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Behavior

마우스의 스트레스를 줄이는 취급 기술

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62593
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 4, 5, 1,2,3, 1,2
1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

Summary

이 논문은 불안과 같은 행동을 줄임으로써 일상적인 처리를 용이하게하고 두 가지 기존 관련 기술 (터널 및 꼬리 처리)에 대한 세부 사항을 제공하는 마우스의 처리 기술인 3D 처리 기술에 대해 설명합니다.

Abstract

실험실 동물은 과학자 또는 동물 관리 공급자에 의해 여러 조작을 받습니다. 이 원인은 스트레스는 동물의 복지에 지대한 영향을 미칠 수 있으며 불안 측정과 같은 실험 변수에 대한 혼란 요인이 될 수 있습니다. 수년에 걸쳐, 취급 관련 스트레스를 최소화 하는 취급 기술은 쥐에 특정 초점으로 개발 되었습니다., 쥐에 거의 관심. 그러나, 마우스는 취급 기술을 사용하여 조작에 습관화될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 마우스를 취급하는 습관화는 스트레스를 줄이고, 일상적인 취급을 용이하게 하며, 동물 복지를 개선하고, 데이터 변동성을 감소시키며, 실험적 신뢰성을 향상시킵니다. 취급의 유익한 효력에도 불구하고, 특히 스트레스가 많은 꼬리 픽업 접근 방식은 여전히 널리 사용됩니다. 이 논문은 인간 상호 작용 중에 동물이 경험한 스트레스를 최소화하기 위한 새로 개발된 마우스 취급 기술에 대한 자세한 설명 및 데모를 제공합니다. 이 수동 기술은 3 일 이상 수행 (3D 처리 기술) 실험자습관 동물의 능력에 초점을 맞추고있다. 이 연구는 또한 이전에 확립 된 터널 처리 기술 (폴리 카보네이트 터널 사용)과 꼬리 픽업 기술의 효과를 보여줍니다. 구체적으로 연구된 것은 행동 테스트(고화플러스 미로 및 참신한 수유), 실험자와의 자발적상호작용 및 생리학적 측정(코르티코스테론 수준)을 사용하여 불안과 같은 행동에 미치는 영향입니다. 3D 핸들링 기술과 터널 처리 기술은 불안과 같은 표현형을 감소시켰습니다. 첫 번째 실험에서, 6 개월 된 남성 마우스를 사용 하 여, 3D 처리 기술 크게 실험자 상호 작용을 향상. 두 번째 실험에서는 2.5개월 된 암컷을 사용하여 코르티코스테론 수준을 감소시다. 따라서 3D 처리는 실험자와의 상호 작용이 요구되거나 선호되는 시나리오또는 실험 중에 터널 처리가 불가능할 수 있는 시나리오에서 유용한 접근 방식입니다.

Introduction

마우스와 쥐는 내분비, 생리학, 약리학적 또는 행동 연구를 포함한 여러 목적을 위해 전임상 연구1,2에 필수적인 자산이다2. 동물과 관련된 연구의 증가로부터, 인간의 상호 작용을 포함한 통제되지 않는 환경 변수가 생물 의학 연구3,4,5에서다양한 결과에 영향을 미친다는 것이 발생했습니다. 이것은 실험 과 연구실험실4,5,동물 연구에서 중요한 주의 사항을 포즈에 걸쳐 관찰 된 상당한 가변성에 대한 책임이 있습니다.

환경 스트레스의 영향을 제한하고 인간의 상호 작용에 대한 반응성을 줄이는 것을 목표로 다양한 접근 법이 구현되었습니다. 예를 들어, 환경 스트레스의 영향을 제한하기 위해 주택 조건의 표준화 및 자동화 된 주택 시스템6,7이 실험실 전반에 걸쳐 구현되었습니다. 인간과의 상호 작용에 관해서는, 동물을 취급하고 수송하기 위한 일반적으로 이용되는 접근법은 동물의 불편과 스트레스에 거의 신경쓰지 않았다. 예를 들어, 꼬리에 의한 동물을 집어들거나 집게8을 사용하면 기준불안9,10,11이증가하여 탐사9,12를 감소시키고 연구 내 및14을통해 개별 간 가변성에 크게 기여한다. 그 결과, 마우스와 쥐에 적용되는 컵 처리 기술과 같은 다른 접근법이 개발되었다. 이 접근법에서, 동물은 그들의 새장에서 "컵", 그리고 컵을 형성하는 그들의 손으로실험자에 의해 개최9,10,11. 꼬리 처리에 대한 또 다른 유용한 대안은 마우스9,10,15를전송하는 폴리 카보네이트 터널의 사용을 포함한다. 이 방법은 마우스와 실험자 간의 직접적인 상호 작용을 제거합니다. 컵과 터널 접근법 은 모두 불안과 같은 행동과 꼬리 픽업 / 꼬리 처리9,10과같은 역경 처리 기술에 의해 과장 될 수있는 실험자의 두려움을 감소시키는 효능을 보였다.

따라서, 증가된 증거는 개인9,11사이의가변성을 감소시키고 동물복지(10)를개선하기 위한 적절한 마우스 취급의 유용성을 입증한다. 그러나 위에서 언급한 기술은 여전히 한계에 직면해 있습니다. 컵 취급 기술은 10일(2주16일10회)부터17주까지의 스케줄로 구현되었으며, 이는 시설 직원과 실험자에게 상당한 시간입니다. 또한, 컵 핸들링의 효과는 변형9에 따라 다르며, 종래의 컵 핸들링은 순진한 마우스 또는 특히 손9,18에서점프하는 급한 균주로 이어질 수 있다. 터널 처리결과 보다 일관되고 일반적으로 더 빠른 결과19. 터널은 홈 케이지 농축으로도 사용됩니다. 그들은 동물이 신속하게 처리하는 습관과 농축의 추가 혜택을 제공하는 데 도움이됩니다. 그러나 터널 처리에는 장치 간에 동물을 옮길 때 제한이 있습니다. 흥미롭게도 허스트와 웨스트9,헨더슨 외20은 터널에서 장치로 동물을 이송하기 위해 부드럽고 간단한 수동 취급을 사용하면 표현형에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증했습니다.

짧은 기간에 달성 가능한 습관과 함께 기존 방법에 대한 대안을 제공하기 위해 이 문서에서는 컵 처리 기술을 확장하는 새로운 기술을 설명하므로 특정 장비가 필요하지 않습니다. 이 접근법은 이정표를 사용하여 마우스가 처리 프로세스에 가지고 있는 편안함의 수준을 측정합니다. 그것은 (행동 및 호르몬 수준에서) 마우스 반응성과 스트레스를 감소에 효능을 보여줍니다, 일상적인 처리를 용이하게하고 동물 사이의 가변성을 감소에 기여. 이 기술의 세부 사항은 여기에 제공되며, 불안과 같은 행동을 감소시키고, 실험자와의 상호 작용을 개선하고, 주변 응력 호르몬 (corticosterone) 방출을 제한하는 효능은 터널 처리 (양성 제어) 및 꼬리 처리 기술 (부정적인 제어)에 비해 두 가지 별도 연구 (남성과 여성 마우스)에서 입증됩니다.

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Protocol

동물 과목과 관련된 절차는 CAMH 동물 관리위원회에 의해 승인되었으며 캐나다 동물 관리 위원회에 따라 수행되었습니다.

참고: 본 명세서에 기재된 처리 방법은 비형질전환(C57/BL6, BalbC, CD1, SV129 등) 및 형질대사를 포함한 다양한 마우스 균주에서 사용될 수 있다. 그것은 또한 젊은 또는 오래 된 마우스와 함께 사용할 수 있습니다., 젊은 성인 지적 (4-6 주 오래 된) 마우스 성인 또는 오래 된 쥐 보다 약간 더 활동적인 경향이, 특히 날에 1.

