebracht. Schaalstaven = 5 μm. (C) Menselijke U2OS-cellen werden geladen met zowel Cy5-RNA 9mer (magenta) als Cy3-DNA 28mer (groene) oligo's, 10 picomol van elk, in 4 μL parelladingsoplossing. Cellen werden 4 uur na het laden van kralen in beeld gebracht. Alle celkernen worden gemarkeerd door een stippellijn. Schaalbalken = 5 μm. Afkortingen: RNAPII = RNA polymerase II. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Cellijn | Celtype | Effectiviteit van het laden van kralen | Opmerkingen/referentie |
| Stamcellen (menselijk) | Embryonale stamcellen | Moeilijk | * Veel cellen pellen af tijdens het laden van kralen als ze op met gelatine beklede platen worden geplateerd |
| Hek 293 | Menselijke embryonale niercellen | Moeilijk | * Noodzaak om een gelmatrix op het oppervlak van de beeldvormingskamer te leggen voordat de kraal wordt geladen. Tik zachtjes wanneer de kraal in het begin wordt geladen. |
| Neuronen (rat) | Primaire embryonale neuronen (e-18), gedissocieerd | Zeer inefficiënt | * Efficiënte kraalbelasting van neuronen werd niet waargenomen met behulp van dit standaard protocol voor het laden van kralen. Dit kan te wijten zijn aan de niet-adherente aard van neuronen of aan de daaruit voortvloeiende schade aan neurale processen. |
| MDCK (hond) | Madin-Darby canine niercellen | Zie McNeil en Warder (1987)14 | * Laag-efficiëntie kraal laden14 |
| U2OS (menselijk) | Osteosarcoom | Standaard protocol voor het laden van kralen | |
| HeLa (mens) | Baarmoederhalskanker | Standaard protocol voor het laden van kralen | |
| RPE1 (menselijk) | Epitheelcellen vereeuwigd met hTERT | Standaard protocol voor het laden van kralen | |
| HFF (menselijk) | Primaire voorhuidfiblasten | Zie Besteiro et al. (2009)31 | *Aangepast protocol van kantelen in plaats van tikken31 |
| BALB/c 3T3, NIH 3T3 en Swiss 3T3 (muis) | Embryonale fibroblasten | Zie Gilmore en Romer (1996)32, Emerson et al. (2014)33 en McNeil en Warder (1987)14 | *425-600 μm glasparels gemeld32 |
| * Gebruikte 200-300 μm glaskralen33 | |||
| *75 μm glasparels gaven betere resultaten dan 400 μm14 | |||
| DM (Indiase muntjac) | Huidfibroblasten | Zie Manders, Kimura en Cook (1999)34 | |
| CHO (hamster) | Epitheliale-achtige eierstokcellen | Zie Memedula en Belmont (2003)35 | * Gebruikte 425-600 μm glaskralen35 |
| BAE (rund) | Runderaorta-endotheelcellen (BAEC-11) | Zie McNeil en Warder (1987)14 | *75 μm glasparels gaven betere resultaten dan 400 μm14 |
| PtK-2 (Potomus tridaclylis) | Epitheliale niercellen | Zie McNeil en Warder (1987)14 | *75 μm glasparels gaven betere resultaten dan 400 μm14 |
| HUVEC (menselijk) | Navelstreng endotheliale cellen | Zie Gilmore en Romer (1996)32 | * Gebruikte 425-600 μm glasparels32 |
| J774 en J774.2 (muis) | monocyte macrofaagcellen | Zie Becker et al. (2005)36 en McNeil en Warder (1987)14 | * Zachte agitatie (in plaats van tikken) en 425-600 μm glaskralen36 |
| MS-5 (muis) | beenmerg stromale cellen | Zie Molenaar et al. (2003)37 | |
| WPE1-NB11 (menselijk) | prostaat epitheelcellen | Zie Gilmore en Romer (1996)32 en | * Gebruikte 425-600 μm glasparels32 |
| Emerson et al. (2014)33 | * Gebruikte 200-300 μm glaskralen33 |
Tabel 1: Kraalbelasting in verschillende cellijnen. Voor de cellijnen die in dit laboratorium nog niet zijn geladen, worden referenties en opmerkingen over variaties in het protocol verstrekt.
