Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Montering av cellimitering stöds och suspenderade lipid bilayer modeller för studie av molekylära interaktioner

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62599
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Center for Biomedical Engineering, School of Engineering, Brown University

Summary

Detta protokoll beskriver bildandet av cell härma uni-lipid och multi-lipid vesicles, stöds lipid bilayers och suspenderade lipid bilayers. Dessa in vitro-modeller kan anpassas för att införliva en mängd olika lipidtyper och kan användas för att undersöka olika interaktioner mellan molekyler och makromolekyler.

Abstract

Modellcellmembran är ett användbart screeningverktyg med tillämpningar som sträcker sig från tidig läkemedelsupptäckt till toxicitetsstudier. Cellmembranet är en avgörande skyddsbarriär för alla celltyper och separerar de inre cellulära komponenterna från den extracellulära miljön. Dessa membran består till stor del av en lipidbilayer, som innehåller yttre hydrofila huvudgrupper och inre hydrofoba svansgrupper, tillsammans med olika proteiner och kolesterol. Lipidernas sammansättning och struktur spelar en avgörande roll för att reglera den biologiska funktionen, inklusive interaktioner mellan celler och cellulär mikromiljö, som kan innehålla läkemedel, biologiska toxiner och miljögifter. I denna studie beskrivs metoder för att formulera uni-lipid och multi-lipid stöds och suspenderad cell som efterliknar lipid bilayers. Tidigare utvecklades uni-lipid fosfatidylkolin (PC) lipidbilayers samt multi-lipid placental trophoblast-inspirerade lipidbilayers för användning för att förstå molekylära interaktioner. Här kommer metoder för att uppnå båda typerna av bilayermodeller att presenteras. För cell som efterliknar multi-lipid bilayers bestäms den önskade lipidkompositionen först via lipidextraktion från primära celler eller cellinjer följt av flytande kromatografi-masspektrometri (LC-MS). Med hjälp av denna komposition tillverkas lipidblåsor med hjälp av en tunnfilmshydrerings- och extruderingsmetod och deras hydrodynamiska diameter och zetapotential kännetecknas. Stödda och suspenderade lipidbilayers kan sedan bildas med hjälp av kvartskristallmikrobalans med dissipationsövervakning (QCM-D) respektive på ett poröst membran för användning i en parallell artificiell membranpermeabilitetsanalys (PAMPA). De representativa resultaten belyser reproducerbarheten och mångsidigheten hos in vitro-cellmembranfettbiayermodeller. De metoder som presenteras kan bidra till snabb, lätt bedömning av interaktionsmekanismer, såsom permeation, adsorption och inbäddning, av olika molekyler och makromolekyler med ett cellmembran, vilket hjälper till att screening av läkemedelskandidater och förutsägelse av potentiell cellulär toxicitet.

Introduction

Cellmembranet, som huvudsakligen består av fosfolipider, kolesterol och proteiner, är en avgörande komponent i alla levande celler1. Med organisation driven av lipidamfifilicitet fungerar cellmembranet som en skyddande barriär och reglerar hur cellen interagerar med sin omgivande miljö2. Flera cellulära processer är beroende av lipid- och proteinsammansättningen i membranet1,2. Till exempel är cellmembraninteraktioner viktiga för effektiv läkemedelsleverans3. Läkemedel, biologiska läkemedel, nanomaterial, biologiska toxiner och miljögifter kan påverka integriteten hos ett cellmembran och därmed påverka cellulär funktion4. Konstruktionen av in vitro-cellimitionsmodeller baserade på cellmembranens lipidsammansättning har potential att tillhandahålla enkla verktyg för att kraftigt förbättra studien av dessa materials potentiella inverkan på celler.

Modell lipidbilayers inkluderar lipidblåsor, stöds lipidbilayers och suspenderade lipidbilayers. Lipidbilayers som stöds är en modell av fosfolipidcellmembranet som vanligtvis används i biotekniktillämpningar där lipidblåsor bryts på ett substratmaterial som stöds5,6,7,8,9. En vanlig teknik som används för att övervaka bilayerbildning är kvartskristallmikrobalans med dissipationsövervakning (QCM-D), som undersöker adsorptionen av blåsor i jämförelse med bulkvätskans egenskaper in situ8,10,11,12,13,14 . Tidigare har QCM-D använts för att visa att under flödesförhållanden, när en kritisk vesikeltäckning av fosfatidylkolin (PC) lipidblåsor uppnås på ytan, brister de spontant i styv lipidbilayers15. Tidigare arbete har också undersökt stödd lipidbilayerbildning med varierande lipidkompositioner16, införlivande av lipidproteiner17,18,19, och användning av polymerkuddar20, vilket ger stödda lipidbilayers som kan efterlikna olika aspekter av cellmembranfunktionen.

Lipidbilayers har använts för att efterlikna olika biologiska barriärer från subcellulära till organnivåer inklusive mitokondri, röda blodkroppar och levercellmembran genom att ändra fosfolipid-, kolesterol- och glykolipidkomponenterna21. Dessa mer komplexa multi-lipid blåsor kan kräva ytterligare metoder för att uppnå vesikel bristning, beroende på lipid sammansättning. Till exempel har tidigare studier använt en α-spiralformad (AH) peptid som härrör från hepatit C-virusets icke-strukturella protein 5A för att inducera bilayerbildning genom att destabilisera adsorberade lipidblåsor22,23. Med hjälp av denna AH-peptid har stödda lipidbilayers som efterliknar placentaceller tidigare bildats24. Den stora potentialen hos lipidbilayers som stöds för biomedicinska tillämpningar har visats med undersökningar som spänner över molekylär- och nanopartikeltransport25,26,interaktioner med miljögifter27,proteinmontering och funktion17,18,19, peptidarrangemang och införande28,29,läkemedelsscreening30och mikrofluidiska plattformar31.

Suspenderade lipidbilayers har använts för läkemedelsscreeningsstudier via en parallell artificiell membranpermeabilitetsanalys (PAMPA) där en lipidbilayer suspenderas över ett poröst hydrofobiskt skär32,33,34,35. PAMPA lipidmodeller har utvecklats för olika biologiska gränssnitt inklusive blod- hjärn-, buccal-, tarm- och depotplåster36. Genom att kombinera både den stödda lipidbilayer och PAMPA tekniker, adsorption, permeabilitet, och inbäddning av föreningar inom lipidkomponenter av en önskad vävnad eller celltyp kan studeras noggrant.

