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Biology

Perlas cargando proteínas y ácidos nucleicos en células humanas adherentes

Published: June 1, 2021 doi: 10.3791/62559
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Colorado State University, 2World Research Hub Initiative, Institute of Innovative Research, Tokyo Institute of Technology

Summary

La carga de perlas introduce proteínas, plásmidos y partículas en las células de mamíferos adherentes. Esta técnica de carga celular es económica, rápida y no afecta sustancialmente la salud celular. Es más adecuado para imágenes de células vivas.

Abstract

Muchos experimentos de imágenes de células vivas utilizan partículas exógenas (por ejemplo, péptidos, anticuerpos, perlas) para etiquetar o funcionar dentro de las células. Sin embargo, la introducción de proteínas en una célula a través de su membrana es difícil. La selección limitada de métodos actuales lucha con la baja eficiencia, requiere equipos costosos y técnicamente exigentes, o funciones dentro de parámetros estrechos. Aquí, describimos una técnica relativamente simple y rentable para cargar ADN, ARN y proteínas en células humanas vivas. La carga de perlas induce una interrupción mecánica temporal de la membrana celular, permitiendo que las macromoléculas entren en células de mamíferos vivas adherentes. A menos de 0.01 USD por experimento, la carga de cuentas es el método de carga celular menos costoso disponible. Además, la carga de perlas no estresa sustancialmente las células ni afecta su viabilidad o proliferación. Este manuscrito describe los pasos del procedimiento de carga de cuentas, adaptaciones, variaciones y limitaciones técnicas. Esta metodología es especialmente adecuada para la obtención de imágenes de células vivas, pero proporciona una solución práctica para otras aplicaciones que requieren la introducción de proteínas, perlas, ARN o plásmidos en células de mamíferos vivas y adherentes.

Introduction

La carga de macromoléculas en células de mamíferos requiere una metodología que les permita cruzar la membrana plasmática de la célula1. Varios métodos pueden introducir plásmidos en las células de mamíferos a través de la transfección, incluida la transfección liposomal2 y la transfección dietilaminoetil-dextrano3. Sin embargo, los métodos para cargar proteínas o partículas impermeables a la membrana en las células son más limitados.

Varias técnicas han evitado este difícil obstáculo utilizando varias estrategias. En primer lugar, la microinyección entrega partículas a través de una micropipeta a las células vivas bajo un microscopio4. Si bien podría decirse que es el método más controlado y menos invasivo, esta técnica tiene un rendimiento relativamente bajo porque las células deben cargarse una por una. Además, la microinyección requiere equipos especializados y es técnicamente exigente.

En segundo lugar, la electroporación es una forma de electroinyectar proteínas en las células a través de la interrupción de la membrana inducida por voltaje5,6,7. Sin embargo, este método nuevamente requiere equipos especializados y costosos, y el choque puede causar estrés celular y mortalidad. Además, las células deben ser tripsinizadas antes de la electroporación y posteriormente replanteadas, lo que limita el período de tiempo en el que las células pueden ser investigadas después de la electroporación.

En tercer lugar, las membranas celulares pueden modificarse químicamente para la permeabilización temporal y reversible8,9. La carga de estreptolysin-O inserta una endotoxina en las membranas celulares, que forma poros temporales, permitiendo que las partículas exógenas impermeables a la membrana, incluidas las proteínas y los plásmidos de ADN, entren en las células10. Después de una recuperación de 2 h, aproximadamente la mitad de las células reparan estos poros y detienen la internalización de partículas de la solución. Sin embargo, esta técnica requiere un largo tiempo de recuperación y es incompatible con los tipos de células que no pueden tolerar las endotoxinas.

Cuarto, la interrupción mecánica carga partículas en las células a través de la perturbación física de la membrana celular11. Esto se puede hacer de múltiples maneras, incluyendo rascar, raspar y enrollar cuentas sobre las celdas12,13. Ya en 1987, las perlas se han utilizado para cargar proteínas en las células mecánicamente14. Más recientemente, la técnica de carga de perlas se ha optimizado y adaptado más allá de las proteínas para incluir la carga de plásmidos y ARN, como se describe aquí.

La carga de perlas es un método fácil, económico y rápido para cargar proteínas y plásmidos en células humanas adherentes. Las perlas de vidrio se enrollan brevemente sobre las células, interrumpiendo temporalmente su membrana celular. Esto permite que entren partículas en solución. Como la carga de perlas tiene una baja eficiencia, es más adecuada para experimentos de microscopía de una sola molécula o de una sola célula. La carga de perlas puede introducir una amplia variedad de proteínas, incluidos anticuerpos fragmentados (Fab),15,16 proteínas purificadas como scFvs,17 intracuerpos,18,19o proteínas de recubrimiento de ARNm, por ejemplo, proteína de capa MS2 (MCP)20,21. Los vectores de expresión de plásmidos también se pueden agregar a la solución de proteínas y cargar perlas simultáneamente22,23,24,25.

