Summary
Perlelasting introduserer proteiner, plasmider og partikler i adherent pattedyrceller. Denne cellelasteteknikken er billig, rask og påvirker ikke cellehelsen betydelig. Den egner seg best for levende celleavbildning.
Abstract
Mange levende celleavbildningsforsøk bruker eksogene partikler (f.eks. peptider, antistoffer, perler) til å merke eller fungere i celler. Det er imidlertid vanskelig å introdusere proteiner i en celle over membranen. Det begrensede utvalget av nåværende metoder sliter med lav effektivitet, krever dyrt og teknisk krevende utstyr, eller funksjoner innenfor smale parametere. Her beskriver vi en relativt enkel og kostnadseffektiv teknikk for lasting av DNA, RNA og proteiner i levende menneskelige celler. Perlelasting induserer en midlertidig mekanisk forstyrrelse av cellemembranen, slik at makromolekyler kan komme inn i adherent, levende pattedyrceller. På mindre enn 0,01 USD per eksperiment er perlelasting den billigste cellebelastningsmetoden som er tilgjengelig. Videre stresser perlebelastning ikke i vesentlig grad celler eller påvirker deres levedyktighet eller spredning. Dette manuskriptet beskriver trinnene i perlelastingsprosedyren, tilpasninger, variasjoner og tekniske begrensninger. Denne metoden er spesielt egnet for levende celleavbildning, men gir en praktisk løsning for andre applikasjoner som krever innføring av proteiner, perler, RNA eller plasmider i levende, tilhengerpattedyrceller.
Introduction
Lasting av makromolekyler i pattedyrceller nødvendiggjør metodikk som gjør at de kan krysse cellens plasmamembran1. Flere metoder kan introdusere plasmider i pattedyrceller gjennom transfeksjon, inkludert liposomal transfeksjon2 og diethylaminoethyl-dextran transfection3. Imidlertid er metoder for lasting av proteiner eller membran-ugjennomtrengelige partikler i celler mer begrenset.
Flere teknikker har omgått dette vanskelige hinderet ved hjelp av ulike strategier. For det første leverer mikroinjeksjon partikler gjennom en mikropipette i levende celler under et mikroskop4. Selv om denne teknikken uten tvil er den mest kontrollerte og minst invasive metoden, er den relativt lav gjennomstrømning fordi celler må lastes en etter en. Videre krever mikroinjeksjon spesialisert utstyr og er teknisk krevende.
For det andre er elektroporasjon en måte å injisere proteiner i celler via spenningsindusert membranforstyrrelse5,6,7. Denne metoden krever imidlertid igjen spesialisert, dyrt utstyr, og sjokket kan forårsake cellestress og dødelighet. Videre må celler prøves på nytt før elektroporasjon og deretter replateres, noe som begrenser tidsrammen for når celler kan undersøkes etter elektroporasjon.
For det tredje kan cellemembraner endres kjemisk for midlertidig, reversibel permeabilisering8,9. Streptolysin-O-lasting setter inn et endotoksin i cellemembraner, som danner midlertidige porer, slik at eksogene membran-ugjennomtrengelige partikler, inkludert proteiner og DNA-plasmider, kan komme inn i cellene10. Etter en 2 timers gjenoppretting reparerer omtrent halvparten av cellene disse porene og stopper internaliseringspartikler fra løsningen. Denne teknikken krever imidlertid lang gjenopprettingstid og er inkompatibel med celletyper som ikke tåler endotoksiner.
For det fjerde laster mekanisk forstyrrelse partikler inn i celler gjennom fysisk perturbasjon av cellemembranen11. Dette kan gjøres på flere måter, inkludert riper, skraping og rullende perler på toppen av celle12,13. Så tidlig som i 1987 har perler blitt brukt til å laste proteiner inn i celler mekanisk14. Mer nylig har perlelastingsteknikken blitt optimalisert og tilpasset utover proteiner for å inkludere lasting av plasmider og RNA, som beskrevet her.
Perlelasting er en enkel, billig og rask metode for lasting av protein og plasmider i tilhørende menneskelige celler. Glassperler rulles kort på toppen av celler, og forstyrrer midlertidig deres cellulære membran. Dette gjør at partikler i oppløsning kan komme inn. Siden perlelasting har lav effektivitet, er den best egnet for enkeltmolekyl- eller encellede mikroskopieksperimenter. Perlelasting kan introdusere et bredt utvalg av proteiner, inkludert fragmenterte antistoffer (Fab),15,16 rensede proteiner som scFvs,17 intrabodies,18,19eller mRNA frakkproteiner, for eksempel MS2-frakkprotein (MCP)20,21. Plasmiduttrykksvektorer kan også legges til proteinoppløsningen og perlelastet samtidig22,23,24,25.
Utover proteiner og plasmider har molekyler så store som 250 nm polystyrenperler blitt introdusert i celler via perlelasting (personlig kommunikasjon). Bead lasting er utrolig billig, koster mindre enn 0.01 USD per eksperiment i materialer og krever ingen ekstra dyrt utstyr. Kostnaden reduseres ytterligere ved å minimere mengden sonder som brukes per eksperiment fordi bare cellene i den sentrale mikrowellen med 14 mm diameter av et bildekammer er lastet. Det skal bemerkes at det begrensede lasteområdet betyr at perlelasting ikke er ideell for bulkcellelasting.