Detta protokoll beskriver tillverkning och tillämpning av in vitro cell membran lipid bilayer modeller för att undersöka flera molekylära interaktioner. Beredning av både uni-lipid och multi-lipid stöds och suspenderade lipidbilayers är detaljerad. För att bilda en stödd lipidbilayer utvecklas lipidblåsor först med tunnfilmshydrering och extruderingsmetoder följt av fysikalisk-kemiska karakterisering. Bildandet av en lipidbilayer som stöds med QCM-D övervakning och tillverkning av suspenderade lipidmembran för användning i PAMPA diskuteras. Slutligen undersöks multi-lipid vesiklar för utveckling av mer komplexa cell härma membran. Med hjälp av båda typerna av tillverkade lipidmembran visar detta protokoll hur detta verktyg kan användas för att studera molekylära interaktioner. Sammantaget konstruerar denna teknik cell som efterliknar lipidbilayers med hög reproducerbarhet och mångsidighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utveckla uni-lipid blåsor

  1. Tunnfilmshydreringsmetod
    1. Beredning och lagring av lipidlagerlösningar
      OBS: Alla steg med kloroform måste utföras i en kemisk rökhuv. Kloroform ska alltid pipetteras med lösningsmedelssäkra rörettspetsar för kolfiber. Lösningar som innehåller kloroform bör alltid förvaras i glasflaskor.
      1. Förbered en 10 mg/ml lipidbuljonglösning genom att tillsätta lämplig volym kloroform i injektionsflaskan som innehåller lipidpulvret och blanda väl. Tillsätt till exempel 20 ml kloroform till 200 mg L-α-fosfatidylkolin (ägg, kyckling) (eggPC). Stamlösningen kan vid behov göras i en annan koncentration.
        OBS: Om pulverfetten förvarades i en ampull, efter tillsats av kloroformöverföring till en glasflaska med ett polytetrafluoretylen (PTFE) fodrat lock.
      2. Försegla injektionsflaskans lock med Parafilm och förvara vid -20 °C i upp till 6 månader.
    2. Bildande av en torr lipidfilm
      1. Tillsätt lämplig volym lipidbuljonglösning i en ren glasflaska som behövs för en slutlig blåsbandskoncentration på 2,5 mg/ml. Till exempel, för att bilda 1 ml ägg PC vesiklar vid 2,5 mg/ml, pipetter 250 μL ägg PC lagerlösning i injektionsflaskan.
        OBS: Den beredda volymen kan bero på vilken extruderprocess som används (se steg 1.3). Den maximala rekommenderade volymen för mini extruder är 1 ml medan det stora extrudervolymområdet är 5-50 ml.
      2. Ta bort kloroform från lipidbuljonglösning med en ström av N2-gas (ultrapure 5.0 Grade).
      3. För att säkerställa fullständig borttagning av kloroform, anslut den torkade lipidfilmen till vakuum och lämna i minst 4 timmar.
        OBS: Processen kan stoppas här. Om lipidfilmen inte kommer att användas omedelbart efter vakuumtorkning, förvara den i en desiccator tills den används. Vi har observerat att dessa lipidfilmer ger liknande kvalitet blåsor efter 1 veckas lagring vid dessa förhållanden; Blåsiclekvaliteten efter längre lagringstid bör vid behov undersökas ytterligare.
    3. Utföra frys-tina-virvelcykler
      1. Förbered en Tris natriumklorid (NaCl) buffertlösning som innehåller 10 mM Tris-basen och 100 mM NaCl. Rehydrera den torkade lipidfilmen med den erforderliga volymen Tris NaCl-buffert för att ge en slutlig blåsor koncentration på 2,5 mg/ml och virvel i cirka 15-30 s.
      2. Överför blåsbandsupphängningen till en behållare med torr is tills den är frusen, ca 30 min. När provet är helt fruset tinar du upp suspensionen i ett vattenbad på 30-40 °C. Virvel den tinade vesikel suspensionen.
        OBS: Vätska N2 kan användas i stället för torris. Överför blåsans suspension till flytande kväve i 30 s och tina sedan omedelbart i ett 80 °C vattenbad.
      3. Upprepa steg 1.1.3.2 ytterligare 4 gånger, i totalt 5 frys-tina-virvelcykler.
  2. Extrudering
    OBS: När frys-tina-virvelcyklerna är klara bildas multilamellblåsor. Extrudering hjälper till att minska storleken och utveckla stora unilameller vesiklar.
    1. Mini (1 mL) extruderprocess
      1. Rengör alla delar av extrudern noggrant med ett milt rengöringsmedel i ultrapurvatten och skölj minst tre gånger med ultrapurvatten så att allt tvättmedel avlägsnas. Torka med N2-gas.
      2. Montera de två inre membranstöden och O-ringarna (innerdiametern 12,7 mm; ytterdiametern 15,2 mm). Placera varje membranstöd så att O-ringen är vänd uppåt.
      3. Förpa ett filterstöd med ultrapurvatten. Placera den på membranstödytan inuti O-ringen. Upprepa för det andra inre membranstödet.
      4. Placera ett internt membranstöd i extruderns yttre hölje. Placera ett 100 nm polykarbonatmembran på det inre membranstödet, direkt över filterstödet.
        OBS: Polykarbonatmembranen lagras separat mellan bitar av blått färgat papper. Ta bort separatpapperet innan du sätter i membranstödet.
      5. Placera det andra inre membranstödet i extruderns yttre hölje med O-ringen och filterstödsidan vänd mot polykarbonatmembranet. Fäst PTFE-lagret i fästmuttern och skruva fast med extruderns yttre hölje. Fäst extrudern i värmeblocket.
      6. Ladda lipidblåsanhängningen i en av sprutorna och placera sprutan i extrudervärmeblocket och för in nålen helt i ena änden av extrudern. Sätt in den andra, tomma sprutan i motsatt sida och lås in båda sprutorna med hjälp av armklämmorna på värmeblocket.
        OBS: Placera extrudervärmeblocket på en kokplatta om det behövs och ställ in temperaturen på ett värde över lipidens övergångstemperatur. Sätt in en termometer i hållaren inbyggd i värmeblocket för exakta temperaturavläsningar och vänta tills önskad temperatur har uppnåtts (~15 min). Ägg PC lipidblåsor kräver inte värme under extrudering.
      7. Tryck långsamt vesikelsuspensionen i den tomma sprutan och sedan tillbaka in i den ursprungliga sprutan. Övervaka för tryckförändringar under hela extruderingen som indikerar en läcka. Upprepa ytterligare 20 gånger i totalt 21 passerar genom polykarbonatmembranet. Överför lipidblåsorna till en ren glasflaska för förvaring.
        OBS: Antalet profiler kan optimeras beroende på lipidsammansättningen.
      8. Om värme användes, låt extruderad vesikel suspension nå rumstemperatur. Förvara de extruderade lipidblåsorna vid 4 °C tills vidare användning.
        OBS: Den rekommenderade lagringstiden för vesikel är starkt beroende av lipidsammansättningen, och de blåsiga fysikalisk-kemiska egenskaperna (t.ex. hydrodynamisk diameter, zetapotential) bör övervakas över tid. Till exempel har ägg PC-blåsor lagrats i minst två veckor utan förändring i blåsstorlek eller bilayerbildningskapacitet.
    2. Stor (5-50 ml) extruderprocess
      OBS: Följ steg 1.2.2.1-1.2.2.5 om värme krävs för vald lipid. Hoppa till steg 1.2.2.5 om värme inte behövs. Steg 1.2.2.1-1.2.2.4 krävs inte för äggdator.
      1. Fyll en 1 L-kolv med omvänd osmos (RO) vatten.
        OBS: Använd inte ultrapurvatten för att cirkulera genom 50 ml-systemet eftersom det kan leda till att metalljoner läcker ut från extrudercylindern.
      2. Placera 1 L-kolven i ett vattenbad på en kokplatta och ställ in värmeplattan på en temperatur över lipidens övergångstemperatur.
      3. Fäst provcylindern på kolven med flexibla slangar via inloppet på provcylindern. Fäst slangen på cylinderns utlopp på toppen av 1 L-kolven. Säkra slangar vid både inlopp och utlopp efter behov. Detta kommer att skapa ett enkelriktat flöde av vattnet genom provcylindern.
      4. Slå på pumpen för att starta vattencirkulationen. Om värme behövs, låt i cirka 30-45 minuter för provcylinder att nå önskad temperatur.
      5. Anslut provcylinderns lock till en kvävetank via den flexibla kontakten som är fäst vid tryckavlastningsventilenheten.
      6. Rengör alla delar av extrudern på 50 ml med 70% (v/v) etanol.
      7. Montera extrudern genom att placera stöd för storhålsskärmen, sintrerad skiva, dräneringsskivor och polykarbonatmembran i utrymmet i extruderns nedre stöd. Anslut extruderns övre och nedre stöd med de fyra skruvarna och dra åt.
      8. Fäst extruderenheten på provcylindern genom att skruva fast botten och dra åt med en skiftnyckel för att säkra.
        OBS: Om värme används, placera en termometer i cylindern och vänta tills vattnet har nått önskad temperatur innan du fortsätter. Detta säkerställer att provtemperaturen bibehålls under hela extruderingsprocessen.
      9. Fyll provcylindern med ultrapurvatten. Extrudera vattnet genom extruderenheten innan provet tillsätts i provcylindern. Detta görs för att fördränna membranen, liknande mini extrudern.
        OBS: Se till att locket är helt fastskruvat och att tryckavlastningsventilen är helt stängd innan du slår på kvävet. Minimalt tryck krävs för detta steg (~5-10 psi).
      10. Tillsätt lipidblåseupphängningen i provcylindern och skruva fast toppen. Öka långsamt trycket tills provet börjar droppa från extruderenheten med en hastighet av cirka 2-3 droppar/s i en ren glasflaska.
        OBS: Öka inte trycket snabbt i detta steg, eftersom för mycket tryck kan påverka membranen negativt och leda till misslyckad extrudering.
      11. När allt prov har extruderats stänger du av N2-tillförseln och släpper ut trycket i provcylindern genom att långsamt öppna tryckavlastningsventilen. Häll tillbaka lipidblåsorna i provcylindern och upprepa steg 1.2.2.11, 9 gånger till för totalt 10 profiler.
        OBS: Det erforderliga trycket för extrudering kan minska med ökande antal profiler, eftersom provet blir mer homogent och närmare i storlek till polykarbonatmembranets porstorlek.
      12. Förvara extruderad lipidblås suspension vid 4 °C tills vidare användning.

