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Bioengineering

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62599
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Center for Biomedical Engineering, School of Engineering, Brown University

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von Zell-imitierenden Uni-Lipid- und Multi-Lipid-Vesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Diese In-vitro-Modelle können angepasst werden, um eine Vielzahl von Lipidtypen zu integrieren und können verwendet werden, um verschiedene Molekül- und Makromolekül-Interaktionen zu untersuchen.

Abstract

Modellzellmembranen sind ein nützliches Screening-Tool mit Anwendungen, die von der frühen Wirkstoffentdeckung bis hin zu Toxizitätsstudien reichen. Die Zellmembran ist eine entscheidende Schutzbarriere für alle Zelltypen, die die internen zellularen Komponenten von der extrazellulären Umgebung trennt. Diese Membranen bestehen größtenteils aus einer Lipiddoppelschicht, die äußere hydrophile Kopfgruppen und innere hydrophobe Schwanzgruppen sowie verschiedene Proteine und Cholesterin enthält. Die Zusammensetzung und Struktur der Lipide selbst spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der biologischen Funktion, einschließlich der Wechselwirkungen zwischen Zellen und der zellulären Mikroumgebung, die Arzneimittel, biologische Toxine und Umweltgifte enthalten kann. In dieser Studie werden Methoden zur Formulierung von Ein-Lipid- und Multi-Lipid-gestützten und suspendierten Zell-imitierenden Lipiddoppelschichten beschrieben. Zuvor wurden Ein-Lipid-Phosphatidylcholin (PC)-Lipiddoppelschichten sowie Multi-Lipid-Plazenta-Trophoblast-inspirierte Lipiddoppelschichten für das Verständnis molekularer Wechselwirkungen entwickelt. Hier werden Methoden zur Erreichung beider Arten von Doppelschichtmodellen vorgestellt. Für zellnachahmende Multilipid-Doppelschichten wird die gewünschte Lipidzusammensetzung zunächst durch Lipidextraktion aus Primärzellen oder Zelllinien bestimmt, gefolgt von der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS). Unter Verwendung dieser Zusammensetzung werden Lipidvesikel unter Verwendung eines Dünnschichthydratations- und Extrusionsverfahrens hergestellt und ihr hydrodynamischer Durchmesser und ihr Zetapotential charakterisiert. Gestützte und suspendierte Lipiddoppelschichten können dann unter Verwendung einer Quarzkristallmikrowage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) und auf einer porösen Membran zur Verwendung in einem parallelen künstlichen Membranpermeabilitätsassay (PAMPA) gebildet werden. Die repräsentativen Ergebnisse unterstreichen die Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit von In-vitro-Zellmembran-Lipid-Doppelschichtmodellen. Die vorgestellten Methoden können bei der schnellen, einfachen Bewertung der Interaktionsmechanismen wie Permeation, Adsorption und Einbettung verschiedener Moleküle und Makromoleküle mit einer Zellmembran helfen, beim Screening von Arzneimittelkandidaten und der Vorhersage potenzieller zellulärer Toxizität helfen.

Introduction

Die Zellmembran, die hauptsächlich aus Phospholipiden, Cholesterin und Proteinen besteht, ist ein entscheidender Bestandteil aller lebenden Zellen1. Mit einer durch Lipidamphiphilie getriebenen Organisation fungiert die Zellmembran als Schutzbarriere und reguliert, wie die Zelle mit ihrer Umgebung interagiert2. Mehrere zelluläre Prozesse sind abhängig von der Lipid- und Proteinzusammensetzung derMembran 1,2. Zum Beispiel sind Zellmembraninteraktionen wichtig für eine effektive Arzneimittelabgabe3. Pharmazeutika, Biologika, Nanomaterialien, biologische Toxine und Umweltgifte können die Integrität einer Zellmembran beeinflussen und dadurch die Zellfunktion beeinträchtigen4. Die Konstruktion von In-vitro-Zell-imitierenden Membranmodellen, die auf der Lipidzusammensetzung von Zellmembranen basieren, hat das Potenzial, einfache Werkzeuge bereitzustellen, um die Untersuchung der möglichen Auswirkungen dieser Materialien auf Zellen erheblich zu verbessern.

Modell-Lipiddoppelschichten umfassen Lipidvesikel, unterstützte Lipiddoppelschichten und suspendierte Lipiddoppelschichten. Unterstützte Lipiddoppelschichten sind ein Modell der Phospholipidzellmembran, die üblicherweise in biotechnologischen Anwendungen verwendet wird, bei denen Lipidvesikel auf einem trägern Substratmaterial5,6,7,8,9 gerissenwerden. Eine gängige Technik zur Überwachung der Doppelschichtbildung ist die Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D), die die Adsorption von Vesikeln im Vergleich zu den Flüssigeneigenschaften in situuntersucht 8,10,11,12,13,14 . Zuvor wurde QCM-D verwendet, um zu zeigen, dass unter Strömungsbedingungen, sobald eine kritische Vesikelabdeckung von Phosphatidylcholin (PC) Lipidvesikeln auf der Oberfläche erreicht ist, sie spontan in starre Lipiddoppelschichten15aufbrechen. Frühere Arbeiten haben auch die unterstützte Lipiddoppelschichtbildung mit unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen16,den Einbau von Lipidproteinen17,18,19und die Verwendung von Polymerkissen20untersucht, wodurch unterstützte Lipiddoppelschichten entstehen, die verschiedene Aspekte der Zellmembranfunktion nachahmen können.

Lipiddoppelschichten wurden verwendet, um verschiedene biologische Barrieren von subzellulären bis hin zu Organebenen nachzuahmen, einschließlich Mitochondrium, roten Blutkörperchen und Leberzellmembranen, indem die Phospholipid-, Cholesterin- und Glykolipidkomponenten verändert wurden21. Diese komplexeren Multilipidvesikel können je nach Lipidzusammensetzung zusätzliche Methoden erfordern, um eine Vesikelruptur zu erreichen. Zum Beispiel haben frühere Studien ein α-helikales (AH) Peptid verwendet, das vom nichtstrukturellen Protein 5A des Hepatitis-C-Virus abgeleitet ist, um die Doppelschichtbildung durch Destabilisierung der adsorbierten Lipidvesikel zu induzieren22,23. Unter Verwendung dieses AH-Peptids wurden zuvor unterstützte Lipiddoppelschichten gebildet, die Plazentazellen nachahmen24. Das große Potenzial unterstützter Lipiddoppelschichten für biomedizinische Anwendungen wurde mit Untersuchungen gezeigt, die den molekularen und Nanopartikeltransport25,26, umwelttoxische Wechselwirkungen27, Proteinaufbau und -funktion17,18,19, Peptidanordnung und -insertion28,29, Arzneimittelscreening30und mikrofluidische Plattformen31umfassen.

Suspendierte Lipiddoppelschichten wurden für pharmazeutische Screening-Studien über einen parallelen künstlichen Membranpermeabilitätstest (PAMPA) verwendet, bei dem eine Lipiddoppelschicht über einen porösen hydrophoben Einsatz32,33,34,35suspendiert ist. PAMPA-Lipidmodelle wurden für verschiedene biologische Grenzflächen entwickelt, einschließlich der Blut-Hirn-, bukkalen, intestinalen und transdermalen Grenzflächen36. Durch die Kombination sowohl der unterstützten Lipiddoppelschicht als auch der PAMPA-Techniken können Adsorption, Permeabilität und Einbettung von Verbindungen in Lipidkomponenten eines gewünschten Gewebes oder Zelltyps gründlich untersucht werden.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Anwendung von In-vitro-Zellmembran-Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung verschiedener molekularer Wechselwirkungen. Die Herstellung von sowohl Uni-Lipid- als auch Multi-Lipid-gestützten und suspendierten Lipiddoppelschichten wird detailliert beschrieben. Um eine unterstützte Lipiddoppelschicht zu bilden, werden Lipidvesikel zunächst unter Verwendung von Dünnschichthydratations- und Extrusionsmethoden entwickelt, gefolgt von einer physikalisch-chemischen Charakterisierung. Die Bildung einer unterstützten Lipiddoppelschicht unter Verwendung von QCM-D-Überwachung und Herstellung von suspendierten Lipidmembranen für den Einsatz in PAMPA wird diskutiert. Schließlich werden Multilipidvesikel für die Entwicklung komplexerer zellimitierender Membranen untersucht. Unter Verwendung beider Arten von hergestellten Lipidmembranen zeigt dieses Protokoll, wie dieses Werkzeug zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen verwendet werden kann. Insgesamt konstruiert diese Technik zellnachahmende Lipiddoppelschichten mit hoher Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit.