Aanvullende video 1: Voorbeeld van een met kralen geladen cel die celdeling ondergaat. U2OS-cellen werden geladen met 1,5 μg van het 14,4 kbp plasmide smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 μg Cy3-geconjugeerde anti-FLAG Fab (groen), 130 ng HaloTag-MCP (magenta) in 8 μL kraallaadoplossing. Vlak voor de beeldvorming werd de HaloTag gekleurd met JF646-HaloLigand. De MS2-stengellussen van het mRNA getranscribeerd uit het reporter plasmide worden gelabeld door MCP (magenta spots), en FLAG-tagged vertaald reporter eiwit wordt gelabeld via anti-FLAG Fab (groene colocalisatie naar mRNA). Volwassen Fab-gelabeld eiwit lokaliseert naar de kern. Deze cel werd 4-15 uur na het laden van de kraal in beeld gebracht. Schaalbalk = 10 μm. Afkorting: MCP = MS2 coat protein. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
De hier beschreven kraalbelastingstechniek is een kosteneffectieve en tijdsefficiënte methode voor het introduceren van macromoleculen en andere deeltjes in aanhankelijke cellen. Dit veelzijdige proces kan eiwitten laden(Figuur 2A)15,16,26,27,een combinatie van eiwitten en plasmiden(Figuur 2B,C)22,25,RNA(Figuur 4C),100 en 250 nm polystyreenparels (persoonlijke correspondentie), synthetische kleurstoffen39 of quantum dots34,40 . Kraalbelasting kan ook de mogelijkheid hebben om andere soorten membraandoordringbare deeltjes te laden. De meest gebruikte toepassing is het laden van antilichamen of Fabs om endogene epitopen, zoals post-translationele modificaties (PTM's), in levende cellen te richten. Doelwitten, zoals PTM's, zijn vaak moeilijk te labelen in levende cellen zonder gevestigde PTM-specifieke, genetisch gecodeerde sondes41,42. Daarentegen kan het laden van kralen meerdere soorten sondes, reporters of andere moleculaire hulpmiddelen samen in dezelfde cel introduceren voor het tegelijkertijd bewaken van meerdere uitlelingen. We verwachten dat het laden van kralen een nuttige techniek zal zijn voor het laden van een verscheidenheid aan macromoleculen of deeltjes.
Een groot voordeel van het laden van kralen is de lage kosten: elk experiment kost minder dan 0,01 USD. Een kralenladerapparaat kan gemakkelijk worden gemaakt met behulp van goedkope materialen die in totaal ~ $ 150 kosten, wat aanzienlijk goedkoper is dan elke andere methode voor het laden van cellen. De kosten van een kralenlader kunnen verder worden verlaagd tot minder dan $ 10 door de herbruikbare metalen kamer te vervangen door een plastic kamer. Boor hiervoor een gat in een kamer van 35 mm of verwijder het glas uit een glazen bodemkamer van 35 mm en bevestig het gaas vervolgens stevig op zijn plaats met tape. In plaats van een apparaat kan het laden van kralen zelfs worden uitgevoerd met behulp van een pipetpunt met een brede boring van 1000 μL om kralen op cellen te scheppen en te strooien, hoewel deze variatie het moeilijk maakt om een monolaag van kralen op cellen te strooien (stap 4.6).
Een ander voordeel van het laden van kralen is dat cellen de normale algehele morfologie kunnen behouden, snel kunnen herstellen en blijven groeien en delen, althans voor de hier bestudeerde U2OS-, RPE1- en HeLa-cellen en voor de andere elders bestudeerde cellijnen (Figuur 3; Figuur 4A(B); Aanvullende video 1; en tabel 1)31. Tijdens het laden van kralen ondergaan cellen fysieke stress en verdrijven en schilferen soms (~ 5% van de cellen schilt onder optimale omstandigheden, maar groter celverlies kan optreden als het laden van kralen te krachtig wordt uitgevoerd of als er te veel glasparels bovenop de cellen worden geladen, zoals afgebeeld in figuur 3B). Cellen met kralen die aan de coverslip blijven vastzitten, zien er echter meestal gezond uit en kunnen al 30 minuten na het laden van de kraal worden afgebeeld(figuur 3A). We staan cellen over het algemeen een herstelperiode van 30 minuten toe, maar verwachten dat beeldvorming eerder na het laden van de parel haalbaar is.
