Summary
Boncuk yükleme, bağlı memeli hücrelerine proteinleri, plazmidleri ve parçacıkları tanıtır. Bu hücre yükleme tekniği ucuz, hızlıdır ve hücre sağlığını önemli ölçüde etkilemez. Canlı hücre görüntüleme için en uygun olanıdır.
Abstract
Birçok canlı hücre görüntüleme deneyi, hücreleri etiketlemek veya işlev görmek için eksojen parçacıklar (örneğin, peptitler, antikorlar, boncuklar) kullanır. Bununla birlikte, zarı boyunca bir hücreye protein sokmak zordur. Mevcut yöntemlerin sınırlı seçimi düşük verimlilikle mücadele eder, pahalı ve teknik olarak zorlu ekipman veya dar parametreler içindeki işlevler gerektirir. Burada, DNA, RNA ve proteinleri canlı insan hücrelerine yüklemek için nispeten basit ve uygun maliyetli bir tekniği açıklıyoruz. Boncuk yüklemesi, hücre zarında geçici bir mekanik bozulmaya neden olur ve makromoleküllerin yapışık, canlı memeli hücrelerine girmesini sağlar. Deneme başına 0,01 USD'den daha az bir fiyata, boncuk yükleme mevcut en ucuz hücre yükleme yöntemidir. Ayrıca, boncuk yüklemesi hücreleri önemli ölçüde strese sokmuyor veya canlılıklarını veya çoğalmalarını etkilemiyor. Bu makalede boncuk yükleme prosedürünün adımları, uyarlamalar, varyasyonlar ve teknik sınırlamalar açıklanmaktadır. Bu metodoloji özellikle canlı hücre görüntüleme için uygundur, ancak proteinlerin, boncukların, RNA'nın veya plazmidlerin canlı, yapışan memeli hücrelerine girmesini gerektiren diğer uygulamalar için pratik bir çözüm sağlar.
Introduction
Makromoleküllerin memeli hücrelerine yüklenmesi, hücrenin plazma zarını geçmelerini sağlayan metodoloji gerektirir1. Lipozomal transfeksiyon 2 ve diethylaminoethyl-dektran transfection3 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler transfection yoluylamemelihücrelerine plazmidler sokabilir. Bununla birlikte, proteinleri veya zar geçirimsiz parçacıkları hücrelere yükleme yöntemleri daha sınırlıdır.
Çeşitli teknikler, çeşitli stratejiler kullanarak bu zor engeli atlamıştır. İlk olarak, mikroenjeksiyon parçacıkları bir mikropipetten mikroskop altında canlı hücrelere ulaştırıyor4. Tartışmasız en kontrollü ve en az invaziv yöntem olsa da, hücrelerin tek tek yüklenmesi gerektiğinden, bu teknik nispeten düşük aktarım hızına sahiptir. Ayrıca, mikroenjeksiyon özel ekipman gerektirir ve teknik olarak talep edicidir.
İkinci olarak, elektroporasyon, proteinleri voltaj kaynaklı membran bozulması 5 ,6,7yoluyla hücrelere elektro enjekteetmeninbir yoludur. Bununla birlikte, bu yöntem yine özel, pahalı ekipman gerektirir ve şok hücre stresine ve mortaliteye neden olabilir. Ayrıca, hücreler elektroporasyondan önce denenmeli ve daha sonra yeniden plakalanmalı ve hücrelerin elektroporasyon sonrası araştırılabileceği zaman dilimi sınırlandırılmalıdır.
Üçüncü olarak, hücre zarları geçici, geri dönüşümlü permeabilizasyon için kimyasal olarak değiştirilebilir8,9. Streptolysin-O yüklemesi hücre zarlarına geçici gözenekler oluşturan bir endotoksin yerleştirir ve proteinler ve DNA plazmidleri de dahil olmak üzere ekzojen membran geçirimsiz parçacıkların hücrelere girmesini sağlar10. 2 saat iyileşmeden sonra, hücrelerin yaklaşık yarısı bu gözenekleri onarır ve çözeltiden parçacıkları içselleştirmeyi durdurur. Bununla birlikte, bu teknik uzun bir iyileşme süresi gerektirir ve endotoksinleri tolere edemeyen hücre tipleriyle uyumsuzdur.
Dördüncü olarak, mekanik bozulma, hücre zarının fiziksel pertürbasyonu yoluyla parçacıkları hücrelere yükler11. Bu,12,13hücrelerinin üzerinde boncukları kaşıma, kazıma ve yuvarlama dahil olmak üzere birden fazla şekilde yapılabilir. 1987'nin başlarında, proteinleri mekanik olarak hücrelere yüklemek için boncuklar kullanılmıştır14. Daha yakın zamanda, boncuk yükleme tekniği, burada açıklandığı gibi plazmidlerin ve RNA'nın yüklenmesini içerecek şekilde proteinlerin ötesinde optimize edilmiş ve uyarlanmıştır.
Boncuk yükleme, protein ve plazmidleri yapışan insan hücrelerine yüklemek için kolay, ucuz ve hızlı bir yöntemdir. Cam boncuklar hücrelerin üzerine kısa bir süre yuvarlanır ve hücresel zarlarını geçici olarak bozar. Bu, çözeltideki parçacıkların girmesini sağlar. Boncuk yüklemesi düşük verimliliğe sahip olduğundan, tek moleküllü veya tek hücreli mikroskopi deneyleri için en uygun olanıdır. Boncuk yükleme, parçalanmış antikorlar (Fab), scFvs, 17 intrabodies, 18,19 veya mRNA kat proteinleri gibi 15,16 saflaştırılmış protein dahil olmak üzere çok çeşitli proteinleri tanıtabilir, örneğin, MS2 kat proteini (MCP)20,21. Plazmid ekspresyon vektörleri de protein çözeltisine eklenebilir ve boncuk yüklü aynı anda22 , 23,24,25.