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Protocol

1. Entwicklung von Uni-Lipid-Vesikeln

  1. Dünnschicht-Hydratationsmethode
    1. Herstellung und Lagerung von Lipidstocklösungen
      HINWEIS: Alle Schritte mit Chloroform müssen in einem chemischen Abzug durchgeführt werden. Chloroform sollte immer mit lösungsmittelsicheren Kohlefaserpipettenspitzen pipettiert werden. Lösungen, die Chloroform enthalten, sollten immer in Glasfläschchen gelagert werden.
      1. Bereiten Sie eine 10 mg/ml Lipidstocklösung vor, indem Sie das entsprechende Volumen Chloroform in die Durchstechflasche geben, die das Lipidpulver enthält, und gut mischen. Fügen Sie beispielsweise 20 ml Chloroform zu 200 mg L-α-Phosphatidylcholin (Ei, Huhn) (EggPC) hinzu. Die Stammlösung kann erforderlichenfalls in einer anderen Konzentration hergestellt werden.
        HINWEIS: Wenn das Pulverlipid in einer Ampulle gelagert wurde, wird nach Zugabe von Chloroform in eine Glasfläschchen mit einer mit Polytetrafluorethylen (PTFE) ausgekleideten Kappe überführt.
      2. Verschließen Sie den Durchstechflaschenverschluss mit Parafilm und lagern Sie ihn bis zu 6 Monate bei -20 °C.
    2. Bildung eines Trocken-Lipid-Films
      1. Geben Sie das entsprechende Volumen der Lipidstocklösung in eine durchsichtige Glasfläschchen, die für eine endgültige Vesikelkonzentration von 2,5 mg / ml erforderlich ist. Um beispielsweise 1 ml Ei-PC-Vesikel bei 2,5 mg/ml zu bilden, werden 250 μL Ei-PC-Brühenlösung in die Durchstechflasche pipettiert.
        HINWEIS: Das vorbereitete Volumen kann vom verwendeten Extruderverfahren abhängen (siehe Schritt 1.3). Das maximale empfohlene Volumen des Miniextruders beträgt 1 ml, während der große Extrudervolumenbereich 5-50 ml beträgt.
      2. Entfernen Sie Chloroform aus der Lipidstocklösung mit einem Strom vonN2-Gas (hochreines 5,0-Grad).
      3. Um eine vollständige Entfernung von Chloroform zu gewährleisten, schließen Sie den getrockneten Lipidfilm an das Vakuum an und lassen Sie ihn mindestens 4 h stehen.
        HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden. Wenn der Lipidfilm nicht sofort nach der Vakuumtrocknung verwendet wird, lagern Sie ihn bis zur Verwendung in einem Exsikkator. Wir haben beobachtet, dass diese Lipidfilme nach 1 Woche Lagerung unter diesen Bedingungen Vesikel ähnlicher Qualität ergeben; die Vesikelqualität nach längerer Lagerdauer sollte erforderlichenfalls weiter untersucht werden.
    3. Gefrier-Tau-Wirbel-Zyklen durchführen
      1. Herstellung einer Tris-Natriumchlorid (NaCl)-Pufferlösung, die 10 mM Tris-Base und 100 mM NaCl enthält. Rehydrieren Sie den getrockneten Lipidfilm mit dem erforderlichen Volumen des Tris NaCl-Puffers, um eine endgültige Vesikelkonzentration von 2,5 mg/ml und einen Wirbel für ca. 15-30 s zu erhalten.
      2. Die Vesikelsuspension in einen Behälter mit Trockeneis geben, bis sie eingefroren ist, ca. 30 min. Nachdem die Probe vollständig eingefroren ist, tauen Sie die Suspension in einem 30-40 °C warmen Wasserbad auf. Wirbeln Sie die aufgetaute Vesikelsuspension.
        HINWEIS: FlüssigkeitN2 kann anstelle von Trockeneis verwendet werden. Die Vesikelsuspension 30 s lang in flüssigen Stickstoff überführen und dann sofort in einem 80 °C warmen Wasserbad auftauen.
      3. Wiederholen Sie Schritt 1.1.3.2 weitere 4 Mal für insgesamt 5 Gefrier-Tau-Wirbel-Zyklen.
  2. Extrusion
    HINWEIS: Nach Abschluss der Gefrier-Tau-Wirbel-Zyklen bilden sich mehrschichtige Vesikel. Die Extrusion hilft bei der Verringerung der Größe und der Entwicklung großer einlamellarer Vesikel.
    1. Mini (1 ml) Extruderverfahren
      1. Reinigen Sie alle Komponenten des Extruders gründlich mit einem milden Reinigungsmittel in Reinstwasser und spülen Sie es mindestens dreimal mit Reinstwasser ab, um sicherzustellen, dass das gesamte Reinigungsmittel entfernt ist. MitN2-Gas trocknen.
      2. Montieren Sie die beiden internen Membranträger und O-Ringe (Innendurchmesser von 12,7 mm; Außendurchmesser von 15,2 mm). Positionieren Sie jede Membranstütze so, dass der O-Ring nach oben zeigt.
      3. Benetzen Sie eine Filterhalterung mit Reinstwasser vor. Legen Sie es auf die Membranträgerfläche im Inneren des O-Rings. Wiederholen Sie dies für die zweite interne Membranstütze.
      4. Positionieren Sie eine interne Membranstütze in das Außengehäuse des Extruders. Legen Sie eine 100 nm Polycarbonatmembran direkt über die Filterhalterung auf die interne Membranhalterung.
        HINWEIS: Die Polycarbonatmembranen werden getrennt zwischen blau gefärbten Papierstücken gelagert. Entfernen Sie das Trennpapier, bevor Sie es auf den Membranträger legen.
      5. Positionieren Sie den zweiten internen Membranträger in das Extruderaußengehäuse, wobei der O-Ring und die Filterträgerseite der Polycarbonatmembran zugewandt sind. Befestigen Sie das PTFE-Lager in der Haltemutter und schrauben Sie es mit dem Extruderaußengehäuse zu. Clippen Sie den Extruder in den Heizblock.
      6. Laden Sie die Lipidvesikelsuspension in eine der Spritzen und positionieren Sie die Spritze im Extruder-Wärmeblock, wobei Sie die Nadel vollständig in ein Ende des Extruders einführen. Setzen Sie die zweite, leere Spritze in die gegenüberliegende Seite ein und verriegeln Sie beide Spritzen mit den Armclips am Wärmeblock.
        HINWEIS: Legen Sie bei Bedarf den Extruder-Wärmeblock auf eine Heizplatte und stellen Sie die Temperatur auf einen Wert über der Übergangstemperatur des Lipids ein. Stecken Sie ein Thermometer in den im Wärmeblock eingebauten Halter für genaue Temperaturmessungen und warten Sie, bis die erforderliche Temperatur erreicht ist (~ 15 min). Ei-PC-Lipidvesikel benötigen während der Extrusion keine Wärme.
      7. Drücken Sie die Vesikelaufhängung langsam in die leere Spritze und dann wieder in die originale Spritze. Überwachen Sie auf Druckänderungen in der gesamten Extrusion, die auf ein Leck hinweisen. Wiederholen Sie dies 20 weitere Male für insgesamt 21 Durchgänge durch die Polycarbonatmembran. Übertragen Sie die Lipidvesikel zur Lagerung in ein sauberes Glasfläschchen.
        HINWEIS: Die Anzahl der Extrusionen kann in Abhängigkeit von der Lipidzusammensetzung optimiert werden.
      8. Wenn Wärme verwendet wurde, lassen Sie die extrudierte Vesikelsuspension Raumtemperatur erreichen. Lagern Sie die extrudierten Lipidvesikel bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung.
        HINWEIS: Die empfohlene Vesikelspeicherdauer hängt stark von der Lipidzusammensetzung ab, und die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Vesikels (z. B. hydrodynamischer Durchmesser, Zetapotential) sollten im Laufe der Zeit überwacht werden. Zum Beispiel wurden EI-PC-Vesikel mindestens zwei Wochen lang gelagert, ohne dass sich die Vesikelgröße oder die Doppelschichtbildungskapazität geändert hat.
    2. Großer (5-50 ml) Extruderprozess
      HINWEIS: Befolgen Sie die Schritte 1.2.2.1-1.2.2.5, wenn für das ausgewählte Lipid Wärme erforderlich ist. Fahren Sie mit Schritt 1.2.2.5 fort, wenn keine Wärme benötigt wird. Die Schritte 1.2.2.1-1.2.2.4 sind für egg PC nicht erforderlich.
      1. Füllen Sie einen 1-Liter-Kolben mit Umkehrosmose(RO)-Wasser.
        HINWEIS: Verwenden Sie kein Reinstwasser, um durch das 50-ml-System zu zirkulieren, da dies dazu führen kann, dass Metallionen aus dem Extruderzylinder austreten.
      2. Stellen Sie den 1-Liter-Kolben in ein Wasserbad auf eine Heizplatte und stellen Sie die Heizplatte auf eine Temperatur über der Übergangstemperatur des Lipids.
      3. Befestigen Sie den Probenzylinder mit flexiblem Schlauch über den Einlass am Probenzylinder am Kolben. Befestigen Sie einen Schlauch am Auslass des Zylinders an der Oberseite des 1-Liter-Kolbens. Sichern Sie die Schläuche sowohl am Einlass als auch am Auslass nach Bedarf. Dadurch entsteht ein unidirektionaler Fluss des Wassers durch den Probenzylinder.
      4. Schalten Sie die Pumpe ein, um die Wasserzirkulation zu starten. Wenn Wärme benötigt wird, warten Sie ca. 30-45 Minuten, bis der Probenzylinder die gewünschte Temperatur erreicht hat.
      5. Verbinden Sie die Kappe des Probenzylinders über den flexiblen Stecker, der an der Überdruckventileinheit angebracht ist, mit einem Stickstofftank.
      6. Reinigen Sie alle Teile des 50 ml Extruders mit 70% (v/v) Ethanol.
      7. Montieren Sie den Extruder, indem Sie die große Lochsiebstütze, die Sinterscheibe, die Ablassscheiben und die Polycarbonatmembran in den Raum in der unteren Auflage des Extruders legen. Verbinden Sie die oberen und unteren Stützen des Extruders mit den vier Schrauben und ziehen Sie sie fest.
      8. Befestigen Sie die Extrudereinheit am Probenzylinder, indem Sie sie an den Boden schrauben und mit einem Schraubenschlüssel festziehen, um sie zu sichern.
        HINWEIS: Wenn Wärme verwendet wird, legen Sie ein Thermometer in den Zylinder und warten Sie, bis das Wasser die gewünschte Temperatur erreicht hat, bevor Sie fortfahren. Dadurch wird sichergestellt, dass die Probentemperatur während des gesamten Extrusionsprozesses aufrechterhalten wird.
      9. Füllen Sie den Probenzylinder mit Reinstwasser. Extrudieren Sie das Wasser durch die Extrudereinheit, bevor Sie die Probe in den Probenzylinder geben. Dies geschieht, um die Membranen vorzubefeuchten, ähnlich wie beim Mini-Extruder.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kappe vollständig verschraubt und das Überdruckventil vollständig geschlossen ist, bevor Sie den Stickstoff einschalten. Für diesen Schritt ist ein minimaler Druck erforderlich (~ 5-10 psi).
      10. Die Lipidvesikelsuspension in den Probenzylinder geben und die Oberseite verschrauben. Erhöhen Sie langsam den Druck, bis die Probe mit einer Geschwindigkeit von ca. 2-3 Tropfen/s aus der Extrudereinheit in eine durchsichtige Glasflasche zu tropfen beginnt.
        HINWEIS: Erhöhen Sie den Druck bei diesem Schritt nicht schnell, da sich zu viel Druck negativ auf die Membranen auswirken und zu einer erfolglosen Extrusion führen kann.
      11. Sobald alle Proben extrudiert wurden, schalten Sie dieN2-Versorgung aus und geben Sie den Druck im Probenzylinder ab, indem Sie das Überdruckventil langsam öffnen. Gießen Sie die Lipidvesikel zurück in den Probenzylinder und wiederholen Sie Schritt 1.2.2.11, 9 weitere Male für insgesamt 10 Extrusionen.
        HINWEIS: Der erforderliche Druck für die Extrusion kann mit zunehmender Anzahl von Extrusionen abnehmen, da die Probe homogener wird und sich der Porengröße der Polycarbonatmembran nähert.
      12. Extrudierte Lipidvesikelsuspension bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung lagern.