Más allá de las proteínas y los plásmidos, moléculas tan grandes como perlas de poliestireno de 250 nm se han introducido en las células a través de la carga de perlas (comunicación personal). La carga de cuentas es increíblemente barata, cuesta menos de 0.01 USD por experimento en materiales y no requiere equipo costoso adicional. El costo se reduce aún más al minimizar la cantidad de sondas utilizadas por experimento porque solo se cargan las células en el micronúculo central de 14 mm de diámetro de una cámara de imágenes. Cabe señalar que el área de carga limitada significa que la carga de perlas no es ideal para la carga de celdas a granel.

Este manuscrito presenta el proceso de carga de cuentas, incluyendo cómo construir el aparato de carga de cuentas y realizar un experimento. Muestra que las proteínas, el ARN y el ADN se pueden cargar en varios tipos de células y que dos proteínas diferentes, cargadas simultáneamente con cuentas, tienen concentraciones celulares altamente correlacionadas y una varianza relativamente baja. También se discuten las variaciones en el protocolo basadas en el tipo de célula y la carga de proteínas, plásmidos o ARN. Aunque se cree que las perlas perforan e interrumpen la membrana celular, cuando se realizan adecuadamente, el proceso de carga de perlas desaloja solo un pequeño número de células de la parte inferior de la cámara de imágenes. Después de un corto período de recuperación, las células continúan creciendo y dividiéndose. Esta metodología es ideal para experimentos de microscopía de células vivas, incluido el seguimiento de proteínas y ARN de molécula única, la detección de modificaciones postraducción, la observación de mecanismos celulares dinámicos o el monitoreo de localización subcelular15,16,22,26,27.

Protocol

1. Limpie, esterilice y seque las cuentas de vidrio para evitar que se agrupen y asegurar que se extiendan uniformemente sobre las células.

  1. Esterilizar aproximadamente 5 ml de perlas de vidrio en hidróxido de sodio (NaOH). Mida las perlas en un tubo cónico de 50 ml. Añadir 25 mL de 2 M de NaOH y mezclar suavemente con un agitador o rotador durante 2 h.
  2. Decantar el NaOH, reteniendo tantas cuentas como sea posible. Si las cuentas están en suspensión, gire el tubo de cuentas brevemente en una centrífuga (1 min a ~ 1000 × g,temperatura ambiente).
  3. Lave bien las perlas con agua de grado de cultivo celular hasta que el pH sea neutro (use una tira reactiva de pH en el eluyente para confirmar un pH neutro). Decanta el agua de lavado cada vez, como antes.
  4. Lave bien las perlas con etanol 100% 2-3x. Decantar el etanol cada vez, como antes.
  5. Secar las cuentas. Espolvoree las cuentas para formar una capa delgada dentro de un recipiente estéril (como una placa de Petri de 10 cm). Dejando el recipiente abierto, deje que las perlas se sequen al aire en un gabinete de bioseguridad durante la noche. Asegúrese de que las perlas estén completamente secas golpeando o agitando suavemente el recipiente y verificando que las cuentas tengan una textura arenosa sin aglutinamiento ni descamación.
  6. Esterilizar con UV las perlas secas durante 15 min.

2. Ensamble el aparato cargador de cuentas.

  1. Sujete un parche de malla (polipropileno o material equivalente, aberturas de 105 μm para permitir el paso de las perlas) para cubrir toda la abertura de la cámara de sujeción de cuentas con cinta adhesiva o sujetando la malla entre los extremos macho y hembra de una cámara de imagen reutilizable de metal(Figura 1A).
  2. Esterilizar el aparato por UV durante 15 min. Agregue las cuentas al aparato y séllelo herméticamente con una película cerosa.
    NOTA: Es esencial que las cuentas estén completamente limpias y secas en este paso. Deben estar sueltos y verse arenosos sin grumos. Si no lo parecen, vuelva a lavar y seque completamente las cuentas.
  3. Guarde el aparato en un recipiente seco y sellado y desecado por gel de sílice u otro medio desecante. Si las perlas se humedecen, lo que será evidente al aglutinar las cuentas, seque y esterilice completamente el cargador de cuentas y reemplácelo con cuentas frescas.
    NOTA: Todas estas precauciones evitarán que crezca moho o bacteria en o alrededor de las cuentas dentro del cargador de cuentas. El aparato cargador de cuentas se puede hacer de diferentes maneras. Vea los detalles en la discusión.