2. Karakterisera lipidblåsor

  1. Hydrodynamisk diametermätning med dynamisk ljusspridning (DLS)
    1. Virvelfettblåsor och pipett 50 μL av lipidblåssens suspension till en engångs cuvette med låg volym. Täck för att förhindra förorening med damm och skräp.
    2. Ladda vesikelupphängningen i DLS-instrumentet, mata in exempelinformationen och utför mätningen med hjälp av tillhörande programvara.
  2. Zeta potential
    1. Förbered en vikt kapillär zetacell genom att tvätta med ultrapure vatten, 70% etanol och ultrapure vatten med sprutor som ansluter till cellens ingångar. Tryck försiktigt vätskan genom cellen 3-4 gånger och töm cellen helt innan du byter till nästa lösning.
    2. Virveln av lipidblåsorna och förbered en 1:10 (v/v) utspädning av lipidblåsor i ultrapure vatten.
    3. Ladda den utspädda lipidblåsesens suspension. Ta bort luftbubblor genom att trycka suspensionen fram och tillbaka mellan sprutorna. Fäst propparna på varje inlopp.
      OBS: Det är viktigt att ta bort alla bubblor, eftersom detta kommer att påverka mätningen.
    4. Placera zetacellen i provkammaren och se till att elektroderna är i kontakt. Stäng provkammarens topp. I den tillhörande programvaran matar du in exempelinformationen och samlar in mätning.

3. Bilda en uni-lipidstödd lipidbilayer med QCM-D

  1. Lösningsberedningar
    1. Förbered en 2% (w/v) natrium dodecylsulfatlösning (SDS) i ultrapurvatten. Blanda på en omrörningsplatta tills den är helt upplöst. Aliquot arbetslösningar på minst 10 ml ultrapurvatten, 2% SDS och Tris NaCl.
    2. Förbered en utspädning av lipidblåsor i Tris NaCl-buffert. Koncentrationen av blåsor är beroende av applikationen. För ägg PC, koncentrationer i intervallet 0,01-0,5 mg/ml har visat sig resultera i framgångsrika stödd lipidbiayer bildas.
  2. Rengöring av kiseldioxidbelagda kvartskristallsensorer
    OBS: Rengöring av QCM-D-kristaller beror på ytmaterialet i sensorn som används. För att bilda lipidbilayers som stöds används kiseldioxidbelagda kvartskristaller i detta protokoll och beskrivs nedan som anpassade från tillverkarens standardrutiner.
    1. Sätt in den kiseldioxidbelagda kvartskristallsensorn i flödesmodulen och se till att "t" på kristallen överensstämmer med "t" på modulen. Skruva fast flödesmodulen.
      OBS: Om den QCM-D som används gör det möjligt att ansluta flera flödesmoduler och köras samtidigt upprepar du följande procedurer för de ytterligare modulerna efter behov.
    2. Sätt in flödesmodulen i instrumentets bas med elektroderna från flödesmodulen som ansluter till analyssystemet. Lås modulen på plats.
    3. Anslut inlopps- och utloppsslangarna till flödesmodulen och pumpen. Placera slangen i hållskydden och stäng locket på analyssystemet. Placera en avfallsbehållare vid pumpens utlopp för att samla in förbrukade lösningar.
    4. För att utföra rengöringen, slå först på pumpen. Ställ in flödeshastigheten på 400 μL/min. Sätt in inloppsslangen i ultrapure vatten och flöda 5-10 ml genom modulen.
    5. Byt inloppsslangen till 2% SDS och flöda 5-10 ml genom modulen. Byt tillbaka inloppsslangen till ultrapure vatten och flöda 10-20 ml genom modulen. Ta bort inloppsslangen från lösningen och flöda luft genom slangen tills all vätska matas ut.
      OBS: Rengöringsprotokollet ovan används dagligen före och efter varje mätning. En noggrann rengöring kan utföras efter behov. Kort, för att utföra en grundlig rengöring, demontera flödesmodulerna. Alla komponenter utom elektrodsidan av flödesmodulen ska nedsänkas i 2% (w/v) SDS och badljudljud, följt av noggrann sköljning med ultrapurvatten och torkning med en ström av N2-gas. Komponenten i flödesmodulen som innehåller elektrodstiften får aldrig vara i kontakt med vätska.
    6. Ta bort sensorn från flödesmodulen och skölj sensorn med ultrapurvatten. Torka sensorn med en N 2-gasström. Torka flödesmodulen med en N 2-gasström. Se till att elektroden alltid förblir fri från vätska.
    7. För in den kiseldioxidbelagda kvartskristallsensorn i ett ultraviolett (UV)/ozonrengöringsinstrument i en kemisk rökhuv. Slå på instrumentet och låt behandlingen i minst 2 min. Ta försiktigt bort sensorerna och gå tillbaka in i flödesmodulen.
  3. Bilda en Tris NaCl-baslinje
    1. Slå på analysinstrumentet för att ansluta till den tillhörande programvaran och ställa in temperaturen till önskat värde för den lipidbiayer som stöds. Låt temperaturen stabiliseras till önskad ingång.
      OBS: Om den inställda temperaturen är över rumstemperatur ska alla lösningar värmas upp till samma temperatur med hjälp av ett värmeblock.
    2. Konfigurera mätningen och hitta alla sensorresonansfrekvenser och avledningssignaler för övertonerna 3, 5, 7, 9, 11 och 13 innan mätningen påbörjas.
      OBS: 1st överton kan ignoreras eftersom denna överton är alltför känslig och producerar bullriga data.
    3. Slå på pumpen och ställ in flödeshastigheten på 175 μL/min eller önskat experimentellt flöde.
    4. Torka av inloppsslangen med etanol innan du förs in i Tris NaCl. Starta mätningen och börja flöda Tris NaCl.
      OBS: Data samlas in och övervakas i realtid. Förändringen från luft till vätska i flödesmodulen kommer att observeras i datainsamlingsprogramvaran genom en snabb avledningsändring(ΔD)ökning och frekvensförändring (ΔF) minskning.
    5. Låt Tris NaCl flöda genom modulen i 5-10 min, vilket säkerställer att baslinjen ΔF- och ΔD-värdena i vätska förblir stabila.
  4. Bilda en uni-lipidstödd lipidbilayer
    1. Stoppa pumpen och ta bort inloppsslangarna från Tris NaCl-lösningen och sätt försiktigt in i lipidblåslösningen. Backflöde i 5 s för att avlägsna eventuella luftbubblor från inloppsslangen och fortsätt sedan framåtflödet. Starta om mätningen i programvaran för att nollställa baslinjen.
      OBS: Var noga med att undvika luftbubblor i slangen, som kan flöda genom modulen och störa bilayerbildningen och dataregistreringen.
    2. Flöde lipidblåsor tills bilayerbildning observeras i realtid i datainsamlingsprogramvaran (minst 8 min för ägg PC-blåsor).
    3. Upprepa steg 3.4.1 för att ändra inloppsslangarna från lipidblåsor tillbaka till Tris NaCl-buffert.
      OBS: Om den önskade applikationen är att studera molekylära interaktioner, fortsätt direkt till steg 6.1 utan att stoppa lösningsflödet eller datainsamlingen. Om bilayerbildning är slutpunkten fortsätter du till steg 3,4,4.
    4. Stoppa mätningen i programvaran och spara filen. Stoppa pumpen.
    5. Rengör flödesmodulen och kiseldioxidbelagd kvartskristallsensor enligt protokollstegen 3.2.4 och 3.2.5.