Protein ve plazmidlerin ötesinde, 250 nm polistiren boncuk kadar büyük moleküller boncuk yüklemesi (kişisel iletişim) yoluyla hücrelere sokulmuşlardır. Boncuk yükleme inanılmaz derecede ucuzdur, malzemelerde deney başına 0,01 USD'den daha ucuzdur ve ek pahalı ekipman gerektirmemektedir. Sadece bir görüntüleme odasının merkezi 14 mm çapındaki mikro kabarmış hücreler yüklendiği için deney başına kullanılan prob miktarı en aza indirilerek maliyet daha da düşürülür. Sınırlı yükleme alanının boncuk yüklemenin toplu hücre yüklemesi için ideal olmadığı anlamına geldiği belirtilmelidir.
Bu makale, boncuk yükleme aparatının nasıl oluşturulacağı ve bir deneyin nasıl gerçekleştirilileceği de dahil olmak üzere boncuk yükleme işlemini sunar. Proteinlerin, RNA'nın ve DNA'nın çeşitli hücre tiplerine yüklenebileceğini ve iki farklı, aynı anda boncuk yüklü proteinin yüksek oranda ilişkili hücresel konsantrasyonlara ve nispeten düşük varyansa sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca, hücre tipine ve protein, plazmid veya RNA'nın yüklenmesine dayalı protokoldeki varyasyonlar da tartışılmaktadır. Boncukların hücre zarını delik deşip bozduğu düşünülse de, uygun şekilde gerçekleştirildiğinde, boncuk yükleme işlemi görüntüleme odasının dibinden sadece az sayıda hücreyi yerinden eder. Kısa bir iyileşme döneminden sonra hücreler büyümeye ve bölünmeye devam ediyor. Bu metodoloji, tek moleküllü protein ve RNA izleme, çeviri sonrası modifikasyon tespiti, dinamik hücresel mekanizmaların gözlemlenmesi veya hücre altı lokalizasyon izleme15 , 16, 22,26,27dahil olmak üzere canlı hücreli mikroskopi deneyleri için idealdir.
Protocol
1. Topaklamayı önlemek ve hücrelerin üzerine bile yayılmasını sağlamak için cam boncukları temizleyin, sterilize edin ve kurutun.
- Sodyum hidroksitte (NaOH) yaklaşık 5 mL cam boncuk sterilize eder. Boncukları 50 mL konik bir tüpte ölçün. 25 mL 2 M NaOH ekleyin ve 2 saat boyunca bir çalkalayıcı veya rotator kullanarak hafifçe karıştırın.
- NaOH'yu dekant, mümkün olduğunca çok boncuk tutarak. Boncuklar süspansiyondaysa, boncuk tüpünü bir santrifüjde kısa bir süre döndürün (~1000 × g'de1 dakika, oda sıcaklığı).
- Boncukları pH nötr olana kadar hücre kültürü sınıfı suyla iyice yıkayın (nötr bir pH'ı onaylamak için yılan balığı üzerinde bir pH test şeridi kullanın). Yıkama suyunu her seferinde, daha önce olduğu gibi demle.
- Boncukları% 100 etanol 2-3x ile iyice yıkayın. Her seferinde etanol dekant.
- Boncukları kurutun. Boncukları steril bir kabın içinde ince bir tabaka oluşturmak için serpin (10 cm Petri kabı gibi). Kabı açık bırakarak, boncukların havasını bir gecede biyogüvenlik kabininde kurumasına izin verin. Kabı dokunarak veya hafifçe sallayarak ve boncukların topaklanma veya pullanma olmadan kumlu bir dokuya sahip olup olmadığını kontrol ederek boncukların tamamen kuru olduğundan emin olun.
- Kuru boncukları 15 dakika boyunca UV sterilize edin.
2. Boncuk yükleyici aparatını monte edin.
- Bir ağ yamasını (polipropilen veya eşdeğer malzeme, boncukların geçmesine izin vermek için 105 μm açıklıklar) boncuk tutma odasının tüm açıklığı bantla kaplayacak veya örgünün metal yeniden kullanılabilir bir görüntüleme odasının erkek ve dişi uçları arasında kenetlenecek şekilde sabitleyin(Şekil 1A).
- UV-sterilize 15 dakika boyunca aparat. Boncukları aparatlara ekleyin ve mumsu filmle sıkıca kapatın.
NOT: Boncukların bu adımda tamamen temiz ve kuru olması önemlidir. Gevşek olmalılar ve kümelenmeden kumlu görünmeliler. Eğer öyle görünmüyorlarsa, boncukları yeniden yıkayın ve tamamen kurulayın. - Cihazı silika jel veya diğer kurutucu ortamlar tarafından kurutulan kapalı, kuru bir kapta saklayın. Boncuklar, boncuk topaklanarak belirginleşecek olan nemli hale gelirse, boncuk yükleyicisini iyice kurulayın ve sterilize edin ve taze boncuklarla değiştirin.
NOT: Tüm bu önlemler, boncuk yükleyicideki boncukların üzerinde veya çevresinde küf veya bakteri büyümesini önleyecektir. Boncuk yükleyici aparatı farklı şekillerde yapılabilir. Tartışmadaki ayrıntılara bakın.
3. Yapışan hücrelerin cam tabanlı odalarını hazırlayın.
- Tohum yapışan memeli hücreleri 35 mm cam tabanlı bir hazneye. Boncuk yükleme sırasında hücrelerin yaklaşık% 80 birleştiğinden emin olun. (Çeşitli hücre türleri hakkında daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakın ve farklı hücre türlerinde boncuk yüklemenin etkinliği hakkında notlar.)
NOT: Hücreler, kaç hücre kullanıldığını korumak için sadece odanın ortasındaki mikrowell'de tohumlanabilir. - Hücreleri cama tamamen yapışana kadar normal koşullarda kuluçkaya yatırın.