1. 실험 준비

  1. 연구 개시 전에, 도착 지침에 따라21,무작위로 각 처리 그룹에 마우스를 할당 (3D 처리, 터널 처리 또는 꼬리 처리).
  2. 취급을 수행할 룸을 식별합니다. 그것은 하우징 룸에서 수행 할 수 있습니다, 또는 별도의 방에서. 동물이 움직이는 수레에서 이동해야 하는 별도의 방에서 처리가 수행되는 경우, 동물이 처리 프로토콜을 개시하기 전에 20-30 분 동안 새 방으로 습관화 할 수 있습니다.
  3. 그룹 보관 동물의 경우 임시 케이지를 사용하여 처리 후 마우스를 수용한 다음 초기 홈 케이지에 있는 마우스를 모두 다시 그룹화합니다. 이것은 취급하기 전에 동물 사이 잠재적인 싸움을 감소시킵니다 (특히 남성에서).
  4. 카운터(바람직하게는 클리어된 조리대) 또는 생물 안전 캐비닛에서 작업하며, 하우징 케이지는 동물에서 멀리 떨어져 처리됩니다. 하우징 케이지에 근접하여 점프의 위험이 증가합니다. 동물이 그룹 으로 보관되는 경우, 홈 케이지로 처리되는 마우스의 점프는 케이지 메이트에게 스트레스를 일으킬 수 있습니다.
    참고: 생물 안전 캐비닛에서 작업하면 쥐가 바닥에서 점프할 위험이 제한되며 특정 시설에서 필요할 수 있습니다. 이 기술은 생물 안전 캐비닛에 사용할 수 있습니다, 항상 생물 안전 캐비닛 내부의 모든 단계를 수행 할 수 있는지 확인, 처리기 팔뚝에 걷는 마우스를 피하기.

2. 1 일 : 마우스 당 5 분

  1. 케이지를 부드럽게 열고 뚜껑을 측면에 놓고 중첩 재질을 제거하고 바퀴나 대피소와 같은 기타 농축물을 제거합니다.
  2. 홈 케이지에 장갑을 낀 손을 도입하여 케이지 벽의 한쪽을 따라 천천히 손을 놓습니다 (핸들러에 가장 가까운 벽, 그림 1A).
    1. 즉시 마우스를 데리러 시도하지 마십시오.
  3. 움직이지 않는 상태로 유지하여 동물이 약 30 s에 대한 케이지에 손의 존재에 습관화 할 수 있습니다.
  4. 손의 손바닥에 마우스를 집어 들으려고 시도하십시오 (즉, 꼬리로 동물을 집어 들지 마십시오).
    1. 3번의 시도 후에 마우스를 쉽게 집어 들지 않으면 마우스를 양손으로 코너와 컵으로 안내합니다.
    2. 컵을 들어 두어 마우스쪽으로 부드럽게 움직이면 마우스를 집어 들려고 합니다.
    3. 양손으로 최대 3번의 시도가 실패한 경우 꼬리 의 밑으로 마우스를 부드럽게 들고 팔뚝이나 평평한 손으로 옮겨줍니다.
  5. 손에 마우스를 사용하면 손을 평평하게 유지하고 가능한 한 엽니다.
    참고: 이것은 마우스가 단계로 단계, 물린의 위험을 제한하는 평면 플랫폼을 제공합니다.
  6. 손바닥위로 손을 열고 평평하게 잡고, 마우스를 들고 손에 인접한 다른 손을 놓고 마우스가 구속없이 손에서 손으로 자유롭게 움직일 수 있도록한다(도 1B).
  7. 마우스를 탐색하고 1 분 동안 손 사이에 이동하자.
    1. 이 시점에서 마우스는 멀리 점프하려고 할 수 있습니다. 마우스가 점프하면 바닥이 아닌 싱크대에 착륙할 수 있도록 손을 배치합니다.
    2. 마우스가 점프를 준비하는 것처럼 보이는 경우 (손의 가장자리를 향해 이동하고 뒷다리에 양육), 천천히 앞에 다른 손을 배치하고이 손에 걸어로 안내하려고합니다. 점프의 위험이 증가함에 따라 갑작스런 움직임을 피하십시오.
    3. 마우스가 점프하는 경우 꼬리 처리를 피하고 처리 세션을 다시 시작하십시오. 마우스가 10s 이상 바닥에 있거나 손 밖으로 머무르는 경우 처리 세션에 시간을 추가하여 마우스가 손에서 벗어난 시간을 만회합니다.
    4. 점프의 메모를. 총 점프 횟수를 사용하여 동물 간의 잠재적 변동성을 평가할 수 있습니다.
  8. 플랫 핸드로 취급 1 분 후 손바닥을 이완시키고 마우스를 손에 약간 컵으로 컵으로 한 후 마우스를 손 사이에 부드럽게 굴리십시오(그림 1C).
    1. "롤"하려면 마우스를 손바닥에 손가락에 수직으로 고정합니다.
    2. 천천히 손을 닫고 손가락을 마우스 뒷면에 놓습니다.
    3. 마우스를 들고 있는 손 바로 아래에 프리 핸드를 놓습니다.
    4. 마우스로 천천히 돌리기/회전하여 마우스를 다른 손으로 부드럽게 옮길 수 있습니다(180° 뒤집기).
    5. 손 사이에 앞뒤로 반복합니다.
  9. 손을 부드럽게 구르고 60 초 동안 열린 손에 무료 탐험을 통해 20 초마다 기술을 번갈아 가며.
  10. "대피소 시험"(그림1D)을수행합니다.
    1. 마우스가 손의 가장자리로 이동한 다음 2 개의 손을 함께 가져옵니다.
    2. 매우 천천히, 마우스가 손에 의해 형성 된 "대피소"내부에 맞는 있도록 그들을 컵. 필요한 경우 마우스가 탈출할 수 있도록 개구부를 둡니다.
    3. 어떤 구속없이, 5-10 s에 대한 대피소에 마우스를 유지하는 것을 목표로.
    4. 대피소 테스트 를 번갈아 가며, 손과 손을 자유롭게 60 초 동안 자유롭게 탐험하여 대피소 단계를 3 번 이상 수행해야합니다.
  11. 2.10에 설명된 모든 절차에서 프로세스를 서두르지 마십시오. 마우스가 스트레스를 받고 나타나면 (즉, 탈출하는 미정, 손에서 점프, 손과의 접촉을 피하기) 손 안에 갇혀, 20 대에 대한 손과 무료 탐사 사이의 롤링을 계속한 다음 다시 시도합니다.
  12. 이정표: 1일차 완공을 위해 10대 이상의 대피소 테스트를 수행합니다.
    1. 마우스가 손에 머무를 때 대피소 테스트가 성공한 것으로 간주합니다. 마우스가 머리를 튀어 나와 대피소로 돌아오면 여전히 성공적인 테스트입니다. 동물이 대피소에서 완전히 빠져나오면 실패입니다.
  13. 30초 동안 무료로 탐험할 수 있습니다.
  14. 케이지에 있는 마우스를 부드럽게 교체합니다. 그룹이 수용된 경우 모든 케이지 메이트가 처리될 때까지 마우스를 임시 케이지에 배치합니다. 쥐를 손바닥에 집어 들고 원래 케이지로 돌아갑니다. 꼬리 픽업을 사용하지 마십시오.
  15. 70 %의 에탄올로 잠재적 인 대변과 소변의 벤치 상단을 청소하십시오.
  16. 70% 에탄올(또는 적절한 세척 용액)으로 장갑을 완전히 헹구거나 다음 마우스를 처리하기 전에 장갑을 교체합니다(케이지 메이트에 대해 동일한 장갑을 보관할 수 있음).
    참고: 처리기의 피로를 피하기 위해 적절한 수의 동물로 취급하는 것이 좋습니다. 24마우스를 취급하는 것은 약 2 시간 소요되고 처리기 당 24 마우스를 초과하지 않는 것이 좋습니다. 더 많은 동물을 처리해야 하는 경우 처리기를 여러 개 갖거나 처리 절차를 여러 일 동안 하위 그룹으로 나누는 것이 좋습니다.