Een groot nadeel van deze techniek is dat de cellen bestand moeten zijn tegen kleine fysieke belasting tijdens het laden en zich stevig aan de coverslip moeten blijven hechten. Slecht/niet-hechtende cellijnen of cellen die op gecoate platen zijn gekweekt (bijv. HEK en stamcellen) komen vaak los bij zacht tikken tijdens het laden van kralen. Verder heeft de ervaring geleerd dat primaire neuronen te gevoelig zijn voor het laden van kralen.
Kraalbelasting is het meest geschikt voor experimenten met één cel of één molecuul. In onze ervaring heeft het laden van kralen een efficiëntie van ongeveer 20-40% eiwitbelasting, en ~ 20% van de cellen met kralenbelaste cellen kwam ook tot expressie met een co-loaded plasmide(figuur 2A,B). Kraalladende plasmiden kunnen dus minder efficiënt zijn voor eiwitexpressie dan parellading gezuiverde eiwitten, omdat plasmiden niet alleen cellen moeten binnendringen, maar ook tot expressie moeten worden gebracht (wat onder andere nucleaire import, transcriptie en vertaling inhoudt, die elk de expressie-efficiëntie kunnen verlagen). De lage efficiëntie van met kralen geladen plasmide-expressie kan worden omzeild door alternatieve transfectieprotocollen te gebruiken, zoals lipofectie, voordat kralen eiwitten of sondes laden16,27. Bovendien kan het incuberen van cellen in optimale media gedurende 30 minuten voordat de kraal wordt geladen, de plasmide-expressie bevorderen. Vanwege de lage plasmide-expressie is kraalbelasting niet vaak gebruikt als alternatief voor op lipofectie gebaseerde transfectie in dit laboratorium. De enige uitzondering is wanneer een gezuiverd eiwit, zoals Fab, moet worden samengeladen, in welk geval het heel handig is om het eiwit en plasmide tegelijkertijd te kralen. Bovendien kan voor cellen die niet reageren of intolerant zijn voor lipofectie, het laden van kralen een alternatieve, zij het weinig efficiënte, methode bieden voor voorbijgaande plasmide-expressie.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
We zijn de leden van het Stasevich-lab dankbaar voor talloze gesprekken die hebben bijgedragen aan het verbeteren en ontwikkelen van dit protocol. In het bijzonder Dr. Linda Forero en Dr. Phil Fox voor advies over het laden van kralen in verschillende celtypen. We willen Dr. Yoko Hayashi-Takanaka, Dr. Yuko Sato en Dr. Hiroshi Kimura oprecht bedanken voor het delen van hun protocol voor het laden van glazen kralen. We zijn Dr. Ashok Prasad en Dr. Diego Krapf erg dankbaar voor het genereus delen van hun kralenbelastingsprotocollen voor het introduceren van anorganische deeltjes in cellen. We zijn Dr. Travis Sanders, Craig Marshall en Dr. Thomas Santangelo dankbaar voor het genereus delen van hun gelabelde RNA-reagens. ALK, MNS, CAC, GG en TJS werden ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidie R35GM119728 en de National Science Foundation (NSF) CAREER grant MCB-1845761, beide aan TJS. CAC werd ook ondersteund door de NSF NRT award DGE-1450032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
| 35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
| Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
| Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
| Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
| L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
| Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
| Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
| Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |
References
- Stewart, M. P., et al. In vitro and ex vivo strategies for intracellular delivery. Nature. 538 (7624), 183-192 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Schenborn, E. T., Goiffon, V. DEAE-dextran tansfection of mammalian cultured cells. Methods in Molecular Biology. 130, 147-153 (2000).
- Celis, J. E. Microinjection of somatic cells with micropipettes: comparison with other transfer techniques. Biochemical Journal. 223 (2), 281-291 (1984).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15494-15500 (1989).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. American Journal of Physiology. 260 (2), 355-363 (1991).
- Potter, H. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. 62 (1), 1-6 (2003).
- Fawell, S., et al. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (2), 664-668 (1994).
- Prior, T. I., FitzGerald, D. J., Pastan, I. Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol. Biochemistry. 31 (14), 3555-3559 (1992).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3185-3190 (2001).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Reports. 13 (8), 709-715 (2012).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98 (4), 1556-1564 (1984).
- Ortiz, D., Baldwin, M. M., Lucas, J. J. Transient correction of genetic defects in cultured animal cells by introduction of functional proteins. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 3012-3017 (1987).