NOT: Hücre yoğunluğunun yeterince yüksek olması ve hücrelerin cama güvenli bir şekilde yapıştırı olması esastır. Bu gereksinimler karşılanmazsa, hücreler büyük olasılıkla boncuk yüklemesi sırasında soyulur. Hücre tohumlama ve boncuk yükleme arasındaki zaman çizelgesi, uygun hücre yapışıklığı ve izdiah sağlamak için uzatılabilir.
4. Boncuk yükleme hücreleri
NOT: Gerekirse, hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile kısa bir süre yıkayın ve ardından optimum ortamdan 2 mL ekleyin. En az 30 dakika kuluçkaya yatır.
- İstenilen plazmidleri, proteini ve/veya parçacıkları içeren 3-8 μL'lik bir çözelti yapın. Deneysel gereksinimlere bağlı olarak her plazmid türünde ~1 μg (0,1-1 pmol) ve proteinin ~0,5 μg (0,01 nmol) kullanın. Proteinler için düşük tutma tüpü kullanın, böylece tüp duvarlarında bırakılmazlar. Çözeltiyi PBS ile en az 3 μL'ye kadar getirin ve yüklenecek hücrelerin tüm alanını kaplamak için çözelti hacmini ayarlayın (yani, odanın mikrowell'i, Şekil 1B).
- Yukarı ve aşağı borulayarak ve/veya tüpü kaydırarak çözeltiyi iyice karıştırın. Çözeltiyi bir masa üstü mikroyapısında tüpün altına kısa bir süre döndürün.
- Boncuk yükleme çözeltisini ve hücre odasını bir doku kültürü başlığına aktarın. Doku kültürü davlumbazında kalan adımları steril teknik kullanarak gerçekleştirin.
- Ortamı hücrelerden çıkarın ve geçici olarak steril bir tüpte saklayın. Odanın kenarlarından tüm ortamı hafifçe emiş edin ve hazneyi yaklaşık 45° açıyla eğin ve orta mikrowell'de kalan ortam damlasını çıkarın. Orta kaldırma sırasında, pipet ucunun cama temas etmesine izin vermekten kaçının, bu da hücre soyulmasına ve kaybına neden olabilir. Hücrelerin uzun süre kuru olmaması için bir sonraki adıma hızla geçin.
- Boncuk yükleme çözeltisini odanın ortasındaki cam mikrowell'e hafifçe pipetlayın. İsteğe bağlı: Haznenin tamamen kurumasına izin vermeden ~30 sn boyunca hafif sallayarak kuluçkaya yatırın.
- Tercihen bir boncuk yükleme aparatı kullanarak, hücrelerin üzerine bir monolayer cam boncuk dağıtın (Şekil 1A). Boncukların cam tabanlı mikrowell'deki hücreleri tamamen kaplağından emin olun.
- Odayı iki parmağınızla kıstırarak, ~2 inç kaldırarak ve sıkıca aşağı indirerek kaput yüzeye dokunun. Çanağı bu yükseklikten düşürmeye yaklaşık olarak eşdeğer bir kuvvet kullanın. Toplam ~10 musluk için tekrarlayın.
NOT: Muslukların hücreleri önemli ölçüde soymadığından emin olun. Dokunma, hücre türü için en iyi duruma getirilebilir. Hücreler kötü yüklenirse, daha sert dokunun; ancak, birçok hücre soyulursa, daha hafif dokunun. - Odanın plastik tarafına yavaşça pipetleme yaparak odaya hafifçe orta geri ekleyin. Hücreleri rahatsız etmeden yüzen boncukları aspire etmeye çalışın. Çok fazla şey kaldırıldıysa, bu adımda önceden ısıtılmış daha fazla ortam ekleyin. Hücreleri inkübatörde 0,5-2 saat kuluçkaya yatırın.
- Boncuk yükleyiciyi kurutma koşullarında depoya geri vermeden önce UV-sterilize edin.
- Üreticinin önerdiği protokole göre hücrelere boya (örneğin, deney için gerekirse DAPI veya HaloTag ligand lekesi) ekleyin.
- Çözeltideki boncukları ve fazla yükleme bileşenlerini çıkarmak için görüntülemeden önce hücreleri orta ile 3x yıkayın. Soyulmalarını önlemek için doğrudan hücrelere pipetlemekten kaçının.
5. Boncuk yüklü hücreleri görüntüleme
- Hücreleri hemen veya denemenin gerektirdiği zaman görüntüleyin. Floresan (lazerler veya tek renkli ışık kaynağı) yakalayabilen bir mikroskop kullanın. Ekscitasyon dalga boylarının seçilen florofor veya boya için uygun olduğundan emin olun (örneğin, yeşil floresan proteini (GFP) için 488 nm dalga boyu ışığı).
NOT: Boncuk yüklü proteinler hücreler iyileştikten sonra görüntülenebilir (burada açıklanan hücre hatları için yüklemeden 30 dakika sonra). Plazmid ifadesi, ifade vektör öğelerine bağlı olarak ≥2 saat sürer(Şekil 1Cve tartışmada daha fazla açıklama). Boncuk yüklü hücrelerin görüntülenmesi, yüklü problarla ilişkili uygun floresan kaynaklarla donatılmış herhangi bir mikroskopta, elektronla çarpan yük bağlantılı cihaz (EMCCD) veya bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kamera ve sıcaklığı, nemi ve karbondioksiti kontrol etmek için bir inkübatör gibi floresan görüntüleri yakalayabilen bir kamerada gerçekleştirilebilir. Floresan mikroskopi rehberi için 27'ye bakın.
Representative Results
Boncuk yüklemenin en yaygın uygulaması, bir veya daha fazla protein türünü yapışan insan hücrelerine tanıtmaktır. Bunu göstermek için, hücreler cy3 ve Alexa488 konjuge Fab proteini çözeltisi ile boncuk yüklüdür. Mikrowelldeki her hücre boncuk yüklü olmasa da, yüklenen hücreler neredeyse her zaman hem Cy3 hem de Alexa488 etiketli proteinlere sahipti (Şekil 2A). Daha önceki bir tahmine göre, 4 mikrolitrede seyreltilmiş 0,5 mikrogram Fab boncuk yüklü olduğunda29Şekil 2A'daolduğu gibi, her hücre kabaca 106 Fab molekülü ile yüklenir.