4. Bilda en suspenderad lipidbilayer

OBS: Protokollet för att bilda en suspenderad lipidbilayer är anpassat från pampa-protokollet (Parallel Artificial Membrane Permeability Assay) som tillhandahålls av filterplattans tillverkare37.

  1. Solubilize önskad lipid i dodecane vid 20 mg/ml (t.ex. 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)).
  2. Tillsätt 5 μL av lipidlösningen till givarfacket, som är en porös polyvinylidendifluorid (PVDF) 96-brunnsfilterplatta med flera skärmar (0,45 μm porstorlek).
  3. Doppa omedelbart filterplattan i acceptorfacket, som är en transportmotsplatta som innehåller 300 μL 1× fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Tillsätt 200 μL av 1× PBS till givarutrymmet.
    OBS: Kontroller av filter med endast lipid och obehandlade filter som utsätts för 1× PBS kan inkluderas.
  4. Fortsätt direkt till avsnitt 6.2 för att undersöka molekylära interaktioner med den suspenderade lipidbilayer. Det rekommenderas att slutföra studien inom 16 timmar från att bilda den suspenderade bilayer.

5. Utveckla multi-lipid cell som härmar vesiklar och bilayers

  1. Lipidextraktion från däggdjursceller
    OBS: Lipidextraktion följer Bligh-Dyer-metoden38.
    1. Odla önskad cellinje efter behov. Efter uppnåendet av 70-80% sammanflöde (T75-kolv), lossa celler med trypsin-etylendiamintretaakutisk syra vid 37 °C i 5 min.
    2. Centrifugceller vid 200 × g i 5 min. Ta bort supernatanten och återanvänd cellpelleten i 1 ml ultrapurvatten.
    3. Tillsätt 3,75 ml 1:2 (v/v) blandning av kloroform: metanol till cellupphängningen och virveln i 15 minuter. Tillsätt sedan 1,25 ml kloroform och virvel i 1 min. Tillsätt slutligen 1,25 ml vatten och virvel i 1 min.
    4. Centrifugcellblandning vid 1000 x g i 10 min. Samla det nedre lagret av vätska, som innehåller lipider i den organiska fasen. Torka under en ström av N2-gas.
    5. Kvantifiera lipidhalten med hjälp av flytande kromatografi-masspektrometri (LC-MS) med hjälp av en C18 omvänd fas, 3,5 μm × 50 mm kolonn.
    6. För den mobila fasen, förbered två lösningar, den första med 60:40 (v/v) acetonitril:vatten och den andra med 90:10 (v/v) isopropanol:acetonitril. Ammoniumformat bör läggas till båda lösningarna vid en slutlig koncentration på 10 mM. Under 60 min, öka den mobila fasgradienten från 35% (v/v) av den andra lösningen till 95% (v/v).
    7. Detektera utflödet i negativt joniseringsläge, med på varandra följande fullskanning MS och tandem MS/MS. Identifiera de enskilda fosfolipidarterna från deras mass-till-laddning (m/z) förhållanden. Analysera massspektrat från kollisionsinducerad dissociation fragmentering, med hjälp av LIPID MAPS masspektrometri analys verktyg. Få extraherade jonkromatogram för att integrera området under kurvan och bestämma förekomsten av varje lipidart.
    8. Utför steg 5.1.5-5.1.7 för en lipidstandard som innehåller de viktigaste lipidklasserna för att bestämma de relativa känsliga detektionskänsliga för varje annan fosfolipidklass.
  2. Utveckla blåsor med flera lipider
    1. Följ stegen i 1.1.1 för att förbereda lipidlagerlösningar för lipider som representerar varje önskad bilayerkomponent, enligt vad som anges i steg 5.1.
    2. På grundval av de lipidsammansättningar som erhålls från steg 5.1, tillsätt lämplig volym lipid/kloroform bestånd i en ren glasflaska som behövs för en slutlig blåsorkkoncentration på 2,5 mg/ml. Ta bort bulkklorformtorkningslösning under en ström av N2-gas.
    3. Följ steg 1.1.2, 1.1.3 och 1.2 för att bilda blåsor med flera lipider. Följ steg 2 för vesikelkarakterisering.
  3. Bilda en lipidstödd lipidbilayer med QCM-D
    OBS: Vissa multi-lipid blåsor kan resultera i spontan lipid vesikel bristning och bilayer bildas liknar uni-lipid PC vesiklar presenteras i steg 3. Mer komplexa multi-lipid blåsor kan dock kräva yttre input för att hjälpa till i vesikel bristning. Här används AH-peptiden för att destabilisera den yttre broschyren av vesikeln vilket resulterar i bilayerbildning. Andra metoder för att uppnå destabilisering och vesikel sprängning kan övervägas om så önskas.
    1. Följ steg 3 för att bilda den multi-lipidstödda lipidbilayer som använder de multi-lipidblåsor som bildas i steg 5.2.
    2. Om spontan bristning av blåsorna i en bilayer inte observeras, försök vesikel destabilisering med ah-peptiden. Förbered AH-peptiden (peptidsekvens: H-Ser−Gly−Ser−Trp−Leu−Arg−Asp−Val−Trp−Asp−Trp−Ile−Cys−Thr−Val−Thr−Thr−Asp−Phe−Lys−Trp−Trp−Leu−Gln−Ser−Lys−Leu−Asp−Tyr−Lys−Asp-NH2) lösning vid 13 μM
    3. Följ steg 3.4.1-3.4.3. Efter steg 3.4.3, byt inloppsslangar till AH-peptidlösningen. Introducera lösningen i flödesmodulen tills ΔF och ΔD observeras från den nya lösningstillägget. Stoppa pumpen och låt AH-peptiden inkubera med blåsorna i 10 minuter.
    4. Byt inloppsslangen till Tris NaCl och starta flödet för att ta bort AH-peptiden från de brusten blåsorna vilket leder till framgångsrik bildning av en lipidbilayer.
      OBS: Om den önskade applikationen är att studera molekylära interaktioner, fortsätt riktningen till steg 6.1 utan att stoppa lösningsflödet eller datainsamlingen.
    5. Stoppa mätningen i programvaran och spara filen. Stoppa pumpen.
    6. Rengör flödesmodulen och kiseldioxidbelagd kvartskristallsensor enligt protokollstegen 3.2.4-3.2.6.
  4. Suspenderade flerfettsbilayers
    1. Solubilisera blandning av önskade lipider i dodecane vid 20 mg/ml.
    2. Gör upp en 5 μL lipidblandningslösning med önskad cellimitionskomposition.
    3. Följ steg 4.2 och 4.3.
      OBS: Fortsätt direkt till steg 6.2 för att undersöka molekylära interaktioner med den suspenderade lipidbiayer.

