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Bioengineering

आणविक इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए समर्थित और निलंबित लिपिड बिलेयर मॉडल की नकल करने वाली सेल की असेंबली

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62599
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Center for Biomedical Engineering, School of Engineering, Brown University

Summary

यह प्रोटोकॉल यूनी-लिपिड और मल्टी-लिपिड वेसिकल्स, समर्थित लिपिड बाइलेयर्स और निलंबित लिपिड बाइलेयर्स की नकल करने वाले सेल के गठन का वर्णन करता है। इन इन विट्रो मॉडलों को विभिन्न प्रकार के लिपिड प्रकारों को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और विभिन्न अणु और मैक्रोमॉलिक्यूल इंटरैक्शन की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Abstract

मॉडल सेल झिल्ली प्रारंभिक दवा खोज से लेकर विषाक्तता अध्ययन तक के अनुप्रयोगों के साथ एक उपयोगी स्क्रीनिंग उपकरण हैं। कोशिका झिल्ली सभी कोशिका प्रकारों के लिए एक महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक बाधा है, जो आंतरिक सेलुलर घटकों को बाह्य पर्यावरण से अलग करती है। ये झिल्ली काफी हद तक लिपिड बाइलेयर से बनी होती हैं, जिसमें विभिन्न प्रोटीन और कोलेस्ट्रॉल के साथ-साथ बाहरी हाइड्रोफिलिक हेड ग्रुप और इनर हाइड्रोफोबिक टेल ग्रुप होते हैं । लिपिड की संरचना और संरचना स्वयं जैविक कार्य को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जिसमें कोशिकाओं और सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट के बीच बातचीत शामिल है, जिसमें फार्मास्यूटिकल्स, जैविक विषाक्त पदार्थ और पर्यावरणीय विषाक्त पदार्थ हो सकते हैं। इस अध्ययन में, यूनी-लिपिड और मल्टी-लिपिड समर्थित और निलंबित सेल नकल करने वाले लिपिड बिलेयर तैयार करने के तरीकों का वर्णन किया गया है। इससे पहले, यूनी-लिपिड फॉस्फेटिलकोलिन (पीसी) लिपिड बिलेयर्स के साथ-साथ बहु-लिपिड अपरा ट्रोफोब्लास्ट-प्रेरित लिपिड बिलेयर आणविक बातचीत को समझने में उपयोग के लिए विकसित किए गए थे। यहां दोनों प्रकार के बाइलेयर मॉडल हासिल करने के तरीके प्रस्तुत किए जाएंगे। बहु-लिपिड बिलायरों की नकल करने वाली कोशिका के लिए, वांछित लिपिड संरचना पहले प्राथमिक कोशिकाओं या सेल लाइनों से लिपिड निष्कर्षण के माध्यम से निर्धारित की जाती है जिसके बाद तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस)। इस संरचना का उपयोग करके, लिपिड वेसिकल्स एक पतली फिल्म हाइड्रेशन और एक्सट्रूज़न विधि का उपयोग करके निर्मित होते हैं और उनके हाइड्रोडायनामिक व्यास और जीटा क्षमता की विशेषता होती है। समर्थित और निलंबित लिपिड बिलेयर तब अपव्यय निगरानी (क्यूसीएम-डी) के साथ क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोसैलेंस का उपयोग करके और एक समानांतर कृत्रिम झिल्ली पारगम्यता परख (पंपपा) में उपयोग के लिए एक छिद्रपूर्ण झिल्ली पर बनाए जा सकते हैं। प्रतिनिधि परिणाम इन विट्रो सेल झिल्ली लिपिड बिलेयर मॉडल की प्रजनन क्षमता और बहुमुखी प्रतिभा को उजागर करते हैं। प्रस्तुत किए गए तरीके एक कोशिका झिल्ली के साथ विभिन्न अणुओं और मैक्रोमॉलिक्यूल्स जैसे इंटरैक्शन तंत्रों के त्वरित, फेसियल मूल्यांकन में सहायता कर सकते हैं, दवा उम्मीदवारों की स्क्रीनिंग और संभावित सेलुलर विषाक्तता की भविष्यवाणी में मदद करते हैं।

Introduction

कोशिका झिल्ली, मुख्य रूप से फॉस्फोलिपिड, कोलेस्ट्रॉल और प्रोटीन से बनी, सभी जीवित कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण घटक है1। लिपिड एम्फीफिलिटी द्वारा संचालित संगठन के साथ, कोशिका झिल्ली एक सुरक्षात्मक बाधा के रूप में कार्य करती है और यह नियंत्रित करती है कि कोशिका अपने आसपास के वातावरण के साथ कैसे बातचीत करती है2। कई सेलुलर प्रक्रियाएं झिल्ली1,2की लिपिड और प्रोटीन संरचना पर निर्भर हैं । उदाहरण के लिए, प्रभावी दवा वितरण3के लिए सेल झिल्ली इंटरैक्शन महत्वपूर्ण हैं। फार्मास्यूटिकल्स, बायोलॉजिक्स, नैनोमैटेरियल्स, बायोलॉजिकल टॉक्सिन्स और पर्यावरणीय विषाक्त पदार्थ कोशिका झिल्ली की अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं, जिससे सेलुलर फ़ंक्शन4प्रभावित हो सकता है। कोशिका झिल्ली की लिपिड संरचना के आधार पर झिल्ली मॉडल की नकल करने वाले इन विट्रो सेल के निर्माण में कोशिकाओं पर इन सामग्रियों के संभावित प्रभाव के अध्ययन को बढ़ाने के लिए फेसियल उपकरण प्रदान करने की क्षमता है।

मॉडल लिपिड बाइलेयर्स में लिपिड वेसिकल्स, समर्थित लिपिड बाइलेयर्स और निलंबित लिपिड बाइलेयर्स शामिल हैं। समर्थित लिपिड बाइलेयर फॉस्फोलिपिड सेल झिल्ली का एक मॉडल होते हैं जिनका उपयोग आमतौर पर जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में किया जाता है जहां लिपिड वेसिकल्स एक समर्थित सब्सट्रेट सामग्री 5 ,6,7,8,9पर उठी होती है। बाइलेयर गठन की निगरानी के लिए उपयोग की जाने वाली एक आम तकनीक क्षय निगरानी (क्यूसीएम-डी) के साथ क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंसहै, जो सीटू8,10, 11, 12,13,14 में थोक तरल गुणों की तुलना में वेसिकल्स के सोखने की जांच करतीहै। . इससे पहले, क्यूसीएम-डी का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया है कि प्रवाह की स्थिति में, एक बार सतह पर फॉस्फेटिलकोलिन (पीसी) लिपिड वेसिकल्स का एक महत्वपूर्ण वेसिकल कवरेज प्राप्त होता है, वे अनायास कठोर लिपिड बिलेयर्स15में टूट जाते हैं। पिछले काम ने अलग-अलग लिपिडरचनाओं 16,लिपिड प्रोटीन17, 18, 19के समावेश और पॉलीमर कुशन20का उपयोग करनेकेसाथ समर्थित लिपिड बाइलेयरगठनकी भी जांच की है, जो सेल झिल्ली समारोह के विभिन्न पहलुओं की नकल करने में सक्षम समर्थित लिपिड बाइलेयर हैं।

लिपिड बिलायरों का उपयोग उप-सेलुलर से अंग स्तर तक विभिन्न जैविक बाधाओं की नकल करने के लिए किया गया है, जिसमें फॉस्फोलिपिड, कोलेस्ट्रॉल और ग्लाइकोलिपिडघटकों मेंफेरबदल करके माइटोकॉन्ड्रियन, लाल रक्त कोशिका और यकृत कोशिका झिल्ली शामिल हैं। लिपिड संरचना के आधार पर इन अधिक जटिल बहु-लिपिड वेसिकल्स को वेसिकल टूटना प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त तरीकों की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों में हेपेटाइटिस सी वायरस के गैर-संरचनाीय प्रोटीन 5 ए से प्राप्त α-हेलिकल (एएच) पेप्टाइड का उपयोग किया गया है ताकि22, 23, 23, 23, 23,एसोबेड लिपिड वेसिकल्स को अस्थिर करके बाइलेयर गठन को प्रेरित किया जा सके। इस एएच पेप्टाइड का उपयोग करके, अपरा कोशिकाओं की नकल करने वाले समर्थित लिपिड बिलेयर पहले24बनाए गए हैं। जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए समर्थित लिपिड बाइलेयर की अपार संभावनाओं को आणविक और नैनोपार्टिकल परिवहन 25 ,26 , 26,पर्यावरण विषाक्त बातचीत27, प्रोटीन असेंबली और कार्य17,18, 19,पेप्टाइड व्यवस्था और सम्मिलन28,29,दवा स्क्रीनिंग 30 और माइक्रोफ्लुइडिकप्लेटफार्मों 31में फैले जांच के साथ प्रदर्शित किया गया है ।