2. Charakterisierung von Lipidvesikeln

  1. Hydrodynamische Durchmessermessung mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS)
    1. Wirbellipidvesikel und Pipette 50 μL der Lipidvesikelsuspension in eine Einwegküvette mit geringem Volumen. Abdeckung, um eine Kontamination mit Staub und Schmutz zu verhindern.
    2. Laden Sie die Vesikelsuspension in das DLS-Gerät, geben Sie die Probendetails ein und führen Sie die Messung mit der zugehörigen Software durch.
  2. Zeta Potenzial
    1. Bereiten Sie eine gefaltete kapillare Zetazelle vor, indem Sie sie mit Reinstwasser, 70% Ethanol und Reinstwasser mit Spritzen waschen, die mit den Eingängen der Zelle verbunden sind. Drücken Sie die Flüssigkeit vorsichtig 3-4 Mal durch die Zelle und entleeren Sie die Zelle vollständig, bevor Sie zur nächsten Lösung wechseln.
    2. Wirbeln Sie die Lipidvesikel und bereiten Sie eine 1:10 (v/v) Verdünnung von Lipidvesikeln in Reinstwasser vor.
    3. Laden Sie die verdünnte Lipidvesikelsuspension. Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie die Aufhängung zwischen den Spritzen hin und her drücken. Befestigen Sie die Stopfen an jedem Einlass.
      HINWEIS: Es ist wichtig, alle Blasen zu entfernen, da dies die Messung beeinflusst.
    4. Platzieren Sie die Zetazelle in der Probenkammer und stellen Sie sicher, dass die Elektroden in Kontakt sind. Schließen Sie die Oberseite der Probenkammer. Geben Sie in der zugehörigen Software die Probendetails ein und erfassen Sie die Messung.