- McNeil, P. L., Warder, E. Glass beads load macromolecules into living cells. Journal of Cell Science. 88 (5), 669-678 (1987).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Research. 39 (15), 6475-6488 (2011).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352 (6292), 1425-1429 (2016).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Zhao, N., et al. A genetically encoded probe for imaging nascent and mature HA-tagged proteins in vivo. Nature Communications. 10 (1), 2947 (2019).
- Jedlitzke, B., Mootz, H. D. Photocaged nanobodies delivered into cells for light activation of biological processes. ChemPhotoChem. 5 (1), 22-25 (2021).
- Coulon, A., et al. Kinetic competition during the transcription cycle results in stochastic RNA processing. eLife. 3, 03939 (2014).
- Pichon, X., Robert, M. -C., Bertrand, E., Singer, R. H., Tutucci, E. New generations of MS2 variants and MCP fusions to detect single mRNAs in living eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 2166, 121-144 (2020).
- Koch, A., et al. Quantifying the dynamics of IRES and cap translation with single-molecule resolution in live cells. Nature Structural & Molecular Biology. 27, 1095-1104 (2020).
- Moon, S. L., et al. Multicolor single-molecule tracking of mRNA interactions with RNP granules. Nature cell biology. 21 (2), 162-168 (2019).
- Moon, S. L. Coupling of translation quality control and mRNA targeting to stress granules. Journal of Cell Biology. 219 (8), 202004120 (2020).
- Cialek, C. A., et al. Imaging translational control by Argonaute with single-molecule resolution in live cells. bioRxiv. , (2021).
- Forero-Quintero, L. S., et al. Live-cell imaging reveals the spatiotemporal organization of endogenous RNA polymerase II phosphorylation at a single gene. bioRxiv. , (2020).
- Lyon, K., Aguilera, L. U., Morisaki, T., Munsky, B., Stasevich, T. J. Live-cell single RNA imaging reveals bursts of translational frameshifting. Molecular Cell. 75 (1), 172-183 (2019).
- JoVE. Introduction to Fluorescence Microscopy. General Laboratory Techniques. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Hayashi-Takanaka, Y., Yamagata, K., Nozaki, N., Kimura, H. Visualizing histone modifications in living cells: spatiotemporal dynamics of H3 phosphorylation during interphase. Journal of Cell Biology. 187 (6), 781-790 (2009).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Stasevich, T. J., et al. Regulation of RNA polymerase II activation by histone acetylation in single living cells. Nature. 516 (7530), 272-275 (2014).
- Besteiro, S., Michelin, A., Poncet, J., Dubremetz, J. -F., Lebrun, M. Export of a Toxoplasma gondii rhoptry neck protein complex at the host cell membrane to form the moving junction during invasion. PLOS Pathogens. 5 (2), 1000309 (2009).
- Gilmore, A. P., Romer, L. H. Inhibition of focal adhesion kinase (FAK) signaling in focal adhesions decreases cell motility and proliferation. Molecular Biology of the Cell. 7 (8), 1209-1224 (1996).
- Emerson, N. T., Hsia, C. -H., Rafalska-Metcalf, I. U., Yang, H. Mechanodelivery of nanoparticles to the cytoplasm of living cells. Nanoscale. 6 (9), 4538-4543 (2014).
- Manders, E. M. M., Kimura, H., Cook, P. R. Direct imaging of DNA in living cells reveals the dynamics of chromosome formation. Journal of Cell Biology. 144 (5), 813-822 (1999).
- Memedula, S., Belmont, A. S. Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16. Current Biology. 13 (3), 241-246 (2003).
- Becker, T., Volchuk, A., Rothman, J. E. Differential use of endoplasmic reticulum membrane for phagocytosis in J774 macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4022-4026 (2005).
- Molenaar, C., et al. Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probes. The EMBO Journal. 22 (24), 6631-6641 (2003).
- Jones, S. A., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
- Sabri, A., Xu, X., Krapf, W. M. Elucidating the origin of heterogeneous anomalous diffusion in the cytoplasm of mammalian cells. Physical Review Letters. 125 (5), 053901 (2020).
- Sato, Y., et al. Genetically encoded system to track histone modification in vivo. Scientific Reports. 3, 2436 (2013).
- Sato, Y., Stasevich, T. J., Kimura, H. Visualizing the dynamics of inactive X chromosomes in living cells using antibody-based fluorescent probes. X-Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, Humana. New York, NY, USA. 91-102 (2018).