निलंबित लिपिड बिलायरों का उपयोग एक समानांतर कृत्रिम झिल्ली पारमीता परख (पंपा) के माध्यम से फार्मास्यूटिकल स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए किया गया है जहां एक लिपिड बाइलेयर को असुरक्षित हाइड्रोफोबिकडालने 32 , 33,34,35में निलंबित कियाजाताहै। पंपा लिपिड मॉडल रक्त-मस्तिष्क, बुक्कल, आंतों, और ट्रांसडरमल इंटरफेस36सहित विभिन्न जैविक इंटरफेस के लिए विकसित किया गया है। समर्थित लिपिड बाइलेयर और पंपा तकनीकों, सोखने, पारमेबिलिटी, और वांछित ऊतक या सेल प्रकार के लिपिड घटकों के भीतर यौगिकों के एम्बेडमेंट दोनों के संयोजन से अच्छी तरह से अध्ययन किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल कई आणविक बातचीत की जांच करने के लिए इन विट्रो सेल झिल्ली लिपिड बाइलेयर मॉडल के निर्माण और अनुप्रयोग का वर्णन करता है। यूनी-लिपिड और मल्टी-लिपिड समर्थित और निलंबित लिपिड बिलेयर दोनों की तैयारी विस्तृत है। एक समर्थित लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए, लिपिड वेसिकल्स को पहले पतली-फिल्म हाइड्रेशन और एक्सट्रूज़न विधियों का उपयोग करके विकसित किया जाता है जिसके बाद भौतिककीय लक्षण वर्णन होता है। पीएसीएम-डी निगरानी और पंपा में उपयोग के लिए निलंबित लिपिड झिल्ली के निर्माण का उपयोग करके एक समर्थित लिपिड बाइलेयर के गठन पर चर्चा की जाती है। अंत में, अधिक जटिल कोशिका नकल करने वाली झिल्ली के विकास के लिए बहु-लिपिड वेसिकल्स की जांच की जाती है। दोनों प्रकार के गढ़े हुए लिपिड झिल्ली का उपयोग करके, यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस उपकरण का उपयोग कैसे किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह तकनीक उच्च प्रजनन क्षमता और बहुमुखी प्रतिभा के साथ लिपिड बाइलेयर्स की नकल करने वाली सेल का निर्माण करती है।

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Protocol

1. यूनी-लिपिड वेसिकल्स का विकास

  1. पतली फिल्म जलयोजन विधि
    1. लिपिड स्टॉक समाधानों की तैयारी और भंडारण
      नोट: क्लोरोफॉर्म का उपयोग करने वाले सभी चरणों को रासायनिक धुएं हुड में किए जाने की आवश्यकता है। क्लोरोफॉर्म को हमेशा सॉल्वेंट सुरक्षित कार्बन फाइबर पिपेट टिप्स का उपयोग करके पिपेट किया जाना चाहिए। क्लोरोफॉर्म युक्त समाधान हमेशा कांच की शीशियों में संग्रहीत किया जाना चाहिए।
      1. लिपिड पाउडर युक्त शीशी में क्लोरोफॉर्म की उचित मात्रा जोड़कर 10 मिलीग्राम/एमएल लिपिड स्टॉक समाधान तैयार करें और अच्छी तरह से मिलाएं। उदाहरण के लिए, 200 मिलीग्राम एल-α-फॉस्फेटिडिलकोलिन (अंडा, चिकन) (अंडापीसी) में क्लोरोफॉर्म के 20 एमएल जोड़ें। यदि आवश्यक हो तो स्टॉक समाधान एक अलग एकाग्रता पर किया जा सकता है।
        नोट: यदि पाउडर लिपिड को एक एम्पुल में संग्रहीत किया गया था, तो पॉलीटट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) लाइन वाली टोपी के साथ ग्लास शीशी में क्लोरोफॉर्म ट्रांसफर जोड़ने के बाद।
      2. पैराफिल्म के साथ शीशी टोपी सील करें और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. एक सूखी लिपिड फिल्म का गठन
      1. लिपिड स्टॉक समाधान की उचित मात्रा को 2.5 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम वेसिकल एकाग्रता के लिए आवश्यक एक साफ ग्लास शीशी में जोड़ें। उदाहरण के लिए, 2.5 मिलीग्राम/एमएल पर अंडे पीसी वेसिकल्स के 1 एमएल बनाने के लिए, पिपेट 250 माइक्रोन अंडे पीसी स्टॉक समाधान को शीशी में।
        नोट: तैयार मात्रा एक्सट्रूडर प्रक्रिया पर निर्भर कर सकती है (चरण 1.3 देखें)। मिनी एक्सट्रूडर मैक्सिमम अनुशंसित वॉल्यूम 1 मिलील है जबकि बड़ी एक्सट्रूडर वॉल्यूम रेंज 5-50 एमएल है।
      2. एन 2 गैस (अल्ट्रापुरे5.0 ग्रेड) की धारा का उपयोग करके लिपिड स्टॉक समाधान से क्लोरोफॉर्म निकालें।
      3. क्लोरोफॉर्म को पूरी तरह से हटाने के लिए, सूखे लिपिड फिल्म को वैक्यूम करने के लिए कनेक्ट करें और कम से कम 4 घंटे के लिए छोड़ दें।
        नोट: प्रक्रिया यहां रोका जा सकता है । यदि लिपिड फिल्म का उपयोग वैक्यूम सुखाने के तुरंत बाद नहीं किया जाएगा, तो उपयोग किए जाने तक एक डिसिकेटर में स्टोर करें। हमने देखा है कि इन लिपिड फिल्मों में इन स्थितियों पर भंडारण के 1 सप्ताह के बाद समान गुणवत्ता वाले वेसिकल्स उत्पीडिंग होती हैं; लंबी भंडारण अवधि के बाद वेसिकल गुणवत्ता, यदि आवश्यक हो, तो आगे का पता लगाया जाना चाहिए।
    3. फ्रीज-गल-भंवर चक्र प्रदर्शन
      1. ट्राइस सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) बफर घोल तैयार करें जिसमें 10 एमएम ट्रिज बेस और 100 एमएम एनएसीएल शामिल हो। लगभग 15-30 एस के लिए 2.5 मिलीग्राम/एमएल और भंवर की अंतिम वेसिकल एकाग्रता उपज करने के लिए Tris NaCl बफर की आवश्यक मात्रा के साथ सूखे लिपिड फिल्म को फिर से हाइड्रेट करें।
      2. जमे हुए, लगभग 30 मिनट तक सूखी बर्फ के साथ एक कंटेनर में वेसिकल निलंबन स्थानांतरित करें। नमूना पूरी तरह से जमे हुए होने के बाद, निलंबन को 30-40 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में गल लें। भंवर गल वेसिकल निलंबन।
        नोट: तरल एन2 सूखी बर्फ के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है । वेसिकल सस्पेंशन को 30 एस के लिए लिक्विड नाइट्रोजन में ट्रांसफर करें, और फिर तुरंत 80 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गल जाएं।
      3. 5 फ्रीज-गल-भंवर चक्र की कुल के लिए, एक अतिरिक्त 4 बार कदम 1.1.3.2 दोहराएं।
  2. बाहर निकालना
    नोट: फ्रीज-गल-भंवर चक्र पूरा होने के बाद, मल्टीलैमलर वेसिकल्स बनते हैं। निष्कासन आकार को कम करने और बड़े एक्लेमेलर वेसिकल्स विकसित करने में सहायक होता है।
    1. मिनी (1 एमएल) एक्सट्रूडर प्रक्रिया
      1. अल्ट्रापुरे पानी में हल्के डिटर्जेंट का उपयोग करके एक्सट्रूडर के सभी घटकों को अच्छी तरह से साफ करें और अल्ट्रापुरे पानी के साथ कम से कम तीन बार कुल्ला करें जिसमें सभी डिटर्जेंट को हटा दिया जाए। एन2 गैस के साथ सूखी।
      2. दो आंतरिक झिल्ली का समर्थन करता है और ओ-रिंग्स (12.7 मिमी का आंतरिक व्यास; 15.2 मिमी का बाहरी व्यास) इकट्ठा करें। स्थिति प्रत्येक झिल्ली समर्थन तो ओ अंगूठी का सामना करना पड़ रहा है ।
      3. अल्ट्रापुरे पानी के साथ फिल्टर सपोर्ट को प्री-वेट करें। इसे ओ-रिंग के अंदर झिल्ली समर्थन सतह पर रखें। दूसरी आंतरिक झिल्ली समर्थन के लिए दोहराएं।
      4. एक्सट्रूडर बाहरी आवरण में एक आंतरिक झिल्ली समर्थन की स्थिति। एक 100 एनएम पॉलीकार्बोनेट झिल्ली को सीधे फिल्टर समर्थन पर आंतरिक झिल्ली समर्थन पर रखें।
        नोट: पॉली कार्बोनेट झिल्ली नीले रंग के कागज के टुकड़ों के बीच अलग से संग्रहीत की जाती है। झिल्ली समर्थन पर डालने से पहले अलग कागज निकालें।
      5. दूसरी आंतरिक झिल्ली को पॉलीकार्बोनेट झिल्ली का सामना करने वाले ओ-रिंग और फिल्टर सपोर्ट साइड के साथ एक्सट्रूडर आउटर केसिंग में स्थिति करें। एक्सट्रूडर बाहरी आवरण के साथ बंद रिटेनर अखरोट और पेंच में पीएफई असर संलग्न करें। हीटिंग ब्लॉक में एक्सट्रूडर क्लिप करें।
      6. लिपिड वेसिकल सस्पेंशन को सिरिंज में से एक में लोड करें और सिरिंज को एक्सट्रूडर हीट ब्लॉक में रखें, सुई को पूरी तरह से एक्सट्रूडर के एक छोर में डालें। दूसरी, खाली सिरिंज को विपरीत दिशा में डालें और हीट ब्लॉक पर आर्म क्लिप का उपयोग करके दोनों सिरिंज में लॉक करें।
        नोट: यदि आवश्यक हो, तो एक्सट्रूडर हीट ब्लॉक को गर्म प्लेट पर रखें और लिपिड के संक्रमण तापमान से ऊपर एक मूल्य के लिए तापमान निर्धारित करें। सटीक तापमान रीडिंग के लिए हीट ब्लॉक में निर्मित धारक में एक थर्मामीटर डालें और आवश्यक तापमान तक पहुंचने तक प्रतीक्षा करें (~ 15 मिनट)। अंडा पीसी लिपिड वेसिकल्स को एक्सट्रूसेशन के दौरान गर्मी की आवश्यकता नहीं होती है।
      7. धीरे-धीरे वेसिकल सस्पेंशन को खाली सिरिंज में धकेलें, और फिर वापस मूल सिरिंज में। एक रिसाव का संकेत है कि extrusion भर में दबाव परिवर्तन के लिए मॉनिटर। पॉलीकार्बोनेट झिल्ली से कुल 21 पास के लिए 20 बार और दोहराएं। भंडारण के लिए लिपिड वेसिकल्स को एक साफ ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें।
        नोट: लिपिड संरचना के आधार पर एक्सट्रूज़न की संख्या को अनुकूलित किया जा सकता है।
      8. यदि गर्मी का उपयोग किया गया था, तो कमरे के तापमान तक पहुंचने के लिए निकाले गए वेसिकल निलंबन की अनुमति दें। आगे के उपयोग तक निकाले गए लिपिड वेसिकल्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
        नोट: अनुशंसित वेसिकल भंडारण अवधि लिपिड संरचना पर अत्यधिक निर्भर है, और वेसिकल शारीरिक गुण (जैसे, हाइड्रोडायनामिक व्यास, जीटा क्षमता) की समय के साथ निगरानी की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, अंडे पीसी वेसिकल्स को कम से कम दो सप्ताह के लिए संग्रहीत किया गया है जिसमें वेसिकल आकार या बाइलेयर गठन क्षमता में कोई परिवर्तन नहीं किया गया है।
    2. बड़ी (5-50 एमएल) एक्सट्रूडर प्रक्रिया
      नोट: यदि चुने हुए लिपिड के लिए गर्मी की आवश्यकता है तो चरण 1.2.2.1-1.2.2.5 का पालन करें। यदि गर्मी की आवश्यकता नहीं है तो चरण 1.2.2.5 पर छोड़ दें। अंडे पीसी के लिए चरण 1.2.2.1-1.2.2.4 की आवश्यकता नहीं है।
      1. रिवर्स ऑस्मोसिस (आरओ) पानी के साथ एक 1 एल फ्लास्क भरें।
        नोट: 50 एमएल सिस्टम के माध्यम से प्रसारित करने के लिए अल्ट्रापुरे पानी का उपयोग न करें क्योंकि यह एक्सट्रूडर सिलेंडर से लीच करने के लिए धातु आयनों का कारण बन सकता है।
      2. एक गर्म थाली पर एक पानी स्नान में 1 एल फ्लास्क रखें और लिपिड के संक्रमण के तापमान से ऊपर एक तापमान के लिए गर्म थाली सेट ।
      3. नमूना सिलेंडर पर इनलेट के माध्यम से लचीला ट्यूबिंग के साथ फ्लास्क के लिए नमूना सिलेंडर संलग्न करें। सिलेंडर के आउटलेट पर टयूबिंग को 1 एल फ्लास्क के ऊपर से अटैच करें। जरूरत के अनुसार, दोनों इनलेट और आउटलेट पर सुरक्षित ट्यूबिंग। इससे सैंपल सिलेंडर के जरिए पानी का यूनी डायरेक्शनल फ्लो पैदा होगा।
      4. पानी का सर्कुलेशन शुरू करने के लिए पंप चालू करें। यदि गर्मी की आवश्यकता है, तो वांछित तापमान तक पहुंचने के लिए नमूना सिलेंडर के लिए लगभग 30-45 मिनट के लिए अनुमति दें।
      5. प्रेशर रिलीफ वाल्व यूनिट से जुड़े लचीले कनेक्टर के जरिए सैंपल सिलेंडर की कैप को नाइट्रोजन टैंक से कनेक्ट करें।
      6. 50 एमएल एक्सट्रूडर के सभी हिस्सों को 70% (v/v) इथेनॉल के साथ साफ करें।
      7. एक्सट्रूडर कम समर्थन में अंतरिक्ष में बड़े होल स्क्रीन समर्थन, सिंट्रेड डिस्क, ड्रेन डिस्क और पॉली कार्बोनेट झिल्ली को रखकर एक्सट्रूडर को इकट्ठा करें। चार शिकंजा का उपयोग कर extruder ऊपरी और निचले समर्थन करता है कनेक्ट और कस।
      8. नीचे करने के लिए पंगा लेना और सुरक्षित करने के लिए एक रिंच के साथ कस द्वारा नमूना सिलेंडर के लिए एक्सट्रूडर यूनिट संलग्न करें।
        नोट: यदि गर्मी का उपयोग किया जाता है, तो सिलेंडर में एक थर्मामीटर रखें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि पानी जारी रखने से पहले वांछित तापमान तक न पहुंच जाए। यह सुनिश्चित करेगा कि नमूना तापमान पूरी निष्कासन प्रक्रिया में बनाए रखा जाता है।
      9. सैंपल सिलेंडर को अल्ट्रापुरे पानी से भरें। नमूना सिलेंडर में नमूना जोड़ने से पहले एक्सट्रूडर यूनिट के माध्यम से पानी को बाहर निकालें। यह झिल्ली को पूर्व-गीला करने के लिए किया जाता है, जो मिनी एक्सट्रूडर के समान होता है।
        नोट: सुनिश्चित करें कि टोपी पूरी तरह से खराब हो गई है और नाइट्रोजन चालू करने से पहले दबाव राहत वाल्व पूरी तरह से बंद हो जाता है। इस चरण (~ 5-10 साई) के लिए न्यूनतम दबाव की आवश्यकता होती है।
      10. नमूना सिलेंडर में लिपिड वेसिकल निलंबन जोड़ें और शीर्ष बंद पेंच। धीरे-धीरे दबाव बढ़ाएं जब तक कि नमूना लगभग 2-3 बूंदों की दर से एक्सट्रूडर यूनिट से ड्रिप करना शुरू न कर ले।
        नोट: इस कदम पर दबाव को जल्दी से न बढ़ाएं, क्योंकि बहुत अधिक दबाव झिल्ली को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है और असफल निष्कासन का कारण बन सकता है।
      11. एक बार जब सभी नमूना निकाल दिया गया है, एन2 की आपूर्ति बंद कर दें और धीरे-धीरे दबाव राहत वाल्व खोलकर नमूना सिलेंडर में दबाव जारी करें। लिपिड वेसिकल्स को नमूना सिलेंडर में वापस डालें और कुल 10 एक्सट्रूज़न के लिए 9 बार चरण 1.2.2.11 दोहराएं।
        नोट: एक्सट्रूजन की बढ़ती संख्या के साथ एक्सट्रूज़न के लिए आवश्यक दबाव कम हो सकता है, क्योंकि नमूना पॉली कार्बोनेट झिल्ली पोर आकार के आकार में अधिक सजातीय और करीब हो जाता है।
      12. आगे के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर लिपिड वेसिकल सस्पेंशन को स्टोर करें।