Plazmid DNA kodlama GFP (1 μg plazmid DNA, 1.8 μL 557 ng/μL çözelti) ve 0.5 μg Cy3 etiketli Fab da boncuk yükleme yoluyla hücrelere sokuldu ve daha sonra ifade edildi ve görselleştirildi (Şekil 2B). GFP floresan, GFP kodlayıcı plazmidin sadece hücrelere yüklenmediğini, aynı zamanda ifade edildiğini de gösterdi. Böylece, aynı hücrede, boncuk yükleme, daha önce bu laboratuvarda22 , 23,24'tegerçekleştirilen bir protein probu (örneğin,Cy3etiketli Fab) ve muhabir plazmidini (örneğin, GFP) tanıtabilir. Hücrelerin% 40'ının Fab proteini ile boncuk yüklü olduğunu ve boncuk yüklü hücrelerin% 21'inin, Şekil 2B'dekitemsili görüş alanlarında gösterildiği gibi, birlikte yüklenen plazmidi ifade ettiğini belirledik. Tipik olarak, her oda 1-2 μg plazmid ile yüklenir, lipofeksiyonla yaklaşık olarak aynı miktardadır.
Boncuk yüklü hücreler çok çeşitli plazmid seviyelerini ifade eder(Şekil 2C, D). Bunu özellikle ölçmek için, protein ve plazmid yoğunluk verilerinin dağılımlarını karşılaştırmak için Fisher Oranı testini kullandık. Sonuçlar, 1 ve 2 proteinlerinin benzer yoğunluk dağılımlarına sahip olmasına rağmen (p = ~1), her proteinin plazmidden önemli ölçüde daha küçük bir dağılıma sahip olduğunu göstermiştir (p = 3.2e-6 ve 1.8e-5). Bu, hücre başına kaç plazmid yüklendiğindeki değişkenlikten kaynaklansa da, hücre çekirdeğine ithal edilmek, transkripsiyon ve çeviri de dahil olmak üzere hücreler arasında büyük ölçüde değişiklik gösterebilecek plazmid ekspresyonu için gereken birçok adımdan daha fazla değişkenlik kaynağı ortaya çıkabilir. Buna karşılık, boncuk yüklü proteinlerin seviyeleri hafif hücreden hücreye varyansa sahipti ve aynı anda yüklenen iki proteinin seviyeleri birbiriyle yüksek oranda ilişkiliydi (Şekil 2D, E).
Plazmid ekspresyâhı 2-4 saat sonrası boncuk yüklemesi kadar erken görülebilir, ancak daha sonra optimal plazmid ekspresyon elde edildiğinden bağlı olarak ortaya çıkabilir. Boncuk yükleme sonrası 2-24 saat yayılan belirli bir plazmid için en iyi ifade penceresini belirlemek için bir zaman kursu gerçekleştirmenizi öneririz. Bu, uzun süreli görüntüleme ile bir odada veya boncuk yükleme ve birden fazla odacık şaşırtıcı ile yapılabilir. Boncuk yüklü hücreler yapışmaya devam ediyor ve büyüyecek ve bölünecek kadar sağlıklı. Boncuk yüklü insan U2OS hücreleri boncuk yüklemeden önce, doğrudan sonra ve 24 saat sonra görüntülenmişti. Şekil 3A'da (sol, orta) gösterildiği gibi, uygun boncuk yüklemesinin hücre sayısı veya morfolojileri üzerinde neredeyse hiçbir belirgin etkisi yoktu.
Buna karşılık, çok fazla boncuk ve aşırı dokunma kuvveti ile zayıf boncuk yükleme Şekil 3B'detasvir edilir. Bu, çok fazla hücre kaybına (hücreleri olmayan kapak örtülerinin büyük yamaları ve ayrılmış, yüzen, odak dışı hücreler), zayıf hücre morfolojisi (yuvarlanmış ve iyi yapışmamış görünen hücreler) ve boncuk yüklendikten sonra örtü üzerinde kalan boncuk kümelerine neden oldu. Hücrelerin boncuk yüklemesi sırasında mekanik hasara uğradığı düşünülse de, boncuk yüklemeden sonra 24 saat artan hücre sayısının kanıtlayarak, hücreler düzgün boncuk yüklü odada büyüdü ve çoğaldı (Şekil 3A, sağ). Hücre canlılığı üzerindeki etkisi, boncuk yüklü hücreleri karşılaştırmak için 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromür (MTT) tahlil gibi çeşitli tahliller aracılığıyla değerlendirilebilir30. Ayrıca, bu ve önceki çalışmalar boncuk yüklü hücrelerin hücre bölünmesinden geçtiğini göstermektedir (Şekil 3C ve Ek Video 1) ve mitozun zamanlaması boncuk yüklemeden etkilenmez31Boncuk yüklemeden sonra sürekli hücre sağlığı için daha fazla kanıt görevi görür.
Boncuk yükleme, çeşitli yapışık hücre hatlarını ve çeşitli makromolekülleri bir arada tanıyan çok yönlü bir tekniktir. Burada, bu çeşitlilik Fab (Şekil 4A, B) ile RPE1 ve HeLa hücre hatları yüklenerek gösterilmiştir. Tablo 1, farklı hücre hatlarında, bu laboratuvarda ve ötesinde boncuk yüklemesinin diğer örneklerini sunar ve diğer laboratuvarlardan boncuk yükleme protokolleri arasındaki bazı nüanslı farklılıklara işaret eder. Not olarak, yükleme için kullanılan cam boncukların çapı laboratuvarlar arasında büyük ölçüde değişmektedir, ancak en verimli yükleme birkaç hücre hattında küçük, 75 μm çapında boncuklar için bulunmuştur14. Ayrıca, bu laboratuvar RNA yüklemeye başladı (veriler gösterilmedi). Şekil 4C, Cy5-RNA 9mer ve Cy3-DNA 28mer ile birlikte yüklü temsili bir U2OS hücre boncuklarını görüntüler.