3. 2 일 : 마우스 당 3 ~ 5 분

  1. 손의 손바닥에 마우스를 데리러 시도합니다. 이 단계에서, 그것은 이미 가능해야하고 마우스는 손에서 뛰어 하지 않아야합니다.
  2. 1일째와 같이 손바닥으로 시작하여 마우스가 20초 동안 자유롭게 탐색할 수 있습니다.
  3. 그런 다음 마우스를 손 사이에 몇 번 굴려 (4-5 번).
  4. 5s에 대한 "대피소 테스트"를 수행합니다.
  5. 대피소 테스트를 2~3분 동안 여러 번 반복합니다(~5-6).
  6. 같은 기간 동안 2~3분 동안, 1일부터 손을 잡고 오픈 핸즈 스텝을 무료로 탐색하여 습관성을 향상시킵니다.
    1. 머리와 뒷면에 마우스를 터치(그림 1E),5-6 번. 습관의 표시는 마우스가 탈출을 시도하지 않고 만질 수 있을 때입니다.
    2. "코 찌르기"를 수행 : 마우스의 주부, 2 ~ 3 번(그림 1F)을만지십시오.
      1. 마우스가 물려고 시도하거나 만질 때 스트레스의 명백한 징후를 표시하는 경우, 즉시 다시 코 찌르기를 시도하지 마십시오. 대신, 플랫 핸드 탐색 및 롤번갈아. "습관"은 인간이 접촉하는 경우 도망치거나 머리를 돌리지 않는 동물에 의해 반영됩니다.
  7. 3.4-3.6에 기술된 모든 절차에서 프로세스를 서두르지 마십시오. 마우스가 손에 갇혀 스트레스를 받는 것처럼 보이거나 만지고 싶지 않은 경우 20-30s의 손을 계속 구르고 다시 시도하십시오.
  8. 이정표: 2일차 완료를 위해 2-3초에 최소 1개의 성공적인 코 찌를 수행합니다.
  9. 동물이 "대피소", "머리 애무", "코 찌르기"에 잘 반응하고 마우스가 스트레스의 흔적없이 손을 탐구하고자하는 것처럼 보이는 경우 처리의 약 3 분 후이 세션을 중지합니다.
  10. 마우스가 계속해서 스트레스의 징후를 나타내거나 "대피소 테스트" 또는 "코 찌르기" 시험에 잘 반응하지 않는 경우, 1일째와 같이 5분에 도달할 때까지 세션을 계속합니다.
  11. 케이지에 있는 마우스를 교체하고, 1일째와 같이 벤치 탑과 장갑을 청소하십시오.

4. 3일차: 마우스당 약 3분

  1. 셋째 날에는 2일2~3분 동안 같은 단계를 진행합니다.
    1. 손의 손바닥에 마우스를 집어 들.
    2. 마우스를 손 사이에 옮기고 굴리기
    3. 대피소 테스트를 수행합니다.
    4. 뒷면과 머리에 마우스를 애완 동물하려고합니다.
  2. 약 1~2분 동안 이러한 단계를 번갈아 가세요.
  3. 마우스가 탈출을 시도하지 않고 손의 손바닥에 앉을 만큼 충분히 완화 될 때까지 절차를 계속합니다.
  4. 3일째가 되기 전에, 대피소 시험과 코 찌르기 테스트를 습관의 시험으로 반복한다.
    1. 두 테스트가 첫 번째 시도에서 완료될 수 있는 경우 습관 프로세스가 완료됩니다. 마우스를 30초에서 1분간 부드럽게 처리합니다.
    2. 마우스가 처음에 어느 테스트에 저항하는 경우, 코 찌르기 및 대피소 테스트를 다시 시도하기 전에 20-30 s에 대한 4.1-4.3 단계를 반복합니다.
    3. 마우스가 3분 후에 이러한 테스트에 저항하는 상태로 유지되면, 셋째 날은 반복될 수 있다.
  5. 이정표: 각각 10s의 최소 2번의 성공적인 대피소 테스트와 3일차 완료를 위한 2개의 성공적인 코 찌르기 테스트, 전체 3D 처리 절차를 완료합니다.
  6. 마우스를 케이지에 반환하고 벤치 탑과 장갑을 청소하십시오.

5. 동물이 주사 또는 영역을 위해 구속을 받을 수 있는 선택적 접근 법

참고: 3일째에 동물이 실험용(구강 개비, 복막 주사 등)을 위해 제지될 경우, 마우스는 목 핀치 테스트를 실시할 수 있다.

  1. 엄지손가락과 집게 손가락 사이의 목의 후두를 잡습니다(그림1G).
  2. 마우스를 손 위로 3-5cm 올려 2-3s로 들어올립니다.
    참고: 이것은 일반적으로 성인 마우스를 위한 비 자연적인 위치이고, 마우스가 움직이지 않는 가까이 남아 있는 경우에, 그(것)들은 취급에 잘 습관화되고 실험적인 목적을 위해 억제하기 쉬울 것입니다.
  3. 마우스를 평평한 손에 다시 놓거나 마우스가 목 핀치에 반응하는 경우 실험자의 소매, 케이지 뚜껑 또는 조리대에 배치하는 것이 좋습니다.
    참고: 생물 안전 캐비닛에서 작업하는 경우, 소매에 마우스를 배치하거나 걸어 올라 와 생물 안전 캐비닛을 종료 할 수 없습니다. 생물 안전 캐비닛 내부의 조리대에 마우스를 배치하는 것을 선호합니다.
  4. 마우스를 남겨 1분 동안 실험자의 손을 자유롭게 탐색하십시오.

6. 추가 처리 일에 대한 선택적 접근 방식

  1. 고스트레스 마우스 라인의 사태에서, 2/3 일에 설명된 방법을 사용하여 동물의 반응성 및 스트레스 수준을 감소시키기 위해 추가 일을 추가합니다.
    참고: 많은 요인이 변형, 형질 전환, 연령, 성별 및 주택 조건을 포함한 동물의 기본 스트레스에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 요인이 젊은 대조군에 대하여 시험되는 노인 동물 또는 형질 전환 동물과 같은 단 사이에서 일치하지 않는 경우에, 각 단에 대하여 습관의 일의 동일한 수를 사용하는 것이 좋습니다.

7. 터널 처리

참고: 이 기술은 터널 처리 마우스에만 적용됩니다. 터널은 길이 약 13cm, 직경 5cm의 폴리카보네이트 튜브입니다.

  1. 터널을 마우스 케이지에 놓습니다.
  2. 처리하기 전에 7 일 동안 케이지에 터널을 둡니다.
  3. 케이지를 열고 뚜껑을 옆으로 놓습니다.
  4. 마우스를 폴리카보네이트 터널(이미 케이지에 있음)으로 부드럽게 안내합니다.
  5. 케이지에서 터널을 수평으로 들어 올립니다. 필요한 경우 터널 끝을 느슨하게 덮어 동물이 터널에서 점프 / 떨어지는 것을 방지하고 케이지 또는 바닥에 다시 떨어질 수 있습니다.
  6. 터널에서 동물을 집 새장에서 멀리 옮기고 30대의 표면에서 멀리 버틸 수 있습니다.
  7. 터널을 홈 케이지에 다시 배치하여 마우스가 튜브를 빠져나갈 수 있도록 합니다.
  8. 60s를 기다린 다음 한 번 7.4-7.7 단계를 반복합니다.
  9. 다음 마우스를 습관화하기 전에 70% 에탄올로 장갑을 완전히 헹구거나 장갑을 교체하십시오.
  10. 이 절차를 10일 연속 반복합니다.

8. 테일 핸들링

참고: 이 기술은 꼬리 처리 된 마우스에만 적용됩니다. 그것은 장치에 그들의 케이지에서 마우스를 전송 하는 데 사용 됩니다., 그리고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.

  1. 케이지를 열고 뚜껑을 옆으로 놓습니다.
  2. 엄지와 집게 손가락 사이의 꼬리 의 바닥에 의해 마우스를 잡아.
  3. 케이지에서 마우스를 들어 올립니다.
  4. 2-3s에서 마우스를 매달려 있는 것을 피하기 위해 꼬리에 그립을 유지하면서 실험자의 반대 팔뚝으로 마우스를 옮기는다.
  5. 이 실험의 구현에서 꼬리 처리가 필요한 경우(예: 코티솔 검사를 위해 혈액이 뽑기 전에) 동물은 꼬리 처리에 의해 실험자의 팔뚝으로 옮겨져 15초 동안 유지되어 케이지로 돌아갑니다.

9. 상승 플러스 미로

  1. 룸 설정
    1. 미로를 메모리 카드가 장착된 디지털 카메라 아래에 방 한가운데에 놓습니다.
    2. 미로 뒤에 배치 된 2 개의 스탠딩 램프를 사용하여 ~ 60 Lux에서 방의 빛을 설정합니다.
    3. 반사를 생성하고 미로에서 동물의 검출을 방해하는 미로에 직접 빛을 피하기 위해 오버 헤드 조명을 끕니다.
    4. 모든 장비가 설정되면 동물을 방으로 옮기고 30 분 동안 조명 설정 및 새로운 환경에 적응하게하십시오.
  2. 테스트
    1. 미로를 70% 에탄올로 청소하여 먼지 나 이전에 테스트 된 동물의 냄새를 방지하십시오.
    2. 카메라를 시작합니다.
    3. 동물을 미로에 넣기 전에 동물 ID가 있는 종이를 사용하여 비디오에 ID를 기록합니다(각 비디오에서 촬영된 마우스의 적절한 식별을 용이하게 합니다).
    4. 각 동물에게 적절한 취급 기술을 사용하여 미로로 옮습니다.
    5. 열린 팔을 마주보고 중앙 플랫폼에 마우스를 놓습니다.
    6. 마우스가 방해받지 않고 10 분 동안 장치를 탐색 할 수 있습니다.
    7. 10분 후 카메라를 중지합니다.
    8. 미로에서 마우스를 검색하고 다시 케이지에 넣습니다.
    9. 70 %의 에탄올로 미로에서 대변과 소변을 청소하십시오.
    10. 모든 마우스로 테스트가 완료되면 메모리 카드에서 비디오 추적을 위한 컴퓨터로 비디오를 전송합니다.
    11. 자동화된 동물 추적 소프트웨어를 사용하여 열린 팔에 대한 항목 수와 열린 팔 또는 밀폐된 무기에서 보낸 시간(여기 Ethovision XT 14)을 추적합니다.