6. Molekylinteraktionsstudier med uni-lipid och multi-lipid bilayers

  1. Studera molekylära interaktioner med en lipidbiayer som stöds med QCM-D
    1. Förbered en lösning av den önskade molekylen för att undersöka adsorption med en stödd lipidbilayer. Förbered till exempel en lösning av 200 μM di(2-etylhexyl) ftalat (DEHP) i Tris NaCl med 1% (v/v) DMSO.
    2. Om molekyllösningen framställs i Tris NaCl kan den flödas direkt efter steg 3.4.3 för en uni-lipidbilayer eller 5.3.4 för en multi-lipidbilayer. Om molekylen måste beredas i ett annat lösningsmedel, för istället in inloppsslangen i önskat lösningsmedel ensam i minst 5 min (t.ex. Tris NaCl med 1% (v/v) DMSO för DEHP).
      OBS: Viskositetsförändringar på grund av lösningsmedlet kan övervakas och övervägas genom att flöda det före och efter införandet av molekylen av intresse.
    3. Byt inloppsslangen till lösningen som innehåller molekylen av intresse och flöde i minst 5 min. Flödet kan också stoppas och vätska som innehåller önskad molekyl tillåtas inkubera med bilayer om så önskas.
    4. Byt inloppsslangen tillbaka till molekylens lösningsmedel ensam om något annat än Tris NaCl. Flöde i minst 5 min. Byt sedan inloppsslangen till Tris NaCl och flöda i minst 5 min.
    5. Stoppa mätningen i programvaran och spara filen. Stoppa pumpen.
    6. Rengör flödesmodulen och kiseldioxidbelagd kvartskristallsensor enligt protokollstegen 3.2.4-3.2.6.
  2. Studera molekylära interaktioner med suspenderade lipidbilayers med PAMPA
    1. Förbered en lösning av önskad molekyl. Förbered till exempel en 200 μM DEHP i 1× PBS med 1% (v/v) DMSO.
    2. Förbered en ny transportmottagareplatta med 300 μL färsk 1x PBS per brunn.
    3. Omedelbart efter steg 3.3 för en en lipidupphängd bilayer eller 4.4.3 för en flerfettsupphängd bilayer, ta bort 1× PBS från givarutrymmet på flerskärmsfilterplattan och ersätt med 200 μL av testlösningen. Doppa omedelbart i transportmottagarens platta som beretts i steg 6.2.2.
    4. Inkubera med mild gungning under önskad tid (t.ex. 2 h) vid 25 °C.
    5. Efter inkubation samlar du in 150 μL av lösningen från givar- och acceptorfacken. Mät molekylkoncentrationen i båda proverna med hjälp av en lämplig metod baserad på egenskaperna hos denna molekyl.
      1. Använd till exempel en mikroplattaspektrofotometer med lämplig absorbansvåglängd, till exempel 280 nm för DEHP, och jämför med en standardkurva av molekylen av intresse.
    6. Beräkna den uppenbara permeabiliteten(P-appen)hos den molekyl av intresse med hjälp av följande ekvationer:
      Equation 1 (1)
      Om Equation 2 (2)
      OBS: [testförening]acceptor är koncentrationen av den molekyl av intresse (t.ex. DEHP) vid tidpunkt, t, i acceptorutrymmet. och [testförening]initial är den ursprungliga koncentrationen av molekylen. A är membranområdet, t är tiden, VD är givarfackets volym och VA är acceptorfackets volym.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll beskriver metoder för att bilda stödda och suspenderade lipidbilayers (figur 1). Det första steget för att bilda en stödd lipidbilayer är att utveckla lipidblåsor. Mini extrudern gör det möjligt att förbereda små volymer lipidblåsor (1 ml eller mindre), medan den stora extrudern gör det möjligt att förbereda 5-50 ml lipidblåsor i en sats. Storleksfördelningar av uni-lipid vesiklar som bildas av antingen mini eller stor extruder visas i figur 2A. Eftersom den stora extrudern använder högtryckS N2-gas för att driva vesikellösningen genom polykarbonatmembranet, resulterar lipidblåsor i en genomsnittlig storleksfördelning vid målet 100 nm hydrodynamisk diameter. Mini extrudern resulterar också i en enhetlig fördelning, även om vesikelkolordynamisk diameter är något större än polykarbonatporstorleken, vilket är typiskt för denna manuella extruderingsmetod.

Figurerna 2B-D jämför storlek, polydispersialitet och zeta potential av uni-lipid ägg PC blåsor och två multi-lipid blåsor komposition. I tabell 1 jämförs den genomsnittliga hydrodynamiska diametern för varje lipidblåsekomposition. Sammansättningen av den första multi-lipid vesikel (ML1) är representativ för placenta-trophoblast inspirerade lipidblåsor med en sammansättning av 57:15:8:8:12% (w/w) av PC: fosfatidylethanolamin (PE): fosfatidylinositol (PI): fosfatidylserin (PS): sphingomyelin (SPH). Storleksfördelningen av ägg PC-blåsor och ML1-blåsor är mycket likformig och nästan identisk, med små skillnader i den genomsnittliga polydispersiiteten (figur 2A,B). Som förväntat, på grund av skillnader i sammansättning, zeta potentialen hos ägg PC uni-lipid blåsor och ML1 vesicle befanns skilja sig(figur 2D). Den andra multi-lipid vesicle (ML2) är 60% ägg PC och 40% 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-etylfosfoolin (EPC). Den positiva laddningen av EPC ledde till en positiv zetapotential för dessa blåsor (figur 2D), och en ökning av polydispersiitetsindexet för ML2-blåsor observerades också jämfört med ägg PC eller ML1 vesicles, sannolikt ett resultat av den specifika sammansättningen av dessa blåsor.