3. Bildung einer ein-lipidgestützten Lipiddoppelschicht mit QCM-D

  1. Lösungsvorbereitungen
    1. Bereiten Sie eine 2%ige (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS)-Lösung in Reinstwasser vor. Auf einer Rührplatte rühren, bis sie vollständig aufgelöst ist. Aliquote Arbeitslösungen von mindestens 10 ml Reinstwasser, 2% SDS und Tris NaCl.
    2. Bereiten Sie eine Verdünnung der Lipidvesikel in Tris NaCl-Puffer vor. Die Konzentration der Vesikel ist abhängig von der Anwendung. Für Ei-PC wurde gezeigt, dass Konzentrationen im Bereich von 0,01-0,5 mg / ml zu einer erfolgreichen unterstützten Lipiddoppelschichtbildung führen.
  2. Reinigung von quarzbeschichteten Quarzkristallsensoren
    HINWEIS: Die Reinigung von QCM-D-Kristallen hängt vom Oberflächenmaterial des verwendeten Sensors ab. Um unterstützte Lipiddoppelschichten zu bilden, werden in diesem Protokoll silikabeschichtete Quarzkristalle verwendet, die im Folgenden gemäß der Standardarbeitsanweisung des Herstellers beschrieben werden.
    1. Setzen Sie den quarzbeschichteten Quarzkristallsensor in das Durchflussmodul ein und stellen Sie sicher, dass das "t" auf dem Kristall mit dem "t" auf dem Modul übereinstimmt. Schrauben Sie das Durchflussmodul zu.
      HINWEIS: Wenn der verwendete QCM-D es zulässt, dass mehrere Durchflussmodule gleichzeitig angeschlossen und ausgeführt werden können, wiederholen Sie die folgenden Schritte für die zusätzlichen Module nach Bedarf.
    2. Setzen Sie das Durchflussmodul mit den Elektroden des Durchflussmoduls in die Basis des Geräts ein, die mit dem Analysatorsystem verbunden sind. Verriegeln Sie das Modul.
    3. Schließen Sie den Einlass- und Auslassschlauch an das Durchflussmodul und die Pumpe an. Legen Sie den Schlauch in die Haltevorrichtungen und schließen Sie den Deckel des Analysatorsystems. Stellen Sie einen Abfallbehälter an den Auslass der Pumpe, um verbrauchte Lösungen zu sammeln.
    4. Um die Reinigung durchzuführen, schalten Sie zuerst die Pumpe ein. Stellen Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf 400 μL/min ein. Setzen Sie den Einlassschlauch in Reinstwasser ein und strömen Sie 5-10 ml durch das Modul.
    5. Schalten Sie den Einlassschlauch in 2% SDS und fließen Sie 5-10 ml durch das Modul. Schalten Sie den Einlassschlauch wieder in Reinstwasser um und strömen Sie 10-20 ml durch das Modul. Entfernen Sie den Einlassschlauch aus der Lösung und strömen Sie Luft durch den Schlauch, bis die gesamte Flüssigkeit ausgestoßen ist.
      HINWEIS: Das oben genannte Reinigungsprotokoll wird täglich vor und nach jeder Messung angewendet. Eine gründliche Reinigung kann nach Bedarf durchgeführt werden. Kurz gesagt, um eine gründliche Reinigung durchzuführen, zerlegen Sie die Durchflussmodule. Alle Komponenten mit Ausnahme der Elektrodenseite des Durchflussmoduls sollten in 2% (w/v) SDS eingetaucht und beschallt werden, gefolgt von einer gründlichen Spülung mit Reinstwasser und einer Trocknung mit einem Strom von N2-Gas. Die Komponente des Durchflussmoduls, die die Elektrodenstifte enthält, sollte niemals mit Flüssigkeit in Berührung kommen.
    6. Entfernen Sie den Sensor aus dem Durchflussmodul und spülen Sie den Sensor mit Reinstwasser ab. Trocknen Sie den Sensor mit einem N2-Gasstrom. Trocknen Sie das Strömungsmodul mit einem N2-Gasstrom. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode immer frei von Flüssigkeiten bleibt.
    7. Setzen Sie den quarzbeschichteten Quarzkristallsensor in einen chemischen Abzug in ein ultraviolettes (UV)/Ozon-Reinigungsinstrument ein. Schalten Sie das Gerät ein und lassen Sie die Behandlung mindestens 2 Minuten einwirken. Entfernen Sie die Sensoren vorsichtig und kehren Sie in das Durchflussmodul zurück.
  3. Bildung einer Tris NaCl Baseline
    1. Schalten Sie das Analysegerät ein, um eine Verbindung zur zugehörigen Software herzustellen, und stellen Sie die Temperatur auf den gewünschten Wert für die unterstützte Lipiddoppelschicht ein. Lassen Sie die Temperatur auf den gewünschten Eingang stabilisieren.
      HINWEIS: Wenn die eingestellte Temperatur über Raumtemperatur liegt, sollten alle Lösungen mit einem Wärmeblock auf die gleiche Temperatur erhitzt werden.
    2. Konfigurieren Sie die Messung und suchen Sie alle Sensorresonanzfrequenzen und -dissipationen für die Obertöne 3, 5, 7, 9, 11 und 13, bevor Sie mit der Messung beginnen.
      HINWEIS: Der1. Oberton kann außer Acht gelassen werden, da diese Harmonische überempfindlich ist und verrauschte Daten erzeugt.
    3. Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie den Durchfluss auf 175 μL/min oder den gewünschten experimentellen Durchfluss ein.
    4. Wischen Sie den Einlassschlauch vor dem Einsetzen in Tris NaCl mit Ethanol ab. Starten Sie die Messung und beginnen Sie mit dem Fließen von Tris NaCl.
      HINWEIS: Die Daten werden in Echtzeit gesammelt und überwacht. Der Wechsel von Luft zu Flüssigkeit im Strömungsmodul wird in der Datenerfassungssoftware durch eine schnelle Verluständerung (ΔD) Zunahme und Frequenzänderung (ΔF) beobachtet.
    5. Lassen Sie Tris NaCl 5-10 min durch das Modul fließen, um sicherzustellen, dass die Basiswerte ΔF und ΔD in Flüssigkeit stabil bleiben.
  4. Bildung einer ein-lipidgestützten Lipiddoppelschicht
    1. Stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie den Einlassschlauch aus der Tris NaCl-Lösung und führen Sie ihn vorsichtig in die Lipidvesikellösung ein. Rückströmung für 5 s, um Luftblasen aus dem Einlassschlauch zu entfernen, und dann den Vorwärtsstrom fortsetzen. Starten Sie die Messung in der Software neu, um die Baseline auf Null zu setzen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, Luftblasen im Schlauch zu vermeiden, die durch das Modul strömen und die Doppelschichtbildung und die Datenaufzeichnung stören können.
    2. Fließen Lipidvesikel bis zur Doppelschichtbildung in Echtzeit in der Datenerfassungssoftware (mindestens 8 min für Ei-PC-Vesikel).
    3. Wiederholen Sie Schritt 3.4.1, um den Einlassschlauch von Lipidvesikeln wieder in Tris NaCl-Puffer zu ändern.
      HINWEIS: Wenn die gewünschte Anwendung darin besteht, molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen, fahren Sie direkt mit Schritt 6.1 fort, ohne den Lösungsfluss oder die Datenerfassung zu stoppen. Wenn die Doppelschichtbildung der Endpunkt ist, fahren Sie mit Schritt 3.4.4 fort.
    4. Stoppen Sie in der Software die Messung und speichern Sie die Datei. Stoppen Sie die Pumpe.
    5. Reinigen Sie das Durchflussmodul und den quarzbeschichteten Quarzkristallsensor gemäß den Protokollschritten 3.2.4 und 3.2.5.

4. Bildung einer suspendierten Lipiddoppelschicht

HINWEIS: Das Protokoll zur Bildung einer suspendierten Lipiddoppelschicht basiert auf dem parallelen PAMPA-Protokoll (Artificial Membrane Permeability Assay), das vom Filterplattenhersteller37zur Verfügung gestellt wird.