10. 실험자 상호 작용 (허스트와 웨스트9에서파생)

  1. 룸 설정
    1. 메모리 카드가 장착된 디지털 카메라 아래에 테스트룸 중앙에 테이블을 놓습니다.
    2. 50-70 Lux에 조명을 설치하여 천장까지 향하는 방 구석에 4 개의 전구를 배치합니다. 반사를 생성하고 경기장에서 동물의 탐지를 방해하는 미로에 직접 빛을 피하기 위해 오버 헤드 조명을 끕니다.
    3. 동물들을 방으로 데려오세요.
    4. 30분 동안 방에 적응하게 하십시오.
  2. 실험
    1. 홈 케이지를 디지털 카메라 아래에 놓습니다.
    2. 뚜껑을 제거합니다.
    3. 동물의 추적을 방해할 수 있는 중첩 물질 및 기타 농축물을 제거합니다.
    4. 카메라를 시작합니다.
    5. 동물 신분증이 있는 케이지 카드를 사용하여 비디오의 동물을 식별합니다.
    6. 오른쪽 앞의 케이지 벽을 따라 홈 케이지에 손을 놓습니다.
      1. 처리기의 머리가 마우스를 촬영하기 위해 카메라를 차단하지 않는지 확인합니다.
    7. 타이머를 시작합니다.
    8. 2 분 동안 움직이지 않는 손을 유지하고 마우스가 손을 탐색할 수 있습니다.
    9. 케이지에서 손을 15s로 제거합니다.
    10. 컵 핸즈를 사용하여 마우스를 선택하고 마우스가 도망할지 여부를 기록하려고 시도합니다.
    11. 마지막 단계를 5초마다 5초마다 반복하거나 마우스를 집어들 때까지 반복합니다.
    12. 마우스를 선택하는 데 필요한 시도 수를 기록합니다.
    13. 중첩 재료와 보강을 케이지에 반환합니다.
    14. 다음 동물로 진행하기 전에 70 % 에탄올로 장갑을 청소하거나 장갑을 교체하십시오.
    15. 테스트 후 메모리 카드에서 컴퓨터로 비디오를 전송합니다.
    16. 자동화된 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 케이지를 4개의 동일한 사분면으로 나누고 각 사분면에서 마우스로 보낸 시간을 기록합니다(여기, Ethovision XT 14).

11. 참신함 억제 먹이주기

  1. 식량 박탈
    1. 시험 3일 전에, 전체 케이지 변경을 수행하고, 단일 집 동물 (단일 하우징은 홈 케이지 테스트를 수행하는 것이 바람직하다).
      참고: 신선한 침구를 제공하면 지난 케이지 변경 이후 침구에 쌓인 잠재적 인 먼지 또는 약간의 음식 조각이 제거됩니다.
    2. 테스트 전날 오후 6시경 모든 동물의 무게를 측정합니다.
    3. 식품 호퍼에서 모든 음식을 제거하고 케이지 또는 침구에 음식 조각이 없는지 확인하십시오.
  2. 룸 설정
    1. NSF 챔버를 테이블에 놓습니다.
    2. 옥수수 침구의 얇은 층으로 챔버를 채웁니다 (또는 동물 홈 케이지에 사용되는 침구와 다른 다른 침구).
    3. 70 Lux에서 4개의 전구가 테이블 구석에 놓고 천장을 향합니다. 오버헤드 라이트를 끄면 실내 조명이 낮게 유지됩니다.
    4. 실험자를 향한 챔버 의 측면에 시설에서 사용되는 표준 차우의 1 펠릿을 놓습니다 (벽에서 ≈10cm).
  3. 테스트
    1. 식량 부족 후 아침에 동물을 테스트 30분 전에 방에 가져와 조명 설정과 새로운 환경에 적응할 수 있도록 합니다.
    2. 전날 측정된 체중에 따라 체중 감소를 측정하기 위해 모든 동물을 계량합니다. 동물은 제대로 작업을 수행 할 수 있도록 하룻밤 8-12 %를 잃게해야합니다.
    3. 체중 감량당 동물을 정렬하고, 가장 적은 무게를 잃은 마우스에 가장 손실 마우스에서 시작 그들을 선별.
    4. 챔버가 침구와 단일 펠릿으로 채워져 있는지 확인합니다.
    5. 동물은 음식 펠릿에서 멀리, 챔버의 반대편에 배치합니다.
    6. 타이머를 즉시 시작합니다.
    7. 마우스가 챔버를 최대 12분 동안 탐색하도록 합니다.
    8. 음식 펠릿에 접근하고 먹이를 주는 대기 시간을 측정합니다(동물은 물고 먹어야 합니다).
      1. 동물이 펠릿가까이 에 와서 냄새를 맡고 물지 않을 때 접근이라고 생각해 보십시오.
      2. 동물이 펠릿을 소비하기 시작할 때물린을 정의합니다.
    9. 몇 초 만에 펠릿에 접근하고 먹이를 주는 대기 시간을 기록합니다.
    10. 마우스가 음식 펠릿에 공급되면 챔버에서 마우스를 제거합니다.
    11. 침구를 폐기하지만 마우스 홈 케이지에서 식욕 드라이브를 테스트하는 데 사용되는 펠릿을 저장합니다.
    12. 다음 동물의 챔버를 재설정하고 다음 동물로 진행합니다.
    13. 챔버에서 시험을 마친 후 15 분, 테스트 중에 사용되는 펠릿을 떨어 뜨리고, 마우스의 홈 케이지 내부, 케이지 의 전면벽에.
    14. 펠릿이 홈 케이지에 있을 때 펠릿을 먹이는 대기 시간을 측정합니다. 이것은 식욕 드라이브에 대 한 측정.
      1. 마우스가 펠릿이 케이지에 떨어지는 것을 볼 수 있도록 중첩 재질을 제거하는 것이 바람직하다.

12. 세럼 컬렉션 및 코르티코스테론 측정

  1. 지정된 기술을 사용하여 1 분 동안 동물을 다루며, 혈액 수집 15 분 전에 (이것은 마우스를 재그룹화 할 때 싸움에 대한 위험을 염두에 두고, 수용 된 그룹 또는 단일 보관 동물로 수행 할 수 있습니다).
    1. 터널 처리 마우스의 경우, 터널로 안내하고, 케이지에서 터널을 1분 동안 들어 올리고, 케이지에 있는 마우스를 교체한다.
    2. 꼬리 처리 마우스의 경우 마우스의 꼬리 베이스를 잡고 케이지에서 마우스를 제거합니다. 마우스를 실험자 슬리브로 1분 동안 옮기고 꼬리 처리로 마우스를 케이지로 되돌려 놓습니다.
    3. 3D 처리 마우스의 경우 컵을 사용하여 케이지에서 마우스를 제거합니다. 마우스를 1분 동안 손에 들고 케이지로 돌려줍니다.
  2. 취급 후 15 분, 복하 정맥(22)에서혈액 수집을 진행한다.
  3. 마우스의 머리가 단단히 고정되어 있도록 마우스를 단단히 으스스하게 합니다.
  4. 펑크 의 사이트를 찾습니다.
    1. 펑크 사이트를 찾기 위해 랜드 마크로 사용할 수있는 얼굴의 하악을 따라 작은 털이 없는 보조등이 있습니다. 턱의 기저와 이 조개 사이의 선을 그리는 이 펑크 사이트는 턱의 경첩 바로 뒤에 약 5mm의 귀를 향해 이 보조개 뒤에 있습니다.
  5. 깨끗한 23 G 바늘을 펑크 부위에 수직으로 잡고 빠른 단단한 랜싱 동작을 사용하십시오. 바늘의 끝은 1-2mm 사이의 깊이로 침투해야하며 정맥이 뚫리자마자 혈액이 즉시 흐르게됩니다.
  6. EDTA 코팅 수집 튜브에서 ~ 150 μL의 혈액을 수집하고 얼음에 보관하십시오.
  7. 혈액이 응고할 수 있도록 5 s 이상 천자 부위에 멸균 거즈 패드로 약간의 압력을 가하십시오.
  8. 피가 응고되면 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
  9. 원심 분리기 혈액은 4 °C 3,500 x g에서 10 분 동안.
  10. 상체를 장식합니다.
  11. 상류 분석을 위해 -20°C에 상체를 저장합니다.
  12. 제조업체의 프로토콜에 따라 코르티코스테론 ELISA 키트를 사용하여 코르티코스테론 수준을 측정합니다.
  13. 분광계를 사용하여 ELISA 결과를 읽습니다.