Şekil 1: Boncuk yükleme aparatı, tekniği ve zaman çizelgesi Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Boncuk yükleme, protein konsantrasyonunda düşük değişkenlik, plazmid ifadesinde yüksek değişkenlik sunar. (A) Hücreler, 4 μL boncuk yükleme çözeltisinde Alexa488 konjuge anti-H3K27 asetil Fab (yeşil) ve Cy3 konjuge anti-RNAPII-Serine 5 fosforilasyonlu Fab (kırmızı) her birinin 0,5 μg'si ile boncuk yüklüdür. Hücreler DAPI lekeli (mavi) ve hemen canlı görüntülendi. Ölçek çubukları = 20 μm. (B) Hücreler 4 μL boncuk yükleme çözeltisinde 0,5 μg Fab proteini (Cy3-konjuge anti-RNAPII-Serine 5 fosforillenmiş protein, kırmızı) ve 1 μg plazmid kodlama süper klasörü GFP-H2B (yeşil) ile boncuk yüklendi. 24 saat sonra, hücreler DAPI lekeli (mavi) ve canlı olarak görüntülendi. Ölçek çubukları = 30 μm. (C-E) Protein 1 (JF646-HaloLigand etiketli HaloTag-MCP), protein 2 (Cy3 konjuge anti-FLAG Fab) ve EGFP (φN-EGFP-LacZ) plazmid kodlaması hücrelere boncukla yüklendi. Her floresan kanalındaki toplam yoğunluk, her hücrenin sitoplazmasında 1,3 x 1,3 μm'lik bir yama ile ölçüldü. N = 25 hücre. (C) Boncuk yüklü plazmid ifade eden temsili hücreler, φN-EGFP-LacZ. Tüm hücreler için aynı görüntüleme koşulları ve yoğunluklar kullanılmıştır. Lekeler eksprese proteinin agregalarıdır. Ölçek çubukları = 10 μm. (D) Grafik, plazmidden ifade edilen protein 1, protein 2 veya EGFP'nin her hücrenin toplam yoğunluğunu gösterir. Her kanal ortancaya normalleştirildi. Bonferroni düzeltilmiş P değerleri, protein veya plazmid yoğunluk verilerinin dağılımının aynı değişkenliğe sahip olup olmadığını belirlemek için Fisher Ratio testi ile hesaplanmıştır. Her nokta bir hücreyi temsil eder. (E) Her iki protein, protein 1 ve plazmid veya protein 2 ve plazmid için toplam yoğunluklar birbirine çizilir. Hesaplanan R2 değerleri görüntülenir. Her nokta bir hücreyi temsil eder. Kısaltmalar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindole; EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein; A.U. = keyfi birimler; MCP = MS2 kat proteini; RNAPII = RNA polimeraz II. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Boncuk yüklü hücreler yapışmaya devam ediyor ve büyüyüp bölünecek kadar sağlıklı. (A) U2OS hücreleri, 4 μL boncuk yükleme çözeltisinde 0,5 μg Cy3 konjuge anti-FLAG Fab ile boncuk yüklendi. Hücreler doğrudan boncuk yüklemesinden sonra, boncuk yüklendikten sonra ve boncuk yüklendikten sonra 24 saat önce görüntülenmişti. Turuncu oklar, boncuk yükleme sırasında hücrelerin soyulduğu alanları tanımlar. Ölçek çubukları = 2 mm. (B) U2OS hücrelerinin temsili görüntüsü,(A)gelen bileşenlerle dolu, ancak sert dokunma ve çok fazla boncuk ile. Kırmızı ok ekstra cam boncukları tanımlar. Ölçek çubuğu = 2 mm. (C) U2OS hücreleri 14,4 kbp plazmid smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2'nin 1,5 μg'si ile yüklendi, 0,5 μg Cy3 konjuge anti-FLAG Fab (yeşil), 8 μL boncuk yükleme çözeltisinde 130 ng HaloTag-MCP (macenta). Görüntülemeden hemen önce HaloTag JF646-HaloLigand ile boyandı. Muhabir plazmidinden yazılan mRNA'nın MS2 kök döngüleri MCP (macenta lekeleri) ve BAYRAK etiketli çevrilmiş muhabir proteini anti-FLAG Fab (yeşil kolokalizasyondan mRNA'ya) ile etiketlenmiştir. Olgun Fab etiketli protein çekirdeğe lokalize eder. Bu hücre boncuk yüklendikten sonra 4-15 saat görüntülendi. Sarı oklar hücre çekirdeğini hücre bölünmesinden önce ve çekirdekleri hücre bölünmesinden sonra tanımlar. Ölçek çubukları = 5 μm. Kısaltma: MCP = MS2 kat proteini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Boncuk yükleme protokolünün hücre tipi yükleme malzemesindeki varyasyonlar. (A-B) RPE1 (A) ve HeLa (B) hücreleri, 4 μL yükleme çözeltisinde 1,5 μg nükleer Fab proteini (anti-RNAPII-Serine 5-fosforilasyon) ile boncuk yüklendi. Her hücrenin çekirdeği (çekirdek) ve sitoplazm (sito) işaretlenir. Hücreler boncuk yüklendikten sonra 6 saat görüntülendi. Ölçek çubukları = 5 μm. (C) İnsan U2OS hücreleri, 4 μL boncuk yükleme çözeltisinde hem Cy5-RNA 9mer (macenta) hem de Cy3-DNA 28mer (yeşil) oligos, her birinin 10 piomolesi ile boncuk yüklendi. Hücreler boncuk yüklendikten sonra 4 saat görüntülendi. Tüm hücre çekirdekleri kesikli bir çizgi ile vurgulanır. Ölçek çubukları = 5 μm. Kısaltmalar: RNAPII = RNA polimeraz II. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hücre satırı | Hücre türü | Boncuk yükleme etkinliği | Notlar/başvuru |
| Kök hücreler (insan) | Embriyonik kök hücreler | Zor | *Jelatin kaplı plakalar üzerine kaplanmışsa boncuk yüklemesi sırasında birçok hücre soyulur |