2. लिपिड वेसिकल्स की विशेषता

  1. गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) का उपयोग करके हाइड्रोडायनामिक व्यास माप
    1. भंवर लिपिड वेसिकल्स और पिपेट 50 माइक्रोन लिपिड वेसिकल सस्पेंशन को डिस्पोजेबल कम वॉल्यूम वाले क्यूवेट में। धूल और मलबे के साथ प्रदूषण को रोकने के लिए कवर करें।
    2. वेसिकल सस्पेंशन को डीएलएस इंस्ट्रूमेंट में लोड करें, सैंपल डिटेल्स इनपुट करें और संबंधित सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करते हुए मेजरमेंट करें।
  2. जीटा क्षमता
    1. सेल के इनपुट से कनेक्ट होने वाली सिरिंज का उपयोग करके अल्ट्रापुरे पानी, 70% इथेनॉल और अल्ट्रापुरे पानी से धोकर एक जोड़ केशिका जीटा सेल तैयार करें। धीरे-धीरे कोशिका के माध्यम से तरल को 3-4 बार पुश करें और अगले समाधान पर स्विच करने से पहले सेल को पूरी तरह से खाली करें।
    2. भंवर लिपिड वेसिकल्स को तैयार करें और अल्ट्रापुरे पानी में लिपिड वेसिकल्स का 1:10 (v/v) कमजोर करने का तैयारी करें ।
    3. पतला लिपिड वेसिकल निलंबन लोड करें। सीरिंज के बीच आगे और पीछे निलंबन धक्का द्वारा हवा बुलबुले निकालें। प्रत्येक इनलेट के लिए डाट देते हैं।
      नोट: सभी बुलबुले को हटाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह माप को प्रभावित करेगा।
    4. जेटा सेल को सैंपल चैंबर में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि इलेक्ट्रोड संपर्क में हैं। नमूना कक्ष शीर्ष बंद करें। संबद्ध सॉफ्टवेयर में, नमूना विवरण इनपुट और माप एकत्र करें।