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Representative Results

2개의 별도 연구 결과는 C57BL/6 마우스로 수행되었습니다. 연구 #1 잭슨 연구소 (고양이 #000664)에서 2.5 개월 된 여성 (N = 36 / 연구)을 포함 6 개월 된 남성과 연구 #2 포함. 마우스는 2 개월의 나이에 시설에 도착했다. 연구 #2 여성은 도착 후 2 주 동안 처리 및 테스트하는 동안, 연구 #1 남성은 6 개월의 나이에 만 처리 및 테스트 (글로벌 전염병 종료로 인한 지연). 이 기간 동안, 연구 #2 마우스 한 개가 실험을 처리하기 전에 사망했습니다. #1 연구 결과는 동물 시설 직원에 의해 보살었습니다. 모든 마우스는 음식과 물 광고 리비툼에대한 액세스를 주어진 12 시간 빛 / 어두운 주기 (7:00 ON, 19:00 OFF)에 유지되었다. 그들의 홈 케이지는 재활용 신문과 침구 재료로 채워졌으며 중첩 재료로 가득 찼습니다. 마우스는 개별적으로 보관되었다, 세션 을 처리하는 동안 또는 혈액 수집 또는 행동 테스트와 같은 절차 후 그룹 보관 남성에서 잠재적 인 작용 행동을 제한하기 위해. 마우스는 꼬리 처리, 터널 처리 및 3D 처리의세 그룹으로 무작위화되었으며, 각각의 그룹의 설계에 따라 오픈룸에서 처리하였다(그림2). 터널 처리 그룹은 처리 세션 전에 1 주일 동안 보강으로 터널을 받았다. 그(것)들은 행동 시험의 앞에 10 (10) 연속일 동안 취급되었습니다. 다양한 처리 세션이 완료된 지 1주일 후 행동 테스트가 시작되었습니다. 16일째에, 마우스는 EPM에서 시험되었고, 그 후 실험자 상호작용 시험에서 시험하였다. 이틀 후, 마우스는 NSF에서 시험되었다. 마지막으로, 24일째에는 초기 취급과 동일한 유형의 1분 처리 세션 후 15분 동안 혈액이 그려졌습니다.

행동 테스트를 위해 터널 처리 된 동물은 케이지에서 가능한 한 터널을 사용하여 장치로 옮겨졌습니다. 그러나, 높은 플러스 미로 실험의 경우, 미로의 치수는 터널을 사용하여 미로에 동물을 제거하거나 배치하는 것을 어렵게 만들었습니다. 이 경우 동물들은 터널에서 손을 컵으로 옮기고 미로로 이송되었습니다. 3D 처리 된 마우스는 터널 처리의 8-10 일(도 2)과동시 3 일 동안 처리되었다. 꼬리 처리 마우스는 취급에 습관화되지 않았지만 실험자와의 상호 작용 중에 꼬리를 다루었습니다. 연구 기간 동안, 각 그룹에 사용되는 적절한 처리 기술의 사용을 보장하기 위해 실험자가 케이지 변경을 수행하였다.

실험자 상호작용 시험에서 동물은 실험자와 자발적으로 상호작용하고 실험적 맥락에서 취급의 용이성을 위해 자발적으로 실험하였다(그림3). ANOVA는 케이지에서 마우스를 픽업하려는 시도 의 수에 따라 #1남성(F(2,31)=6.36, p=0.004) 및 연구에서 #2 여성(F(2,33) =12.21, p=0.0001)에서 처리 접근법의 중요한 효과를 보였다. Scheffe의 포스트 호크 분석은 마우스를 픽업하는 데 필요한 시도 의 수가 크게 3D (연구 #1 남성에서 0.0061, 및 p =0.0002 연구에서 #2 여성) 및 터널 처리 (p = 0.04 연구 #1 남성, 및 p =0.003 연구 #2 여성)에 의해 감소된 것으로 나타났습니다. ANOVA는 손으로 동일한 사분면에 소요된 시간에 수행된 #1 연구에서남성(F(2,31)=5.38, p=0.009) 및 연구에서 #2여성(F(2,33) =3.5,p=0.04; 그림 3B). Scheffe의 포스트 호크 분석은 3D 처리 기술로 처리된 연구 #1 수컷 마우스가 꼬리 처리 마우스(p=0.012)에 비해 실험자의 손보다 동일한 사분면에서 훨씬 더 많은 시간을 소비한 것으로 나타났습니다. 연구 #2, 2.5 개월 된 여성의 처리 그룹 사이에 는 중요한 차이가 없었다. 실험자와의 상호작용 정도는 마우스의 중심점의 결합된 열맵에 의해 더욱 입증된다(도3C-E). 이들은 연구 #1 에서 3D 처리 된 남성 마우스가 손 근처의 영역을 포함하여 손에 더 많은 시간을 보냈는지, 꼬리 처리 마우스는 손과의 전반적인 상호 작용이 가장 적은 방법을 보여줍니다.

3D 및 터널 처리의 효과는 불안과 같은 행동의 두 가지 테스트에서 꼬리 처리에 비해, 참신 억제 공급 (NSF) 테스트및 높은 플러스 미로 (EPM). NSF 테스트에서, 접근에 대한 대기 시간에 수행된 ANOVA는 연구 #1남성(F(2,31) =3.5,p=0.04에 사용되는 취급 기술의 효과를 보였다. 연구 #1 수컷에서 Scheffe의 포스트 호크 분석은 3D 처리 마우스 (p=0.08) 및 터널 처리 마우스 (p=0.08)에서 추세를 보였으며, 꼬리 처리 마우스에 비해 접근 대기 시간이 감소(그림4A). 연구 #2 아무 효과 관찰 되지 않았습니다. ANOVA는 마우스 홈 케이지 (도시되지 않은 데이터)에서 접근 하는 대기 시간에 수행 처리의 영향을 보여주지 않았다 (p=0.88 연구 #1 남성에서, 그리고 p=0.16 연구에서 #2 여성). EPM에서 열린 무기의 백분율 시간에 수행된 ANOVA는 연구 #2여성(F(2,33) =3.5,p=0.04)에서 처리의 중요한 효과를 밝혀냈습니다. 연구 #1 남성 (F(2,31)=2.1, p =0.1에서 아무 효과 관찰 되지 않았습니다. 그림 4B). Scheffe의 포스트 호크 분석은 꼬리 처리 마우스 (p =0.07)에 비해 연구 #2 처리 된 마우스에서 열린 팔에 소요되는 시간이 증가하는 추세를 밝혔습니다. ANOVA는 두드러진무기(도 4C)의백분율 항목에 대해 남성 및 연구 #1 #2 여성(F(2,31) =1.12, p=0.33 및F(2,33)=1.3, p=0.26, 각각 취급효과가 없음을 밝혔다. 행동 점수는 Guilloux외. 23에서와같이 z 점수로 요약되었으며, 꼬리 처리 마우스에 비해 불안과 같은 행동의 잠재적 감소를 알리는 마우스(그림 4D). z-점수에 ANOVA는 연구 #1 남성 (F(2,31)= 5.6, p =0.008) 하지만 연구에서 #2 여성 (F(2,33)= 1.07, p =0.35)에서 처리의 중요한 효과를 보였다. Scheffe의 포스트 호크 분석은 3D 취급 및 터널 처리가 꼬리 처리에 비해 z 점수 (p=0.04 및 0.01) 크게 감소한다는 것을 보여주었으며, 두 가지 접근 법은 남성 #1 연구에서 불안과 같은 행동을 감소시킨다는 것을 시사합니다.