Dette manuskriptet presenterer perlelastingsprosessen, inkludert hvordan man konstruerer perlelasteapparatet og utfører et eksperiment. Den viser at proteiner, RNA og DNA kan lastes inn i ulike celletyper, og at to forskjellige, samtidig perlelastede proteiner har svært korrelerte cellulære konsentrasjoner og relativt lav varians. Også diskutert er variasjoner i protokollen basert på celletype og lasting av protein, plasmid eller RNA. Selv om perler antas å perforere og forstyrre cellemembranen, løsner perlelastingsprosessen bare et lite antall celler fra bunnen av bildekammeret når det utføres på riktig måte. Etter en kort gjenopprettingsperiode fortsetter cellene å vokse og dele seg. Denne metoden er ideell for levende cellemikroskopieksperimenter, inkludert enkeltmolekylprotein og RNA-sporing, post-translasjonell modifikasjonsdeteksjon, observasjon av dynamiske cellulære mekanismer eller subcellulær lokaliseringsovervåking15,16,22,26,27.
Protocol
1. Rengjør, steriliser og tørk glassperler for å unngå klumping og sikre jevn spredning på toppen av cellene.
- Steriliser ca. 5 ml glassperler i natriumhydroksid (NaOH). Mål perlene i et 50 ml konisk rør. Tilsett 25 ml 2 M NaOH og bland forsiktig med en shaker eller rotator i 2 timer.
- Dekanter NaOH, og behold så mange perler som mulig. Hvis perlene er i suspensjon, spinn ned perlerøret kort i en sentrifuge (1 min ved ~ 1000 × g, romtemperatur).
- Vask perlene grundig med cellekulturelt vann til pH er nøytral (bruk en pH-teststrimmel på eluenten for å bekrefte en nøytral pH). Dekanter vaskevannet hver gang, som før.
- Vask perlene grundig med 100% etanol 2-3x. Dekanter etanol hver gang, som før.
- Tørk perlene. Dryss perlene for å danne et tynt lag inne i en steril beholder (for eksempel en 10 cm Petri-tallerken). La beholderen stå åpen, la perlene lufttørke i et biosikkerhetsskap over natten. Forsikre deg om at perlene er helt tørre ved å banke eller forsiktig riste beholderen og kontrollere at perlene har en sandaktig tekstur uten klumping eller flassing.
- UV-steriliser de tørre perlene i 15 min.
2. Monter perlelasterapparatet.
- Fest en plastlapp (polypropylen eller tilsvarende materiale, 105 μm åpninger slik at perlene kan passere gjennom) for å dekke hele åpningen av perlenes holdekammer med enten tape eller klemme nettet mellom hannen og hunnendene av et metall gjenbrukbart bildekammer (Figur 1A).
- UV-steriliser apparatet i 15 min. Tilsett perlene til apparatet og forsegle det tett med voksaktig film.
MERK: Det er viktig at perlene er helt rene og tørre på dette trinnet. De skal være løse og se sandaktig ut uten klumper. Hvis de ikke ser slik ut, vask og tørk perlene helt. - Oppbevar apparatet i en forseglet, tørr beholder tørket av silikagel eller annet tørkemiddelmedium. Hvis perlene blir fuktige, noe som vil være tydelig ved perle klumping, grundig tørr og sterilisere perlelasteren og erstatte med friske perler.
MERK: Alle disse forholdsreglene vil forhindre at mugg eller bakterier vokser på eller rundt perlene i perlelasteren. Perlelasterapparatet kan gjøres på forskjellige måter. Se detaljene i diskusjonen.
3. Forbered glassbunnskamre av tilhengerceller.
- Frøtilhørige pattedyrceller på et 35 mm glassbunnkammer. Forsikre deg om at cellene er ca. 80% sammenfallende på tidspunktet for perlelasting. (Se tabell 1 hvis du vil ha mer informasjon om ulike celletyper og notater om effektiviteten av perlelasting i forskjellige celletyper.)
MERK: Celler kan bare frøs i mikrowell i midten av kammeret for å bevare hvor mange celler som brukes. - Inkuber cellene under normale forhold til de er helt festet til glasset.
MERK: Det er viktig at celletettheten er høy nok og at cellene sitter godt fast i glasset. Hvis disse kravene ikke er oppfylt, vil cellene sannsynligvis skrelle av under bead lasting. Tidslinjen mellom cellesåing og perlelasting kan forlenges for å sikre riktig celleadheft og samløp.
4. Perle lasting celler
MERK: Vask om nødvendig cellene kort med fosfatbufret saltvann (PBS) og tilsett deretter 2 ml av det optimale mediet. Inkuber i minst 30 min.
- Lag en løsning på 3-8 μL som inneholder de ønskede plasmidene, proteinene og / eller partiklene. Bruk ~1 μg (0,1-1 pmol) av hver type plasmid og ~0,5 μg (0,01 nmol) protein, avhengig av eksperimentelle krav. Bruk et rør med lav oppbevaring for proteiner slik at de ikke blir etterlatt på rørveggene. Ta løsningen opp til minimum 3 μL med PBS, og juster løsningsvolumet for å belegge hele celleområdet som skal lastes (dvs. kammerets mikrowell, figur 1B).