3. क्यूसीएम-डी का उपयोग करके एक यूनी-लिपिड समर्थित लिपिड बाइलेयर बनाना

  1. समाधान की तैयारी
    1. अल्ट्रापुरे पानी में 2% (डब्ल्यू/वी) सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) समाधान तैयार करें। पूरी तरह से भंग होने तक हलचल प्लेट पर मिलाएं। अल्ट्रापुरे पानी के कम से कम 10 एमएल, 2% एसडीएस और ट्रिस एनएसीएल के अलीकोट काम करने वाले समाधान।
    2. ट्राइस एनएसीएल बफर में लिपिड वेसिकल्स का कमजोर पड़ने की तैयारी करें। वेसिकल्स की एकाग्रता आवेदन पर निर्भर है। अंडे पीसी के लिए, 0.01-0.5 मिलीग्राम/एमएल की सीमा में सांद्रता सफल समर्थित लिपिड बाइलेयर गठन में परिणाम के लिए दिखाया गया है ।
  2. सिलिका-लेपित क्वार्ट्ज क्रिस्टल सेंसर की सफाई
    नोट: क्यूसीएम-डी क्रिस्टल की सफाई सेंसर की सतह सामग्री पर निर्भर करती है। समर्थित लिपिड बिलेयर बनाने के लिए, सिलिका-लेपित क्वार्ट्ज क्रिस्टल का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया जाता है और निर्माता की मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया से अनुकूलित के रूप में नीचे विस्तृत किया जाता है।
    1. सिलिका-लेपित क्वार्ट्ज क्रिस्टल सेंसर को प्रवाह मॉड्यूल में डालें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि क्रिस्टल पर "टी" मॉड्यूल पर "टी" के साथ संरेखित हो। फ्लो मॉड्यूल को बंद कर पेंच।
      नोट: यदि क्यूसीएम-डी का उपयोग कई प्रवाह मॉड्यूल को एक साथ जोड़ने और चलाने की अनुमति देता है, तो आवश्यकतानुसार अतिरिक्त मॉड्यूल के लिए निम्नलिखित प्रक्रियाओं को दोहराएं।
    2. फ्लो मॉड्यूल को एनालाइजर सिस्टम से जोड़ने वाले फ्लो मॉड्यूल से इलेक्ट्रोड के साथ इंस्ट्रूमेंट के बेस में डालें। मॉड्यूल को जगह में लॉक करें।
    3. इनलेट और आउटलेट ट्यूबिंग को फ्लो मॉड्यूल और पंप से कनेक्ट करें। टयूबिंग को होल्डिंग गार्ड्स में रखें और एनालाइजर सिस्टम का ढक्कन बंद कर दें। खर्च समाधान इकट्ठा करने के लिए पंप के आउटलेट पर एक बेकार कंटेनर रखें।
    4. सफाई करने के लिए, सबसे पहले पंप चालू करें। प्रवाह की गति 400 μL/मिनट के लिए निर्धारित करें। इनलेट ट्यूबिंग को अल्ट्रापुरे पानी में डालें और मॉड्यूल के माध्यम से 5-10 एमएल प्रवाहित करें।
    5. इनलेट ट्यूबिंग को 2% एसडीएस में स्विच करें और मॉड्यूल के माध्यम से 5-10 एमएल प्रवाहित करें। इनलेट ट्यूबिंग को वापस अल्ट्रापुरे पानी में स्विच करें और मॉड्यूल के माध्यम से 10-20 एमएल प्रवाहित करें। समाधान से इनलेट ट्यूबिंग निकालें और सभी तरल बाहर निकालने तक ट्यूबिंग के माध्यम से हवा प्रवाह।
      नोट: ऊपर सफाई प्रोटोकॉल से पहले और हर माप के बाद दैनिक प्रयोग किया जाता है। जरूरत के अनुसार पूरी तरह से सफाई की जा सकती है। संक्षेप में, पूरी तरह से सफाई करने के लिए, प्रवाह मॉड्यूल को अलग करें। प्रवाह मॉड्यूल के इलेक्ट्रोड पक्ष को छोड़कर सभी घटकों को 2% (w/v) एसडीएस और बाथ सोनिकेटेड में डुबोया जाना चाहिए, जिसके बाद अल्ट्रापुरे पानी के साथ पूरी तरह से कुल्ला किया जाना चाहिए और एन2 गैस की धारा के साथ सूखना चाहिए । इलेक्ट्रोड पिन युक्त प्रवाह मॉड्यूल का घटक कभी भी तरल के संपर्क में नहीं होना चाहिए।
    6. फ्लो मॉड्यूल से सेंसर निकालें और अल्ट्रापुरे पानी से सेंसर को कुल्ला करें। एन2 गैस स्ट्रीम के साथ सेंसर को सुखा लें। एन2 गैस स्ट्रीम के साथ फ्लो मॉड्यूल को सुखाएं। सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड हमेशा किसी भी तरल से मुक्त रहते हैं।
    7. एक रासायनिक धुएं हुड में, सिलिका-लेपित क्वार्ट्ज क्रिस्टल सेंसर को अल्ट्रा-वायलेट (यूवी) /ओजोन सफाई उपकरण में डालें। उपकरण चालू करें और कम से कम 2 मिनट के लिए उपचार की अनुमति दें। सेंसर को ध्यान से निकालें और प्रवाह मॉड्यूल में लौटें।
  3. एक Tris NaCl बेसलाइन बनाने
    1. संबद्ध सॉफ्टवेयर से कनेक्ट करने के लिए एनालाइजर उपकरण चालू करें और समर्थित लिपिड बाइलेयर के लिए वांछित मूल्य के लिए तापमान सेट करें। तापमान वांछित इनपुट को स्थिर करने की अनुमति दें।
      नोट: यदि सेट तापमान कमरे के तापमान से ऊपर है, तो सभी समाधानों को गर्मी ब्लॉक का उपयोग करके एक ही तापमान पर गर्म किया जाना चाहिए।
    2. माप को कॉन्फ़िगर करें और माप शुरू करने से पहले ओवरटोन 3, 5, 7, 9, 11 और 13 के लिए सभी सेंसर प्रतिध्वनि आवृत्तियों और अपव्यय पाते हैं।
      नोट: 1सेंट ओवरटोन की अवहेलना की जा सकती है क्योंकि यह हार्मोनिक अति संवेदनशील है और शोर डेटा पैदा करता है।
    3. पंप चालू करें और प्रवाह दर को 175 माइक्रोन/न्यूनतम या वांछित प्रायोगिक प्रवाह दर पर सेट करें।
    4. ट्रिस एनएसीएल में डालने से पहले इथेनॉल के साथ इनलेट ट्यूबिंग को मिटा दें। माप शुरू करें और ट्रिस एनएसीएल बहने शुरू करें।
      नोट: डेटा एकत्र किया जाता है और वास्तविक समय में निगरानी की जाती है। फ्लो मॉड्यूल में हवा से लिक्विड में बदलाव तेजी से अपव्यय परिवर्तन(10)वृद्धि और आवृत्ति परिवर्तन(1F)कमी द्वारा डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर में देखा जाएगा।
    5. ट्रिस एनएसीएल को मॉड्यूल के माध्यम से 5-10 मिनट के लिए प्रवाहित करने की अनुमति दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि बेसलाइन एनएएफ और तरल में 1D मान स्थिर रहें।
  4. एक यूनी-लिपिड समर्थित लिपिड बाइलेयर बनाना
    1. पंप बंद करो और Tris NaCl समाधान से इनलेट ट्यूबिंग को हटा दें और ध्यान से लिपिड वेसिकल समाधान में डालें। इनलेट ट्यूबिंग से किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 5 एस के लिए वापस प्रवाह, और फिर आगे प्रवाह जारी रखें। बेसलाइन को शून्य करने के लिए सॉफ्टवेयर में माप को पुनः आरंभ करें।
      नोट: टयूबिंग में हवा के बुलबुले से बचने के लिए सावधान रहें, जो मॉड्यूल के माध्यम से प्रवाहित हो सकता है और बिलेयर गठन और डेटा रिकॉर्डिंग को बाधित कर सकता है।
    2. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (अंडे पीसी वेसिकल्स के लिए कम से कम 8 मिनट) में वास्तविक समय में बाइलेयर गठन तक फ्लो लिपिड वेसिकल्स का प्रवाह किया जाता है।
    3. लिपिड वेसिकल्स से इनलेट ट्यूबिंग को वापस ट्राइस एनएसीएल बफर में बदलने के लिए चरण 3.4.1 दोहराएं।
      नोट: वांछित आवेदन आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए है, तो समाधान प्रवाह या डेटा अधिग्रहण को रोके बिना सीधे 6.1 कदम जारी रखें। यदि बाइलेयर गठन अंतिम बिंदु है, तो 3.4.4 चरण में आगे बढ़ें।
    4. सॉफ्टवेयर में, माप बंद करो और फ़ाइल को बचाने के लिए। पंप बंद करो।
    5. प्रोटोकॉल चरण 3.2.4 और 3.2.5 के बाद प्रवाह मॉड्यूल और सिलिका-लेपित क्वार्ट्ज क्रिस्टल सेंसर को साफ करें।

4. एक निलंबित लिपिड बिलेयर बनाना

नोट: एक निलंबित लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए प्रोटोकॉल फ़िल्टर प्लेट निर्माता37द्वारा प्रदान किए गए समानांतर कृत्रिम झिल्ली पार पार्यता परख (पंपपा) प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया है।

  1. 20 मिलीग्राम/एमएल (उदाहरण के लिए, 1,2-डायोलिओल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीओपीसी) में डोडेकाने में वांछित लिपिड को सोलुबिलाइज करें।
  2. दाता डिब्बे में लिपिड समाधान का 5 माइक्रोन जोड़ें, जो एक असुरक्षित पॉलीविनाइलिडीन डिफ्लोराइड (पीवीडीएफ) 96-वेल मल्टीस्क्रीन फिल्टर प्लेट (0.45 माइक्रोन पोर आकार) है।
  3. तुरंत फिल्टर प्लेट को स्वीकारकर्ता डिब्बे में जलमग्न कर दें, जो एक परिवहन रिसीवर प्लेट है जिसमें 1× फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का 300 माइक्रोन होता है। दाता डिब्बे में 1× पीबीएस के 200 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: केवल लिपिड के साथ फिल्टर के नियंत्रण और 1× पीबीएस के संपर्क में अनुपचारित फिल्टर शामिल किया जा सकता है ।
  4. निलंबित लिपिड बाइलेयर के साथ आणविक बातचीत की जांच करने के लिए सीधे धारा 6.2 पर जारी रखें। निलंबित बिलेयर बनाने के 16 घंटे के भीतर अध्ययन पूरा करने की सिफारिश की जाती है।

5. मल्टी लिपिड सेल का विकास करते हुए वेसिकल्स और बिलेयर की नकल

  1. स्तनधारी कोशिकाओं से लिपिड निष्कर्षण
    नोट: लिपिड निष्कर्षण ब्लिग-डायर दृष्टिकोण३८के बाद ।
    1. संस्कृति उपयुक्त के रूप में वांछित सेल लाइन। 70-80% संगम (T75 फ्लास्क) प्राप्त करने के बाद, 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्राइप्सिन-एथिलीनडाइमिनेट्रेएक्टाएसेटिक एसिड का उपयोग करके अलग कोशिकाओं को अलग करें।
    2. 5 मिनट के लिए 200 × जी पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं। सुपरनेट निकालें और अल्ट्रापुरे पानी के 1 एमएल में सेल पेलेट को रीसस्ट करें।
    3. क्लोरोफॉर्म के 1:2 (v/v) मिश्रण का 3.75 एमएल जोड़ें: सेल सस्पेंशन और भंवर में 15 मिनट के लिए मेथनॉल। इसके बाद 1 मिनट के लिए क्लोरोफॉर्म और भंवर का सवा एमएल डालें। अंत में, 1 मिनट के लिए 1.25 एमएल पानी और भंवर जोड़ें।
    4. 10 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज सेल मिश्रण। तरल की निचली परत को इकट्ठा करें, जिसमें कार्बनिक चरण में लिपिड होते हैं। एन 2 गैस की एक धारा केनीचे सूखी।
    5. सी 18 रिवर्स चरण, 3.5 माइक्रोन × 50 मिमी कॉलम का उपयोग करके तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) का उपयोग करके लिपिड सामग्री की मात्रा निर्धारित करें।
    6. मोबाइल चरण के लिए, दो समाधान तैयार करें, पहला 60:40 (v/v) एसीटोनिट्रिल के साथ: पानी और दूसरा 90:10 (v/v) आइसोप्रोपनोल: एसीटोनीट्रिल के साथ। अमोनियम फोरमेट को 10 mm की अंतिम एकाग्रता पर दोनों समाधानों में जोड़ा जाना चाहिए। 60 मिनट से अधिक, मोबाइल चरण ढाल को दूसरे समाधान के 35% (v/v) से बढ़ाकर 95% (v/v) करें।
    7. नकारात्मक आयनीकरण मोड में बहिस्त्राव का पता लगाएं, लगातार पूर्ण स्कैन एमएस और टैंडेम एमएस/एमएस के साथ । व्यक्तिगत फॉस्फोलिपिड प्रजातियों को उनके मास-टू-चार्ज (m/z) अनुपात से पहचानें । लिपिड मैप्स मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करके, टकराव-प्रेरित वियोजन विखंडन से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा का विश्लेषण करें। वक्र के तहत क्षेत्र को एकीकृत करने के लिए निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम प्राप्त करें, प्रत्येक लिपिड प्रजातियों की बहुतायत का निर्धारण करें।
    8. प्रत्येक अलग फॉस्फोलिपिड वर्ग के लिए पता लगाने के सापेक्ष संवेदनशील निर्धारित करने के लिए प्रमुख लिपिड वर्गों वाले लिपिड मानक के लिए चरण 5.1.5-5.1.7 करें।
  2. मल्टी लिपिड वेसिकल्स का विकास
    1. प्रत्येक वांछित बाइलेयर घटक का प्रतिनिधित्व करने वाले लिपिड के लिए लिपिड स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए 1.1.1 में चरणों का पालन करें, जैसा कि चरण 5.1 में पहचाना गया है।
    2. चरण 5.1 से प्राप्त लिपिड रचनाओं के आधार पर, लिपिड/क्लोरोफॉर्म स्टॉक की उचित मात्रा को 2.5 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम वेसिकल एकाग्रता के लिए आवश्यक एक स्वच्छ ग्लास शीशी में जोड़ें। एन2 गैस की धारा के नीचे थोक क्लोरोफॉर्म सुखाने का समाधान निकालें।
    3. मल्टी लिपिड वेसिकल्स बनाने के लिए चरण 1.1.2, 1.1.3, और 1.2 का पालन करें। वेसिकल लक्षण वर्णन के लिए चरण 2 का पालन करें।
  3. क्यूसीएम-डी का उपयोग करके एक बहु-लिपिड समर्थित लिपिड बाइलेयर बनाना
    नोट: कुछ बहु लिपिड वेसिकल्स के परिणामस्वरूप सहज लिपिड वेसिकल टूटना और बाइलेयर गठन हो सकता है जो चरण 3 में प्रस्तुत यूनी-लिपिड पीसी वेसिकल्स के समान है। हालांकि, अधिक जटिल बहु लिपिड वेसिकल्स को वेसिकल टूटना में सहायता करने के लिए बाहरी इनपुट की आवश्यकता हो सकती है। यहां, एएच पेप्टाइड का उपयोग वेसिकल के बाहरी पत्रक को अस्थिर करने के लिए किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप बाइलेयर गठन होता है। अस्थिरता और वेसिकल टूटना प्राप्त करने के अन्य तरीकों पर विचार किया जा सकता है यदि वांछित है।
    1. चरण 5.2 में गठित बहु-लिपिड वेसिकल्स का उपयोग करने वाले मल्टी-लिपिड समर्थित लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए चरण 3 का पालन करें।
    2. यदि एक बाइलेयर में वेसिकल्स का सहज टूटना नहीं देखा जाता है, तो एएच पेप्टाइड का उपयोग करके वेसिकल अस्थिरता का प्रयास करें। एएच पेप्टाइड (पेप्टाइड सीक्वेंस: एच-सेर−ग्ली−सेर−टीआरपी−लेउ−Arg−Asp−Val−Trp−Asp−T.Ile−Cys−Thr−Val−Thr−Asp−Phe−Lys−Thr−Trp−Leu−Gln−Ser−Lys−Leu−Asp−Tyr−Lys−Asp-NH2)समाधान 1% (v/v) डिमथाइल्सुऑक्साइड, डीएमएसओ के साथ ट्रिस एनएसीएल में 13 माइक्रोनएम पर।
    3. चरणों का पालन करें 3.4.1-3.4.3। चरण 3.4.3 के बाद, इनलेट ट्यूबिंग को एएच पेप्टाइड समाधान में बदलें। प्रवाह मॉड्यूल में समाधान का परिचय तब तक करें जब तक कि नए समाधान के अलावा से एएफ और एडीडी मनाया न जाए। पंप बंद करो और आह पेप्टाइड 10 मिनट के लिए वेसिकल्स के साथ इनक्यूबेट करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    4. इनलेट ट्यूबिंग को ट्रिस नैक में स्विच करें और उठी हुई वेसिकल्स से एएच पेप्टाइड को हटाने के लिए प्रवाह शुरू करें जिससे लिपिड बाइलेयर का सफल गठन हो सके।
      नोट: वांछित आवेदन आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए है, समाधान प्रवाह या डेटा अधिग्रहण को रोकने के बिना 6.1 कदम के लिए दिशा जारी रखें।
    5. सॉफ्टवेयर में, माप बंद करो और फ़ाइल को बचाने के लिए। पंप बंद करो।
    6. प्रोटोकॉल चरण 3.2.4-3.2.6 के बाद प्रवाह मॉड्यूल और सिलिका-लेपित क्वार्ट्ज क्रिस्टल सेंसर को साफ करें।
  4. निलंबित बहु लिपिड बिलेयर्स
    1. 20 मिलीग्राम/एमएल पर डोडेकाने में वांछित लिपिड का मिश्रण सोलूबिलाइज करें।
    2. वांछित सेल नकल उतार संरचना का उपयोग करके 5 माइक्रोन लिपिड मिश्रण समाधान बनाएं।
    3. चरण 4.2 और 4.3 का पालन करें।
      नोट: निलंबित लिपिड बाइलेयर के साथ आणविक बातचीत की जांच करने के लिए सीधे 6.2 कदम जारी रखें।

6. यूनी-लिपिड और मल्टी-लिपिड बिलेयर्स के साथ अणु इंटरैक्शन अध्ययन

  1. क्यूसीएम-डी का उपयोग करके समर्थित लिपिड बाइलेयर के साथ आणविक बातचीत का अध्ययन करना
    1. एक समर्थित लिपिड बाइलेयर के साथ सोखने की जांच करने के लिए वांछित अणु का समाधान तैयार करें। उदाहरण के लिए, 1% (v/v) DMSO के साथ ट्रिस एनएसीएल में 200 μM di (2-ethylhexyl) थैलेट (DEHP) का समाधान तैयार करें।
    2. यदि ट्राइस एनएसीएल में अणु समाधान तैयार किया जाता है, तो इसे यूनी-लिपिड बाइलेयर के लिए चरण 3.4.3 या बहु-लिपिड बाइलेयर के लिए 5.3.4 के बाद सीधे प्रवाहित किया जा सकता है। यदि अणु को एक अलग सॉल्वेंट में तैयार किया जाना चाहिए, तो इसके बजाय कम से कम 5 मिनट (उदाहरण के लिए, डीईपीपी के लिए 1% (v/v) डीएमएसओ के साथ एनएसीएल को 1% के साथ ट्राइस नैक डालें)।
      नोट: विलायक के कारण चिपचिपाहट परिवर्तन की निगरानी की जा सकती है और ब्याज के अणु की शुरुआत से पहले और बाद में इसे प्रवाहित करके विचार किया जा सकता है।
    3. इनलेट ट्यूबिंग को ब्याज के अणु से युक्त समाधान में स्विच करें और कम से कम 5 मिनट के लिए प्रवाह करें। प्रवाह को भी रोका जा सकता है और वांछित अणु युक्त तरल यदि वांछित हो तो बाइलेयर के साथ इनक्यूबेट करने की अनुमति दी जाती है।
    4. इनलेट ट्यूबिंग को अकेले अणु सॉल्वेंट में बदलें यदि ट्रिस एनएसीएल के अलावा कुछ और। कम से कम 5 मिनट के लिए प्रवाह। फिर, इनलेट ट्यूबिंग को ट्राइस एनएसीएल में स्विच करें और कम से कम 5 मिनट के लिए प्रवाह करें।
    5. सॉफ्टवेयर में, माप बंद करो और फ़ाइल को बचाने के लिए। पंप बंद करो।
    6. प्रोटोकॉल चरण 3.2.4-3.2.6 के बाद प्रवाह मॉड्यूल और सिलिका-लेपित क्वार्ट्ज क्रिस्टल सेंसर को साफ करें।
  2. पंपा का उपयोग कर निलंबित लिपिड बिलेयर के साथ आणविक बातचीत का अध्ययन
    1. वांछित अणु का समाधान तैयार करें। उदाहरण के लिए, 1% (v/v) DMSO के साथ 1× पीबीएस में 200 माइक्रोन डीईएचपी तैयार करें।
    2. ताजा 1x PBS के 300 μL के साथ एक नया परिवहन रिसीवर प्लेट तैयार करें।
    3. एक बहु लिपिड निलंबित बाइलेयर के लिए एक यूनी-लिपिड निलंबित बाइलेयर या 4.4.3 के लिए चरण 3.3 के तुरंत बाद, मल्टीस्क्रीन फिल्टर प्लेट के दाता डिब्बे से 1× पीबीएस को हटा दें और परीक्षण समाधान के 200 μL के साथ बदलें। तुरंत कदम 6.2.2 में तैयार परिवहन रिसीवर प्लेट में जलमग्न।
    4. 25 डिग्री सेल्सियस पर वांछित समय (जैसे, 2 घंटे) के लिए कोमल कमाल के साथ इनक्यूबेट।
    5. इनक्यूबेशन के बाद, दाता और स्वीकारकर्ता डिब्बों से समाधान के 150 μL एकत्र करें। इस अणु के गुणों के आधार पर एक उपयुक्त विधि का उपयोग कर दोनों नमूनों में अणु एकाग्रता को मापने।
      1. उदाहरण के लिए, उपयुक्त अवशोषण तरंगदैर्ध्य के साथ एक माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें, जैसे कि डीईएचपी के लिए 280 एनएम, और ब्याज के अणु के मानक वक्र के साथ तुलना करें।
    6. निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग कर ब्याज के अणु के स्पष्ट पारिष्ठाता (पीएप्लिकेशन)की गणना करें:
      Equation 1 (1)
      कहां Equation 2 (2)
      नोट: [परीक्षण यौगिक]स्वीकार्यकर्ता समय पर ब्याज के अणु (जैसे, DEHP) की एकाग्रता है, टी, स्वीकारकर्ता डिब्बे में; और [परीक्षण यौगिक]प्रारंभिक अणु की प्रारंभिक एकाग्रता है। एक झिल्ली क्षेत्र है, टी समय है, वीडी दाता डिब्बे की मात्रा है, और वीए स्वीकारकर्ता डिब्बे की मात्रा है ।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल समर्थित और निलंबित लिपिड बिलेयर(चित्रा 1)बनाने के तरीकों का विवरण देता है। एक समर्थित लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए पहला कदम लिपिड वेसिकल्स विकसित करना है। मिनी एक्सट्रूडर लिपिड वेसिकल्स की छोटी मात्रा (1 एमएल या उससे कम) तैयार करने की अनुमति देता है, जबकि बड़े एक्सट्रूडर एक बैच में तैयार होने वाले लिपिड वेसिकल्स के 5-50 एमएल के लिए अनुमति देता है। मिनी या बड़े एक्सट्रूडर द्वारा गठित यूनी-लिपिड वेसिकल्स के आकार वितरण को चित्र 2 एमें दिखाया गया है। चूंकि बड़ा एक्सट्रूडर पॉलीकार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से वेसिकल समाधान को पुश करने के लिए उच्च दबाव एन2 गैस का उपयोग करता है, लिपिड वेसिकल्स के परिणामस्वरूप लक्ष्य 100 एनएम हाइड्रोडायनामिक व्यास पर औसत आकार वितरण होता है। मिनी एक्सट्रूडर के परिणामस्वरूप एक समान वितरण भी होता है, हालांकि वेसिकल हाइड्रोडायनामिक व्यास पॉलीकार्बोनेट पोर आकार से थोड़ा बड़ा होता है, जो एक्सट्रूशन की इस मैनुअल विधि के लिए विशिष्ट है।

आंकड़े 2B-D आकार, पॉलीडिस्पर्सिटी, और यूनी-लिपिड अंडे पीसी वेसिकल्स और दो बहु-लिपिड वेसिकल्स संरचना की जीटा क्षमता की तुलना करते हैं। तालिका 1 प्रत्येक लिपिड वेसिकल संरचना के औसत हाइड्रोडायनामिक व्यास की तुलना करता है। पहली मल्टी-लिपिड वेसिकल (एमएल1) की संरचना अपरा-ट्रोफोब्लास्ट प्रेरित लिपिड वेसिकल्स का प्रतिनिधि है, जिसमें पीसी की 57:15:8:8:12% (w/w) की संरचना है: फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (पीई): फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (पीई): फॉस्फेटिडिलिन्स (पीएस): स्पिंगसोम (SPHline)। अंडा पीसी वेसिकल्स और ML1 वेसिकल्स का आकार वितरण अत्यधिक समान और लगभग समान होता है, जिसमें औसत पॉलीडिस्परिटी(चित्रा 2 ए,बी)में छोटे अंतर होते हैं। जैसा कि अपेक्षित था, संरचना में अंतर के कारण, अंडे पीसी यूनी-लिपिड वेसिकल्स और एमएल1 वेसिकल की जीटा क्षमता अलग -अलग पाई गई(चित्रा 2डी)। दूसरा मल्टी लिपिड वेसिकल (एमएल2) 60% अंडा पीसी और 40% 1,2-डिस्टेरोसाइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-एथिलफॉस्फोचोलिन (ईपीसी) है। ईपीसी के सकारात्मक प्रभारे ने इन वेसिकल्स(चित्रा 2 डी)के लिए सकारात्मक जीटा क्षमता का नेतृत्व किया, और अंडे पीसी या एमएल1 वेसिकल्स की तुलना में ML2 वेसिकल्स के पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स में वृद्धि भी देखी गई, जो इन वेसिकल्स की विशिष्ट संरचना का परिणाम है।

क्यूसीएम-डी का उपयोग सिलिका-लेपित सेंसर पर वेसिकल टूटना के माध्यम से समर्थित लिपिड बाइलेयर्स बनाने के लिए किया जा सकता है, और इस प्रक्रिया के दौरान एसीएफ और एडब्ल्यूडी वास्तविक समय में निगरानी की जाती है। इसके विपरीत बड़े पैमाने पर परिवर्तन से संबंधित है, और वृद्धि हुई है 1D संरचना तरलता में वृद्धि को इंगित करता है। सेंसर के लिए वेसिकल्स एसोर्ब के रूप में, 1F कम हो जाता है और ΑD बढ़ जाता है। जैसे ही वेसिकल सतह पर एक महत्वपूर्ण वेसिकल कवरेज तक पहुंचता है, वहां बीएफ और एडब्ल्यूडीका एक पठार होगा। अंत में, जैसे ही वेसिकल्स टूटना, उठी हुए वेसिकल्स से एनकैप्सुलेटेड पानी छोड़ने और कठोर बाइलेयर के गठन के कारण क्रमशः एक एसीएफ वृद्धि और ΑD कमी देखी जाती है। चित्रा 3 यूनी-लिपिड और मल्टी-लिपिड बाइलेयर संरचनाओं के लिए सतह पर वेसिकल्स एसोर्ब और टूटना के रूप में होने वाले एटीएफ और एबीडब्ल्यूडी को दिखाता है। यूनी-लिपिड अंडा पीसी सतह पर आसानी से सोजोर्ब करता है जैसा कि एएफएफ कम हो जाता है और एडब्ल्यूडी वृद्धि द्वारा दिखाया गया है। क्रिटिकल वेसिकल कवरेज 5 मिनट के भीतर पहुंच जाता है, जिसके बाद वेसिकल्स टूटना शुरू हो जाते हैं। समर्थित अंडे पीसी बाइलेयर गठन पर मनाया गया कुल मिलाकर ~ -25 हर्ट्ज है, जिसमें ~0 की डीडी है।

ML1 vesicles अंडे पीसी vesicles की तुलना में एसोर्ब के लिए अब ले और इन vesicles के विपरीत, वे अनायास टूटना नहीं है, लेकिन सतह पर स्थिर रहते हैं । इसके बजाय, एएच पेप्टाइड को एसोबेड वेसिकल्स के साथ इनक्यूबेट करने की अनुमति है, जिससे उनके टूटना पैदा होता है जब एएच पेप्टाइड को ट्राइस एनएसीएल कुल्ला के साथ हटा दिया जाता है। टूटना और बाइलेयर गठन के दौरान, अंडे पीसी वेसिकल्स के समान, एसीएफ वृद्धि और ΑD कमी देखी जाती है। इस मल्टी लिपिड बाइलेयर के एटीएफ का परिणाम लगभग -28 हर्ट्ज और लगभग 1 ×10-6का है। हालांकि अंडे पीसी लिपिड बाइलेयर के बराबर, 1F और 1D में ये मामूली अंतर संरचना में मौजूद कई लिपिड प्रकारों के कारण बाइलेयर की बढ़ी हुई तरलता का संकेत देते हैं।

बाइलेयर गठन के बाद, इन संरचनाओं का उपयोग विभिन्न यौगिकों के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। समर्थित लिपिड बिलेयर के साथ, यौगिक की शुरुआत से पहले और बाद में 1F और 1D का विश्लेषण किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, समर्थित यूनी-और मल्टी-लिपिड (एमएल1) बाइलेयर्स के साथ डीईपीएच इंटरैक्शन को चित्र 4ए,बीमें दिखाया गया है। इस मामले में, डीईपी के समान स्तर दोनों लिपिड बाइलेयर प्रकार(चित्रा 4 ए)के लिए देखे जाते हैं। हालांकि, बिलेयर्स के बीच बीडीडी में अंतर देखा गया, जिसमें ML1 बाइलेयर(चित्रा 4 बी)की तुलना में अंडे पीसी बाइलेयर के लिए एक बड़ा देखा गया। जबकि समर्थित लिपिड बाइलेयर संभावित लिपिड हटाने के साथ-साथ सोखने और ब्याज के यौगिकों के संभावित एम्बेड के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, निलंबित लिपिड बाइलेयर पंपा का उपयोग करके बाइलेयर में पारमेबिलिटी के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। डीईएचपी के मामले में, यूनी और एमएल1 बिलायर(चित्रा 4C)दोनों के लिए थोड़ा पारम देखा गया था। पीएप्लिकेशन एक विश्वविद्यालय लिपिड भर में DEHP के लिए गणना (~ ५.५ × 10-11 सेमी/s) और बहु लिपिड बाइलेयर (~ ६.५ × 10-6 सेमी/s) कम पारियता की विशेषता थी । हालांकि, अन्य यौगिकों के परिणामस्वरूप अधिक पारमशीलता हो सकती है, जिसकी इस तकनीक का उपयोग करके जांच की जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1:समर्थित लिपिड बिलेयर (ऊपर) और निलंबित लिपिड बिलायर (नीचे) बनाने की प्रक्रिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:यूनी-लिपिड और मल्टी-लिपिड वेसिकल लक्षण वर्णन। (क) एक मिनी एक्सट्रूडर और बड़े एक्सट्रूडर का उपयोग करके गठित अंडे पीसी वेसिकल्स का हाइड्रोडायनामिक व्यास वितरण। (ख) एग पीसी और दो मल्टी-लिपिड फॉर्मूलेशन, ML1 (57:15:8:8:12% (w/w) पीसी: पीई: पीई: पीएस: एसपीएच) और एमएल2 (60:40% (w/w) अंडा पीसी:आइपीसी) वाले यूनी-लिपिड वेसिकल्स का हाइड्रोडायनामिक व्यास वितरण। (ग) यूनी-लिपिड और मल्टी लिपिड वेसिकल्स के पॉलीडिस्पनेस इंडेक्स । (घ) यूनी-लिपिड और मल्टी लिपिड वेसिकल्स की जीटा क्षमता । परिणाम मानक विचलन ± मतलब के रूप में दिखाए जाते हैं। सांख्यिकीय महत्व की गणना तुकी के पोस्ट हॉक विश्लेषण (α = 0.05, के साथ विचरण (ANOVA) के एक तरफा विश्लेषण का उपयोग करके की गई थी। पी<0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:यूनी-लिपिड अंडे पीसी बाइलेयर गठन (हल्के नीले रंग में1F और हल्के लाल रंग में 1D) और एक बहु लिपिड बाइलेयर गठन (57:15:8:8:12% (w/w) पीसी: पीई: पीई: पीएस: SPH) (गहरे नीले रंग में1F और गहरे लाल रंग में डी) QCM-D का उपयोग कर समय के साथ निगरानी की । धराशायी लाइनें यूनी-लिपिड बाइलेयर फॉर्मेशन (लाइट ब्लू) और मल्टी-लिपिड बाइलेयर फॉर्मेशन (गहरे नीले) के लिए समाधान परिवर्तन का संकेत देती हैं। अंडा पीसी बाइलेयर ~ 15 मिनट से बनता है, जबकि मल्टी लिपिड बाइलेयर ~ 45 मिनट लेता है और एएच पेप्टाइड के अलावा की आवश्यकता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:समर्थित और निलंबित लिपिड बिलेयर के साथ अणु बातचीत। (क) यूनी-लिपिड और मल्टी लिपिड (57:15:8:8:12% (w/w) पीसी: पीई: पीआई: पीएस: SPH) बिलेयर्स के साथ DEHP बातचीत के कारणएक एफ । (ख)यूनी-लिपिड और मल्टी लिपिड बिलेयर्स के साथ डीईपीएचपी इंटरैक्शन केकारण । (ग) यूनी-लिपिड और मल्टी लिपिड निलंबित बिलायरों में रिस रहा डेएचपी का प्रतिशत । परिणाम मानक विचलन ± मतलब के रूप में दिखाए जाते हैं। सांख्यिकीय महत्व की गणना छात्र के टी-टेस्ट(α = 0.05, पी<0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था, *p<0.05) का उपयोग करके गणना की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

यूनी-लिपिड बनाम मल्टी लिपिड संयोजन एक्सट्रूडर हाइड्रोडायनामिक व्यास (एनएम)
यूनी लिपिड 100% अंडा पीसी छोटा 165 ± 1
यूनी लिपिड 100% अंडा पीसी विशाल 108 ± 2
मल्टी लिपिड 57:15:8:8:12% (w/w) पीसी: पीई: PI: PS: SPH विशाल 109 ± 1
मल्टी लिपिड 60:40% (w/w) अंडा पीसी: EPC विशाल 91.0 ± 0.2

तालिका 1:लिपिड वेसिकल हाइड्रोडायनामिक व्यास।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल लिपिड वेसिकल्स, समर्थित लिपिड बिलेयर, और निलंबित लिपिड बिलेयर के गठन की अनुमति देता है। यहां, इन संरचनाओं में से प्रत्येक के रूप में महत्वपूर्ण कदम प्रस्तुत किए जाते हैं। लिपिड वेसिकल्स बनाते समय, लिपिड39के संक्रमण तापमान से ऊपर निकालना महत्वपूर्ण है। संक्रमण के तापमान से नीचे होने पर, लिपिड अपने आदेशित जेल चरण39में शारीरिक रूप से मौजूद होता है। इस क्रम में हाइड्रोकार्बन लिपिड पूंछ पूरी तरह से बंद पैकिंग के लिए अनुमति दी जाती है, बाहर निकालना चुनौतीपूर्ण३९बना रहे हैं । संक्रमण के तापमान से ऊपर गर्म होने पर लिपिड अधिक अव्यवस्थित हो जाता है जिसके परिणामस्वरूप तरल क्रिस्टलीय चरण39हो जाता है। लिपिड की हाइड्रोकार्बन पूंछ इन तापमानों पर अधिक तरल पदार्थ हैं, जो सफल निष्कासन39के लिए अनुमति देती हैं। लिपिड विशेषताएं जैसे कि हेड ग्रुप कंपोजीशन, संतृप्ति और चार्ज उनके संक्रमण के तापमान को प्रभावित करेंगे। लिपिड फिल्म बनाते समय सभी क्लोरोफॉर्म को हटाना भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म रिहाइड्रेशन के बाद वेसिकल गठन और गुणों को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा।

क्यूसीएम-डी का उपयोग करके समर्थित लिपिड बाइलेयर गठन के दौरान सिलिका-लेपित क्वार्ट्ज क्रिस्टल सेंसर के लिए प्राचीन स्थिति में होना महत्वपूर्ण है। सेंसर फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन किसी भी खरोंच, मलबे, या अन्य पहनने के लिए हर बार जांच की जानी चाहिए और अगर कोई अपूर्णता पाई जाती है तो छोड़ दिया जाना चाहिए, क्योंकि सेंसर अपूर्णता वेसिकल सोखने और बाइलेयर गठन को प्रभावित कर सकती है। पीजोइलेक्ट्रिक क्वार्ट्ज सेंसर की मौलिक आवृत्ति 5 मेगाहर्ट्ज है, जिसमें एटीएफ और एजेडडी ने अजीब ओवरटोन (3, 5, 7, 9, 11 और 13) पर निगरानी रखी है। यह सुनिश्चित करना कि माप से पहले पाए गए प्रत्येक ओवरटोन के लिए मौलिक प्रतिध्वनि आवृत्तियों अपेक्षित सैद्धांतिक मूल्यों के समान हैं, एक संभावित क्रिस्टल मुद्दे की पहचान करने में मदद कर सकते हैं। प्राप्त डेटा का उपयोग करके चिपचिपा मॉडलिंग के लिए कई ओवरटोन से माप एकत्र करना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि क्यूसीएम-डी प्रवाह मॉड्यूल के माध्यम से द्रव प्रवाह के दौरान हवा को सिस्टम में पेश नहीं किया जाता है। हवा में एक हवा-तरल बदलाव होगा जो वास्तविक समय डेटा संग्रह में मनाया जाएगा और परिणामस्वरूप लिपिड बाइलेयर की अखंडता की हानि होगी। बहु-लिपिड समर्थित लिपिड बाइलेयर्स बनाने के लिए हमने वेसिकल टूटना को प्रेरित करने के लिए एएच पेप्टाइड के उपयोग को नोट किया है। लिपिड संरचना के आधार पर, अन्य तरीकों को अलग-अलग आयनिक शक्ति, तापमान और प्रवाह जैसे वेसिकल टूटना को प्रेरित करने के लिए खोजा जा सकता है। उदाहरण के लिए, बफर नमक एकाग्रता में फेरबदल का उपयोग बहु-लिपिड बिलायलर्स को प्राप्त करने के लिए किया गया है, जैसे कि उन बैक्टीरियल झिल्ली की नकल करना जिसमें संरचना में पीई और फॉस्फेटिडाइलग्लीसेरोल (पीजी) शामिल हैं। 40 निलंबित लिपिड बाइलेयर गठन के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि लिपिड चुने जाते हैं जो डोडेकेन में घुलनशील होते हैं, जैसे डीओपीसी38,39। आवेदन के आधार पर और विशेष रूप से सेल झिल्ली नकल करने वाले बाइलेयर्स के लिए, असुरक्षित आवेषण42, 43, 44पर गठित निलंबित लिपिड बाइलेयर और सेल मोनोलेयर के बीच तुलना पारगम्यता अध्ययन करने की सलाह दी जा सकतीहै।

इस प्रोटोकॉल में कई कदम हैं जिन्हें किसी विशेष एप्लिकेशन के लिए अनुकूलित या संशोधित किया जा सकता है। लिपिड और रचनाओं का उपयोग किया जाता है, लिपिड वेसिकल सस्पेंशन की एकाग्रता, तैयार वेसिकल्स की मात्रा, वेसिकल रिहाइड्रेशन बफर, एक्सट्रूडर के माध्यम से गुजरता है की संख्या, पॉलीकार्बोनेट झिल्ली पोर आकार, क्वार्ट्ज क्रिस्टल सब्सट्रेट सामग्री, क्यूटीएम-डी प्रवाह दर, आणविक बातचीत का अध्ययन किया गया, बातचीत के लिए समय की लंबाई, और तापमान सभी अनुकूलित हो सकते हैं, यह एक बहुमुखी दृष्टिकोण बना रहा है। यहां विस्तृत एक्सट्रूशन प्रक्रियाओं का उपयोग चिकित्सीय लिपोसोम बनाने के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मिनी एक्सट्रूडर और बड़े एक्सट्रूडर दोनों का उपयोग एंटीफंगल लिपोसोम बनाने के लिए किया गया है जो अल्ट्रापुरे पानी 45 में 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम140दिनों तक स्थिर रहते हैं। वेसिकल या लिपिड बाइलेयर गठन और लक्षण वर्णन के लिए अन्य तरीकों पर भी तुलना या अतिरिक्त सत्यापन के लिए विचार किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सोनीशन एक और तकनीक है जिसका उपयोग लिपिड वेसिकल्स46बनाने के लिए किया जाता है, और क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जैसी तकनीकों का उपयोगलैमेलिटी 15, 45की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी47,सतह प्लाज्मन अनुनाद48, और न्यूट्रॉन रिफ्लेक्सिटी49 का उपयोग क्यूटीएम-डी के संयोजन में समर्थित लिपिड बाइलेयर्स50का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में चर्चा की गई फिल्टर और रिसीवर वेल प्लेटों का उपयोग करने के अलावा माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों30,51 में निलंबित लिपिड बाइलेयर भी बनाए गए हैं।

जबकि यहां वर्णित विधि फेसियल लिपिड बाइलेयर्स प्रदान कर सकती है जो सेलुलर लिपिड संरचना की नकल करती है, वे केवल इन लिपिड के साथ आणविक बातचीत के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। प्रोटीन कोशिका झिल्ली के प्रमुख घटक भी हैं और सोखने, पारमेबिलिटी, और सक्रिय और निष्क्रिय परिवहन गुणों को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, प्रोटीन को शामिल करने के लिए इन मॉडल लिपिड बाइलेयर्स को आगे बढ़ाने से अतिरिक्त सेल नकल करने वाले गुण होंगे, जो इन दृष्टिकोणों से प्राप्त जानकारी को बढ़ा सकते हैं। उदाहरण के लिए, हाल ही में हुए एक अध्ययन में मेसोपोरस सिलिका सब्सट्रेट्स का उपयोग करके समर्थित लिपिड बाइलेयर्स में प्रोटीन को शामिल किया गया है, जो देशी ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन52को शामिल करने के लिए एक सिलवाया सतह पोर आकार की अनुमति देता है। जिन आवेदनों में ये बिलेयर विशेष रूप से महत्वपूर्ण होंगे , उनमें विषाक्तता परीक्षण और फार्मास्यूटिकल स्क्रीनिंग अध्ययन24,27शामिल हैं । कुल मिलाकर, इन सेल नकल करने वाले मॉडलों की बहुमुखी प्रतिभा और प्रजनन क्षमता जांच की एक श्रृंखला के लिए उनकी उपयोगिता को जोड़ती है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे हितों का कोई टकराव या प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह सामग्री एएस को दिए गए अनुदान संख्या 1942418 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित कार्य पर आधारित है, और अनुदान संख्या 1644760 के तहत सी.M.B एच को सम्मानित किया गया एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप है । किसी भी राय, निष्कर्ष, और निष्कर्ष या इस सामग्री में व्यक्त की सिफारिशों लेखकों के हैं और जरूरी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के विचारों को प्रतिबिंबित नहीं करते. लेखक लिपिड वेसिकल चरित्र चित्रण डेटा अधिग्रहण के लिए डॉ नोएल वेरा-गोंजालेज का शुक्रिया अदा करते हैं । लेखक अपने Zetasizer के उपयोग के लिए प्रोफेसर रॉबर्ट चोट (ब्राउन विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करते हैं । लेखक ब्राउन यूनिवर्सिटी मास स्पेक्ट्रोमेट्री फैसिलिटी, विशेष रूप से डॉ तुन-ली शेन को लिपिड संरचना की मात्रा के साथ सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC) Avanti Polar Lipids 850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) Avanti Polar Lipids 850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) Avanti Polar Lipids 850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) Avanti Polar Lipids 850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) Avanti Polar Lipids 890703
3 mL Luer-Loc syringes BD 309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner Duran Wheaton Kimble W224605
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Alconox Fisher Scientific 50-821-781
Ammonium formate Millipore Sigma LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire Waters  186002551
Chloroform Millipore Sigma LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK Sarstedt 67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) Millipore Sigma 36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma LSAC472301
Ethanol Pharmco 111000200
Filter supports, 10 mm Avanti Polar Lipids 610014 Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell Malvern Panalytical DTS1070
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764-4L
Kimwipes Kimberly Clark 34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) Avanti Polar Lipids 840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 840051
LiposoFast ® LF-50 Avestin, Inc.
Methanol Sigma-Aldrich 179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating block Avanti Polar Lipids 610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile Millipore Sigma MAIPS4510 for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure TechAir NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um Whatman 800309 Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um Whatman 110605 Size for large extruder
Parafilm Bemis PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x Genesee Scienfitic 25-507X Dilute to 1x
Qsoft 401 software Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL Duran Wheaton Kimble 986561
Silicon Dioxide, thin QSensors Biolin Scientific QSX 303
Sodium chloride (NaCl) Millipore Sigma LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-100
Solvent Safe pipette tips Sigma-Aldrich S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 860061
Trizma base Millipore Sigma LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid Caisson Labs TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm Whatman 230600 Size for large extruder
Zetasizer ZS90 Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software Malvern Panalytical

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बायोइंजीनियरिंग अंक 174
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Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., … More

Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., Shukla, A. Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions. J. Vis. Exp. (174), e62599, doi:10.3791/62599 (2021).

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