처리 후 코르티코스테론 수준도 간략한 처리세션(그림 5)후15분 후에 평가되었다. ANOVA는 연구 #2 여성 (F(2,33)= 4.44, p =0.01)에서 처리의 중요한 효과를 발견, 하지만 연구 #1 남성 (F(1,31)= 0.53, p = 0.59). 연구에서 #2 여성, 포스트 호크 분석은 꼬리 처리 그룹 (p =0.02)에 비해 3D 처리 그룹에서 마우스에 있는 corticosterone 수준에 있는 유의한 감소를 밝혔습니다.

처리 기술이 얻은 데이터의 가변성에 중대한 영향을 미쳤는지 확인하기 위해 Bartlett의 균일성 분산 테스트를 적용했습니다. 우리의 결과는 측정에 걸쳐 연구 #2 여성 마우스의 가변성에 유의한 차이를 발견하지 못했습니다 (% 시간 EPM B(2,33)= 4.95, p=0.087; % 항목 EPM B(2, 33)= 3.68, p =0.16; NSF B(2, 33)= 0.20, p=0.91; CORT B(2, 33)=1.69, p=0.42). 그러나, 연구 #1 남성 마우스에서, NSF 시험에서 분산의 상당한 이질성이 있었다 (B(2,31)=8.08, p=0.0175) 및 측정된 CORT수준(B(2,32)=11.63, p=0.0029)에서 EPM(% 시간 EPM B(2,32)=1.16, p=0.56; % 엔트리 EPM B(2,32)=2.79 p5=2.79 p5)에 포함되지 않았습니다. F-테스트를 사용하여 두 가지 분산을 비교하는 데 따르면 NSF 테스트 분산은3D(F(1,21)=4.22, p=0.04) 및 터널 처리기술(F(1,22)=4.01;p=0.03)에 의해 남성 스터디#1 연구에서 크게 감소된 것으로 나타났다. 처리 후 CORT의 농도의 경우, 3D 처리만이 테일 핸들링에 비해 가변성을 현저히감소시켰습니다(F(1,20)=9.65, p=0.0019).

Figure 1
그림 1. 3D 처리 절차의 대표적인 이미지입니다.  이미지는 3D 처리 절차를 보여 줍니다. A) 케이지에 손 : 실험자의 손은 케이지에 배치하고 마우스가 케이지에 손의 존재에 습관화 할 수 있도록, 가만히 유지된다. B) 플랫 핸드: 케이지에서 처음 제거하면 마우스가 손바닥의 평평한 손바닥에 놓입니다. 마우스는 자유롭게 손바닥 주위를 걷고 인접한 평평한 손 사이를 이동할 수 있습니다. C) 롤 : 마우스 주위에 느슨한 "컵"을 형성하기 위해 손의 손바닥을 휴식. 컵을 반대쪽 손으로 부드럽게 기울이면 마우스가 부드럽게 다른 손으로 안내하지 않으면 마우스가 자유롭게 이 손으로 움직여야 합니다. D) 대피소: 마우스를 손 가장자리에 배치한 다음 두 손을 함께 모으고 마우스 주위에 컵을 천천히 형성합니다. 마우스를 억제해서는 안되며 마우스가 빠져나간 수 있도록 개구부를 유지해야 합니다. ~5-10s를 잡고 평평한 손에 열립니다. E) 머리/백 페팅: 마우스가 손바닥의 평평한 손바닥을 탐험하는 동안 마우스를 머리와 등에 부드럽게 애완동물로 두습니다. 이것은 위에서 실험자의 접근에 마우스를 습관화. F) 코 찌르기: 마우스가 취급에 습관화된 것처럼 보이는 경우 주전자에서 마우스를 직접 부드럽게 만지려고 합니다. 마우스가 머리를 멀리 움직이지 않으면 취급에 잘 습관화됩니다. G) 마지막 날에 짧은 (2-3 s) 목 핀치를 수행 하여 경합이 필요한 미래의 개입시 동물의 습관성을 측정할 수 있습니다. 처리에 습관화할 때, 마우스는 목 꼬집기 도중 움직이지 않는 남아 있는 동안, 비 습관적인 마우스는 경합에서 풀어 얻기 위하여 그들의 꼬리를 회전하여 탈출을 시도할 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. 실험 적 디자인.  시설에 도착한 후, 꼬리 처리 마우스는 습관도받지 못했습니다. 터널 처리 된 마우스는 처리가 시작되기 1 주일 전에 홈 케이지의 터널에 습관화되었습니다. 터널 처리 마우스는 터널 처리 기술로 10일(처리 첫날 = 1일) 3일간 3일간(8-10일)동안 습관화되었다. 마우스는 그 후 높은 플러스 미로(EPM) (16일차), 실험자 상호작용 시험(19일차), 참신억제수유(21일), CORT 측정을 위한 혈청 수집(24일)을 거쳐 간략한 처리 세션을 진행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. 세 가지 처리 기술이 처리의 용이성과 실험자와 상호 작용하려는 의지에 미치는 영향. A) 케이지에서 마우스를 제거하는 데 필요한 평균 픽업 시도 수입니다. 연구 #1 남성 (왼쪽 패널, 꼬리 처리 N = 12, 터널 처리 N =12 및 3D 처리 N=11) 및 연구 #2 여성 (오른쪽 패널, 그룹 당 N =12) 두 터널과 3D 처리 그룹 모두에서 마우스는 꼬리 처리 마우스에 비해 케이지에서 제거하는 데 필요한 시도의 수에 상당한 감소를 표시. B) 실험자의 손과 같은 케이지 사분면에 있는 동물이 보낸 평균 시간입니다. 3D 기술로 처리된 #1 연구 결과는 실험자의 손과 같은 사분면에서 소요되는 시간의 유의한 증가를 보여주었습니다. C-E) Ethovision XT 14에서 렌더링된 시간별 마우스 중심점의 평균 열맵은 3D 처리 된 남성 마우스#1 연구 실험자와의 증가 된 탐사 및 상호 작용을 시각적으로 입증했습니다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. *p<0.05, **p<0.01 테일 핸들드 그룹에 비해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

Figure 4
그림 4. 불안 같은 행동에 세 가지 처리 기술의 영향. A) 연구 #1 수컷 마우스(Tail Handling N= 12, 터널 핸들링 N=12 및 3D 취급 N=11) 및 #2 연구에서 여성 마우스(N=12/그룹)에서 참신억제 된 먹이실에서 펠릿에 접근하고 먹이를 주는 대기 시간. 3D 처리 및 터널 처리 그룹에서 남성 마우스를 #1 연구 결과에서 데이터는 펠릿에 접근하는 대기 시간의 현저한 감소를 향한 추세를 보였다. B) 높은 플러스 미로의 열린 팔에 소요 된 시간의 % 수단. 연구 #1 남성에 있는 단 사이 중요한 다름이 없었다, 그리고 터널 처리 단에 있는 연구 #2 여성에 의해 열린 무기에 있는 더 많은 시간을 향해 추세. C) 열린 팔에 항목: 남성 에 #1 연구 그룹 사이 중요 한 차이가 없었다, 또는 연구에서 #2 여성. D) Z 점수는 불안과 같은 행동을 요약합니다. A, B 및 C에 제시된 데이터를 사용하여, z-점수는 꼬리 처리 마우스를 참조로 사용하여 계산하였다. z-점수의 감소는 NSF와 EPM 테스트에 의해 측정된 불안같이 행동에 있는 감소를 건의합니다. 3D 또는 터널 기술을 사용하여 처리된 #1 수컷 마우스는 꼬리 처리마우스에 비해 불안과 같은 표현형을 감소시켰습니다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. *p<0.05 꼬리 처리 그룹에 대한 비교. t는 꼬리 처리 그룹에 비해 유의 (p<0.1)의 추세 수준을 묘사한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

Figure 5
그림 5. 처리 후 코르티코스테론 의 수준.  세럼은 간략한 처리 세션 후 15분 동안 수집된 다음 CORT 수준은 모두 연구 #1 수컷(테일 핸들링 N= 12, 터널 핸들링 N=12 및 3D 처리 N=11)과 연구 #2 여성 마우스(N=12/그룹)에서 ELISA에 의해 측정되었다. 3D 취급 기술을 통해 처리된 여성 마우스#2 연구는 꼬리에 의해 처리된 마우스에 비해 감소된 코르티코스테론 수준을 보여주었습니다. 연구 #1 ANOVA는 남성 마우스 사이의 차이에 대한 중요성에 도달하지 않았다 (p=0.5). 오류 막대는 테일 핸들드 그룹에 비해 SEM. *p<0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Table 1
표 1.