3. Prepare cámaras con fondo de vidrio de células adherentes.

  1. Semillas de células de mamíferos adherentes en una cámara con fondo de vidrio de 35 mm. Asegúrese de que las celdas sean aproximadamente 80% confluentes en el momento de la carga de la perla. (Consulte la Tabla 1 para obtener más información sobre varios tipos de celdas y notas sobre la efectividad de la carga de perlas en diferentes tipos de celdas).
    NOTA: Las células se pueden sembrar solo en el micronúcero en el centro de la cámara para conservar cuántas células se utilizan.
  2. Incubar las células en condiciones normales hasta que estén completamente adheridas al vidrio.
    NOTA: Es esencial que la densidad celular sea lo suficientemente alta y que las células estén firmemente adheridas al vidrio. Si no se cumplen estos requisitos, es probable que las células se despeguen durante la carga de perlas. La línea de tiempo entre la siembra celular y la carga de perlas se puede alargar para garantizar la adhesión y la confluencia celular adecuadas.

4. Celdas de carga de cuentas

NOTA: Si es necesario, lave las células brevemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego agregue 2 ml del medio óptimo. Incubar durante al menos 30 min.

  1. Hacer una solución de 3-8 μL que contenga los plásmidos, proteínas y/o partículas deseados. Use ~ 1 μg (0.1-1 pmol) de cada tipo de plásmido y ~ 0.5 μg (0.01 nmol) de proteína, dependiendo de los requisitos experimentales. Use un tubo de baja retención para las proteínas para que no se queden atrás en las paredes del tubo. Lleve la solución hasta un mínimo de 3 μL con PBS y ajuste el volumen de la solución para recubrir toda el área de celdas a cargar (es decir, el microopozo de la cámara, Figura 1B).
  2. Mezcle bien la solución mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo y / o moviendo el tubo. Gire brevemente la solución hasta la parte inferior del tubo en un microfuge de mesa.
  3. Transfiera la solución de carga de perlas y la cámara de células a una campana de cultivo de tejidos. Realice los pasos restantes en la campana de cultivo de tejidos utilizando la técnica estéril.
  4. Retire el medio de las células y guárdelo temporalmente en un tubo estéril. Aspire suavemente todo el medio desde alrededor de los bordes de la cámara, e incline la cámara en un ángulo de aproximadamente 45 ° y retire la gota restante de medios en el micronúcero central. Durante la extracción media, asegúrese de evitar dejar que la punta de la pipeta toque el vidrio, lo que puede provocar la descamación y pérdida de células. Pase rápidamente al siguiente paso para que las células no estén secas por mucho tiempo.
  5. Pipete suavemente la solución de carga de perlas en el micropero de vidrio en el centro de la cámara. Opcional: Incubar con balanceo suave durante ~ 30 s sin permitir que la cámara se seque por completo.
  6. Disperse suavemente una monocapa de cuentas de vidrio en la parte superior de las celdas, preferiblemente utilizando un aparato de carga de cuentas(Figura 1A). Asegúrese de que las perlas cubran completamente las celdas en el micronúcero con fondo de vidrio.
  7. Pellizcando la cámara con dos dedos, tóquela contra la superficie de la capucha levantándola ~ 2 pulgadas y bajando firmemente. Usa una fuerza aproximadamente equivalente a dejar caer el plato desde esa altura. Repita para un total de ~ 10 toques.
    NOTA: Asegúrese de que los grifos no pelen sustancialmente las células. El tapping se puede optimizar para el tipo de celda. Si las células se cargan mal, toque más fuerte; sin embargo, si muchas células se desprenden, toque más ligeramente.
  8. Agregue suavemente el medio de nuevo a la cámara mediante el pipeteo lento en el lado de plástico de la cámara. Trate de aspirar cualquier cuenta flotante sin perturbar las células. Agregue más medios precalentados en este paso si se eliminó demasiado. Incubar las células durante 0,5-2 h en la incubadora.
  9. Esterilizar por UV el cargador de perlas durante 15 minutos antes de devolverlo al almacenamiento en condiciones de desecado.
  10. Agregue tinte (por ejemplo, tinción de ligando DAPI o HaloTag, si el experimento lo requiere) a las células según el protocolo recomendado por el fabricante.
  11. Lave las celdas 3 veces con medio antes de obtener imágenes para eliminar las perlas y el exceso de carga de los componentes en solución. Evite pipetear directamente sobre las células para evitar que se pelen.

5. Obtención de imágenes de las celdas cargadas de perlas

  1. Obtenga una imagen de las células inmediatamente o cuando lo requiera el experimento. Utilice un microscopio capaz de capturar la fluorescencia (láseres o fuente de luz monocromática). Asegúrese de que las longitudes de onda de excitación sean apropiadas para el fluoróforo o colorante elegido (por ejemplo, luz de longitud de onda de 488 nm para la proteína de fluorescencia verde (GFP)).
    NOTA: Las proteínas cargadas con perlas pueden ser fotografiadas una vez que las células se han recuperado (tan pronto como 30 minutos después de la carga para las líneas celulares descritas aquí). La expresión del plásmido toma ≥2 h dependiendo de los elementos vectoriales de expresión(Figura 1C,y explicación adicional en la discusión). Las imágenes de células cargadas de perlas se pueden realizar en cualquier microscopio equipado con las fuentes fluorescentes apropiadas asociadas con sondas cargadas, una cámara capaz de capturar imágenes de fluorescencia, como un dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones (EMCCD) o una cámara científica complementaria de semiconductores de óxido de metal (sCMOS), y una incubadora para controlar la temperatura, la humedad y el dióxido de carbono. Para obtener una guía sobre la microscopía de fluorescencia, consulte 27.

Representative Results

La aplicación más común de la carga de perlas es introducir uno o más tipos de proteínas en las células humanas adherentes. Para ilustrar esto, las células se cargaron con una solución de una proteína Fab conjugada con Cy3 y Alexa488. Aunque no todas las células en el micronúcero estaban cargadas de perlas, las células que estaban cargadas casi siempre tenían proteínas etiquetadas con Cy3 y Alexa488 juntas(Figura 2A). Según una estimación anterior, cuando 0,5 microgramos de Fab diluidos en 4 microlitros están cargadosde perlas 29,como en la Figura 2A,cada célula está cargada con aproximadamente 106 moléculas Fab.

El ADN plásmido que codifica GFP (1 μg de ADN plásmido, 1,8 μL de una solución de 557 ng/ μL) y 0,5 μg de Fab etiquetado con Cy3 también se introdujo en las células a través de la carga de perlas y posteriormente se expresó y visualizó (Figura 2B). La fluorescencia GFP indicó que el plásmido que codifica GFP no solo se cargó en las células, sino que también se expresó. Así, en la misma célula, la carga de perlas puede introducir una sonda de proteína (por ejemplo, Fab etiquetada con Cy3) y un plásmido reportero (por ejemplo, GFP), como se realizaba en este laboratorio anteriormente22,23,24. Determinamos que el 40% de las células estaban cargadas con proteína Fab y el 21% de las células cargadas con perlas expresaban el plásmido cocargado, como se muestra en los campos de visión representativos de la Figura 2B. Por lo general, cada cámara está cargada con 1-2 μg de plásmido, aproximadamente la misma cantidad que la lipofección.

Las células cargadas de perlas expresan niveles muy variables de plásmidos(Figura 2C,D). Para medir esto específicamente, utilizamos la prueba Fisher Ratio para comparar las distribuciones de los datos de intensidad de proteínas y plásmidos. Los resultados mostraron que aunque las proteínas 1 y 2 tenían distribuciones de intensidad similares (p = ~1), cada proteína tenía una distribución significativamente menor que el plásmido (p = 3.2e-6 y 1.8e-5). Aunque esto podría deberse a la variabilidad en la cantidad de plásmidos que se cargan por célula, la mayor fuente de variabilidad puede surgir de los muchos pasos necesarios para la expresión de plásmidos que probablemente varíen mucho entre las células, incluida la importación al núcleo celular, la transcripción y la traducción. En contraste, los niveles de proteínas cargadas de perlas tenían una ligera varianza de célula a célula, y los niveles de dos proteínas cargadas simultáneamente estaban altamente correlacionados entre sí(Figura 2D,E).

La expresión del plásmido se puede ver tan pronto como 2-4 h después de la carga de la perla, pero puede ocurrir más tarde dependiendo de cuándo se obtenga la expresión óptima del plásmido. Recomendamos realizar un curso de tiempo para determinar la mejor ventana de expresión para un plásmido específico que abarque de 2 a 24 horas después de la carga de cuentas. Esto se puede hacer en una cámara con imágenes de largo plazo o mediante la carga de cuentas y el escalonamiento de múltiples cámaras. Las células cargadas de perlas permanecen adherentes y son lo suficientemente sanas como para crecer y dividirse. Las células U2OS humanas cargadas con perlas se fotografió directamente antes, directamente después y 24 horas después de la carga de cuentas. La carga adecuada de perlas casi no tuvo un efecto notable en el número de células o su morfología, como se muestra en la Figura 3A (izquierda, centro).