QCM-D kan användas för att bilda lipidbilayers som stöds via vesikelbrott på en kiseldioxidbelagd sensor, och ΔF och ΔD under denna process övervakas i realtid. ΔF är omvänt relaterat till massförändringar, och ökad ΔD indikerar ökning av strukturen fluiditet. När blåsorber till sensorn minskar ΔF och ΔD ökar. När vesikeln når en kritisk vesikeltäckning på ytan kommer det att finnas en platå av ΔF och ΔD. Slutligen, som vesicles bristning, en ΔF ökning och ΔD minskning observeras, på grund av frisättning av inkapslat vatten från brusten blåsor och bildandet av styv bilayer, respektive. Figur 3 visar att ΔF och ΔD förekommer som blåsorb och bristning på ytan för uni-lipid och multi-lipid bilayer formationer. Uni-lipid ägg PC vesiklar lätt adsorb till ytan som visas av ΔF minskning och ΔD öka. Kritisk vesikeltäckning uppnås inom 5 minuter, varefter blåsorna börjar brista. Den totala ΔF observeras vid stödda ägg PC bilayer bildas är ~-25 Hz, med ΔD på ~0.

ML1-blåsor tar längre tid att adsorb jämfört med ägg PC-blåsor och till skillnad från dessa blåsor brister de inte spontant, men förblir stabila på ytan. Istället får en AH-peptid inkubera med adsorberade blåsor som orsakar deras bristning när AH-peptiden avlägsnas med en Tris NaCl-sköljning. Under bristning och bilayerbildning observeras ΔF-ökningen och ΔD-minskningen, liknande ägg PC-blåsorna. ΔF av denna multi-lipid bilayer resulterar i cirka -28 Hz och ΔD på cirka 1 × 10-6. Även om det är jämförbart med ägg PC lipid bilayer, dessa små skillnader i ΔF och ΔD sannolikt indikerar den ökade fluiditeten hos bilayer på grund av de flera lipidtyper som finns i strukturen.

Efter bilayerbildning kan dessa strukturer användas för att studera interaktioner med olika föreningar. Med stöd lipidbilayers, ΔF och ΔD kan analyseras före och efter introduktionen av föreningen. Som ett exempel visas DEHP-interaktion med stödda uni- och multi-lipid (ML1) bilayers i figur 4A,B. I detta fall observeras liknande nivåer av DEHP-adsorption för båda typerna av lipidbilayer (figur 4A). Skillnader i ΔD observerades dock mellan bilayers, med en större ΔD sett för ägg PC bilayer jämfört med ML1 bilayer (figur 4B). Medan den stödda lipidbilayer möjliggör studier av adsorption och potentiell inbäddning av föreningar av intresse tillsammans med potentiellt lipidborttagning, kan suspenderade lipidbilayers ge information om permeabiliteten över bilayer med hjälp av en PAMPA. När det gäller DEHP observerades liten permeation för både uni- och ML1 bilayers (figur 4C). Papp beräknat för DEHP över en uni-lipid (~ 5,5 × 10-11 cm/s) och multi-lipid bilayer (~ 6,5 × 10-6 cm/s) var karakteristisk för låg permeabilitet. Emellertid, andra föreningar kan resultera i större permeabilitet, som kan undersökas med denna teknik.

Figure 1
Figur 1: Process för att bilda lipidbilayers (överst) och suspenderade lipidbilayers (längst ner). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Uni-lipid och multi-lipid vesikel karakterisering. A) Hydrodynamisk diameterfördelning av ägg PC-blåsor som bildas med hjälp av en mini extruder och stor extruder. B) Hydrodynamisk diameterfördelning av en lipidblåsor som innehåller ägg pc och två multi-lipid formuleringar, ML1 (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH) och ML2 (60:40 % (w/w) ägg PC:EPC). C) Polydispersitetsindex för uni-lipid- och multifettblåsor. (D) Zeta potentialer av uni-lipid och multi-lipid vesicles. Resultaten visas som medelvärde ± standardavvikelse. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av envägsanalys av variansen (ANOVA) med Tukeys post hoc-analys (α=0,05, p<0,05 ansågs vara statistiskt signifikant, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Uni-lipid ägg PC bilayer formation(ΔF i ljusblått och ΔD i ljusrött) och en multi-lipid bilayer formation (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH)(ΔF i mörkblått och ΔD i mörkrött) övervakas över tiden med QCM-D. Streckade linjer indikerar lösningsförändringar för en lipidbilayerbildning (ljusblå) och flerfettsbilayerbildning (mörkblå). Ägg PC bilayer bildas av ~ 15 min, medan multi-lipid bilayer tar ~ 45 min och kräver tillsats av AH peptiden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Molekylinteraktioner med stödda och suspenderade lipidbilayers. (A) ΔF på grund av dehp-interaktion med uni-lipid och multi-lipid (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH) bilayers. B) ΔD på grund av DEHP-interaktion med uni-lipid och multi-lipid biayers. (C) Procent av DEHP genomsyras av uni-lipid och multi-lipid suspenderade bilayers. Resultaten visas som medelvärde ± standardavvikelse. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av en deltagares t-test(α=0,05, s<0,05 ansågs vara statistiskt signifikant, *p<0,05). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Uni-lipid vs. multi-lipid Sammansättning Extrudern Hydrodynamisk diameter (nm)
Uni-lipid 100% ägg PC Mini 165 ± 1
Uni-lipid 100% ägg PC Stor 108 ± 2
Multi-lipid 57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH Stor 109 ± 1
Multi-lipid 60:40 % (w/w) ägg PC:EPC Stor 91.0 ± 0.2

Tabell 1: Lipidblåse hydrodynamiska diametrar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll möjliggör bildandet av lipidblåsor, stöds lipidbilayers och suspenderade lipidbilayers. Här presenteras kritiska steg för att bilda var och en av dessa strukturer. Vid formning av lipidblåsor är det viktigt att extrudera över övergångstemperaturen för lipiden39. När den är under övergångstemperaturen är lipiden fysiskt närvarande i sin beställda gelfas39. I denna beställda fas är kolvätefettsvansarna helt utsträckta vilket möjliggör nära förpackning, vilket gör extrudering utmanande39. Vid uppvärmning över övergångstemperaturen blir lipiden mer oordnad vilket resulterar i den flytande kristallina fas39. Lipidens kolvätesvansar är mer flytande vid dessa temperaturer, vilket möjliggör framgångsrik extrudering39. Lipidegenskaper som huvudgruppssammansättning, mättnad och laddning kommer att påverka deras övergångstemperatur. Det är också viktigt att ta bort all kloroform när man bildar lipidfilmen, eftersom restklorform kommer att påverka vesikelbildning och egenskaper negativt efter rehydrering.