  1. Solubilisieren Sie das gewünschte Lipid in Dodecan bei 20 mg/ml (z. B.1,2-Dioleoyl- sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)).
  2. 5 μL der Lipidlösung in das Donorkompartiment geben, bei dem es sich um eine poröse Polyvinylidendifluorid (PVDF) 96-Well-Multiscreen-Filterplatte (0,45 μm Porengröße) handelt.
  3. Tauchen Sie die Filterplatte sofort in das Akzeptorfach ein, bei dem es sich um eine Transportbehälterplatte handelt, die 300 μL 1× phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält. 200 μL 1× PBS in das Spenderkompartiment geben.
    HINWEIS: Kontrollen von Filtern mit nur Lipid und unbehandelten Filtern, die 1× PBS ausgesetzt sind, können eingeschlossen sein.
  4. Fahren Sie direkt mit Abschnitt 6.2 fort, um die molekularen Wechselwirkungen mit der suspendierten Lipiddoppelschicht zu untersuchen. Es wird empfohlen, die Studie innerhalb von 16 Stunden nach Dem Bilden der suspendierten Doppelschicht abzuschließen.

5. Entwicklung von Multilipidzellen, die Vesikel und Doppelschichten nachahmen

  1. Lipidextraktion aus Säugetierzellen
    ANMERKUNG: Die Lipidextraktion folgt dem Bligh-Dyer-Ansatz38.
    1. Kulturieren Sie die gewünschte Zelllinie nach Bedarf. Nach Erreichen einer Konfluenz von 70-80% (T75-Kolben) werden die Zellen mit Trypsin-Ethylendiamintretaessigsäure bei 37 °C für 5 min abgetrennt.
    2. Zentrifugieren Sie Zellen bei 200 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 1 ml Reinstwasser.
    3. 3,75 ml eines 1:2 (v/v) Gemisches aus Chloroform:methanol in die Zellsuspension gegeben und 15 min lang gewirbelt. Dann 1,25 ml Chloroform und Wirbel für 1 min hinzufügen. Zum Schluss 1,25 ml Wasser und Wirbel für 1 min hinzufügen.
    4. Zentrifugenzellmischung bei 1000 x g für 10 min. Sammeln Sie die unterste Flüssigkeitsschicht, die Lipide in der organischen Phase enthält. Trocken unter einem Strom von N2-Gas.
    5. Quantifizieren Sie den Lipidgehalt mit Hilfe der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) unter Verwendung einer C18-Umkehrphase, 3,5 μm × 50-mm-Säule.
    6. Bereiten Sie für die mobile Phase zwei Lösungen vor, die erste mit 60:40 (v/v) Acetonitril:Wasser und die zweite mit 90:10 (v/v) Isopropanol:Acetonitril. Ammoniumformiat sollte beiden Lösungen in einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt werden. Über 60 Min wird der mobile Phasengradient von 35 % (v/v) der zweiten Lösung auf 95 % (v/v) erhöht.
    7. Nachweis des Abwassers im negativen Ionisationsmodus mit aufeinanderfolgenden Full-Scan-MS und Tandem-MS/MS. Identifizieren Sie die einzelnen Phospholipidspezies anhand ihrer Masse-Ladungs-Verhältnisse (m/z). Analysieren Sie die Massenspektren aus der kollisionsinduzierten Dissoziationsfragmentierung mit den LIPID MAPS-Massenspektrometrie-Analysewerkzeugen. Erhalten Sie extrahierte Ionenchromatogramme, um den Bereich unter der Kurve zu integrieren und die Häufigkeit jeder Lipidspezies zu bestimmen.
    8. Führen Sie die Schritte 5.1.5-5.1.7 für einen Lipidstandard aus, der die wichtigsten Lipidklassen enthält, um die relativen Nachweisempfindlichkeiten für jede einzelne Phospholipidklasse zu bestimmen.
  2. Entwicklung von Multilipidvesikeln
    1. Befolgen Sie die Schritte in 1.1.1, um Lipidstocklösungen für Lipide herzustellen, die jede gewünschte Doppelschichtkomponente repräsentieren, wie in Schritt 5.1 beschrieben.
    2. Geben Sie auf der Grundlage der aus Schritt 5.1 erhaltenen Lipidzusammensetzungen das entsprechende Volumen an Lipid/Chloroform-Stamm in eine durchsichtige Durchstechflasche aus Glas, die für eine endgültige Vesikelkonzentration von 2,5 mg/ml erforderlich ist. Bulk-Chloroform-Trocknungslösung unter einem Strom vonN2-Gas entfernen.
    3. Befolgen Sie die Schritte 1.1.2, 1.1.3 und 1.2, um Multilipidvesikel zu bilden. Befolgen Sie Schritt 2 für die Vesikelcharakterisierung.
  3. Bildung einer Multi-Lipid-gestützten Lipiddoppelschicht mit QCM-D
    HINWEIS: Einige Multilipidvesikel können zu einer spontanen Lipidvesikelruptur und Doppelschichtbildung führen, ähnlich wie bei den in Schritt 3 dargestellten Einlipid-PC-Vesikeln. Komplexere Multilipidvesikel können jedoch einen externen Input erfordern, um bei der Vesikelruptur zu helfen. Hier wird das AH-Peptid verwendet, um das äußere Blättchen des Vesikels zu destabilisieren, was zur Bildung von Doppelschichten führt. Andere Methoden, um Destabilisierung und Vesikelruptur zu erreichen, können in Betracht gezogen werden, wenn gewünscht.
    1. Befolgen Sie Schritt 3, um die Multilipid-unterstützte Lipiddoppelschicht unter Verwendung der in Schritt 5.2 gebildeten Multilipidvesikel zu bilden.
    2. Wenn ein spontaner Bruch der Vesikel in eine Doppelschicht nicht beobachtet wird, versuchen Sie eine Vesikeldestabilisierung mit dem AH-Peptid. Präparieren Sie das AH-Peptid (Peptidsequenz: H-Ser−Gly−Ser−Trp−Leu−Arg−Asp−Val−Trp−Asp−Trp−Ile−Cys−Thr−Val−Thr−Asp−Phe−Lys−Thr−Trp−Leu−Gln−Ser−Lys−Leu−Asp−Tyr−Lys−Asp-NH2)Lösung bei 13 μM in Tris NaCl mit 1% (v/v) Dimethylsulfoxid, DMSO.
    3. Führen Sie die Schritte 3.4.1-3.4.3 aus. Nach Schritt 3.4.3 wird der Einlassschlauch in die AH-Peptidlösung umgewandelt. Führen Sie die Lösung in das Strömungsmodul ein, bis ΔF und ΔD aus der neuen Lösungszugabe beobachtet werden. Stoppen Sie die Pumpe und lassen Sie das AH-Peptid 10 Minuten lang mit den Vesikeln inkubieren.
    4. Schalten Sie den Einlassschlauch in Tris NaCl und starten Sie den Fluss, um das AH-Peptid aus den gerissenen Vesikeln zu entfernen, was zur erfolgreichen Bildung einer Lipiddoppelschicht führt.
      HINWEIS: Wenn die gewünschte Anwendung darin besteht, molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen, fahren Sie mit Schritt 6.1 fort, ohne den Lösungsfluss oder die Datenerfassung zu stoppen.
    5. Stoppen Sie in der Software die Messung und speichern Sie die Datei. Stoppen Sie die Pumpe.
    6. Reinigen Sie das Durchflussmodul und den quarzbeschichteten Quarzkristallsensor gemäß den Protokollschritten 3.2.4-3.2.6.
  4. Suspendierte Multilipid-Doppelschichten
    1. Solubilisieren Sie die Mischung der gewünschten Lipide in Dodecan bei 20 mg / ml.
    2. Stellen Sie eine 5-μL-Lipidmischlösung unter Verwendung der gewünschten Zellimitationszusammensetzung her.
    3. Führen Sie die Schritte 4.2 und 4.3 aus.
      HINWEIS: Fahren Sie direkt mit Schritt 6.2 fort, um molekulare Wechselwirkungen mit der suspendierten Lipiddoppelschicht zu untersuchen.