En contraste, la carga deficiente de cuentas con demasiadas cuentas y una fuerza de golpeteo excesiva se representa en la Figura 3B. Esto causó mucha pérdida celular (grandes parches de la cubierta sin células y células desprendidas, flotantes y fuera de foco), mala morfología celular (células que aparecen redondeadas y mal adheridas) y grupos de cuentas que permanecen en la cubierta después de la carga de la perla. Aunque se cree que las células sufren daños mecánicos durante la carga de perlas, las células crecieron y proliferaron en la cámara correctamente cargada de perlas, como lo demuestra el aumento del número de células 24 h después de la carga de cuentas(Figura 3A,derecha). El efecto sobre la viabilidad celular se puede evaluar a través de una variedad de ensayos, como un ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), para comparar las células cargadas con perlas con las células cargadas de simulación30. Además, este y trabajos anteriores muestran que las células cargadas de perlas se someten a división celular(Figura 3C y Video Suplementario 1),y el momento de la mitosis no se ve afectado por la carga de perlas31,lo que sirve como evidencia adicional para la salud celular sostenida después de la carga de perlas.

La carga de perlas es una técnica versátil, que acomoda varias líneas celulares adherentes y varias macromoléculas. Aquí, esta variedad se ha demostrado cargando líneas celulares RPE1 y HeLa con Fab (Figura 4A, B). La Tabla 1 proporciona más ejemplos de carga de perlas en diferentes líneas celulares, en este laboratorio y más allá, y señala algunas de las diferencias matizadas entre los protocolos de carga de perlas de otros laboratorios. Cabe destacar que el diámetro de las perlas de vidrio utilizadas para la carga varía mucho entre los laboratorios, aunque la carga más eficiente se encontró para cuentas pequeñas de 75 μm de diámetro en varias líneas celulares14. Además, este laboratorio también ha comenzado a cargar ARN (datos no mostrados). La Figura 4C muestra una perla de célula U2OS representativa cargada con un Cy5-RNA 9mer y Cy3-DNA 28mer juntos.