- Bland oppløsningen grundig ved å pipettere opp og ned og/eller flikke røret. Snurr kort løsningen ned til bunnen av røret i en bordplatemikrofuge.
- Overfør perlelastingsløsningen og kammeret av celler til en vevskulturhette. Utfør de resterende trinnene i vevskulturhetten ved hjelp av steril teknikk.
- Fjern mediet fra cellene og lagre det midlertidig i et sterilt rør. Aspirer forsiktig hele mediet fra rundt kantene av kammeret, og vipp kammeret i omtrent en 45° vinkel og fjern den gjenværende mediedråpen i midtmikrowell. Under middels fjerning, sørg for å unngå å la pipettespissen berøre glasset, noe som kan føre til celle peeling og tap. Flytt raskt til neste trinn slik at cellene ikke er tørre lenge.
- Rør forsiktig perlelastingsløsningen på glassmikrowellet i midten av kammeret. Valgfritt: Inkuber med skånsom gynge i ca. 30 s uten å la kammeret tørke helt opp.
- Disperger forsiktig en monolayer av glassperler på toppen av cellene, helst ved hjelp av et perlelasteapparat (Figur 1A). Pass på at perlene dekker cellene i glassbunnmikrowell helt.
- Klem kammeret med to fingre, trykk det mot hetteoverflaten ved å løfte det ~ 2 tommer og bringe det godt ned. Bruk en kraft som tilsvarer å slippe parabolen fra den høyden. Gjenta for totalt ~10 trykk.
MERK: Pass på at kranene ikke skreller cellene vesentlig. Trykking kan optimaliseres for celletypen. Hvis cellene lastes dårlig, trykker du hardere. Men hvis mange celler skreller av, trykk lettere. - Legg forsiktig medium tilbake i kammeret ved å pipetter sakte på plastsiden av kammeret. Prøv å aspirere flytende perler uten å forstyrre cellene. Legg til flere forhåndsvarmede medier på dette trinnet hvis for mye ble fjernet. Inkuber cellene i 0,5-2 timer i inkubatoren.
- UV-steriliser perlelasteren i 15 minutter før den returneres til oppbevaring under uttørkende forhold.
- Tilsett fargestoff (f.eks. DAPI- eller HaloTag-ligandflekk, hvis eksperimentet krever det) i cellene i henhold til produsentens anbefalte protokoll.
- Vask cellene 3x med medium før avbildning for å fjerne perler og overflødige lastekomponenter i løsningen. Unngå pipettering direkte på celler for å hindre at de skreller.
5. Bilde av perlebelastede celler
- Bilde av cellene umiddelbart eller når eksperimentet krever det. Bruk et mikroskop som er i stand til å fange fluorescens (lasere eller monokromatisk lyskilde). Påse at eksitasjonsbølgelengdene passer for den valgte fluoroforen eller fargestoffet (f.eks. 488 nm bølgelengdelys for grønt fluorescensprotein (GFP)).
MERK: Perlebelastede proteiner kan avbildes når cellene er gjenvunnet (så snart 30 minutter etter lasting for cellelinjene beskrevet her). Plasmiduttrykk tar ≥2 h avhengig av uttrykksvektorelementer (Figur 1C, og ytterligere forklaring i diskusjonen). Avbildning av perlelastede celler kan utføres på et hvilket som helst mikroskop utstyrt med de riktige fluorescerende kildene forbundet med lastede sonder, et kamera som er i stand til å fange fluorescensbilder, for eksempel et elektron-multipliserende ladekoblingsenhet (EMCCD) eller vitenskapelig komplementært metalloksid halvlederkamera (sCMOS) og en inkubator for å kontrollere temperatur, fuktighet og karbondioksid. For en veiledning til fluorescensmikroskopi, se 27.
Representative Results
Den vanligste anvendelsen av perle lasting er å introdusere en eller flere typer protein i tilhenger menneskelige celler. For å illustrere dette ble cellene bead-lastet med en løsning av et Cy3- og Alexa488-konjugert Fab-protein. Selv om ikke alle cellene i mikrowellet var bead-lastet, hadde cellene som ble lastet nesten alltid både Cy3- og Alexa488-merkede proteiner sammen (Figur 2A). Ifølge et tidligere estimat, når 0,5 mikrogram Fab fortynnet i 4 mikroliter er perlelastet29, som i figur 2A, er hver celle lastet med omtrent 106 Fab-molekyler.
Plasmid DNA-koding GFP (1 μg plasmid DNA, 1,8 μL av en 557 ng/μL-løsning) og 0,5 μg Cy3-merket Fab ble også introdusert i celler via perlelasting og deretter uttrykt og visualisert (Figur 2B). GFP-fluorescensen indikerte at GFP-kodingsplasmid ikke bare ble lastet inn i celler, men også uttrykt. Således, i samme celle, perle lasting kan introdusere en protein sonde (f.eks, Cy3-merket Fab) og reporter plasmid (f.eks, GFP), som utført i dette laboratoriet tidligere22,23,24. Vi fant ut at 40% av cellene var perlelastet med Fab-protein og 21% av de perlelastede cellene uttrykte den co-loaded plasmid, som vist i de representative synsfeltene i figur 2B. Vanligvis er hvert kammer lastet med 1-2 μg plasmid, omtrent samme mengde som lipofeksjon.