6. Molekülinteraktionsstudien mit Ein-Lipid- und Multilipid-Doppelschichten

  1. Untersuchung molekularer Wechselwirkungen mit einer unterstützten Lipiddoppelschicht mittels QCM-D
    1. Bereiten Sie eine Lösung des gewünschten Moleküls vor, um die Adsorption mit einer gestützten Lipiddoppelschicht zu untersuchen. Zum Beispiel wird eine Lösung von 200 μM Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) in Tris NaCl mit 1% (v/v) DMSO hergestellt.
    2. Wenn die Moleküllösung in Tris NaCl hergestellt wird, kann sie direkt nach Schritt 3.4.3 für eine Einlipid-Doppelschicht oder 5.3.4 für eine Multilipid-Doppelschicht fließen. Wenn das Molekül in einem anderen Lösungsmittel hergestellt werden muss, setzen Sie stattdessen den Einlassschlauch für mindestens 5 min allein in das gewünschte Lösungsmittel ein (z. B. Tris NaCl mit 1% (v/v) DMSO für DEHP).
      HINWEIS: Viskositätsänderungen aufgrund des Lösungsmittels können überwacht und berücksichtigt werden, indem es vor und nach dem Einbringen des interessierenden Moleküls geflossen wird.
    3. Schalten Sie den Einlassschlauch in die Lösung, die das interessierende Molekül enthält, und fließen Sie mindestens 5 Minuten lang. Der Fluss kann auch gestoppt werden und Flüssigkeit, die das gewünschte Molekül enthält, auf Wunsch mit der Doppelschicht inkubieren.
    4. Ändern Sie den Einlassschlauch zurück zum Moleküllösungsmittel allein, wenn etwas anderes als Tris NaCl. Durchfluss für mindestens 5 min. Schalten Sie dann den Einlassschlauch in Tris NaCl um und fließen Sie für mindestens 5 Minuten.
    5. Stoppen Sie in der Software die Messung und speichern Sie die Datei. Stoppen Sie die Pumpe.
    6. Reinigen Sie das Durchflussmodul und den quarzbeschichteten Quarzkristallsensor gemäß den Protokollschritten 3.2.4-3.2.6.
  2. Untersuchung molekularer Wechselwirkungen mit suspendierten Lipiddoppelschichten mit PAMPA
    1. Bereiten Sie eine Lösung des gewünschten Moleküls vor. Bereiten Sie beispielsweise ein 200 μM DEHP in 1× PBS mit 1% (v/v) DMSO vor.
    2. Bereiten Sie eine neue Transportbehälterplatte mit 300 μL frischem 1x PBS pro Well vor.
    3. Unmittelbar nach Schritt 3.3 für eine suspendierte Einlipiddoppelschicht oder 4.4.3 für eine suspendierte Multilipiddoppelschicht wird die 1× PBS aus dem Spenderkompartiment der Multiscreen-Filterplatte entfernt und durch 200 μL der Testlösung ersetzt. Tauchen Sie sofort in die in Schritt 6.2.2 vorbereitete Transportbehälterplatte ein.
    4. Mit sanftem Schaukeln für eine gewünschte Zeit (z.B. 2 h) bei 25 °C inkubieren.
    5. Nach der Inkubation werden 150 μL der Lösung aus den Spender- und Akzeptorkompartimenten entnommen. Messen Sie die Molekülkonzentration in beiden Proben mit einer geeigneten Methode, die auf den Eigenschaften dieses Moleküls basiert.
      1. Verwenden Sie beispielsweise ein Mikroplattenspektrophotometer mit der entsprechenden Absorptionswellenlänge, z. B. 280 nm für DEHP, und vergleichen Sie es mit einer Standardkurve des interessierenden Moleküls.
    6. Berechnen Sie die scheinbare Permeabilität (Papp) des interessierenden Moleküls mit den folgenden Gleichungen:
      Equation 1 (1)
      Wobei Equation 2 (2)
      ANMERKUNG: [Testverbindung]Akzeptor ist die Konzentration des interessierenden Moleküls (z. B. DEHP) zum Zeitpunkt t im Akzeptorkompartiment; und [Testverbindung]Initial ist die Anfangskonzentration des Moleküls. A ist die Membranfläche, t ist die Zeit, VD ist das Volumen des Spenderfachs und VA ist das Volumen des Akzeptorfachs.

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Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Bildung von unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichten (Abbildung 1). Der erste Schritt zur Bildung einer unterstützten Lipiddoppelschicht ist die Entwicklung von Lipidvesikeln. Der Mini-Extruder ermöglicht die Herstellung kleiner Mengen von Lipidvesikeln (1 ml oder weniger), während der große Extruder die Herstellung von 5-50 ml Lipidvesikeln in einer Charge ermöglicht. Größenverteilungen von Einlipidvesikeln, die entweder vom Mini- oder Großextruder gebildet werden, sind in Abbildung 2A dargestellt. Da der große Extruder Hochdruck-N2-Gas verwendet, um die Vesikellösung durch die Polycarbonatmembran zu drücken, führen Lipidvesikel zu einer durchschnittlichen Größenverteilung bei einem hydrodynamischen Zieldurchmesser von 100 nm. Der Miniextruder führt auch zu einer gleichmäßigen Verteilung, obwohl der hydrodynamische Durchmesser des Vesikels etwas größer ist als die Polycarbonat-Porengröße, die für diese manuelle Extrusionsmethode typisch ist.

Abbildungen 2B-D vergleichen Größe, Polydispersität und Zetapotenzial von Einlipid-Ei-PC-Vesikeln und zwei Multilipid-Vesikel-Zusammensetzung. Tabelle 1 vergleicht den durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser jeder Lipidvesikelzusammensetzung. Die Zusammensetzung des ersten Multilipidvesikels (ML1) ist repräsentativ für Plazenta-Trophoblast-inspirierte Lipidvesikel mit einer Zusammensetzung von 57:15:8:8:12 % (w/w) PC: Phosphatidylethanolamin (PE): Phosphatidylinositol (PI): Phosphatidylserin (PS): Sphingomyelin (SPH). Die Größenverteilung der EI-PC-Vesikel und ML1-Vesikel ist sehr gleichmäßig und nahezu identisch, mit geringen Unterschieden in der durchschnittlichen Polydispersität (Abbildung 2A, B). Wie erwartet, unterschieden sich aufgrund von Unterschieden in der Zusammensetzung das Zetapotential der EI-PC-Unilipidvesikel und des ML1-Vesikels (Abbildung 2D). Das zweite Multilipidvesikel (ML2) besteht zu 60 % aus Ei-PC und zu 40 % aus 1,2%-Distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin (EPC). Die positive Ladung von EPC führte zu einem positiven Zetapotential für diese Vesikel (Abbildung 2D), und es wurde auch eine Erhöhung des Polydispersitätsindex von ML2-Vesikeln im Vergleich zu EI-PC- oder ML1-Vesikeln beobachtet, wahrscheinlich ein Ergebnis der spezifischen Zusammensetzung dieser Vesikel.

QCM-D kann verwendet werden, um unterstützte Lipiddoppelschichten durch Vesikelbruch auf einem kieselsäurebeschichteten Sensor zu bilden, und ΔF und ΔD während dieses Prozesses werden in Echtzeit überwacht. ΔF ist umgekehrt mit Massenänderungen verbunden, und erhöhtes ΔD zeigt eine Zunahme der Strukturfluidität an. Wenn Vesikel an den Sensor adsorbieren, nimmt ΔF ab und ΔD nimmt zu. Wenn das Vesikel eine kritische Vesikelabdeckung auf der Oberfläche erreicht, wird es ein Plateau von ΔF und ΔDgeben. Schließlich, wenn die Vesikel reißen, wird ein ΔF-Anstieg und eine ΔD-Abnahme beobachtet, was auf die Freisetzung von verkapseltem Wasser aus gerissenen Vesikeln bzw. die Bildung einer starren Doppelschicht zurückzuführen ist. Abbildung 3 zeigt die ΔF und ΔD, die auftreten, wenn die Vesikel adsorbieren und auf der Oberfläche für Ein-Lipid- und Multi-Lipid-Doppelschichtformationen reißen. Uni-Lipid-Ei-PC-Vesikel adsorbieren leicht an der Oberfläche, wie die ΔF-Abnahme und der ΔD-Anstieg zeigen. Die kritische Vesikelabdeckung wird innerhalb von 5 Minuten erreicht, danach beginnen die Vesikel zu reißen. Das Gesamt-ΔF, das bei der Unterstützten Ei-PC-Doppelschichtbildung beobachtet wurde, beträgt ~-25 Hz, wobei ΔD bei ~0 liegt.