Figure 1
Figura 1: Aparato de carga de cuentas, técnica y línea de tiempo Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. La carga de perlas introduce una baja variabilidad en la concentración de proteínas, pero una alta variabilidad en la expresión de plásmidos. (A) Las células se cargaron con 0,5 μg de cada uno de los acetil Fab (verde) anti-H3K27 conjugados con Alexa488 y Anti-RNAPII-Serina 5-fosforilado Fab (rojo) conjugados con Cy3 en 4 μL de solución de carga de perlas. Las células fueron teñidas con DAPI (azul) y luego fotografiadas en vivo de inmediato. Barras de escala = 20 μm. (B) Las células estaban cargadas con 0,5 μg de proteína Fab (proteína anti-ARNPII-serina 5-fosforilatada conjugada con Cy3, roja) y 1 μg de plásmido que codifica la supercarpeta GFP-H2B (verde) en 4 μL de solución de carga de perlas. Después de 24 h, las células fueron teñidas con DAPI (azul) y fotografiadas en vivo. Barras de escala = 30 μm. (C-E) La proteína 1 (JF646-HaloLigand-labeled HaloTag-MCP), la proteína 2 (Cy3-conjugated anti-FLAG Fab) y un plásmido que codifica EGFP (λN-EGFP-LacZ) se cargaron juntos en las células. La intensidad total en cada canal fluorescente se midió en un parche de 1,3 x 1,3 μm en el citoplasma de cada célula. N = 25 celdas. (C) Células representativas que expresan el plásmido cargado de perlas, λN-EGFP-LacZ. Se utilizaron las mismas condiciones e intensidades de imagen para todas las células. Las manchas son agregados de la proteína expresada. Barras de escala = 10 μm. (D) El gráfico muestra la intensidad total de cada célula de la proteína 1, proteína 2 o EGFP expresada a partir del plásmido. Cada canal se normalizó a la mediana. Los valores de P corregidos por Bonferroni se calcularon mediante la prueba fisher Ratio para determinar si la distribución de los datos de intensidad de proteínas o plásmidos tiene la misma variabilidad. Cada punto representa una celda. (E) Las intensidades totales de ambas proteínas, la proteína 1 y el plásmido, o la proteína 2 y el plásmido, se trazan entre sí. Se muestran los valores calculados de R2. Cada punto representa una celda. Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; EGFP = proteína fluorescente verde mejorada; A.U. = unidades arbitrarias; MCP = proteína de la capa MS2; RNAPII = ARN polimerasa II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Las células cargadas con perlas permanecen adherentes y son lo suficientemente sanas como para crecer y dividirse. (A) Las células U2OS fueron cargadas con perlas con 0,5 μg de Anti-FLAG Fab conjugado con Cy3 en 4 μL de solución de carga de perlas. Las celdas fueron fotografiadas directamente antes, directamente después de la carga de la cuenta, y 24 horas después de la carga de la cuenta. Las flechas naranjas identifican áreas donde las células se despegaron durante la carga de cuentas. Barras de escala = 2 mm. (B) Imagen representativa de celdas U2OS cargadas con componentes de (A) pero con golpes fuertes y demasiadas cuentas. La flecha roja identifica cuentas de vidrio adicionales. Barra de escala = 2 mm. (C) Las células U2OS se cargaron con 1,5 μg del plásmido smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2 de 14,4 kbp, 0,5 μg de Anti-FLAG Fab conjugado con Cy3 (verde), 130 ng de HaloTag-MCP (magenta) en 8 μL de solución de carga de perlas. Directamente antes de la toma de imágenes, el HaloTag se tiñó con JF646-HaloLigand. Los bucles de tallo MS2 del ARNm transcrito del plásmido reportero están etiquetados por MCP (manchas magenta), y la proteína reportera traducida marcada con FLAG se etiqueta por anti-FLAG Fab (colocalización verde a ARNm). La proteína madura de la marca Fab se localiza en el núcleo. Esta celda fue fotografiada 4-15 h después de la carga de cuentas. Las flechas amarillas identifican el núcleo celular antes y los núcleos después de la división celular. Barras de escala = 5 μm. Abreviatura: MCP = proteína de recubrimiento MS2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Variaciones en el material de carga tipo celda del protocolo de carga de perlas. (A-B) Las células RPE1 (A) y HeLa (B) se cargaron con 1,5 μg de una proteína Fab nuclear (anti-ARNPII-Serina 5-fosforilación) en 4 μL de solución de carga. El núcleo (nuc) y el citoplasma (cito) de cada célula están marcados. Las células fueron fotografiadas 6 h después de ser cargadas con cuentas. Barras de escala = 5 μm. (C) Las células U2OS humanas estaban cargadas con oligos Cy5-RNA 9mer (magenta) y Cy3-DNA 28mer (verde), 10 picomoles de cada uno, en 4 μL de solución de carga de perlas. Las células fueron fotografiadas 4 h después de ser cargadas con cuentas. Todos los núcleos celulares están resaltados por una línea discontinua. Barras de escala = 5 μm. Abreviaturas: RNAPII = ARN polimerasa II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Línea celular Tipo de celda Eficacia de carga de perlas Notas/referencia
Células madre (humanas) Células madre embrionarias Difícil * Muchas células se desprenden durante la carga de perlas si se chapan en placas recubiertas de gelatina
HEK 293 Células renales embrionarias humanas Difícil * Necesidad de establecer una matriz de gel en la superficie de la cámara de imágenes antes de la carga de la perla. Toque suavemente cuando se cargue la cuenta al principio.
Neuronas (rata) Neuronas embrionarias primarias (e-18), disociadas Muy ineficiente * No se observó una carga eficiente de neuronas utilizando este protocolo estándar de carga de cuentas. Esto podría deberse a la naturaleza no adherente de las neuronas o al consiguiente daño a los procesos neuronales.
MDCK (canino) Células renales caninas madin-Darby Véase McNeil y Warder (1987)14 * Carga de perlas de baja eficiencia14
U2OS (humano) Osteosarcoma Protocolo de carga de cuentas estándar
HeLa (humano) Cáncer cervical Protocolo de carga de cuentas estándar
RPE1 (humano) Células epiteliales inmortalizadas con hTERT Protocolo de carga de cuentas estándar
HFF (humano) Fibroblastos primarios del prepucio Véase Besteiro et al. (2009)31  * Protocolo modificado de inclinación en lugar de tocar31
BALB/c 3T3, NIH 3T3 y Swiss 3T3 (ratón) Fibroblastos embrionarios Véase Gilmore y Romer (1996)32, Emerson et al. (2014)33 y McNeil y Warder (1987)14 *425–600 μm de cuentas de vidrio reportadas32
*Perlas de vidrio usadas de 200–300 μm33
* Las perlas de vidrio de 75 μm dieron mejores resultados que 400 μm14
DM (muntjac indio) Fibroblastos de la piel Véase Manders, Kimura y Cook (1999)34
CHO (hámster) Células ovábres epiteliales Véase Memedula y Belmont (2003)35 *Perlas de vidrio usadas de 425–600 μm35
BAE (bovino) Células endoteliales aórticas bovinas (BAEC-11) Véase McNeil y Warder (1987)14 * Las perlas de vidrio de 75 μm dieron mejores resultados que 400 μm14
PtK-2 (Potomus tridaclylis) Células renales epiteliales Véase McNeil y Warder (1987)14 * Las perlas de vidrio de 75 μm dieron mejores resultados que 400 μm14
HUVEC (humano) Células endoteliales de la vena umbilical Véase Gilmore y Romer (1996)32 *Perlas de vidrio usadas de 425–600 μm32
J774 y J774.2 (ratón) células de macrófagos monocitos Véase Becker et al. (2005)36 y McNeil y Warder (1987)14 * Agitación suave (en lugar de golpeteo) y cuentas de vidrio de 425–600 μm36
MS-5 (ratón) células estromales de la médula ósea Véase Molenaar et al. (2003)37
WPE1-NB11 (humano) células epiteliales de próstata Véase Gilmore y Romer (1996)32 y *Perlas de vidrio usadas de 425–600 μm32
Emerson et al. (2014)33 *Perlas de vidrio usadas de 200–300 μm33

Tabla 1: Carga de perlas en diferentes líneas celulares. Para las líneas celulares que aún no se han cargado en este laboratorio, se proporcionan referencias y notas sobre las variaciones en el protocolo.