| HEK 293 | İnsan embriyonik böbrek hücreleri | Zor | *Boncuk yüklemeden önce görüntüleme odası yüzeyine bir jel matrisi koymanız gerekir. İlk başta boncuk yüklerken hafifçe dokunun. |
| Nöronlar (sıçan) | Primer embriyonik nöronlar (e-18), ayrışmış | Çok verimsiz | *Bu standart boncuk yükleme protokolü kullanılarak nöronların verimli boncuk yüklemesi gözlenmedi. Bunun nedeni nöronların yapışmayan doğası veya bunun sonucunda sinirsel süreçlere verilen hasar olabilir. |
| MDCK (köpek) | Madin-Darby köpek böbrek hücreleri | Bkz. McNeil ve Warder (1987)14 | *Düşük verimli boncuk yükleme14 |
| U2OS (insan) | Osteosarkom | Standart boncuk yükleme protokolü | |
| HeLa (insan) | Rahim ağzı kanseri | Standart boncuk yükleme protokolü | |
| RPE1 (insan) | Epitel hücreleri hTERT ile ölümsüzleştirildi | Standart boncuk yükleme protokolü | |
| HFF (insan) | Birincil önskin fibroblastları | Bkz. Besteiro vd. (2009)31 | *31'e dokunmak yerine eğim protokolü değiştirildi |
| BALB/c 3T3, NIH 3T3 ve İsviçre 3T3 (fare) | Embriyonik fibroblastlar | Bakınız Gilmore ve Romer (1996)32, Emerson ve arkadaşları (2014)33 ve McNeil ve Warder (1987)14 | *425–600 μm cam boncuk rapor32 |
| *Kullanılmış 200–300 μm cam boncuk33 | |||
| *75 μm cam boncuklar 400 μm14'ten daha iyi sonuçlar verdi | |||
| DM (Hint muntjac) | Cilt fibroblastları | Bkz. Manders, Kimura ve Cook (1999)34 | |
| CHO (hamster) | Epitel benzeri yumurtalık hücreleri | Bkz. Memedula ve Belmont (2003)35 | *Kullanılmış 425–600 μm cam boncuk35 |
| BAE (sığır) | Sığır aort endotel hücreleri (BAEC-11) | Bkz. McNeil ve Warder (1987)14 | *75 μm cam boncuklar 400 μm14'ten daha iyi sonuçlar verdi |
| PtK-2 (Potomus tridaclylis) | Epitel böbrek hücreleri | Bkz. McNeil ve Warder (1987)14 | *75 μm cam boncuklar 400 μm14'ten daha iyi sonuçlar verdi |
| HUVEC (insan) | Göbek damarı endotel hücreleri | Bkz. Gilmore ve Romer (1996)32 | *Kullanılmış 425–600 μm cam boncuk32 |
| J774 ve J774.2 (fare) | monosit makrofaj hücreleri | Bkz. Becker ve arkadaşları(2005)36 ve McNeil ve Warder (1987)14 | *Nazik ajitasyon (dokunmak yerine) ve 425–600 μm camboncuklar 36 |
| MS-5 (fare) | kemik iliği stromal hücreleri | Bkz. Molenaar vd. (2003)37 | |
| WPE1-NB11 (insan) | prostat epitel hücreleri | Bakınız Gilmore ve Romer (1996)32 ve | *Kullanılmış 425–600 μm cam boncuk32 |
| Emerson ve ark. (2014)33 | *Kullanılmış 200–300 μm cam boncuk33 |
Tablo 1: Farklı hücre hatlarında boncuk yüklemesi. Bu laboratuvarda henüz boncuk yüklü olmayan hücre hatları için protokoldeki varyasyonlara ilişkin referanslar ve notlar verilmiştir.
Ek Video 1: Hücre bölünmesi geçiren boncuk yüklü bir hücre örneği. U2OS hücreleri 14,4 kbp plazmid smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2'nin 1,5 μg'si ile yüklendi, 0,5 μg Cy3 konjuge anti-FLAG Fab (yeşil), 8 μL boncuk yükleme çözeltisinde 130 ng HaloTag-MCP (macenta). Görüntülemeden hemen önce HaloTag JF646-HaloLigand ile boyandı. Muhabir plazmidinden yazılan mRNA'nın MS2 kök döngüleri MCP (macenta lekeleri) ile etiketlenir ve BAYRAK etiketli çevrilmiş muhabir proteini anti-FLAG Fab (yeşil kolokalizasyondan mRNA'ya) ile etiketlenir. Olgun Fab etiketli protein çekirdeğe lokalize eder. Bu hücre boncuk yüklendikten sonra 4-15 saat görüntülendi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltma: MCP = MS2 kat proteini. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Burada açıklanan boncuk yükleme tekniği, makromolekülleri ve diğer parçacıkları yapışık hücrelere sokmak için uygun maliyetli ve zaman verimli bir yöntemdir. Bu çok yönlü işlem protein yükleyebilirsiniz (Şekil 2A)15,16,26,27, protein ve plazmidlerin bir kombinasyonu ( Şekil2B,C)22,25, RNA ( Şekil4C), 100 ve 250 nm polistiren boncuklar (kişisel yazışma), sentetik boyalar39 veya kuantum noktaları34,40 . Boncuk yükleme, diğer zar geçirimsiz parçacık türlerini de yükleme yeteneğine sahip olabilir. En sık kullanılan uygulaması, çeviri sonrası değişiklikler (PTM'ler) gibi endojen epitopları hedeflemek için antikorları veya Fabs'ı canlı hücrelere yüklemek içindir. PTM'ler gibi hedeflerin, PTM'ye özgü, genetik olarak kodlanmış problar41 , 42olmadan canlı hücrelerde etiketlenerek etiketlenmeleri genellikle zordur. Buna karşılık, boncuk yükleme, aynı anda birden fazla okumayı izlemek için aynı hücreye birden fazla prob, muhabir veya diğer moleküler araçları birlikte sokabilir. Boncuk yüklemenin çeşitli makromolekülleri veya parçacıkları yüklemek için yararlı bir teknik olacağını öngörüyoruz.