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Discussion

이 연구 와 방법 개발은 마우스의 취급 기술이 여전히 과학계에 의해 간과되고 있으며, 일부 실험실은 여전히 실험 전에 동물의 스트레스와 반응성을 줄이기 위해 습관또는 취급 기술을 구현하는 것을 꺼려한다는 관찰에 근거합니다. 시간 투입을 대표하는 동안, 동물 취급은 수행 될 실험의 성공에 기여할 수있는 동물에게 유익한 효과를 제공하고 데이터 가변성 또는 동물 과반응으로 인해 실험이 여러 번 수행될 필요가 없도록합니다. 3D 처리 기술의 사용은 마우스에서 탈출 시도를 감소. 그것은 또한 우리의 6 개월 된 남성 마우스에 실험자와 상호 작용을 증가 하 고 감소 불안 같은 표현형. 또한, 3D 취급은 처리의 단지 3 의 초기 일 후에 2.5 달 된 여자 마우스에 있는 데이터 가변성을 감소시키고 코티코스테론 수준을 감소시켰습니다. 이 방법은 부드러운 전송과 쉽게 개입을 용이하게 실험자가 처리하기 위해 마우스를 습관화하는 부드러운 조작에 의존한다.

3D 처리 기법에서 강조할 가치가 있는 것은 위에서 설명한 이정표의 달성에 따라 마우스의 반응성에 대응하여 처리 방법의 진행이 발생한다는 것입니다. 동물은 다음 단계로 진행하기 전에 반응성을 한 처리 단계로 줄여야 합니다. 충분히 습관화되지 않은 동물의 "대피소" 또는 "코 찌르기" 단계로 너무 빨리 진행하려고 하면 스트레스가 증가하고 잠재적으로 절차의 효과를 줄일 수 있습니다. 마찬가지로, 취급의 매일 동물의 반응성을 모니터링 해야 하 고 추가 처리 일이 필요한 지 결정할 때 고려 되어야 한다. 동물이 첫 번째 이정표를 달성하기위한 기준을 충족하지 않고 첫날대피소 시험에 잘 반응하지 않으면 이정표가 완료 될 때까지 처리의 첫 날이 반복 될 수 있습니다. 마찬가지로, 동물이 둘째 날에 코 찌르기 시험에 반응하지 못하면 둘째 날도 반복될 수 있다. 이 접근법으로 주의해야 할 또 다른 주의 사항은 마우스가 멀리 점프하는 것이 처리의 첫날, 특히 C57BL6와 같은 급격한 균주에서 더 크다는 것입니다. 위에서 설명한 지침에 따라 점프의 위험을 줄이고 그러한 행동을 제한하는 방법을 제공해야 합니다. 단계를 통한 처리 및 진행 기간은 긴장에 따라 달라질 수 있으며, 특히 불안한 표현형을 나타내는 것으로 알려진 형질전환 모델로 작업하는 경우 특히 다양할 수 있습니다.

제시된 3D 취급 기술의 효과를 줄이는 데 몇 가지 요인이 기여할 수 있습니다. 이러한 요인 중 하나는 실험자의 잠재적 인 두려움이나 주저, 실험자가 마우스 처리에 익숙하지 않은 경우, 또는 마우스의 무서워되는 경우. 따라서 처리기에 미치는 영향도 고려해야 할 사항입니다. 그러나, 마우스와의 상호 작용 수준이 점진적으로 증가하면 초보 실험자가 핸들링 단계를 통해 진행됨에 따라 핸들링 기술을 수행하는 데 있어 자신감과 더 큰 기술을 개발할 수 있습니다. 제안된 단계/이정표(대피소 및 코 찌르기 테스트)는 초보 처리기의 잠재적인 인간의 가변성에 대처하는 데 도움이 될 수 있으므로 동물이 비슷한 수준의 습관에 도달할 수 있습니다. 동물과 인간-동물의 긍정적인 상호 작용을 육성하는 것은 동물 관리직원(24)의삶의 질과 동정심을 높이는 결과를 낳은 것으로 알려졌다. 따라서 취급에서 젠틀링은 일반적인 상호 작용 또는 개입 중에 처리기와 동물 모두에게 이점을 제공합니다.

6개월 된 남성과 2.5개월 된 암컷 모두에서 마우스 를 픽업하려는 시도 횟수를 줄이는 데 미치는 영향으로 3D 핸들링은 터널 처리 또는 기타 기술에 대한 대안을 제공하여 케이지에서 실험 장치로 동물을 쉽게 옮길 수 있도록 합니다. 3D 처리 기술은 또한 실험자가 가진 6 개월 된 남성 마우스의 상호 작용을 증가시켰습니다. 이것은 2.5 달 된 여자 마우스에서 관찰되지 않았습니다, 그러나 여성 마우스는 꼬리 처리한 마우스에 비해 픽업하기 쉽게 남아 있었습니다. 이것은 3D 취급 기술이 모리스 물 미로와 같은 동물과 실험자 사이 직접적인 상호 작용을 요구하는 실험에 더 적합할 지도 모르다는 것을 건의합니다 (나중에 논의된 잠재적인 성/나이 혼란 요인에도 불구하고). 다른 사람들은 추가 조작 없이, 컵 손으로 동물을 따기로 구성된 수동 취급 기술을 개발하고 사용했다10. 이러한 기술은 유익한 효과를 보였지만, 문헌의 데이터는 종종 10 일9,16을초과하는 습관 기간이있는 처리프로토콜을제시합니다. 또한 3D 핸들링에 의해 제공되는 세련된 상호 작용없이 컵 처리는 손에서 계속 뛰어 내리는 점프 균주에 적합하지 않을 수 있습니다. 이 연구에서 컵 방법에 대한 직접 비교는 하지 않았지만 3D 처리는 이를 해결하고 마우스와 처리기 간의 상호 작용을 촉진하기 위해 세련된 움직임에 의존합니다. Ghosal et al.16의 연구는 5 일 동안 마사지와 결합 된 컵 처리 기술을 사용했으며,이 기술은 더 나은 효능을 위해 취급하는 동안 세련된 움직임과 상호 작용의 필요성을 강조하여 신진 대사 종점에 스트레스의 영향을 제한하는 것으로 나타났습니다. 이 컵 마사지 기술을 기반으로 3D 핸들링은 마우스를 습관화하기 위해 추가 상호 작용을 사용합니다. 3D 처리 접근법을 사용하여, 처리기는 모든 마우스가 표준화된 움직임을 수행하고 필요에 따라 각 동물에게 절차의 기간을 조정하여 유사한 수준의 습관화에 도달하도록 보장합니다(본 연구에서는 모든 마우스가 이정표를 통과하고 3일 만에 3D 처리 프로토콜을 완료했습니다). 이 방법은 각 마우스에 "개인화"로 간주 될 수 있으므로 모든 동물이 매일 처리할 때마다 원하는 수준의 습관에 도달합니다. 앞에서 언급했듯이, 동물이 프로토콜에 설명된 이정표에 도달하지 못하면 이 기술은 일 수를 늘려 서 조정할 수 있다. 이 기술은 행동 연구 와 생리 측정 (CORT 수준에서 동물 사이 가변성을 감소시키기 위한 유익한 효력을 보여주었습니다), 이 접근은 연구 내 가변성의 감소에 기여할 수 있고 실험 오류의 충격을 잠재적으로 전임상 연구에서 유도하는 충격을 감소시킬 수 있었다는 것을 건의합니다.

지원 결과 제안 3D-및 터널 처리 대상 쥐 는 꼬리 처리 마우스에 비해 참신 억제 된 공급 테스트에서 불안을 감소 시켰다. NSF와 EPM에서 결합된 데이터를 고려, 두 접근 은 6 개월 된 남성 마우스에 불안을 감소에 중요 한 효과 보였다. 이것은 터널 처리에 습관화한 동물이 불안9,10+ 취급 의 일 후에15에 대한 시험에서 성능을 향상했다는 사실 인정을 복제하고, 유사한 효력을 전시하기 위하여 3D 취급의 잠재력을 더 보여줍니다. 이것은 또한 3D 처리된 6 개월 된 남성 마우스 접근하고 자발적으로 터널과 꼬리 처리를 실시 하는 6 개월 된 남성 마우스 보다 그들의 실험자와 더 상호 작용 하는 것으로 나타났다. 중요한 것은, 3D 취급을 실시하는 2.5개월 된 암컷 마우스는 이전에 발표된 결과9와동의하는 CORT의 수준을 감소시켰습니다. 두 연구 (연구 #1 6 개월 된 남성에 #1 연구 와 연구 #2 2.5 개월 된 여성) 확인, 처리 불안 같은 표현형에 유익한 영향을 가지고 두 가지 다른 방법으로 (연구 #1 행동 결과에, 또는 연구 #2 코르트 수준에).