Video suplementario 1: Ejemplo de una célula cargada de cuentas que se somete a división celular. Las células U2OS se cargaron con 1,5 μg del plásmido smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2 de 14,5 μg de anti-FLAG Fab conjugado con Cy3 (verde), 130 ng de HaloTag-MCP (magenta) en 8 μL de solución de carga de perlas. Directamente antes de la toma de imágenes, el HaloTag se tiñó con JF646-HaloLigand. Los bucles de tallo MS2 del ARNm transcrito del plásmido reportero están etiquetados por MCP (manchas magenta), y la proteína reportera traducida marcada con FLAG se etiqueta a través de anti-FLAG Fab (colocalización verde a ARNm). La proteína madura de la marca Fab se localiza en el núcleo. Esta celda fue fotografiada 4-15 h después de la carga de cuentas. Barra de escala = 10 μm. Abreviatura: MCP = proteína de recubrimiento MS2. Haga clic aquí para descargar este video.

Discussion

La técnica de carga de perlas descrita aquí es un método rentable y eficiente en el tiempo para introducir macromoléculas y otras partículas en las células adherentes. Este versátil proceso puede cargar proteínas(Figura 2A)15,16,26,27,una combinación de proteínas y plásmidos(Figura 2B,C)22,25,ARN(Figura 4C),perlas de poliestireno de 100 y 250 nm (correspondencia personal), colorantes sintéticos39 o puntos cuánticos34,40 . La carga de perlas también puede tener la capacidad de cargar otros tipos de partículas impermeables a la membrana. Su aplicación más utilizada es para cargar anticuerpos o Fabs para dirigirse a epítopos endógenos, como las modificaciones post-tradesales (PTM), en células vivas. Los objetivos, como los PTM, a menudo son difíciles de etiquetar en células vivas sin sondas establecidas específicas de PTM, codificadas genéticamente41,42. Por el contrario, la carga de perlas puede introducir múltiples tipos de sondas, reporteros u otras herramientas moleculares juntas en la misma celda para monitorear múltiples lecturas simultáneamente. Anticipamos que la carga de cuentas será una técnica útil para cargar una variedad de macromoléculas o partículas.

Una gran ventaja de la carga de cuentas es el bajo costo: cada experimento cuesta menos de 0.01 USD. Un aparato cargador de cuentas se puede hacer fácilmente utilizando materiales baratos que cuestan en total ~ $ 150, que es significativamente menos costoso que cualquier otro método de carga de celdas. El costo de un aparato cargador de cuentas se puede reducir aún más a menos de $ 10 reemplazando la cámara de metal reutilizable por una de plástico. Para esto, perfore un orificio en una cámara de 35 mm o retire el vidrio de una cámara con fondo de vidrio de 35 mm, luego sujete de forma segura la malla en su lugar con cinta adhesiva. En lugar de un aparato, la carga de perlas incluso se puede realizar utilizando una punta de pipeta de 1000 μL de diámetro ancho para recoger y rociar cuentas sobre las células, aunque esta variación dificulta la espolvoreo de una monocapa de perlas sobre las células (paso 4.6).

Otro beneficio de la carga de perlas es que las células pueden retener la morfología general normal, recuperarse rápidamente y continuar creciendo y dividiéndose, al menos para las células U2OS, RPE1 y HeLa estudiadas aquí y para las otras líneas celulares estudiadas en otros lugares (Figura 3; Figura 4A,B; Video suplementario 1; y Cuadro 1)31. Durante la carga de perlas, las células sufren estrés físico y, a veces, se desprenden y pelan (~ 5% de las células se pelan en condiciones óptimas, pero puede ocurrir una mayor pérdida de células si la carga de cuentas se realiza con demasiada fuerza o se cargan demasiadas perlas de vidrio sobre las células, como se muestra en la Figura 3B). Sin embargo, las células cargadas de perlas que permanecen unidas al la cubierta generalmente parecen sanas y se pueden obtener imágenes tan pronto como 30 minutos después de la carga de la cuenta(Figura 3A). Por lo general, permitimos a las células un período de recuperación de 30 minutos, pero anticipamos que es factible obtener imágenes antes después de la carga de perlas.

Un inconveniente importante de esta técnica es que las células deben ser capaces de soportar un estrés físico menor durante la carga y permanecer firmemente adheridas a la cubierta. Las líneas celulares pobres / no adherentes o las células cultivadas en placas recubiertas (por ejemplo, HEK y células madre) a menudo se desprenden al golpear suavemente durante la carga de perlas. Además, la experiencia ha demostrado que las neuronas primarias son demasiado sensibles para la carga de perlas.

La carga de perlas es la más adecuada para experimentos de una sola célula o de una sola molécula. En nuestra experiencia, la carga de perlas tiene una eficiencia de carga de proteínas de aproximadamente el 20-40%, y ~ 20% de las células cargadas de perlas también expresaron un plásmido cocargado(Figura 2A,B). Por lo tanto, los plásmidos de carga de perlas pueden ser menos eficientes para la expresión de proteínas que las proteínas purificadas de carga de perlas porque los plásmidos no solo deben ingresar a las células sino también expresarse (lo que implica, entre otras cosas, la importación nuclear, la transcripción y la traducción, cada una de las cuales puede disminuir la eficiencia de expresión). La baja eficiencia de la expresión de plásmidos cargados de perlas puede eludirse mediante el uso de protocolos alternativos de transfección, como la lipofección, antes de las proteínas de carga de perlas o sondas16,27. Además, la incubación de células en medios óptimos durante 30 minutos antes de la carga de perlas puede ayudar a la expresión de plásmidos. Debido a la baja expresión de plásmidos, la carga de perlas no se ha utilizado a menudo como una alternativa a la transfección basada en la lipofección en este laboratorio. La única excepción es cuando una proteína purificada, como Fab, se va a cargar de forma co-cargada, en cuyo caso es bastante conveniente cargar la proteína y el plásmido al mismo tiempo. Además, para las células que no responden o son intolerantes a la lipofección, la carga de perlas puede proporcionar un método alternativo, aunque de baja eficiencia, para la expresión transitoria de plásmidos.

Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a los miembros del laboratorio Stasevich por las innumerables conversaciones que ayudaron a mejorar y desarrollar este protocolo. Específicamente, la Dra. Linda Forero y el Dr. Phil Fox para obtener consejos sobre la carga de cuentas en diferentes tipos de células. Yoko Hayashi-Takanaka, el Dr. Yuko Sato y el Dr. Hiroshi Kimura por compartir su protocolo de carga de cuentas de vidrio. Estamos muy agradecidos al Dr. Ashok Prasad y al Dr. Diego Krapf por compartir generosamente sus protocolos de carga de cuentas para introducir partículas inorgánicas en las células. Estamos agradecidos con el Dr. Travis Sanders, Craig Marshall y el Dr. Thomas Santangelo por compartir generosamente su reactivo de ARN etiquetado. ALK, MNS, CAC, GG y TJS fueron apoyados por la subvención R35GM119728 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y la subvención CAREER de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF) MCB-1845761, ambas a TJS. CAC también fue apoyado por el premio NSF NRT DGE-1450032.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm cell culture dishes VWR 82050-916 Use to culture cells
35 mm cell culture dishes Falcon 353001 Use to construct bead loader
Attofluor Cell Chamber Thermo Fisher Scientific A7816 Use to construct the custom bead loader
DMEM, high glucose, no glutamine Thermo Fisher Scientific 11960069 Use in general cell culture
Drierite Indicating Absorbents Thermo Fisher Scientific 07-578-3B Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets
Fetal Bovine Serum Atlas Biologics F-0050-A Use in general cell culture and as a supplement before bead loading
Glass beads, acid washed, ≤106 µm* Millipore Sigma G4649 Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins
Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Seed cells onto these chambers for imaging
L-Glutamine-200 mM Thermo Fisher Scientific 25030081 Use to make DMEM + media
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070 Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step)
Parafilm VWR 52858-032 waxy film used to construct bead loader
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 Use to make DMEM + media
Phenol-free DMEM Thermo Fisher Scientific 31053036 Use on cells before imaging
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9625 Working stock of sterile 1X PBS
Sodium Hydroxide (NaOH) Thermo Fisher Scientific S318-500 Use 2 M solution to wash glass beads
Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening Spectrum Labs 148496 Use to construct bead loader
Trypsin Thermo Fisher Scientific 25300062 Use in general cell culture

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Biología Número 172
Perlas cargando proteínas y ácidos nucleicos en células humanas adherentes
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Cialek, C. A., Galindo, G., Koch, A. L., Saxton, M. N., Stasevich, T. J. Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells. J. Vis. Exp. (172), e62559, doi:10.3791/62559 (2021).

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