Perlelastede celler uttrykker svært varierende nivåer av plasmider (Figur 2C,D). For å spesifikt måle dette brukte vi Fisher Ratio-testen til å sammenligne fordelingene av protein- og plasmidintensitetsdata. Resultatene viste at selv om proteinene 1 og 2 hadde lignende intensitetsfordelinger (p = ~1), hadde hvert protein en betydelig mindre fordeling enn plasmidet (p = 3,2e-6 og 1,8e-5). Selv om dette kan skyldes variasjon i hvor mange plasmider som lastes per celle, kan den største kilden til variasjon oppstå fra de mange trinnene som kreves for plasmiduttrykk som sannsynligvis vil variere sterkt mellom celler, inkludert å bli importert til cellekjernen, transkripsjonen og oversettelsen. Derimot hadde nivåene av perlebelastede proteiner liten celle-til-celle-varians, og nivåene av to samtidig belastede proteiner var svært korrelert med hverandre (Figur 2D,E).
Plasmid uttrykk kan sees så tidlig som 2-4 h post perle lasting, men kan oppstå senere avhengig av når optimal plasmid uttrykk er oppnådd. Vi anbefaler å utføre et tidskurs for å bestemme det beste uttrykksvinduet for en bestemt plasmid som spenner over 2-24 timers postperlelasting. Dette kan gjøres i ett kammer med lang tidsramme avbildning eller ved perle lasting og svimlende flere kamre. Perlebelastede celler forblir tilhenger og er sunne nok til å vokse og dele seg. Perlebelastede menneskelige U2OS-celler ble avbildet rett før, rett etter, og 24 timer etter perlelasting. Riktig bead lasting hadde nesten ingen merkbar effekt på antall celler eller deres morfologi, som vist i figur 3A (venstre, midten).
Derimot er dårlig perlelasting med for mange perler og overdreven tappekraft avbildet i figur 3B. Dette forårsaket mye celletap (store flekker av coverglasset uten celler og frittliggende, flytende, ute av fokus celler), dårlig cellemorfologi (celler vises avrundet opp og dårlig festet), og klynger av perler gjenstår på coverglasset etter perle lasting. Selv om celler antas å gjennomgå mekanisk skade under bead lasting, celler vokste og spredte seg i riktig perle-lastet kammer, som det fremgår av det økte antall celler 24 h etter perle lasting (Figur 3A, høyre). Effekten på celle levedyktighet kan vurderes gjennom en rekke analyser, for eksempel en 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse, for å sammenligne perle lastet til mock-loaded celler30. Videre viser dette og tidligere arbeid at de perlebelastede cellene gjennomgår celledeling (Figur 3C og Supplerende video 1), og tidspunktet for mitose påvirkes ikke av perlelasting31, som tjener som ytterligere bevis for vedvarende cellehelse etter perlelasting.
Perle lasting er en allsidig teknikk, imøtekomme flere adherent cellelinjer og ulike makromolekyler. Her har denne variasjonen blitt demonstrert ved å laste inn RPE1- og HeLa-cellelinjer med Fab (Figur 4A, B). Tabell 1 gir ytterligere eksempler på perlelasting i ulike cellelinjer, i dette laboratoriet og utover, og påpeker noen av de nyanserte forskjellene mellom perlelastingsprotokoller fra andre laboratorier. Vær oppmerksom på at diameteren på glassperler som brukes til lasting varierer sterkt mellom laboratorier, selv om den mest effektive belastningen ble funnet for små, 75 μm diameter perler i flere cellelinjer14. Videre har dette laboratoriet begynt perle lasting RNA også (data ikke vist). Figur 4C viser en representativ U2OS-celleperle lastet med en Cy5-RNA 9mer og Cy3-DNA 28mer sammen.