효과에 가능한 기여 요인은 실험자의 섹스, 이 경우 남성. 그것은 Sorge외. 25 남성 실험자의 존재는 CORT에 있는 증가와 남성 마우스에 있는 행동 같이 불안으로 이끌어 낼 수 있다는 것을 보여주었습니다. 이것은 본 연구 결과와 대조적입니다. 이 연구와 Sorge외. 25의 연구 사이의 주요 차이점은 여기에 설명된 접근법이 실험자와 양성(비 강화) 상호 작용을 육성하여 마우스를 처리하는 습관화에 관한 것으로 구성되어 있으며, Sorge et al.25는 인간과 상호 작용하지 않는 순진한 설치류를 사용했다는 것입니다. 순진한 마우스가 실험자가 위협을 나타내지 않는다는 것을 배우지 않으면 인간 실험자에 대한 강한 반응을 가질 수 있다고 기대할 수 있습니다. 그러나, 본 연구는 남성 실험자와 함께 수행 되었다, 그리고 미래 연구 는 이러한 효과 여성 실험자와 재현 하는 경우 조사 해야. 이러한 요소를 격리하는 것은 이 논문의 범위를 벗어났지만, 취급 습관을 구현하거나 실험 설계에서 이러한 가변성 원인을 식별하는 것이 중요하다는 점을 강조할 가치가 있습니다.

본 연구는 또한 마우스9,10,11에서불안과 같은 행동과 CORT 수준을 감소시키는 터널 처리 기술의효능을확인하였다. 이 접근법의 추가 이점은 터널이농축(26)으로케이지에 남을 수 있다는것입니다. 이 경우 실험자의 역할은 각 동물과 함께 터널만을 1분 동안 조작하는 것입니다. 그러나 Gouveia et al19에의해 설명된 바와 같이, 터널은 반드시 홈 케이지에 남아있을 필요가 없으며, 대신 추가 스트레스를 유발하지 않고 동물을 전송하는 데 필요한 경우에만 동물에게 제시 될 수있다. 두 접근 방식, 터널 및 3D 처리 기술은 실험실과 실험자가 자신의 요구에 가장 적합한 접근 방식을 결정하기 위해 평가해야 하는 이점을 제공합니다. 본 연구에서는, 터널은 케이지에 남아 있었고, 우리가 불안과 같은 행동에 관찰한 영향은 터널 처리와 농축의 조합 때문일 수 있습니다.

둘 다 유익한 효과를 제공하지만 3D 및 터널 처리 기술은 제한없이 제공되지 않습니다. 공동의 제한은 동물 시설이 이러한 절차를 구현하는 데 시간이 많이 걸리고 잠재적으로 실망스러울 수 있다는 것입니다. 그러나, 추가 된 혜택은 스트레스를 줄이고 실험자 및 동물 관리 제공자와의 상호 작용을 개선하여 동물 복지를 개선하고 (스판겐베르크와 켈링27에설명 된 바와 같이), 연구 신뢰성과 재현성을 향상시킵니다. 우리의 시설에서 증거는이 기술은 동물과 축산 직원 사이의 상호 작용을 향상 제안, 케이지 변경 및 건강 모니터링을 촉진. 우리의 시설에 있는 그밖 사용자에서, 경합 및 전반적인 조작은 처리된 마우스와 현저하게 쉽게 보고됩니다, 3D 기술로 취급된 마우스가 포착될 때 달아나기 위하여 확률이 낮다는 우리의 사실 인정과 일치하고 우리의 예에서, 6 개월 된 남성은 그들의 실험자와 상호 작용하는 경향이 있습니다. 후속 연구는 기술의 유용성을 입증하기 위해 이러한 효과를 정량화 할 수 있습니다. 이 3D 처리 접근 방식과 터널 접근법은 특히 일상적인 동물 상호 작용을 정제하여 처리에 대한 응을 최소화함으로써 3R의 규칙에 기여합니다. 데이터의 가변성이 관찰된 감소를 감안할 때, 이것은 또한 일관된 결과를 얻기 위하여 필요한 동물의 수를 감소시키고 가변성을 제한하는 데 사용된 접근 방식을 정제하는 잠재력을 가지고 있습니다.

제시된 데이터에 근거를 둔 토론의 또 다른 점은 이 연구 결과가 단하나 수용되는 동물로 수행되었다는 것입니다. 단일 하우징은 잠재적인 작용성 행동(특히 남성 마우스)을 제한하기 때문에, 개인 간가변성(28,29)에기여할 수 있는 것이 바람직하였다. 그룹 간의 일관성을 위해 모든 동물이 단독으로 보관되었습니다. 쥐 간질의 형태로 쥐에서 양성 실험자 -동물 상호 작용, 단일 보관쥐30,31에서사회적 고립의 효과의 일부를 완화 할 수 있었다는 점에 유의하는 것도 흥미롭다. 3D 핸들링 기술이나 Ghosal 외11에 의해 기술된 컵 마사지 기술과 같이 동물과 실험자 간의 직접적인 접촉을 포함하는 취급 기술이 유사한 효과를 가질 수 있다. 미래의 연구는 단일 및 그룹 보관 동물에서 기술을 취급의 효과를 비교하여이 질문을 탐구 할 수 있습니다. 과거 연구는 그룹 하우스 환경에서 마우스와 컵 및 터널 처리 접근의 영향을 조사하고, 유사한 결과를 얻었다7,8. 이는 본 명세서에 기재된 동물과 함께 단일 집 또는 그룹 하우스 조건에 보관되어 있는 동물과 함께 처리 프로토콜을 사용할 수 있음을 확인하며, 케이지에서 한 마리의 동물을 데리고 다시 배치할 때 고뇌적 행동의 가능성을 염두에 두고(특히 남성 마우스 또는 공격적인 마우스 라인에서)에 다시 배치할 수 있음을 확인한다. 이러한 경우 모든 동물을 함께 다시 그룹화하기 전에 임시 케이지를 사용하는 것이 좋습니다.

결론을 내리기 위해 제안된 3D 처리 접근법은 마우스의 반응성과 스트레스를 줄이는 데 기여합니다. 또한 처리 3일 후 가변성을 줄임으로써 데이터 신뢰성을 향상시킵니다. 터널 처리 10일 후에 터널 처리와 유사한 결과를 관찰할 수 있습니다. 터널 처리 기술과 비교하여, 3D 취급 기술은 어떤 경우에는 중요할 수 있는 우리의 6 달 된 남성 마우스에 있는 실험자와의 상호 작용을 증가시키는 이득을 제공했습니다. 3D 또는 터널 처리 기술이 데이터 생성을 위한 큰 개선을 나타내고 연구에서 동물 사용 의 감소에 크게 기여할 모든 동물 시설에서 구현될 경우.

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Disclosures

저자는 공개 할 이해상충이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 이 일을 지원하기 위한 CAMH의 동물 관리 위원회, 뿐만 아니라 절차의 유용성에 대한 광범위한 피드백을 제공 CAMH의 동물 간병인, 설명 된 실험의 실행 및 다른 사용자를위한 상세한 프로토콜의 제출을 동기를 부여. 이 작품은 부분적으로 CAMH 브레이크 스루 챌린지에 의해 투자되었다, TP에 수여, CAMH에서 내부 자금에 의해.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. BD 2546-CABD305145 Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk BD 367841 EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding Bed-O-Cobs BEDO1/4 Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5424 R For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit Arbor Assays K003-H1W
Digital Camera Panasonic HC-V770 Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze Home Made n/a Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol Medstore House Brand 39753-P016-EA95 Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15 Noldus n/a Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Memory Card Kingstone Technology SDA3/64GB For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber Home Made n/a Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes Home Made n/a 13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding Purina n/a Standard Bedding
Spectrophotometer Biotek Epoch Microplate Reader

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References

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동작 문제 175
마우스의 스트레스를 줄이는 취급 기술
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Marcotte, M., Bernardo, A., Linga,… More

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga, N., Pérez-Romero, C. A., Guillou, J. L., Sibille, E., Prevot, T. D. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J. Vis. Exp. (175), e62593, doi:10.3791/62593 (2021).

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