Boncuk yüklemenin en büyük avantajı düşük maliyettir: her denemenin maliyeti 0,01 USD'den azdır. Boncuk yükleyici aparatı, diğer hücre yükleme yöntemlerinden önemli ölçüde daha ucuz olan toplam ~$ 150'ye mal olan ucuz malzemeler kullanılarak kolayca yapılabilir. Boncuk yükleyici aparatının maliyeti, yeniden kullanılabilir metal hazneyi plastik bir oda ile değiştirerek 10 doların altına düşürülebilir. Bunun için, 35 mm'lik bir haznede bir delik açın veya camı 35 mm'lik bir cam tabanlı hazneden çıkarın, ardından ağı bantla güvenli bir şekilde sabitleyin. Bir aparat yerine, boncuk yükleme, hücrelere boncuk kepçesi ve serpmek için geniş delikli 1000 μL pipet ucu kullanılarak bile gerçekleştirilebilir, ancak bu varyasyon hücrelere bir tek katman boncuk serpmeyi zorlaştırır (adım 4.6).
Boncuk yüklemenin bir başka yararı, hücrelerin normal genel morfolojiyi koruyabilmesi, hızla iyileşebilmesi ve en azından burada çalışılan U2OS, RPE1 ve HeLa hücreleri ve başka bir yerde çalışılan diğer hücre hatları için büyümeye ve bölünmeye devam etmesidir (Şekil 3; Şekil 4A,B; Ek Video 1; ve Tablo 1)31. Boncuk yüklemesi sırasında, hücreler fiziksel strese maruz kalmaz ve bazen yerinden çıkarır ve soyulur (~% 5 hücrelerin en uygun koşullar altında soyulur, ancak boncuk yüklemesi çok güçlü bir şekilde yapılırsa veya Şekil 3B'degösterildiği gibi hücrelerin üzerine çok fazla cam boncuk yüklenirse daha fazla hücre kaybı olabilir). Bununla birlikte, kapak kapağına bağlı kalan boncuk yüklü hücreler genellikle sağlıklı görünür ve boncuk yüklendikten 30 dakika sonra görüntülenebilir (Şekil 3A). Genellikle hücrelere 30 dakikalık bir iyileşme süresine izin veririz, ancak boncuk sonrası yüklemeden önce görüntülemenin mümkün olduğunu tahmin ederiz.
Bu tekniğin önemli bir dezavantajı, hücrelerin yükleme sırasında küçük fiziksel strese dayanabilmesi ve kapak kılıflarına güvenli bir şekilde yapışması gerektiğidir. Kaplamalı plakalarda (örneğin, HEK ve kök hücreler) yetişen zayıf/yapışmayan hücre çizgileri veya hücreler genellikle boncuk yüklemesi sırasında hafifçe dokunulduğunda ayrılır. Ayrıca, deneyimler birincil nöronların boncuk yüklemesi için çok hassas olduğunu göstermiştir.
Boncuk yükleme, tek hücreli veya tek moleküllü deneyler için en uygun olanıdır. Deneyimlerimize göre, boncuk yükleme kabaca% 20-40 protein yükleme verimliliğine sahiptir ve boncuk yüklü hücrelerin ~ % 20'si de birlikte yüklenmiş bir plazmid ifade eder (Şekil 2A, B). Bu nedenle, boncuk yükleme plazmidleri protein ekspresyonu için saflaştırılmış proteinleri yükleyen boncuktan daha az verimli olabilir, çünkü plazmidler sadece hücrelere girmekle kalmaz, aynı zamanda ifade edilmelidir (diğer şeylerin yanı sıra, her biri ifade verimliliğini düşürebilen nükleer ithalat, transkripsiyon ve çeviri içerir). Boncuk yüklü plazmid ekspresyonunun düşük verimliliği, boncuk yükleme proteinleri veya probları16,27'denönce lipofeksiyon gibi alternatif transfeksiyon protokolleri kullanılarak atlatılabilir. Ayrıca, boncuk yüklemeden önce hücrelerin 30 dakika boyunca optimal ortamda inkübe edilmesi plazmid ekspresyona yardımcı olabilir. Düşük plazmid ekspresyonu nedeniyle, boncuk yüklemesi bu laboratuvarda lipofeksiyon bazlı transfeksiyona alternatif olarak sıklıkla kullanılmamıştır. Tek istisna, Fab gibi saflaştırılmış bir proteinin birlikte yüklenmesidir, bu durumda proteini ve plazmidi aynı anda boncukla yüklemek oldukça uygundur. Ayrıca, lipofeksiyona tepkisiz veya hoşgörüsüz hücreler için boncuk yükleme, düşük verimli de olsa, geçici plazmid ekspresyonu için alternatif bir yöntem sağlayabilir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Stasevich laboratuvarı üyelerine, bu protokolün geliştirilmesine ve geliştirilmesine yardımcı olan sayısız konuşma için minnettarız. Özellikle, Dr. Linda Forero ve Dr. Phil Fox farklı hücre tiplerini yükleyen boncuk hakkında tavsiyeler için. Dr. Yoko Hayashi-Takanaka, Dr. Yuko Sato ve Dr. Hiroshi Kimura'ya cam boncuk yükleme protokollerini paylaştıkları için içtenlikle teşekkür ederiz. Dr. Ashok Prasad ve Dr. Diego Krapf'a, hücrelere inorganik parçacıklar sokmak için boncuk yükleme protokollerini cömertçe paylaştıkları için çok minnettarız. Dr. Travis Sanders, Craig Marshall ve Dr. Thomas Santangelo'ya etiketli RNA reaktiflerini cömertçe paylaştıkları için minnettarız. ALK, MNS, CAC, GG ve TJS, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibesi R35GM119728 ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) CAREER hibeSI MCB-1845761 tarafından desteklendi. CAC ayrıca NSF NRT ödülü DGE-1450032 tarafından da desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
| 35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
| Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
| Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
| Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
| L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
| Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
| Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
| Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |
References
- Stewart, M. P., et al. In vitro and ex vivo strategies for intracellular delivery. Nature. 538 (7624), 183-192 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Schenborn, E. T., Goiffon, V. DEAE-dextran tansfection of mammalian cultured cells. Methods in Molecular Biology. 130, 147-153 (2000).