Figur 1: Perlelasteapparat, teknikk og tidslinje Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Perlelasting introduserer lav variasjon i proteinkonsentrasjon, men høy variasjon i plasmiduttrykk. (A) Celler ble bead-lastet med 0,5 μg av hver av Alexa488-konjugert anti-H3K27 acetyl Fab (grønn) og Cy3-konjugert anti-RNAPII-Serine 5-fosforylert Fab (rød) i 4 μL perle lasting løsning. Cellene ble DAPI-farget (blå) og deretter levende bilde umiddelbart. Skalastenger = 20 μm. (B) Celler ble bead-lastet med 0,5 μg Fab protein (Cy3-konjugert anti-RNAPII-Serine 5-fosforlatert protein, rød) og 1 μg plasmid koding superfolder GFP-H2B (grønn) i 4 μL perle lasting løsning. Etter 24 timer ble cellene DAPI-farget (blå) og avbildet levende. Skalastenger = 30 μm. (C-E) Protein 1 (JF646-HaloLigand-merket HaloTag-MCP), protein 2 (Cy3-konjugert anti-FLAG Fab), og en plasmidkoding EGFP (λN-EG-LacZ) ble bead-lastet sammen i celler. Den totale intensiteten i hver fluorescerende kanal ble målt i en 1,3 x 1,3 μm patch i cytoplasma i hver celle. N = 25 celler. (C) Representative celler som uttrykker perlebelastet plasmid, λN-EGFP-LacZ. De samme bildeforholdene og intensitetene ble brukt for alle celler. Flekker er aggregater av det uttrykte proteinet. Skalastenger = 10 μm. (D) Diagrammet viser hver celles totale intensitet av enten protein 1, protein 2 eller EGFP uttrykt fra plasmidet. Hver kanal ble normalisert til medianen. Bonferroni-korrigerte P-verdier ble beregnet av Fisher Ratio-testen for å avgjøre om fordelingen av protein- eller plasmidintensitetsdata har samme variasjon. Hvert punkt representerer en celle. (E) De totale intensitetene for enten proteiner, protein 1 og plasmid, eller protein 2 og plasmid, er plottet mot hverandre. Beregnede R2-verdier vises. Hvert punkt representerer en celle. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; A.U. = vilkårlige enheter; MCP = MS2-frakkprotein; RNAPII = RNA polymerase II. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Perlelastede celler forblir tilhengere og er sunne nok til å vokse og dele seg. (A) U2OS-celler ble bead-lastet med 0,5 μg Cy3-konjugert anti-FLAG Fab i 4 μL perlelastingsløsning. Cellene ble avbildet rett før, rett etter perlelasting, og 24 timer etter perlelasting. Oransje piler identifiserer områder der celler skrelles av under bead lasting. Skalastenger = 2 mm. (B) Representativt bilde av U2OS-celler perle lastet med komponenter fra (A), men med hard tapping og for mange perler. Den røde pilen identifiserer ekstra glassperler. Skalastang = 2 mm. (C) U2OS-celler ble lastet med 1,5 μg av 14,4 kbp plasmid smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 μg Cy3-konjugert anti-FLAG Fab (grønn), 130 ng HaloTag-MCP (magenta) i 8 μL bead lasteløsning. Rett før avbildning ble HaloTag farget med JF646-HaloLigand. MS2-stammeløkkene til mRNA transkribert fra reporterplasmid er merket med MCP (magenta flekker), og FLAGG-merket oversatt reporterprotein er merket med anti-FLAG Fab (grønn colocalization til mRNA). Eldre Fab-merket protein lokaliserer til kjernen. Denne cellen ble avbildet 4-15 timer etter bead lasting. Gule piler identifiserer cellekjernen før og kjerner etter celledeling. Skalastenger = 5 μm. Forkortelse: MCP = MS2 frakkprotein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Variasjoner i lastemateriale av perlelastingsprotokollen. (A-B) RPE1 (A) og HeLa (B) celler ble perlelastet med 1,5 μg av et kjernefysisk Fab-protein (anti-RNAPII-Serine 5-fosforylering) i 4 μL lasteløsning. Hver celles kjerne (kjerne) og cytoplasma (cyto) er merket. Celler ble avbildet 6 timer etter å ha blitt bead-lastet. Skalastenger = 5 μm. (C) Humane U2OS-celler ble perlelastet med både Cy5-RNA 9mer (magenta) og Cy3-DNA 28mer (grønn) oligos, 10 picomoles av hver, i 4 μL perlelastingsløsning. Celler ble avbildet 4 timer etter å ha blitt bead-lastet. Alle cellekjerner utheves med en stiplet linje. Skalastenger = 5 μm. Forkortelser: RNAPII = RNA polymerase II. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Cellelinje | Celletype | Bead laster effektivitet | Notater/referanse |
| Stamceller (humane) | Embryonale stamceller | Vanskelig | * Mange celler skreller av under perlelasting hvis de er belagt på gelatinbelagte plater |
| HEK 293 | Humane embryonale nyreceller | Vanskelig | * Trenger å legge ned en gel matrise til bildekammer overflate før perle lasting. Trykk forsiktig når perle lastes inn først. |
| Nevroner (rotte) | Primære embryonale nevroner (e-18), dissosierte | Svært ineffektiv | *Effektiv bead lasting av nevroner ble ikke observert ved hjelp av denne standard perle lasting protokollen. Dette kan skyldes nevroners ikke-tilhenger natur eller fra følgelig skade på nevrale prosesser. |
| MDCK (hund) | Madin-Darby nyreceller | Se McNeil og Warder (1987)14 | *Laveffektiv perle lasting14 |
| U2OS (menneske) | Osteosarcoma | Standard innlastingsprotokoll for perle | |
| HeLa (menneske) | Livmorhalskreft | Standard innlastingsprotokoll for perle | |
| RPE1 (menneske) | Epitelceller udødeliggjort med hTERT | Standard innlastingsprotokoll for perle | |
| HFF (menneske) | Primær forhud fibroblaster | Se Besteiro et al. (2009)31 | *Modifisert protokoll for tilting i stedet for å trykke på31 |
| BALB/c 3T3, NIH 3T3 og sveitsisk 3T3 (mus) | Embryonale fibroblaster | Se Gilmore and Romer (1996)32, Emerson et al. (2014)33 og McNeil and Warder (1987)14 | *425–600 μm glassperler rapportert32 |
| *Brukt 200–300 μm glassperler33 | |||
| *75 μm glassperler ga bedre resultater enn 400 μm14 | |||
| DM (indisk muntjac) | Hudfibroblaster | Se Manders, Kimura og Cook (1999)34 | |
| CHO (hamster) | Epitellignende eggstokkceller | Se Memedula og Belmont (2003)35 | *Brukt 425–600 μm glassperler35 |
| BAE (storfe) | Bovine aorta endotelceller (BAEC-11) | Se McNeil og Warder (1987)14 | *75 μm glassperler ga bedre resultater enn 400 μm14 |
| PtK-2 (Potomus tridaclylis) | Epitelial nyreceller | Se McNeil og Warder (1987)14 | *75 μm glassperler ga bedre resultater enn 400 μm14 |
| HUVEC (menneske) | Navlestreng vene endotelceller | Se Gilmore og Romer (1996)32 | *Brukt 425–600 μm glassperler32 |
| J774 og J774.2 (mus) | monocytt makrofagceller | Se Becker et al. (2005)36 og McNeil og Warder (1987)14 | *Skånsom agitasjon (i stedet for å tappe) og 425–600 μm glassperler36 |
| MS-5 (mus) | benmargstromle celler | Se Molenaar et al. (2003)37 | |
| WPE1-NB11 (menneske) | prostata epitelceller | Se Gilmore og Romer (1996)32 og | *Brukt 425–600 μm glassperler32 |
| Emerson et al. (2014)33 | *Brukt 200–300 μm glassperler33 |
Tabell 1: Perle som lastes inn i forskjellige cellelinjer. For cellelinjene som ennå ikke er bead-lastet i dette laboratoriet, er referanser og notater om variasjoner i protokollen gitt.
Ekstra video 1: Eksempel på en perlebelastet celle som gjennomgår celledeling. U2OS-celler ble lastet med 1,5 μg av 14,4 kbp plasmid smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2, 0,5 μg Cy3-konjugert anti-FLAG Fab (grønn), 130 ng HaloTag-MCP (magenta) i 8 μL perlelastingsløsning. Rett før avbildning ble HaloTag farget med JF646-HaloLigand. MS2-stammeløkkene til mRNA transkribert fra reporterplasmidet er merket med MCP (magenta flekker), og FLAGG-merket oversatt reporterprotein er merket via anti-FLAG Fab (grønn colocalization til mRNA). Eldre Fab-merket protein lokaliserer til kjernen. Denne cellen ble avbildet 4-15 timer etter bead lasting. Skalastang = 10 μm. Forkortelse: MCP = MS2 frakkprotein. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Perlelastingsteknikken som er beskrevet her, er en kostnadseffektiv og tidseffektiv metode for å introdusere makromolekyler og andre partikler i adherentceller. Denne allsidige prosessen kan laste protein (Figur 2A)15,16,26,27, en kombinasjon av protein og plasmider (Figur 2B,C)22,25, RNA (Figur 4C), 100 og 250 nm polystyrenperler (personlig korrespondanse), syntetiske fargestoffer39 eller kvanteprikker34,40 . Perlelasting kan også ha evnen til å laste inn andre typer membran-ugjennomtrengelige partikler. Den mest brukte applikasjonen er for lasting av antistoffer eller Fabs for å målrette endogene epitoper, for eksempel post-translasjonelle modifikasjoner (PTMer), i levende celler. Mål, for eksempel PTMer, er ofte vanskelige å merke i levende celler uten etablerte PTM-spesifikke, genetisk kodede sonder41,42. Til sammenligning kan perlelasting introdusere flere typer sonder, reportere eller andre molekylære verktøy sammen i samme celle for overvåking av flere avlesninger samtidig. Vi forventer at perle lasting vil være en nyttig teknikk for lasting av en rekke makromolekyler eller partikler.
En stor fordel med bead lasting er den lave prisen: hvert eksperiment koster mindre enn 0.01 USD. Et perlelasterapparat kan enkelt gjøres ved hjelp av billige materialer som koster totalt ~ $ 150, noe som er betydelig billigere enn noen annen cellelastingsmetode. Kostnaden for et perlelasterapparat kan reduseres ytterligere til under $ 10 ved å erstatte det gjenbrukbare metallkammeret med en plast. For dette, enten bor et hull i et 35 mm kammer eller fjern glasset fra et 35 mm glassbunnkammer, og fest deretter nettet sikkert med tape. I stedet for et apparat kan perlelasting til og med utføres ved hjelp av en bredboret 1000 μL pipettespiss for å øse og drysse perler på celler, selv om denne variasjonen gjør det vanskelig å drysse en monolayer av perler på celler (trinn 4.6).
En annen fordel med bead lasting er at celler kan beholde normal generell morfologi, gjenopprette raskt, og fortsette å vokse og dele, i det minste for U2OS, RPE1 og HeLa celler studert her og for de andre cellelinjene studert andre steder (Figur 3; Figur 4A;B; Ekstra video 1; og Tabell 1)31. Under bead lasting gjennomgår celler fysisk stress og noen ganger løsner og skreller (~ 5% av cellene skreller under optimale forhold, men større celletap kan skje hvis perlebelastning utføres for kraftig eller for mange glassperler lastes på toppen av cellene, som vist i figur 3B). Imidlertid virker perlebelastede celler som forblir festet til dekslene vanligvis sunne og kan avbildes så snart som 30 minutter etter bead lasting (Figur 3A). Vi tillater vanligvis celler en 30-minutters gjenopprettingsperiode, men forventer at avbildning tidligere etter perle lasting er mulig.
En stor ulempe med denne teknikken er at cellene må være i stand til å motstå mindre fysisk stress under lasting og forbli sikkert tilhenger av dekslene. Dårlig/ikke-tilhenger cellelinjer eller celler dyrket på belagte plater (f.eks. HEK og stamceller) løsner ofte ved skånsom tapping under perlelasting. Videre har erfaring vist at primære nevroner er for følsomme for bead lasting.
Perlelasting er best egnet for enkeltcellede eller enkeltmolekyleksperimenter. Etter vår erfaring har perlelasting en omtrent 20-40% proteinbelastningseffektivitet, og ~ 20% av perlebelastede celler uttrykte også en co-loaded plasmid (Figur 2A, B). Dermed kan perlelastende plasmider være mindre effektive for proteinuttrykk enn perlelastende rensede proteiner fordi plasmider ikke bare må komme inn i celler, men også uttrykkes (som blant annet innebærer kjernefysisk import, transkripsjon og oversettelse, som hver kan redusere uttrykkseffektiviteten). Den lave effektiviteten til perlebelastet plasmiduttrykk kan omgås ved hjelp av alternative transfeksjonsprotokoller, for eksempel lipofeksjon, før perlelasting av proteiner eller sonder16,27. I tillegg kan inkubering av celler i optimale medier i 30 minutter før perlelasting hjelpe plasmiduttrykk. På grunn av lavt plasmiduttrykk har perlelasting ikke ofte blitt brukt som et alternativ til lipofeksjonsbasert transfeksjon i dette laboratoriet. Det eneste unntaket er når et renset protein, som Fab, skal co-loaded, i så fall er det ganske praktisk å bead-load proteinet og plasmid samtidig. Videre, for celler som ikke reagerer eller intolerant mot lipofeksjon, kan perlelasting gi en alternativ, om enn lav effektivitet, metode for forbigående plasmiduttrykk.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til medlemmene av Stasevich lab for utallige samtaler som bidro til å forbedre og utvikle denne protokollen. Nærmere bestemt Dr. Linda Forero og Dr. Phil Fox for råd om perle lasting av forskjellige celletyper. Vi vil gjerne takke Dr. Yoko Hayashi-Takanaka, Dr. Yuko Sato og Dr. Hiroshi Kimura for å dele deres glassperlelastingsprotokoll. Vi er veldig takknemlige til Dr. Ashok Prasad og Dr. Diego Krapf for sjenerøst å dele sine perlelastingsprotokoller for å introdusere uorganiske partikler i celler. Vi er takknemlige til Dr. Travis Sanders, Craig Marshall og Dr. Thomas Santangelo for sjenerøst å dele deres merkede RNA-reagens. ALK, MNS, CAC, GG og TJS ble støttet av National Institutes of Health (NIH) grant R35GM119728 og National Science Foundation (NSF) CAREER grant MCB-1845761, begge til TJS. CAC ble også støttet av NSF NRT-prisen DGE-1450032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture dishes | VWR | 82050-916 | Use to culture cells |
| 35 mm cell culture dishes | Falcon | 353001 | Use to construct bead loader |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 | Use to construct the custom bead loader |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | Use in general cell culture |
| Drierite Indicating Absorbents | Thermo Fisher Scientific | 07-578-3B | Store the bead loader in a desiccator with these absorbent pellets |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologics | F-0050-A | Use in general cell culture and as a supplement before bead loading |
| Glass beads, acid washed, ≤106 µm* | Millipore Sigma | G4649 | Sprinkle on cells to bead load plasmid DNA and proteins |
| Glass bottom dishes, 35 mm, #1.5, 14 mm glass | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Seed cells onto these chambers for imaging |
| L-Glutamine-200 mM | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Use to make DMEM + media |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Optimal media for incubating cells before bead loading (optional step) |
| Parafilm | VWR | 52858-032 | waxy film used to construct bead loader |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Use to make DMEM + media |
| Phenol-free DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31053036 | Use on cells before imaging |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | Working stock of sterile 1X PBS |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | S318-500 | Use 2 M solution to wash glass beads |
| Spectra Mesh Woven Filters, Polypropylene, 105 µm opening | Spectrum Labs | 148496 | Use to construct bead loader |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | Use in general cell culture |
References
- Stewart, M. P., et al. In vitro and ex vivo strategies for intracellular delivery. Nature. 538 (7624), 183-192 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Schenborn, E. T., Goiffon, V. DEAE-dextran tansfection of mammalian cultured cells. Methods in Molecular Biology. 130, 147-153 (2000).