ML1-Vesikel brauchen im Vergleich zu EI-PC-Vesikeln länger, um zu adsorbieren, und im Gegensatz zu diesen Vesikeln reißen sie nicht spontan, sondern bleiben an der Oberfläche stabil. Stattdessen darf ein AH-Peptid mit den adsorbierten Vesikeln inkubieren, was zu ihrem Bruch führt, wenn das AH-Peptid mit einer Tris NaCl-Spülung entfernt wird. Während der Ruptur- und Doppelschichtbildung wird der ΔF-Anstieg und die ΔD-Abnahme beobachtet, ähnlich wie bei den EI-PC-Vesikeln. Die ΔF dieser Multilipid-Doppelschicht ergibt etwa -28 Hz und ΔD von etwa 1 × 10-6. Obwohl sie mit der Ei-PC-Lipiddoppelschicht vergleichbar sind, weisen diese geringfügigen Unterschiede in ΔF und ΔD wahrscheinlich auf die erhöhte Fließfähigkeit der Doppelschicht aufgrund der mehreren lipidtypen in der Struktur hin.

Nach der Doppelschichtbildung können diese Strukturen verwendet werden, um Wechselwirkungen mit verschiedenen Verbindungen zu untersuchen. Mit unterstützten Lipiddoppelschichten können ΔF und ΔD vor und nach dem Einbringen der Verbindung analysiert werden. Als Beispiel ist die DEHP-Wechselwirkung mit unterstützten Ein- und Multilipid -Doppelschichten (ML1) in Abbildung 4A,Bdargestellt. In diesem Fall werden ähnliche Konzentrationen der DEHP-Adsorption für beide Lipiddoppelschichttypen beobachtet (Abbildung 4A). Es wurden jedoch Unterschiede in ΔD zwischen den Doppelschichten beobachtet, wobei ein größeres ΔD für die Ei-PC-Doppelschicht im Vergleich zur ML1-Doppelschicht beobachtet wurde (Abbildung 4B). Während die unterstützte Lipiddoppelschicht die Untersuchung der Adsorption und potenziellen Einbettung von Verbindungen von Interesse zusammen mit einer potenziellen Lipidentfernung ermöglicht, können suspendierte Lipiddoppelschichten Informationen über die Permeabilität über die Doppelschicht unter Verwendung einer PAMPA liefern. Im Fall von DEHP wurde sowohl für Uni- als auch für ML1-Doppelschichten eine geringe Permeation beobachtet (Abbildung 4C). PApp berechnet für DEHP über ein Uni-Lipid (~5,5 × 10-11 cm/s) und Multi-Lipid-Doppelschicht (~6,5 × 10-6 cm/s) war charakteristisch für eine geringe Permeabilität. Andere Verbindungen können jedoch zu einer größeren Permeabilität führen, die mit dieser Technik untersucht werden kann.

Figure 1
Abbildung 1: Prozess der Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten (oben) und suspendierten Lipiddoppelschichten (unten).

Figure 2
Abbildung 2: Charakterisierung von Uni-Lipid- und Multi-Lipid-Vesikeln. (A) Hydrodynamische Durchmesserverteilung von Ei-PC-Vesikeln, die mit einem Miniextruder und einem großen Extruder gebildet werden. (B) Hydrodynamische Durchmesserverteilung von Einlipidvesikeln, die Ei-PC und zwei Multilipidformulierungen enthalten, ML1 (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH) und ML2 (60:40 % (w/w) Ei PC:EPC). (C) Polydispersitätsindizes der Einlipid- und Multilipidvesikel. (D) Zetapotentiale der Einlipid- und Multilipidvesikel. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit tukeys Post-hoc-Analyse berechnet (α=0,05, p<0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Uni-Lipid-Ei-PC-Doppelschichtbildung(ΔF in Hellblau und ΔD in Hellrot) und eine Multi-Lipid-Doppelschichtbildung (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH) (ΔF in Dunkelblau und ΔD in Dunkelrot), die im Laufe der Zeit mit QCM-D überwacht wurden. Gestrichelte Linien zeigen Lösungsänderungen für die Bildung von Ein-Lipid-Doppelschichten (hellblau) und Multi-Lipid-Doppelschichten (dunkelblau) an. Die Ei-PC-Doppelschicht wird durch ~ 15 Minuten gebildet, während die Multi-Lipid-Doppelschicht ~ 45 Minuten dauert und die Zugabe des AH-Peptids erfordert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Molekülwechselwirkungen mit unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichten. (A) ΔF aufgrund der DEHP-Wechselwirkung mit Ein-Lipid- und Multilipid-Doppelschichten (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH). (B) ΔD aufgrund der DEHP-Wechselwirkung mit Ein-Lipid- und Multi-Lipid-Doppelschichten. (C) Prozentsatz des DEHP, das über die Ein-Lipid- und Multi-Lipid-Suspendierungsdoppelschichten durchdrungen ist. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Die statistische Signifikanz wurde anhand des t-Testseines Schülers berechnet (α=0,05, S<0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen, *p<0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Uni-Lipid vs. Multi-Lipid Zusammensetzung Extruder Hydrodynamischer Durchmesser (nm)
Uni-Lipid 100% Ei PC Mini 165 ± 1
Uni-Lipid 100% Ei PC Groß 108 ± 2
Multi-Lipid 57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH Groß 109 ± 1
Multi-Lipid 60:40 % (w/w) Ei PC:EPC Groß 91,0 ± 0,2

Tabelle 1: Hydrodynamische Durchmesser von Lipidvesikeln.

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Discussion

Dieses Protokoll ermöglicht die Bildung von Lipidvesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Hier werden kritische Schritte vorgestellt, um jede dieser Strukturen zu bilden. Bei der Bildung von Lipidvesikeln ist es wichtig, oberhalb der Sprungtemperatur des Lipids39zu extrudieren. Wenn unterhalb der Übergangstemperatur das Lipid physisch in seiner geordneten Gelphase39vorhanden ist. In dieser geordneten Phase sind die Kohlenwasserstoff-Lipidschwänze vollständig ausgefahren, was eine enge Packung ermöglicht, was die Extrusion zu einer Herausforderungmacht 39. Wenn das Lipid über die Übergangstemperatur erhitzt wird, wird es ungeordneter, was zu der flüssigkristallinen Phase39führt. Die Kohlenwasserstoffschwänze des Lipids sind bei diesen Temperaturen flüssiger, was eine erfolgreiche Extrusionermöglicht 39. Lipideigenschaften wie die Zusammensetzung der Kopfgruppe, Sättigung und Ladung beeinflussen ihre Übergangstemperatur. Es ist auch wichtig, alle Chloroformen bei der Bildung des Lipidfilms zu entfernen, da Restchloroform die Vesikelbildung und die Eigenschaften nach der Rehydratation negativ beeinflusst.