- Celis, J. E. Microinjection of somatic cells with micropipettes: comparison with other transfer techniques. Biochemical Journal. 223 (2), 281-291 (1984).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15494-15500 (1989).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. American Journal of Physiology. 260 (2), 355-363 (1991).
- Potter, H.
- Fawell, S., et al. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (2), 664-668 (1994).
- Prior, T. I., FitzGerald, D. J., Pastan, I. Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol. Biochemistry. 31 (14), 3555-3559 (1992).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3185-3190 (2001).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Reports. 13 (8), 709-715 (2012).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98 (4), 1556-1564 (1984).
- Ortiz, D., Baldwin, M. M., Lucas, J. J. Transient correction of genetic defects in cultured animal cells by introduction of functional proteins. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 3012-3017 (1987).
- McNeil, P. L., Warder, E. Glass beads load macromolecules into living cells. Journal of Cell Science. 88 (5), 669-678 (1987).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Research. 39 (15), 6475-6488 (2011).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352 (6292), 1425-1429 (2016).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Zhao, N., et al. A genetically encoded probe for imaging nascent and mature HA-tagged proteins in vivo. Nature Communications. 10 (1), 2947 (2019).
- Jedlitzke, B., Mootz, H. D. Photocaged nanobodies delivered into cells for light activation of biological processes. ChemPhotoChem. 5 (1), 22-25 (2021).
- Coulon, A., et al. Kinetic competition during the transcription cycle results in stochastic RNA processing. eLife. 3, 03939 (2014).
- Pichon, X., Robert, M. -C., Bertrand, E., Singer, R. H., Tutucci, E. New generations of MS2 variants and MCP fusions to detect single mRNAs in living eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 2166, 121-144 (2020).
- Koch, A., et al. Quantifying the dynamics of IRES and cap translation with single-molecule resolution in live cells. Nature Structural & Molecular Biology. 27, 1095-1104 (2020).
- Moon, S. L., et al. Multicolor single-molecule tracking of mRNA interactions with RNP granules. Nature cell biology. 21 (2), 162-168 (2019).
- Moon, S. L. Coupling of translation quality control and mRNA targeting to stress granules. Journal of Cell Biology. 219 (8), 202004120 (2020).
- Cialek, C. A., et al. Imaging translational control by Argonaute with single-molecule resolution in live cells. bioRxiv. , (2021).
- Forero-Quintero, L. S., et al. Live-cell imaging reveals the spatiotemporal organization of endogenous RNA polymerase II phosphorylation at a single gene. bioRxiv. , (2020).
- Lyon, K., Aguilera, L. U., Morisaki, T., Munsky, B., Stasevich, T. J. Live-cell single RNA imaging reveals bursts of translational frameshifting. Molecular Cell. 75 (1), 172-183 (2019).
- JoVE. Introduction to Fluorescence Microscopy. General Laboratory Techniques. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Hayashi-Takanaka, Y., Yamagata, K., Nozaki, N., Kimura, H. Visualizing histone modifications in living cells: spatiotemporal dynamics of H3 phosphorylation during interphase. Journal of Cell Biology. 187 (6), 781-790 (2009).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Stasevich, T. J., et al. Regulation of RNA polymerase II activation by histone acetylation in single living cells. Nature. 516 (7530), 272-275 (2014).
- Besteiro, S., Michelin, A., Poncet, J., Dubremetz, J. -F., Lebrun, M. Export of a Toxoplasma gondii rhoptry neck protein complex at the host cell membrane to form the moving junction during invasion. PLOS Pathogens. 5 (2), 1000309 (2009).
- Gilmore, A. P., Romer, L. H. Inhibition of focal adhesion kinase (FAK) signaling in focal adhesions decreases cell motility and proliferation. Molecular Biology of the Cell. 7 (8), 1209-1224 (1996).
- Emerson, N. T., Hsia, C. -H., Rafalska-Metcalf, I. U., Yang, H. Mechanodelivery of nanoparticles to the cytoplasm of living cells. Nanoscale. 6 (9), 4538-4543 (2014).
- Manders, E. M. M., Kimura, H., Cook, P. R. Direct imaging of DNA in living cells reveals the dynamics of chromosome formation. Journal of Cell Biology. 144 (5), 813-822 (1999).
- Memedula, S., Belmont, A. S. Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16. Current Biology. 13 (3), 241-246 (2003).
- Becker, T., Volchuk, A., Rothman, J. E. Differential use of endoplasmic reticulum membrane for phagocytosis in J774 macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4022-4026 (2005).
- Molenaar, C., et al. Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probes. The EMBO Journal. 22 (24), 6631-6641 (2003).
- Jones, S. A., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
- Sabri, A., Xu, X., Krapf, W. M. Elucidating the origin of heterogeneous anomalous diffusion in the cytoplasm of mammalian cells. Physical Review Letters. 125 (5), 053901 (2020).
- Sato, Y., et al. Genetically encoded system to track histone modification in vivo. Scientific Reports. 3, 2436 (2013).
- Sato, Y., Stasevich, T. J., Kimura, H. Visualizing the dynamics of inactive X chromosomes in living cells using antibody-based fluorescent probes. X-Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, Humana. New York, NY, USA. 91-102 (2018).