Under stödd lipidbilayerbildning med QCM-D är det avgörande för att den kiseldioxidbelagda kvartskristallsensorn är i orört skick. Sensorerna kan återanvändas, men måste kontrolleras varje gång för repor, skräp eller annat slitage och kasseras om någon ofullkomlighet upptäcks, eftersom sensorfel kan påverka vesikeladsorption och bilayerbildning. Den grundläggande frekvensen av den piezoelektriska kvartssensorn är 5 MHz, med ΔF och ΔD övervakade vid udda övertoner (3, 5, 7, 9, 11 och 13). Att se till att de grundläggande resonansfrekvenserna för varje överton som hittas före mätningen liknar de förväntade teoretiska värdena kan hjälpa till att identifiera ett möjligt kristallproblem. Insamling av mätningar från flera övertoner är viktigt för viskoelastisk modellering med hjälp av de data som erhållits. Det är också viktigt att se till att luft inte förs in i systemet under vätskeflödet genom QCM-D-flödesmodulerna. Luft kommer att orsaka en luft-vätskeförskjutning som kommer att observeras i datainsamlingen i realtid och resultera i förlust av lipidbilayerens integritet. För att bilda multi-lipidstödda lipidbilayers har vi noterat användningen av en AH-peptid för att inducera vesikelbrott. Beroende på lipidsammansättning kan andra metoder utforskas för att inducera blåsormbrott, såsom varierande jonisk styrka, temperatur och flöde. Till exempel, ändra buffert salt koncentrationen har använts för att uppnå multi-lipid bilayers, såsom de härma bakteriella membran som inkluderar PE och fosfatidylglycerol (PG) i kompositionen. 40 Vid suspenderad lipidbilayerbildning är det viktigt att lipider väljs som är lösliga i dodecane, såsom DOPC38,39. Beroende på applikation och särskilt för cellmembran som efterliknar bilayers, kan det vara lämpligt att utföra jämförelsegenomtränglighetsstudier mellan de suspenderade lipidbilayers och cellmonolayers som bildas på porösa skär42,43,44.

Det finns många steg i det här protokollet som kan anpassas eller ändras för ett visst program. Lipiderna och kompositionerna som används, koncentrationen av lipidblåse suspension, volym av vesiklar beredda, vesikel rehydreringsbuffert, antal passerar genom extrudern, polykarbonatmembran porstorlek, kvarts kristall substrat material, QCM-D flöde, molekylära interaktioner studerade, tid för interaktion och temperatur kan alla anpassas, vilket gör detta till ett mångsidigt tillvägagångssätt. Extruderingsprocesserna som beskrivs här kan också användas för att bilda terapeutiska liposomer. Till exempel har både mini extruder och stor extruder använts för att bilda svampdödande liposomer som förblir stabila i minst 140 dagar vid 4 °C i ultrapurvatten45. Andra metoder för blåsor eller lipidbilayerbildning och karakterisering kan också övervägas för jämförelse eller ytterligare verifiering. Ultraljudsbehandling är till exempel en annan teknik som används för att bilda lipidblåsor46, och tekniker som kryoöverföring elektronmikroskopi kan användas för att bekräfta lamellaritet15,45. Atomkraftmikroskopi47,ytplasmonresonans48och neutronreflektivitet49 kan också användas i kombination med QCM-D för att studera lipidbilayers som stöds50. Suspenderade lipidbilayers har också bildats i mikrofluidiska enheter30,51 förutom att använda filtret och mottagarens brunnsplattor som diskuteras i detta protokoll.