Während der unterstützten Lipiddoppelschichtbildung mit QCM-D ist es entscheidend, dass der quarzbeschichtete Quarzkristallsensor in makellosem Zustand ist. Die Sensoren können wiederverwendet werden, müssen jedoch jedes Mal auf Kratzer, Ablagerungen oder anderen Verschleiß überprüft und verworfen werden, wenn Eine Unvollkommenheit gefunden wird, da Sensorunvollkommenheiten die Vesikeladsorption und doppelschichtige Bildung beeinträchtigen können. Die Grundfrequenz des piezoelektrischen Quarzsensors beträgt 5 MHz, wobei ΔF und ΔD bei ungeraden Obertönen (3, 5, 7, 9, 11 und 13) überwacht werden. Sicherzustellen, dass die grundlegenden Resonanzfrequenzen für jeden Vorton, der vor der Messung gefunden wurde, den erwarteten theoretischen Werten ähneln, kann helfen, ein mögliches Kristallproblem zu identifizieren. Das Sammeln von Messungen aus mehreren Obertönen ist wichtig für die viskoelastische Modellierung unter Verwendung der erhaltenen Daten. Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass während des Flüssigkeitsstroms durch die QCM-D-Strömungsmodule keine Luft in das System eingebracht wird. Luft verursacht eine Luft-Flüssigkeits-Verschiebung, die bei der Echtzeit-Datenerfassung beobachtet wird und zum Verlust der Integrität der Lipiddoppelschicht führt. Um Multi-Lipid-unterstützte Lipiddoppelschichten zu bilden, haben wir die Verwendung eines AH-Peptids festgestellt, um eine Vesikelruptur zu induzieren. Abhängig von der Lipidzusammensetzung können andere Methoden untersucht werden, um einen Vesikelbruch zu induzieren, wie z.B. unterschiedliche Ionenstärke, Temperatur und Strömung. Zum Beispiel wurde die Veränderung der Puffersalzkonzentration verwendet, um Multilipid-Doppelschichten zu erreichen, wie solche, die Bakterienmembranen nachahmen, die PE und Phosphatidylglycerin (PG) in der Zusammensetzung enthalten. 40 Bei der Bildung suspendierter Lipiddoppelschichten ist es wichtig, dass Lipide ausgewählt werden, die in Dodecan löslich sind, wie DOPC38,39. Je nach Anwendung und insbesondere bei Zellmembran-imitierenden Doppelschichten kann es ratsam sein, Permeabilitätsvergleiche zwischen den suspendierten Lipiddoppelschichten und Zellmonoschichten, die auf porösenInserts 42 , 43,44gebildet werden, durchzuführen.

Es gibt viele Schritte in diesem Protokoll, die für eine bestimmte Anwendung angepasst oder geändert werden können. Die Lipide und die verwendeten Zusammensetzungen, Konzentration der Lipidvesikelsuspension, Volumen der hergestellten Vesikel, Vesikel-Rehydratationspuffer, Anzahl der Durchgänge durch den Extruder, Polycarbonatmembranporengröße, Quarzkristallsubstratmaterial, QCM-D-Flussrate, die untersuchten molekularen Wechselwirkungen, Die Dauer der Interaktion und Temperatur können alle angepasst werden, was dies zu einem vielseitigen Ansatz macht. Die hier beschriebenen Extrusionsverfahren können auch zur Bildung therapeutischer Liposomen genutzt werden. So wurden sowohl der Miniextruder als auch der Großextruder verwendet, um antimykotische Liposomen zu bilden, die bei 4 °C in Reinstwasser mindestens 140 Tage stabil bleiben45. Andere Methoden zur Bildung und Charakterisierung von Vesikel- oder Lipiddoppelschichten können ebenfalls zum Vergleich oder zur zusätzlichen Überprüfung in Betracht gezogen werden. Zum Beispiel ist die Beschallung eine andere Technik, die verwendet wird, um Lipidvesikel46zu bilden, und Techniken wie die Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie können verwendet werden, um die Lamellarität15,45zu bestätigen. Rasterkraftmikroskopie47, Oberflächenplasmonenresonanz48und Neutronenreflektivität49 können auch in Kombination mit QCM-D verwendet werden, um unterstützte Lipiddoppelschichten50zu untersuchen. Suspendierte Lipiddoppelschichten wurden auch in mikrofluidischenVorrichtungen 30,51 zusätzlich zur Verwendung der in diesem Protokoll diskutierten Filter- und Empfängerschachtplatten gebildet.

Während die hier beschriebene Methode einfache Lipiddoppelschichten liefern kann, die die zelluläre Lipidzusammensetzung nachahmen, liefern sie nur Informationen über molekulare Wechselwirkungen mit diesen Lipiden. Proteine sind auch Schlüsselkomponenten der Zellmembran und können adsorption, Permeabilität sowie aktive und passive Transporteigenschaften beeinflussen. Daher wird die Weiterentwicklung dieser Modelllipiddoppelschichten zur Integration von Proteinen zu zusätzlichen Zellnachahmungseigenschaften führen, die die aus diesen Ansätzen gewonnenen Informationen verbessern können. Zum Beispiel wurden in einer kürzlich durchgeführten Studie Proteine in unterstützte Lipiddoppelschichten integriert, indem mesoporöse Silica-Substrate verwendet wurden, die eine maßgeschneiderte Oberflächenporengröße ermöglichen, um native Transmembranproteine zu integrieren52. Zu den Anwendungen, bei denen diese Doppelschichten besonders wichtig seinwerden,gehören Toxizitätstests und pharmazeutische Screening-Studien24,27. Insgesamt trägt die Vielseitigkeit und Reproduzierbarkeit dieser Zellimitationsmodelle zu ihrem Nutzen für eine Reihe von Untersuchungen bei.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt oder konkurrierende finanzielle Interessen haben.

Acknowledgments

Dieses Material basiert auf Arbeiten, die von der National Science Foundation im Rahmen von Grant No. 1942418 an AS und einem Graduate Research Fellowship der National Science Foundation an C.M.B.H. unter Grant No. 1644760 unterstützt werden. Alle Meinungen, Ergebnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider. Die Autoren danken Dr. Noel Vera-González für die Datenerfassung zur Charakterisierung von Lipidvesikeln. Die Autoren danken Professor Robert (Brown University) für den Einsatz seines Zetasizers. Die Autoren danken der Brown University Mass Spectrometry Facility, insbesondere Dr. Tun-Li Shen für die Unterstützung bei der Quantifizierung der Lipidzusammensetzung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC) Avanti Polar Lipids 850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) Avanti Polar Lipids 850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) Avanti Polar Lipids 850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) Avanti Polar Lipids 850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) Avanti Polar Lipids 890703
3 mL Luer-Loc syringes BD 309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner Duran Wheaton Kimble W224605
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Alconox Fisher Scientific 50-821-781
Ammonium formate Millipore Sigma LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire Waters  186002551
Chloroform Millipore Sigma LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK Sarstedt 67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) Millipore Sigma 36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma LSAC472301
Ethanol Pharmco 111000200
Filter supports, 10 mm Avanti Polar Lipids 610014 Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell Malvern Panalytical DTS1070
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764-4L
Kimwipes Kimberly Clark 34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) Avanti Polar Lipids 840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 840051
LiposoFast ® LF-50 Avestin, Inc.
Methanol Sigma-Aldrich 179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating block Avanti Polar Lipids 610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile Millipore Sigma MAIPS4510 for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure TechAir NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um Whatman 800309 Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um Whatman 110605 Size for large extruder
Parafilm Bemis PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x Genesee Scienfitic 25-507X Dilute to 1x
Qsoft 401 software Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL Duran Wheaton Kimble 986561
Silicon Dioxide, thin QSensors Biolin Scientific QSX 303
Sodium chloride (NaCl) Millipore Sigma LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-100
Solvent Safe pipette tips Sigma-Aldrich S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 860061
Trizma base Millipore Sigma LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid Caisson Labs TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm Whatman 230600 Size for large extruder
Zetasizer ZS90 Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software Malvern Panalytical

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References

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Bioengineering Ausgabe 174
Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen
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Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., … More

Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., Shukla, A. Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions. J. Vis. Exp. (174), e62599, doi:10.3791/62599 (2021).

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