- Celis, J. E. Microinjection of somatic cells with micropipettes: comparison with other transfer techniques. Biochemical Journal. 223 (2), 281-291 (1984).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15494-15500 (1989).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. American Journal of Physiology. 260 (2), 355-363 (1991).
- Potter, H.
- Fawell, S., et al. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (2), 664-668 (1994).
- Prior, T. I., FitzGerald, D. J., Pastan, I. Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol. Biochemistry. 31 (14), 3555-3559 (1992).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3185-3190 (2001).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Reports. 13 (8), 709-715 (2012).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98 (4), 1556-1564 (1984).
- Ortiz, D., Baldwin, M. M., Lucas, J. J. Transient correction of genetic defects in cultured animal cells by introduction of functional proteins. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 3012-3017 (1987).
- McNeil, P. L., Warder, E. Glass beads load macromolecules into living cells. Journal of Cell Science. 88 (5), 669-678 (1987).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Research. 39 (15), 6475-6488 (2011).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352 (6292), 1425-1429 (2016).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Zhao, N., et al. A genetically encoded probe for imaging nascent and mature HA-tagged proteins in vivo. Nature Communications. 10 (1), 2947 (2019).
- Jedlitzke, B., Mootz, H. D. Photocaged nanobodies delivered into cells for light activation of biological processes. ChemPhotoChem. 5 (1), 22-25 (2021).
- Coulon, A., et al. Kinetic competition during the transcription cycle results in stochastic RNA processing. eLife. 3, 03939 (2014).
- Pichon, X., Robert, M. -C., Bertrand, E., Singer, R. H., Tutucci, E. New generations of MS2 variants and MCP fusions to detect single mRNAs in living eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 2166, 121-144 (2020).
- Koch, A., et al. Quantifying the dynamics of IRES and cap translation with single-molecule resolution in live cells. Nature Structural & Molecular Biology. 27, 1095-1104 (2020).
- Moon, S. L., et al. Multicolor single-molecule tracking of mRNA interactions with RNP granules. Nature cell biology. 21 (2), 162-168 (2019).
- Moon, S. L. Coupling of translation quality control and mRNA targeting to stress granules. Journal of Cell Biology. 219 (8), 202004120 (2020).
- Cialek, C. A., et al. Imaging translational control by Argonaute with single-molecule resolution in live cells. bioRxiv. , (2021).
- Forero-Quintero, L. S., et al. Live-cell imaging reveals the spatiotemporal organization of endogenous RNA polymerase II phosphorylation at a single gene. bioRxiv. , (2020).
- Lyon, K., Aguilera, L. U., Morisaki, T., Munsky, B., Stasevich, T. J. Live-cell single RNA imaging reveals bursts of translational frameshifting. Molecular Cell. 75 (1), 172-183 (2019).
- JoVE. Introduction to Fluorescence Microscopy. General Laboratory Techniques. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Hayashi-Takanaka, Y., Yamagata, K., Nozaki, N., Kimura, H. Visualizing histone modifications in living cells: spatiotemporal dynamics of H3 phosphorylation during interphase. Journal of Cell Biology. 187 (6), 781-790 (2009).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Stasevich, T. J., et al. Regulation of RNA polymerase II activation by histone acetylation in single living cells. Nature. 516 (7530), 272-275 (2014).
- Besteiro, S., Michelin, A., Poncet, J., Dubremetz, J. -F., Lebrun, M. Export of a Toxoplasma gondii rhoptry neck protein complex at the host cell membrane to form the moving junction during invasion. PLOS Pathogens. 5 (2), 1000309 (2009).
- Gilmore, A. P., Romer, L. H. Inhibition of focal adhesion kinase (FAK) signaling in focal adhesions decreases cell motility and proliferation. Molecular Biology of the Cell. 7 (8), 1209-1224 (1996).
- Emerson, N. T., Hsia, C. -H., Rafalska-Metcalf, I. U., Yang, H. Mechanodelivery of nanoparticles to the cytoplasm of living cells. Nanoscale. 6 (9), 4538-4543 (2014).
- Manders, E. M. M., Kimura, H., Cook, P. R. Direct imaging of DNA in living cells reveals the dynamics of chromosome formation. Journal of Cell Biology. 144 (5), 813-822 (1999).
- Memedula, S., Belmont, A. S. Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16. Current Biology. 13 (3), 241-246 (2003).
- Becker, T., Volchuk, A., Rothman, J. E. Differential use of endoplasmic reticulum membrane for phagocytosis in J774 macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4022-4026 (2005).
- Molenaar, C., et al. Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probes. The EMBO Journal. 22 (24), 6631-6641 (2003).
- Jones, S. A., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
- Sabri, A., Xu, X., Krapf, W. M. Elucidating the origin of heterogeneous anomalous diffusion in the cytoplasm of mammalian cells. Physical Review Letters. 125 (5), 053901 (2020).
- Sato, Y., et al. Genetically encoded system to track histone modification in vivo. Scientific Reports. 3, 2436 (2013).
- Sato, Y., Stasevich, T. J., Kimura, H. Visualizing the dynamics of inactive X chromosomes in living cells using antibody-based fluorescent probes. X-Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, Humana. New York, NY, USA. 91-102 (2018).