Medan metoden som beskrivs här kan ge fakila lipidbilayers som efterliknar cellulär lipidkomposition, ger de bara information om molekylära interaktioner med dessa lipider. Proteiner är också viktiga komponenter i cellmembranet och kan påverka adsorption, permeabilitet och aktiva och passiva transportegenskaper. Således, främja dessa modell lipid bilayers att införliva proteiner kommer att resultera i ytterligare cell härma egenskaper, som kan förbättra informationen som erhålls från dessa metoder. Till exempel införlivade en ny studie proteiner i lipidbilayers med hjälp av mesoporösa kiseldioxidsubstrat som möjliggör en skräddarsydd ytporstorlek för att införliva inhemska transmembranproteiner52. Tillämpningar där dessa bilayers kommer att vara särskilt viktiga inkluderar toxicitetstestning och läkemedelsscreeningsstudier24,27. Sammantaget bidrar mångsidigheten och reproducerbarheten hos dessa cellimiking modeller till deras nytta för en rad undersökningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt eller konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation under Grant No. 1942418 som tilldelats A.S., och en National Science Foundation Graduate Research Fellowship som tilldelas C.M.B.H., under Grant No. 1644760. Alla åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis National Science Foundations åsikter. Författarna tackar Dr. Noel Vera-González för lipid vesikel karakterisering data förvärv. Författarna tackar professor Robert Hurt (Brown University) för användningen av hans Zetasizer. Författarna tackar Brown University Mass Spectrometry Facility, i synnerhet Dr. Tun-Li Shen för hjälp med att kvantifiera lipidkomposition.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC) Avanti Polar Lipids 850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) Avanti Polar Lipids 850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) Avanti Polar Lipids 850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) Avanti Polar Lipids 850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) Avanti Polar Lipids 890703
3 mL Luer-Loc syringes BD 309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner Duran Wheaton Kimble W224605
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Alconox Fisher Scientific 50-821-781
Ammonium formate Millipore Sigma LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire Waters  186002551
Chloroform Millipore Sigma LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK Sarstedt 67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) Millipore Sigma 36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma LSAC472301
Ethanol Pharmco 111000200
Filter supports, 10 mm Avanti Polar Lipids 610014 Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell Malvern Panalytical DTS1070
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764-4L
Kimwipes Kimberly Clark 34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) Avanti Polar Lipids 840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 840051
LiposoFast ® LF-50 Avestin, Inc.
Methanol Sigma-Aldrich 179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating block Avanti Polar Lipids 610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile Millipore Sigma MAIPS4510 for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure TechAir NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um Whatman 800309 Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um Whatman 110605 Size for large extruder
Parafilm Bemis PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x Genesee Scienfitic 25-507X Dilute to 1x
Qsoft 401 software Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL Duran Wheaton Kimble 986561
Silicon Dioxide, thin QSensors Biolin Scientific QSX 303
Sodium chloride (NaCl) Millipore Sigma LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-100
Solvent Safe pipette tips Sigma-Aldrich S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 860061
Trizma base Millipore Sigma LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid Caisson Labs TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm Whatman 230600 Size for large extruder
Zetasizer ZS90 Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software Malvern Panalytical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lucio, M., Lima, J. L. F. C., Reis, S. Drug-Membrane Interactions: Significance for Medicinal Chemistry. Current Medicinal Chemistry. 17 (17), 1795-1809 (2010).
  2. Mayne, C. G., et al. The cellular membrane as a mediator for small molecule interaction with membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1858 (10), 2290-2304 (2016).
  3. Bunea, A. I., Harloff-Helleberg, S., Taboryski, R., Nielsen, H. M. Membrane interactions in drug delivery: Model cell membranes and orthogonal techniques. Advances in Colloid and Interface Science. 281, 102177 (2020).
  4. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: Applications in drug discovery and drug delivery. Molecular Pharmaceutics. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  5. Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of Lipid Vesicle Deposition on Solid Surfaces: A Combined QCM-D and AFM Study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
  6. Lind, T. K., Cárdenas, M., Wacklin, H. P. Formation of supported lipid bilayers by vesicle fusion: Effect of deposition temperature. Langmuir. 30 (25), 7259-7263 (2014).
  7. Mingeot-Leclercq, M. -P., Deleu, M., Brasseur, R., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy of supported lipid bilayers. Nature protocols. 3 (10), 1654-1659 (2008).
  8. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  9. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  10. Edvardsson, M., Svedhem, S., Wang, G., Richter, R., Rodahl, M., Kasemo, B. QCM-D and reflectometry instrument: applications to supported lipid structures and their biomolecular interactions. Analytical chemistry. 81 (1), 349-361 (2009).
  11. Rodahl, M., et al. Simultaneous frequency and dissipation factor QCM measurements of biomolecular adsorption and cell adhesion. Faraday Discussions. 107, 229-246 (1997).
  12. Keller, C. A., Glasmästar, K., Zhdanov, V. P., Kasemo, B. Formation of Supported Membranes from Vesicles. Physical Review Letters. 84 (23), 5443-5446 (2000).
  13. Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical journal. 75 (3), 1397-1402 (1998).
  14. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature protocols. 5 (6), 1096-1106 (2010).
  15. Bailey, C. M., Tripathi, A., Shukla, A. Effects of Flow and Bulk Vesicle Concentration on Supported Lipid Bilayer Formation. Langmuir. 33 (43), 11986-11997 (2017).
  16. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature reviews. Molecular cell biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  17. Rossi, C., Chopineau, J. Biomimetic tethered lipid membranes designed for membrane-protein interaction studies. European Biophysics Journal. 36 (8), 955-965 (2007).
  18. Hatty, C. R., et al. Investigating the interactions of the 18 kDa translocator protein and its ligand PK11195 in planar lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (3), 1019-1030 (2014).
  19. Min, Y., Kristiansen, K., Boggs, J. M., Husted, C., Zasadzinski, J. a, Israelachvili, J. Interaction forces and adhesion of supported myelin lipid bilayers modulated by myelin basic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3154-3159 (2009).
  20. Heath, G. R., et al. Layer-by-layer assembly of supported lipid bilayer poly-l-lysine multilayers. Biomacromolecules. 17 (1), 324-335 (2016).
  21. Alberts, B., Lewis, J. The Lipid Bilayer. Molecular Biology of the Cell. , 6-11 (2013).
  22. Cho, N. J., Wang, G., Edvardsson, M., Glenn, J. S., Hook, F., Frank, C. W. Alpha-helical peptide-induced vesicle rupture revealing new insight into the vesicle fusion process as monitored in situ by quartz crystal microbalance-dissipation and reflectometry. Analytical Chemistry. 81 (12), 4752-4761 (2009).
  23. Hardy, G. J., Nayak, R., Munir Alam, S., Shapter, J. G., Heinrich, F., Zauscher, S. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by α-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22 (37), 19506-19513 (2012).
  24. Bailey-Hytholt, C. M., Shen, T. L., Nie, B., Tripathi, A., Shukla, A. Placental Trophoblast-Inspired Lipid Bilayers for Cell-Free Investigation of Molecular Interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (28), 31099-31111 (2020).
  25. Domenech, O., Francius, G., Tulkens, P. M., Van Bambeke, F., Dufrêne, Y., Mingeot-Leclercq, M. -P. Interactions of oritavancin, a new lipoglycopeptide derived from vancomycin, with phospholipid bilayers: Effect on membrane permeability and nanoscale lipid membrane organization. Biochimica et biophysica acta. 1788 (9), 1832-1840 (2009).
  26. Bailey, C. M., Kamaloo, E., Waterman, K. L., Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. a Size dependence of gold nanoparticle interactions with a supported lipid bilayer: A QCM-D study. Biophysical Chemistry. 203-204, 51-61 (2015).
  27. Bailey-Hytholt, C. M., Puranik, T., Tripathi, A., Shukla, A. Investigating interactions of phthalate environmental toxicants with lipid structures. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 190, 110923 (2020).
  28. Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Antimicrobial peptide alamethicin insertion into lipid bilayer: a QCM-D exploration. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 116, 472-481 (2014).
  29. Lozeau, L. D., Rolle, M. W., Camesano, T. A. A QCM-D study of the concentration- and time-dependent interactions of human LL37 with model mammalian lipid bilayers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167 (1), 229-238 (2018).
  30. Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
  31. Ren, X., et al. Design, fabrication, and characterization of archaeal tetraether free-standing planar membranes in a PDMS-and PCB-based fluidic platform. ACS Applied Materials & Interfaces. 6 (15), 12618-12628 (2014).
  32. Seo, P. R., Teksin, Z. S., Kao, J. P. Y., Polli, J. E. Lipid composition effect on permeability across PAMPA. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 29 (3-4), 259-268 (2006).
  33. Avdeef, A. The rise of PAMPA. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 1 (2), 325-342 (2005).
  34. Avdeef, A., Artursson, P., Neuhoff, S., Lazorova, L., Gråsjö, J., Tavelin, S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA method. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 24 (4), 333-349 (2005).
  35. Campbell, S. D., Regina, K. J., Kharasch, E. D. Significance of Lipid Composition in a Blood-Brain Barrier-Mimetic PAMPA Assay. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 437-444 (2014).
  36. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  37. Schmidt, D., Lynch, J. Evaluation of the reproducibility of Parallel Artificial Membrane Permation Assays (PAMPA). EMD Millipore Corporation. , (2020).
  38. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  39. Nayar, R., Hope, M. J., Cullis, P. R. Generation of large unilamellar vesicles from long-chain saturated phosphatidylcholines by extrusion technique. BBA - Biomembranes. 986 (2), 200-206 (1989).
  40. Lind, T. K., Skida, M. W. A., Cárdenas, M. Formation and Characterization of Supported Lipid Bilayers Composed of Phosphatidylethanolamine and Phosphatidylglycerol by Vesicle Fusion, a Simple but Relevant Model for Bacterial Membranes. ACS Omega. 4 (6), 10687-10694 (2019).
  41. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  42. Bermejo, M., et al. PAMPA-a drug absorption in vitro model: 7. Comparing rat in situ, Caco-2, and PAMPA permeability of fluoroquinolones. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (4), 429-441 (2004).
  43. Kerns, E. H., Di, L., Petusky, S., Farris, M., Ley, R., Jupp, P. Application of parallel artificial membrane permeability assay and Caco-2 permeability. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (6), 1440-1453 (2004).
  44. Masungi, C., et al. Parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) combined with a 10-day multiscreen Caco-2 cell culture as a tool for assessing new drug candidates. Pharmazie. 63 (3), 194-199 (2008).
  45. Vera-González, N., et al. Anidulafungin liposome nanoparticles exhibit antifungal activity against planktonic and biofilm Candida albicans. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (11), 2263-2276 (2020).
  46. Barenholz, Y., Gibbes, D., Litman, B. J., Goll, J., Thompson, T. E., Carlson, F. D. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (1), 2806-2810 (1977).
  47. El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1798 (4), 750-765 (2010).
  48. Tawa, K., Morigaki, K. Substrate-supported phospholipid membranes studied by surface plasmon resonance and surface plasmon fluorescence spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (4), 2750-2758 (2005).
  49. Koenig, B. W., et al. Neutron Reflectivity and Atomic Force Microscopy Studies of a Lipid Bilayer in Water Adsorbed to the Surface of a Silicon Single Crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  50. Lind, T. K., Cárdenas, M. Understanding the formation of supported lipid bilayers via vesicle fusion-A case that exemplifies the need for the complementary method approach (Review). Biointerphases. 11 (2), 020801 (2016).
  51. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  52. Isaksson, S., et al. Protein-Containing Lipid Bilayers Intercalated with Size-Matched Mesoporous Silica Thin Films. Nano Letters. 17 (1), 476-485 (2017).

Tags

Bioengineering nummer 174
Montering av cellimitering stöds och suspenderade lipid bilayer modeller för studie av molekylära interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., … More

Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., Shukla, A. Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions. J. Vis. Exp. (174), e62599, doi:10.3791/62599 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter