Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Samling af cell mimicking Understøttet og suspenderet Lipid Bilayer Modeller for studiet af molekylære interaktioner

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62599
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Center for Biomedical Engineering, School of Engineering, Brown University

Summary

Denne protokol beskriver dannelsen af celle efterligne uni-lipid og multi-lipid vesikler, støttede lipid bilayers, og suspenderet lipid bilayers. Disse in vitro-modeller kan tilpasses til at inkorporere en række lipidtyper og kan bruges til at undersøge forskellige molekyle- og makromolekyleinteraktioner.

Abstract

Modelcellemembraner er et nyttigt screeningsværktøj med applikationer lige fra tidlig lægemiddelopdagelse til toksicitetsundersøgelser. Cellemembranen er en afgørende beskyttende barriere for alle celletyper, der adskiller de interne cellulære komponenter fra det ekstracellulære miljø. Disse membraner består i vid udstrækning af en lipid bilayer, som indeholder ydre hydrofile hovedgrupper og indre hydrofobiske halegrupper sammen med forskellige proteiner og kolesterol. Sammensætningen og strukturen af lipiderne selv spiller en afgørende rolle i reguleringen af biologisk funktion, herunder interaktioner mellem celler og det cellulære mikromiljø, som kan indeholde lægemidler, biologiske toksiner og miljømæssige toksiksmidler. I denne undersøgelse, metoder til at formulere uni-lipid og multi-lipid understøttet og suspenderet celle efterligne lipid bilayers er beskrevet. Tidligere, uni-lipid fosfatylcholin (PC) lipid bilayers samt multi-lipid placental trofoblast-inspirerede lipid bilayers blev udviklet til brug i forståelsen af molekylære interaktioner. Her vil metoder til at opnå begge typer bilayer modeller blive præsenteret. For celle efterligne multi-lipid bilayers bestemmes den ønskede lipidsammensætning først via lipidudvinding fra primære celler eller cellelinjer efterfulgt af flydende kromatografi-massespektrometri (LC-MS). Ved hjælp af denne sammensætning fremstilles lipid vesikler ved hjælp af en tyndfilmshydrering og ekstruderingsmetode, og deres hydrodynamiske diameter og zetapotentiale er karakteriseret. Understøttede og suspenderede lipid bilayers kan derefter dannes ved hjælp af kvartskrystal mikrobalance med spredning overvågning (QCM-D) og på en porøs membran til brug i en parallel kunstig membran permeabilitet assay (PAMPA), henholdsvis. De repræsentative resultater fremhæver reproducerbarhed og alsidighed af in vitro celle membran lipid bilayer modeller. De præsenterede metoder kan støtte i hurtig, let vurdering af interaktionsmekanismerne, såsom permeation, adsorption og indlejring, af forskellige molekyler og makromolekyler med en cellemembran, der hjælper med screening af lægemiddelkandidater og forudsigelse af potentiel cellulær toksicitet.

Introduction

Cellemembranen, der primært består af fosfolipider, kolesterol og proteiner, er en afgørende komponent i alle levende celler1. Med organisation drevet af lipid amfifilitet fungerer cellemembranen som en beskyttende barriere og regulerer, hvordan cellen interagerer med det omgivende miljø2. Flere cellulære processer er afhængige af lipid- og proteinsammensætningen af membranen1,2. For eksempel er cellemembraninteraktioner vigtige for effektiv lægemiddellevering3. Lægemidler, biologics, nanomaterialer, biologiske toksiner og miljømæssige toksiksmidler kan påvirke integriteten af en cellemembran og derved påvirke cellulær funktion4. Konstruktionen af in vitro-celle efterligne membran modeller baseret på lipid sammensætning af cellemembraner har potentiale til at give letkøbte værktøjer til i høj grad at forbedre undersøgelsen af den potentielle indvirkning af disse materialer på celler.

Model lipid bilayers omfatter lipid vesikler, støttede lipid bilayers, og suspenderet lipid bilayers. Understøttede lipid-bilayere er en model af den fosfolipidcellemembran , der almindeligvis anvendes i bioteknologiske applikationer , hvor lipid vesikler er bristet på et understøttet substratmateriale5,6,7,8,9. En almindelig teknik, der anvendes til at overvåge bilayer dannelse er kvarts krystal mikrobalance med spredning overvågning (QCM-D), som undersøger adsorption af vesikler i forhold til bulk flydende egenskaber in situ8,10,11,12,13,14 . Tidligere har QCM-D været brugt til at påvise, at under flowforhold, når en kritisk vesikel dækning af fosphatidylcholin (PC) lipid vesikler er opnået på overfladen, de spontant brister i stive lipid bilayers15. Tidligere arbejde har også undersøgt understøttet lipid bilayer dannelse med varierende lipid kompositioner16, inkorporering af lipid proteiner17,18,19, og udnytte polymer puder20, giver understøttede lipid bilayers i stand til at efterligne forskellige aspekter af cellemembran funktion.

Lipid bilayers er blevet brugt til at efterligne forskellige biologiske barrierer fra sub-cellulære til organniveauer, herunder mitokondrie, røde blodlegemer, og levercellemembraner ved at ændre fosfolipid, kolesterol, og glycolipid komponenter21. Disse mere komplekse multi-lipid vesikler kan kræve yderligere metoder til at opnå vesikel brud, afhængigt af lipid sammensætning. For eksempel har tidligere undersøgelser udnyttet en α-spiralformet (AH) peptid stammer fra hepatitis C virus's nonstructural protein 5A at fremkalde bilayer dannelse ved at destabilisere adsorber lipid vesikler22,23. Ved hjælp af denne AH peptid, støttede lipid bilayers efterligne placenta celler er tidligere blevet dannet24. Det store potentiale af understøttede lipid-bilayers til biomedicinske anvendelser er blevet påvist medundersøgelser,der spænder over molekylær og nanopartikler transport25,26, miljømæssige toksikantinteraktioner27, proteinsamling og funktion17,18,19, peptidarrangement og indsættelse28,29, lægemiddelscreening30og mikrofluidiske platforme31.

Suspenderet lipid bilayers er blevet brugt til farmaceutiske screening undersøgelser via en parallel kunstig membran permeabilitet assay (PAMPA), hvor en lipid bilayer er suspenderet på tværs af en porøs hydrofob skær32,33,34,35. PAMPA lipid modeller er blevet udviklet til forskellige biologiske grænseflader, herunder blod-hjerne, buccal, tarm, og depotgrænseflader36. Ved at kombinere både de understøttede lipid bilayer og PAMPA teknikker, adsorption, permeabilitet, og indlejring af forbindelser i lipid komponenter af en ønsket væv eller celletype kan grundigt studeres.

Denne protokol beskriver fremstilling og anvendelse af in vitro celle membran lipid bilayer modeller til at undersøge flere molekylære interaktioner. Forberedelse af både uni-lipid og multi-lipid understøttet og suspenderet lipid bilayers er detaljeret. For at danne en understøttet lipid bilayer, lipid vesikler er først udviklet ved hjælp af tyndfilm hydrering og ekstrudering metoder efterfulgt af fysisk-kemisk karakterisering. Dannelse af en understøttet lipid bilayer ved hjælp af QCM-D overvågning og fremstilling af suspenderede lipid membraner til brug i PAMPA diskuteres. Endelig undersøges multi-lipid vesikler til udvikling af mere komplekse cellemitkende membraner. Ved hjælp af begge typer af fabrikerede lipidmembraner viser denne protokol, hvordan dette værktøj kan bruges til at studere molekylære interaktioner. Samlet set denne teknik konstruerer celle efterligne lipid bilayers med høj reproducerbarhed og alsidighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udvikling af uni-lipid vesikler

  1. Tyndfilmshydreringsmetode
    1. Forberedelse og opbevaring af lipid lagerløsninger
      BEMÆRK: Alle trin ved hjælp af kloroform skal udføres i en kemisk røghætte. Kloroform bør altid pipetteres ved hjælp af opløsningsmiddelsikre kulfiberpipettespidser. Opløsninger, der indeholder kloroform, bør altid opbevares i glasglas.
      1. Forbered en 10 mg/mL lipid lageropløsning ved at tilføje den passende mængde kloroform i hætteglasset indeholder lipid pulver og bland godt. For eksempel tilsættes 20 mL kloroform til 200 mg L-α-fosphatidylcholin (æg, kylling) (eggPC). Lageropløsningen kan om nødvendigt fremstilles i en anden koncentration.
        BEMÆRK: Hvis pulverlipiden blev opbevaret i en ampul, efter tilsætning af chloroform overførsel til et glas hætteglas med en polytetrafluoroethylen (PTFE) foret hætte.
      2. Forsegl hætteglasset med parafilm og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
    2. Dannelse af en tør-lipid film
      1. Der tilsættes den passende mængde lipidlageropløsning til et rent glasglas, der er nødvendigt for en endelig vesikelkoncentration på 2,5 mg/mL. For eksempel at danne 1 mL æg PC vesikler ved 2,5 mg / mL, pipette 250 μL æg PC lageropløsning i hætteglasset.
        BEMÆRK: Det forberedte volumen kan afhænge af ekstruderprocessen (se trin 1.3). Mini ekstruderens maksimale anbefalede volumen er 1 mL, mens det store ekstrudervolumenområde er 5-50 mL.
      2. Fjern kloroform fra lipidlageropløsning ved hjælp af en strøm af N2-gas (ultrapure 5.0 Grade).
      3. For at sikre fuld fjernelse af kloroform skal den tørrede lipidfilm forbindes til vakuum og lade den stå i mindst 4 timer.
        BEMÆRK: Processen kan stoppes her. Hvis lipidfilmen ikke vil blive brugt umiddelbart efter vakuumtørring, opbevares i en udtørrer, indtil den er brugt. Vi har observeret, at disse lipidfilm giver lignende kvalitets vesikler efter 1 uges opbevaring under disse forhold; vesikelkvaliteten efter den længere opbevaringsperiode bør om nødvendigt undersøges nærmere.
    3. Udførelse af fryse-optø-vortex cykler
      1. Der fremstilles en Tris natriumchlorid (NaCl) bufferopløsning, der indeholder 10 mM Tris-base og 100 mM NaCl. Rehydrere den tørrede lipid film med den nødvendige mængde Tris NaCl buffer til at give en endelig vesikel koncentration på 2,5 mg /mL og vortex for ca 15-30 s.
      2. Træk vesikelaffjedringen over i en beholder med tøris, indtil den er frosset, ca. 30 min. Når prøven er helt frosset, optøs suspensionen i et vandbad på 30-40 °C. Hvirvles den optøede vesikel suspension.
        BEMÆRK: Flydende N2 kan anvendes i stedet for tøris. Vesikelaffjedringen overføres til flydende nitrogen i 30 s, og optø straks i et 80 °C vandbad.
      3. Gentag trin 1.1.3.2 yderligere 4 gange for i alt 5 fryse-optø-vortex cyklusser.
  2. Ekstrudering
    BEMÆRK: Efter fryse-optø-vortex cyklusser er afsluttet, multilamellar vesikler dannes. Ekstrudering hjælpemidler til at reducere størrelsen og udvikle store unilamellar vesikler.
    1. Mini (1 mL) ekstruder proces
      1. Rengør alle ekstruderens komponenter grundigt ved hjælp af et mildt vaskemiddel i ultrapurt vand, og skyl mindst tre gange med ultrapurt vand, så alt vaskemiddel fjernes. Tør med N2 gas.
      2. Saml de to indvendige membranstøtter og O-ringe (indvendig diameter på 12,7 mm; ydre diameter på 15,2 mm). Placer hver membranstøtte, så O-ringen vender mod midten.
      3. Forbehandlet filterstøtte med ultrapurt vand. Placer den på membranstøtteoverfladen inde i O-ringen. Gentag for den anden interne membranstøtte.
      4. Placer en intern membranstøtte i ekstruderens yderhus. Placer en 100 nm polycarbonatmembran på den interne membranstøtte direkte over filterstøtten.
        BEMÆRK: Polycarbonatmembranerne opbevares separat mellem stykker af blåt farvet papir. Fjern adskillelsespapiret, før du sætter det på membranstøtten.
      5. Placer den anden interne membranstøtte i ekstruderens ydre hylster med O-ringen og filterstøttesiden mod polycarbonatmembranen. Fastgør PTFE-lejet i holdermøtrikken, og skru den er lukket med ekstruderens yderhus. Klip ekstruderen ind i varmeblokken.
      6. Læg lipid vesikelaffjedringen i en af sprøjterne, og placer sprøjten i ekstruderens varmeblok, og lad nålen sættes helt ind i den ene ende af ekstruderen. Sæt den anden, tomme sprøjte ind i den modsatte side og lås i begge sprøjter ved hjælp af armclipsene på varmeblokken.
        BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, skal ekstruderens varmeblok placeres på en kogeplade og indstille temperaturen til en værdi over lipidens overgangstemperatur. Sæt et termometer ind i holderen indbygget i varmeblokken for nøjagtige temperaturaflæsninger og vent, indtil den krævede temperatur er nået (~ 15 min). Æg PC lipid vesikler kræver ikke varme under ekstrudering.
      7. Skub langsomt vesikelaffjedringen ind i den tomme sprøjte, og derefter tilbage i den oprindelige sprøjte. Monitor for trykændringer i hele ekstrudering, der indikerer en lækage. Gentag 20 gange mere for i alt 21 passerer gennem polycarbonatmembranen. Overfør lipid vesikler til et rent glas hætteglas til opbevaring.
        BEMÆRK: Antallet af ekstruder kan optimeres afhængigt af lipidsammensætningen.
      8. Hvis der blev brugt varme, skal du tillade ekstruderet vesikelaffjedring for at nå stuetemperatur. Opbevar de ekstruderede lipid vesikler ved 4 °C, indtil de anvendes yderligere.
        BEMÆRK: Den anbefalede vesikelopbevaringsvarighed afhænger i høj grad af lipidsammensætningen, og vesikelfysicokemiske egenskaber (f.eks. hydrodynamisk diameter, zetapotentiale) bør overvåges over tid. For eksempel, æg PC vesikler er blevet opbevaret i mindst to uger uden ændring i vesikel størrelse eller bilayer dannelse kapacitet.
    2. Stor ekstruderproces (5-50 mL)
      BEMÆRK: Følg trin 1.2.2.1-1.2.2.5, hvis der kræves varme til valgt lipid. Gå til trin 1.2.2.5, hvis der ikke er behov for varme. Trin 1.2.2.1-1.2.2.4 er ikke påkrævet for æg-pc.
      1. Fyld en 1 L kolbe med omvendt osmose (RO) vand.
        BEMÆRK: Brug ikke ultrapurt vand til at cirkulere gennem 50 mL-systemet, da det kan få metalioner til at sive ud fra ekstrudercylinderen.
      2. Placer 1 L kolbe i et vandbad på en kogeplade og sæt kogepladen til en temperatur over overgangstemperaturen af lipid.
      3. Prøvecylinderen fastgøres til kolben med fleksible slanger via indløbet på prøvecylinderen. Fastgør slangen på cylinderens udløb til toppen af 1 L-kolben. Fastgør slangerne ved både indløb og udløb efter behov. Dette vil skabe en envejsstrøm af vandet gennem prøvecylinderen.
      4. Tænd for pumpen for at starte vandcirkulationen. Hvis der er behov for varme, skal der være ca. 30-45 minutter, før prøvecylinderen når den ønskede temperatur.
      5. Tilslut prøvecylinderens hætte til en nitrogentank via det fleksible stik, der er fastgjort til trykaflastningsventilenheden.
      6. Rengør alle dele af 50 mL ekstruderen med 70 % (v/v) ethanol.
      7. Saml ekstruderen ved at placere den store hulskærmstøtte, sintret disk, drænskiver og polycarbonatmembran i rummet i ekstruderens lavere støtte. Tilslut ekstruder øvre og nedre støtter ved hjælp af de fire skruer og stramme.
      8. Sæt ekstruderenheden fast på prøvecylinderen ved at skrue til bunden og stramme med en skruenøgle for at sikre.
        BEMÆRK: Hvis der anvendes varme, skal du placere et termometer i cylinderen og vente, indtil vandet har nået den ønskede temperatur, før du fortsætter. Dette vil sikre, at prøvetemperaturen opretholdes under hele ekstruderingsprocessen.
      9. Fyld prøvecylinderen med ultrapurt vand. Udstøt vandet gennem ekstruderenheden, inden prøven tilsættes i prøvecylinderen. Dette gøres for at forbehandle membranerne, svarende til mini ekstruderen.
        BEMÆRK: Sørg for, at hætten er helt skruet på, og trykaflastningsventilen er lukket helt, før nitrogenet tændes. Der kræves minimalt tryk for dette trin (~5-10 psi).
      10. Tilsæt lipid vesikelaffjedringen i prøvecylinderen og skru toppen lukket. Forøg langsomt trykket, indtil prøven begynder at dryppe fra ekstruderenheden med en hastighed på ca. 2-3 dråber/s til et rent glasglasglas.
        BEMÆRK: Forøg ikke trykket hurtigt ved dette trin, da for meget tryk kan påvirke membranerne negativt og føre til mislykket ekstrudering.
      11. Når alle prøver er ekstruderet, skal N2-forsyningen slukkes og slippe trykket i prøvecylinderen ved at åbne trykaflastningsventilen langsomt. Lipid vesikler tilbage i prøven cylinder og gentag trin 1.2.2.11, 9 flere gange for i alt 10 ekstrudering.
        BEMÆRK: Det krævede tryk for ekstrudering kan falde med et stigende antal ekstruder, da prøven bliver mere homogen og tættere på polycarbonatmembranens porestørrelse.
      12. Opbevar ekstruderet lipid vesikelaffjedring ved 4 °C, indtil den er yderligere brugt.

2. Karakterisere lipid vesikler

  1. Hydrodynamisk diametermåling ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS)
    1. Vortex lipid vesikler og pipette 50 μL af lipid vesikel suspension i en engangs lav volumen cuvette. Dæk for at forhindre forurening med støv og snavs.
    2. Indlæs vesikelaffjedringen i DLS-instrumentet, indtast prøvedetaljerne, og udfør målingen ved hjælp af den tilknyttede software.
  2. Zeta potentiale
    1. Forbered en foldet kapillær zeta celle ved at vaske med ultrapure vand, 70% ethanol, og ultrapure vand ved hjælp af sprøjter, der forbinder til indgangene af cellen. Skub forsigtigt væsken gennem cellen 3-4 gange og tøm cellen helt, før du skifter til den næste opløsning.
    2. Vortex lipid vesikler og forberede en 1:10 (v/v) fortynding af lipid vesikler i ultrapure vand.
    3. Læg den fortyndede lipid vesikel suspension. Fjern luftbobler ved at skubbe affjedringen frem og tilbage mellem sprøjterne. Fastgør propperne til hvert indløb.
      BEMÆRK: Det er afgørende at fjerne alle bobler, da dette vil påvirke målingen.
    4. Anbring zetacellen i prøvekammeret, så elektroderne er i kontakt. Luk prøvekammerets top. I den tilhørende software skal du indtaste prøveoplysningerne og indsamle måling.

3. Danner en uni-lipid understøttet lipid bilayer ved hjælp af QCM-D

  1. Opløsningspræparater
    1. Tilbered en opløsning på 2 % (w/v) natrium dodecylsulfat (SDS) i ultrapurt vand. Bland på en rørplade, indtil den er helt opløst. Aliquot arbejdsløsninger på mindst 10 mL ultrapure vand, 2% SDS og Tris NaCl.
    2. Forbered en fortynding af lipid vesikler i Tris NaCl buffer. Koncentrationen af vesikler er afhængig af ansøgningen. For æg PC, koncentrationer i intervallet 0,01-0,5 mg/mL har vist sig at resultere i en vellykket understøttet lipid bilayer dannelse.
  2. Rengøring af silicabelagte kvartskrystalsensorer
    BEMÆRK: Rengøring af QCM-D-krystaller afhænger af overfladematerialet i den anvendte sensor. For at danne understøttede lipid-bilayere anvendes silicabelagte kvartskrystaller i denne protokol og er beskrevet nedenfor som tilpasset fra producentens standardprocedure.
    1. Sæt den silicabelagte kvartskrystalsensor i flowmodulet for at sikre, at "t" på krystallen flugter med "t" på modulet. Skru flowmodulet lukket.
      BEMÆRK: Hvis den anvendte QCM-D gør det muligt at tilslutte flere flowmoduler og køre samtidigt, skal du gentage følgende procedurer for de ekstra moduler efter behov.
    2. Sæt flowmodulet i instrumentets bund med elektroderne fra flowmodulet, der forbinder med analysatorsystemet. Lås modulet på plads.
    3. Tilslut indløbs- og udløbsrør til flowmodulet og pumpen. Placer slangen i holderne og luk låget på analysatorsystemet. Placer en affaldsbeholder ved pumpens udløb for at indsamle brugte løsninger.
    4. For at udføre rengøringen skal du først tænde for pumpen. Indstil strømningshastighed til 400 μL/min. Indløbsslangen sættes i ultrapurt vand og flow 5-10 mL gennem modulet.
    5. Skift indløbsslangen til 2% SDS og flow 5-10 mL gennem modulet. Skift indløbsslangen tilbage til ultrapurt vand og flow 10-20 mL gennem modulet. Fjern indløbsslangen fra opløsningen, og strøm luft gennem slangen, indtil al væske skubbes ud.
      BEMÆRK: Rengøringsprotokollen ovenfor bruges dagligt før og efter hver måling. En grundig rengøring kan udføres efter behov. Kort sagt, for at udføre en grundig rengøring, adskille flow moduler. Alle komponenter undtagen elektrodesiden af flowmodulet skal nedsænkes i 2 % (w/v) SDS og bade sonikeres, efterfulgt af grundig skylning med ultrapurt vand og tørring med en strøm af N2-gas. Komponenten i flowmodulet, der indeholder elektrodenålene, må aldrig være i kontakt med væske.
    6. Fjern sensoren fra flowmodulet, og skyl sensoren med ultrapurt vand. Tør sensoren med en N2 gasstrøm. Tør flowmodulet med en N2 gasstrøm. Sørg for, at elektroden altid forbliver fri for væske.
    7. I en kemisk røghætte skal den silicabelagte kvartskrystalsensor indsættes i et ultraviolet (UV)/ozonrensningsinstrument. Tænd instrumentet og lad behandlingen være i mindst 2 min. Fjern sensorerne forsigtigt, og vend tilbage til flowmodulet.
  3. Danner en Tris NaCl baseline
    1. Tænd analysatorinstrumentet for at oprette forbindelse til den tilhørende software, og indstil temperaturen til den ønskede værdi for den understøttede lipid-bilayer. Lad temperaturen stabilisere sig til den ønskede indgang.
      BEMÆRK: Hvis den indstillede temperatur er over stuetemperatur, skal alle opløsninger opvarmes til samme temperatur ved hjælp af en varmeblok.
    2. Konfigurer målingen, og find alle sensor resonansfrekvenser og spredninger for overtoner 3, 5, 7, 9, 11 og 13, før målingen startes.
      BEMÆRK: Den1. overtone kan ses bort fra, da denne harmoniske er alt for følsom og producerer støjende data.
    3. Tænd for pumpen, og indstil strømningshastighed til 175 μL/min eller den ønskede eksperimentelle strømningshastighed.
    4. Tør indløbsslangen af med ethanol, inden den indsættes i Tris NaCl. Start målingen og begynd at flyde Tris NaCl.
      BEMÆRK: Data indsamles og overvåges i realtid. Ændringen fra luft til væske i flowmodulet vil blive observeret i dataindsamlingssoftwaren ved en hurtig spredningsændring (ΔD) stigning og frekvensændring (ΔF) fald.
    5. Tillad Tris NaCl at strømme gennem modulet i 5-10 min, hvilket sikrer, at de oprindelige ΔF- og ΔD-værdier i væske forbliver stabile.
  4. Danner en uni-lipid støttet lipid bilayer
    1. Stop pumpen og fjern indløbsslangen fra Tris NaCl-opløsningen, og sæt forsigtigt ind i lipid vesikelopløsningen. Tilbagestrømning i 5 s for at fjerne eventuelle luftbobler fra indløbet slange, og derefter fortsætte fremad flow. Genstart målingen i softwaren for at nulstille grundlinjen.
      BEMÆRK: Vær omhyggelig med at undgå luftbobler i slangen, som kan strømme gennem modulet og forstyrre bilayerdannelsen og dataregistreringen.
    2. Flow lipid vesikler indtil bilayer dannelse er observeret i realtid i dataindsamling software (mindst 8 min for æg PC vesikler).
    3. Gentag trin 3.4.1 for at ændre indløbsrør fra lipid vesikler tilbage i Tris NaCl buffer.
      BEMÆRK: Hvis den ønskede anvendelse er at studere molekylære interaktioner, skal du fortsætte direkte til trin 6.1 uden at stoppe løsningsflowet eller dataindsamlingen. Hvis bilayerdannelse er slutpunktet, skal du fortsætte til trin 3.4.4.
    4. Stop målingen i softwaren, og gem filen. Stop pumpen.
    5. Flowmodulet og silicabelagt kvartskrystalsensoren rengøres efter protokoltrin 3.2.4 og 3.2.5.

4. Danner en suspenderet lipid bilayer

BEMÆRK: Protokollen til dannelse af en suspenderet lipid bilayer er tilpasset fra den parallelle kunstige membran permeabilitet assay (PAMPA) protokol fra filterplade producenten37.

  1. Opløse ønsket lipid i dodecane ved 20 mg/mL (f.eks. 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DOPC)).
  2. Donorrummet tilsættes 5 μL, som er en porøs polyvinyliden difluorid (PVDF) 96-brønd multiscreen filterplade (0,45 μm pore size).
  3. Dyk straks filterpladen ned i acceptorrummet, som er en transportmodtagerplade, der indeholder 300 μL på 1× fosfatbufferet saltvand (PBS). Der tilsættes 200 μL af 1× PBS til donorrummet.
    BEMÆRK: Kontrol af filtre med lipid kun og ubehandlede filtre udsat for 1× PBS kan medtages.
  4. Fortsæt direkte til afsnit 6.2 for at undersøge molekylære interaktioner med den suspenderede lipid bilayer. Det anbefales at afslutte undersøgelsen inden for 16 timer efter dannelsen af den suspenderede bilayer.

5. Udvikling af multi-lipid celle efterligne vesikler og bilayers

  1. Lipidudvinding fra pattedyrceller
    BEMÆRK: Lipid ekstraktion følger Bligh-Dyer tilgang38.
    1. Kultur den ønskede cellelinje efter behov. Efter at have opnået 70-80% sammenløb (T75 kolbe), løsne celler ved hjælp af trypsin-ethylendiamintretaacetic syre ved 37 °C i 5 min.
    2. Centrifugeceller ved 200 × g i 5 min. Fjern supernatanten, og brug cellepillen igen i 1 mL ultrapurt vand.
    3. Der tilsættes 3,75 mL af en 1:2 (v/v) blanding af chloroform:methanol til celleaffjedringen og vortex i 15 min. Derefter tilsættes 1,25 mL kloroform og vortex i 1 min. Endelig tilsættes 1,25 mL vand og vortex i 1 min.
    4. Centrifugecelleblanding ved 1000 x g i 10 min. Saml det nederste lag af væske, som indeholder lipider i den organiske fase. Tør under en strøm af N2 gas.
    5. Kvantificer lipidindholdet ved hjælp af flydende kromatografi-massespektrometri (LC-MS) ved hjælp af en C18-omvendt fase, 3,5 μm × 50 mm kolonne.
    6. Til den mobile fase skal du forberede to løsninger, den første med 60:40 (v/v) acetonitril:vand og den anden med 90:10 (v/v) isopropanol:acetonitrile. Ammonium format skal tilføjes til begge opløsninger ved en endelig koncentration på 10 mM. Over 60 min, øge den mobile fase gradient fra 35% (v / v) af den anden løsning til 95% (v / v).
    7. Detekter spildevandet i negativ ioniseringstilstand, med fortløbende MS med fuld scanning ms og tandem MS/MS. Identificer de enkelte fosfolipidarter ud fra deres masse-til-opladningsforhold (m/z). Analysere massespektre fra kollision-induceret dissociation fragmentering, ved hjælp af LIPID MAPS massespektrometri analyseværktøjer. Opnå ekstraheret ionkromamatrammer for at integrere området under kurven, der bestemmer overfloden af hver lipidart.
    8. Udfør trin 5.1.5-5.1.7 for en lipidstandard, der indeholder de store lipidklasser, for at bestemme de relative detstler for denektion for hver anden fosfolipidklasse.
  2. Udvikling af multi-lipid vesikler
    1. Følg trinene i 1.1.1 for at forberede lipid stock løsninger til lipider, der repræsenterer hver ønsket bilayer komponent, som identificeret i trin 5.1.
    2. Baseret på lipidsammensætningerne fra trin 5.1 tilsættes den passende mængde lipid/chloroformlager i et rent glasglas, der er nødvendigt for en endelig vesikelkoncentration på 2,5 mg/mL. Fjern bulk chloroform tørring opløsning under en strøm af N2 gas.
    3. Følg trin 1.1.2, 1.1.3 og 1.2 for at danne multi-lipid vesikler. Følg trin 2 for vesikelkarakterisering.
  3. Danner en multi-lipid understøttet lipid bilayer ved hjælp af QCM-D
    BEMÆRK: Nogle multi-lipid vesikler kan resultere i spontan lipid vesikel brud og bilayer dannelse svarende til uni-lipid PC vesikler præsenteret i trin 3. Men, mere komplekse multi-lipid vesikler kan kræve ekstern input til støtte i vesikel brud. Her bruges AH peptid til at destabilisere den ydre folder på vesikel, hvilket resulterer i bilayerdannelse. Andre metoder til at opnå destabilisering og vesikel brud kan overvejes, hvis det ønskes.
    1. Følg trin 3 for at danne multi-lipid understøttet lipid bilayer udnytte multi-lipid vesikler dannet i trin 5,2.
    2. Hvis spontane brud på vesikler i en bilayer ikke overholdes, forsøg vesikel destabilisering ved hjælp af AH peptid. Forbered AH peptid (peptid sekvens: H-Ser−Gly−Ser−Trp−Leu−Arg−Asp−Val−Trp−Asp−Trp−Ile−Cys−Thr−Val−Thr−Asp−Phe−Lys−Thr−Trp−Leu−Gln−Ser−Lys−Leu−Asp−Tyr−Lys−Lys−NH2) opløsning ved 13 μM i Tris NaCl med 1% (v/v) dimethylsulfoxid, DMSO.
    3. Følg trin 3.4.1-3.4.3. Efter trin 3.4.3 skal indløbsslangen omdannes til AH-peptidopløsningen. Indfør opløsningen i flowmodulet, indtil ΔF og ΔD observeres fra den nye løsningstilsætning. Stop pumpen og lad AH peptid inkubere med vesiklerne i 10 min.
    4. Skift indløbsrørene til Tris NaCl, og start strømmen for at fjerne AH-peptid fra de bristede vesikler, hvilket fører til vellykket dannelse af en lipid bilayer.
      BEMÆRK: Hvis den ønskede anvendelse er at studere molekylære interaktioner, skal du fortsætte retningen til trin 6.1 uden at stoppe løsningsflowet eller dataindsamlingen.
    5. Stop målingen i softwaren, og gem filen. Stop pumpen.
    6. Flowmodulet og silicabelagt kvartskrystalsensoren rengøres efter protokoltrin 3.2.4-3.2.6.
  4. Suspenderede multi-lipid bilayers
    1. Opløse blanding af ønskede lipider i dodecane ved 20 mg/mL.
    2. Lav en 5 μL lipid mix opløsning ved hjælp af den ønskede celle efterligne sammensætning.
    3. Følg trin 4.2 og 4.3.
      BEMÆRK: Fortsæt direkte til trin 6.2 for at undersøge molekylære interaktioner med den suspenderede lipid bilayer.

6. Molekyleinteraktionsstudier med uni-lipid og multi-lipid bilayers

  1. Undersøgelse af molekylære interaktioner med en understøttet lipid bilayer ved hjælp af QCM-D
    1. Forbered en opløsning af det ønskede molekyle til at undersøge adsorption med en understøttet lipid bilayer. For eksempel skal du forberede en opløsning på 200 μM di(2-ethylhexyl) ftalat (DEHP) i Tris NaCl med 1% (v/v) DMSO.
    2. Hvis molekyleopløsningen fremstilles i Tris NaCl, kan den flødes direkte efter trin 3.4.3 for en uni-lipid bilayer eller 5.3.4 for en multi-lipid bilayer. Hvis molekylet skal fremstilles i et andet opløsningsmiddel, skal indløbsslangen i stedet indsættes alene i det ønskede opløsningsmiddel i mindst 5 min (f.eks. Tris NaCl med 1% (v/v) DMSO for DEHP).
      BEMÆRK: Viskositetsændringer på grund af opløsningsmidlet kan overvåges og overvejes ved at flyde det før og efter indførelsen af molekylet af interesse.
    3. Skift indløbsslangen til den opløsning, der indeholder molekylet af interesse og flow i mindst 5 min. Strømmen kan også stoppes, og væske, der indeholder det ønskede molekyle, får lov til at inkubere med bilayeren, hvis det ønskes.
    4. Skift indløbsrøret tilbage til molekylet opløsningsmiddel alene, hvis noget andet end Tris NaCl. Flow i mindst 5 min. Derefter skal du skifte indløbsslangen til Tris NaCl og flyde i mindst 5 minutter.
    5. Stop målingen i softwaren, og gem filen. Stop pumpen.
    6. Flowmodulet og silicabelagt kvartskrystalsensoren rengøres efter protokoltrin 3.2.4-3.2.6.
  2. Undersøgelse af molekylære interaktioner med suspenderede lipid bilayers ved hjælp af PAMPA
    1. Forbered en opløsning af det ønskede molekyle. For eksempel skal du forberede en 200 μM DEHP i 1× PBS med 1% (v/v) DMSO.
    2. Klargør en ny transportmodtagerplade med 300 μL frisk 1x PBS pr. brønd.
    3. Umiddelbart efter trin 3.3 for en uni-lipid suspenderet bilayer eller 4.4.3 for en multi-lipid suspenderet bilayer, fjerne 1× PBS fra donorrummet på multiscreen filterpladen og erstattes med 200 μL af testopløsningen. Dyk straks ned i transportmodtagerpladen, der er forberedt i trin 6.2.2.
    4. Inkuberes med skånsom vuggen i den ønskede tid (f.eks. 2 timer) ved 25 °C.
    5. Efter inkubation opsamles 150 μL af opløsningen fra donor- og acceptorrummene. Mål molekylekoncentrationen i begge prøver ved hjælp af en passende metode baseret på egenskaberne af dette molekyle.
      1. For eksempel skal du bruge et mikropladespektrofotometer med den passende absorbansbølgelængde, såsom 280 nm til DEHP, og sammenlign med en standardkurve af interessemolekylet.
    6. Beregn den tilsyneladende permeabilitet (Papp)af molekylet af interesse ved hjælp af følgende ligninger:
      Equation 1 (1)
      Hvor Equation 2 (2)
      BEMÆRK: [testforbindelse]acceptor er koncentrationen af molekylet af interesse (f.eks. DEHP) på det tidspunkt, t, i acceptorrummet; og [testforbindelse]indledende er den oprindelige koncentration af molekylet. A er membranområdet, t er tiden, VD er donorrummets volumen, og VA er acceptorrummets volumen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol beskriver metoder til dannelse af understøttede og suspenderede lipid-bilayere (figur 1). Det første skridt til at danne en understøttet lipid bilayer er at udvikle lipid vesikler. Mini ekstruder giver mulighed for små mængder lipid vesikler, der skal fremstilles (1 mL eller mindre), mens den store ekstruder giver mulighed for 5-50 mL lipid vesikler, der skal fremstilles i et parti. Størrelsesfordelinger af uni-lipid vesikler dannet af enten mini eller stor ekstruder er vist i figur 2A. Da den store ekstruder bruger højtrykS N2 gas til at skubbe vesikelopløsningen gennem polycarbonatmembranen, resulterer lipid vesikler i en gennemsnitlig størrelsesfordeling ved målet 100 nm hydrodynamisk diameter. Miniekstruderen resulterer også i en ensartet fordeling, selv om vesikelhydrodynamisk diameter er lidt større end polycarbonatporestørrelsen, hvilket er typisk for denne manuelle ekstruderingsmetode.

Figur 2B-D sammenligne størrelse, polydispersitet, og zeta potentiale uni-lipid æg PC vesikler og to multi-lipid vesikler sammensætning. Tabel 1 sammenligner den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter af hver lipid vesikel sammensætning. Sammensætningen af den første multi-lipid vesikel (ML1) er repræsentativ for placental-trofoblastinspirerede lipid vesikler med en sammensætning på 57:15:8:8:12 % (w/w) pc: fosfatylethanolamin (PE): fosfattidylinositol (PI): fosfattidylserin (PS): sphingomyelin (SPH). Størrelsen fordeling af æg PC vesikler og ML1 vesikler er meget ensartet og næsten identiske, med små forskelle i den gennemsnitlige polydispersitet (Figur 2A,B). Som forventet, på grund af forskelle i sammensætning, zeta potentiale æg PC uni-lipid vesikler og ML1 vesikel viste sig at afvige (Figur 2D). Den anden multi-lipid vesikel (ML2) er 60% æg PC og 40% 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin (EPC). Den positive ladning af EPC førte til et positivt zetapotentiale for disse vesikler (figur 2D), og der blev også observeret en stigning i polydispersitetsindekset for ML2-vesikler sammenlignet med æg-pc' eller ML1-vesikler, sandsynligvis et resultat af den specifikke sammensætning af disse vesikler.

QCM-D kan bruges til at danne understøttede lipid bilayers via vesikel brud på en silica-belagt sensor, og ΔF og ΔD under denne proces overvåges i realtid. ΔF er omvendt relateret til masseændringer, og øget ΔD indikerer stigning i strukturen fluiditet. Som vesikler adsorber til sensoren, ΔF falder og ΔD stiger. Da vesikel nå en kritisk vesikel dækning på overfladen, vil der være et plateau af ΔF og ΔD. Endelig, som vesikler brud, en ΔF stigning og ΔD fald observeres, på grund af frigivelse af indkapslet vand fra bristede vesikler og dannelse af stiv bilayer, henholdsvis. Figur 3 viser ΔF og ΔD forekommer som vesikler adsorber og brud på overfladen for uni-lipid og multi-lipid bilayer formationer. Uni-lipid æg PC vesikler let adsorber til overfladen som vist ved ΔF fald og ΔD stigning. Kritisk vesikel dækning er nået inden for 5 minutter, hvorefter vesiklerne begynder at briste. Den samlede ΔF observeret på understøttet æg PC bilayer dannelse er ~ -25 Hz, med ΔD på ~ 0.

ML1 vesikler tage længere tid at adsorbere i forhold til æg PC vesikler og i modsætning til disse vesikler, de ikke spontant briste, men forbliver stabil på overfladen. I stedet, en AH peptid får lov til at inkubere med adsorberet vesikler forårsager deres brud, når AH peptid fjernes med en Tris NaCl skylning. Under brud og bilayer dannelse observeres ΔF-stigningen og ΔD-faldet, svarende til æg-pc-vesiklerne. ΔF af denne multi-lipid bilayer resulterer i ca -28 Hz og ΔD på ca 1 × 10-6. Selvom de kan sammenlignes med æg pc lipid bilayer, disse små forskelle i ΔF og ΔD sandsynligvis indikerer den øgede fluiditet af bilayer på grund af de mange lipid typer til stede i strukturen.

Efter bilayer dannelse, disse strukturer kan bruges til at studere interaktioner med forskellige forbindelser. Med understøttede lipid bilayers, ΔF og ΔD kan analyseres før og efter indførelsen af forbindelsen. Som et eksempel vises DEHP-interaktion med understøttede uni- og multi lipid (ML1) bilayere i figur 4A,B. I dette tilfælde observeres lignende niveauer af DEHP adsorption for begge lipid bilayer typer (Figur 4A). Der blev dog observeret forskelle i ΔD mellem bilayerne, med en større ΔD set for æg pc bilayer i forhold til ML1 bilayer (Figur 4B). Mens den støttede lipid bilayer giver mulighed for undersøgelse af adsorption og potentielle indlejring af forbindelser af interesse sammen med potentielle lipid fjernelse, suspenderet lipid bilayers kan give oplysninger om permeabilitet på tværs af bilayer ved hjælp af en PAMPA. For DEHP's vedkommende blev der kun observeret ringe permeation for både uni- og ML1-bilayere (figur 4C). Papp beregnet for DEHP på tværs af en uni-lipid (~ 5,5 × 10-11 cm / s) og multi-lipid bilayer (~ 6,5 × 10-6 cm / s) var karakteristisk for lav permeabilitet. Men, andre forbindelser kan resultere i større gennemtrængelighed, som kan undersøges ved hjælp af denne teknik.

Figure 1
Figur 1: Processen med at danne understøttede lipid bilayers (øverst) og suspenderet lipid bilayers (nederst). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Uni-lipid og multi-lipid vesikel karakterisering. A) Hydrodynamisk diameterfordeling af æg pc-vesikler dannet ved hjælp af en mini ekstruder og stor ekstruder. B) Hydrodynamisk diameterfordeling af uni lipid-vesikler, der indeholder æg-pc og to multi lipidformuleringer, ML1 (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH) og ML2 (60:40 % (w/w) æg PC:EPC). (C) Polydispersitet indekser af uni-lipid og multi-lipid vesikler. (D) Zeta potentialer af uni-lipid og multi-lipid vesikler. Resultaterne vises som gennemsnitlige ± standardafvigelse. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af envejsanalyse af varians (ANOVA) med Tukeys post hoc-analyse (α=0,05, p<0,05 blev anset for at være statistisk signifikant, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0.001, ****p<0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Uni-lipid æg PC bilayer dannelse (ΔF i lyseblå og ΔD i lyse rødt) og en multi-lipid bilayer formation (57:15:8:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH) (ΔF i mørkeblå og ΔD i mørkerød) overvåges over tid ved hjælp af QCM-D. Stiplede linjer indikerer løsningsændringer for uni-lipid bilayer dannelse (lyseblå) og multi-lipid bilayer formation (mørkeblå). Ægget PC bilayer er dannet af ~ 15 min, mens multi-lipid bilayer tager ~ 45 min og kræver tilsætning af AH peptid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Molekyleinteraktioner med understøttede og suspenderede lipid-bilayere. (A) ΔF på grund af DEHP interaktion med uni-lipid og multi-lipid (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH) bilayers. (B) ΔD på grund af DEHP interaktion med uni-lipid og multi-lipid bilayers. (C) Procent af DEHP gennemsyret på tværs af uni-lipid og multi-lipid suspenderet bilayers. Resultaterne vises som gennemsnitlige ± standardafvigelse. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af en studerendes t-test(α= 0,05, p<0,05 blev anset for at være statistisk signifikant, * p<0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

Uni-lipid vs. multi-lipid Sammensætning Ekstruder Hydrodynamisk diameter (nm)
Uni-lipid 100% æg PC Mini 165 ± 1
Uni-lipid 100% æg PC Stor 108 ± 2
Multi-lipid 57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH Stor 109 ± 1
Multi-lipid 60:40 % (w/w) æg PC:EPC Stor 91,0 ± 0,2

Tabel 1: Lipid vesikel hydrodynamiske diametre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol giver mulighed for dannelse af lipid vesikler, støttede lipid bilayers, og suspenderet lipid bilayers. Her præsenteres kritiske trin for at danne hver af disse strukturer. Når der dannes lipid vesikler, er det vigtigt at ekstrudere over overgangstemperaturen på lipid39. Når under overgangstemperaturen, lipid er fysisk til stede i sin bestilte gel fase39. I denne bestilte fase kulbrinte lipid haler er fuldt udvidet giver mulighed for tæt pakning, hvilket gør ekstrudering udfordrende39. Når lipiden opvarmes over overgangstemperaturen, bliver den mere uorganiseret, hvilket resulterer i den flydende krystallinske fase39. Fedtfiskens kulbrintehaler er mere flydende ved disse temperaturer, hvilket giver mulighed for vellykket ekstrudering39. Lipid egenskaber såsom hovedgruppen sammensætning, mætning, og opladning vil påvirke deres overgangstemperatur. Det er også vigtigt at fjerne al kloroform, når lipidfilmen dannes, da resterende kloroform vil påvirke vesikeldannelsen og egenskaber negativt efter rehydrering.

Under understøttet lipid bilayer dannelse ved hjælp af QCM-D er det afgørende for silica-belagt kvarts krystal sensor at være i uberørt stand. Sensorerne kan genbruges, men skal kontrolleres hver gang for ridser, snavs eller andet slid og kasseres, hvis der findes ufuldkommenheder, da sensorfejl kan påvirke vesikel adsorption og bilayer dannelse. Den grundlæggende frekvens af piezoelektrisk kvartssensor er 5 MHz, med ΔF og ΔD overvåget ved ulige overtoner (3, 5, 7, 9, 11 og 13). Sikring af, at de grundlæggende resonans frekvenser for hver overtone fundet før måling svarer til de forventede teoretiske værdier kan hjælpe med at identificere en mulig krystal problem. Indsamling af målinger fra flere overtoner er vigtigt for viskoelastic modellering ved hjælp af de opnåede data. Det er også vigtigt at sikre, at der ikke indføres luft i systemet under væskestrøm gennem QCM-D flowmodulerne. Luft vil medføre et luft-flydende skift, som vil blive observeret i realtid dataindsamling og resultere i tab af integritet lipid bilayer. At danne multi-lipid støttet lipid bilayers vi har bemærket brugen af en AH peptid til at fremkalde vesikel brud. Afhængigt af lipid sammensætning, andre metoder kan undersøges for at fremkalde vesikel brud, såsom varierende ionisk styrke, temperatur, og flow. For eksempel er ændring af buffersaltkoncentrationen blevet brugt til at opnå multi-lipid bilayers, såsom dem, der efterligner bakteriemembraner, der omfatter PE og fosphatidylglycerol (PG) i sammensætningen. 40 Under suspenderet lipid bilayer dannelse, er det vigtigt, at lipider er valgt, der er opløselige i dodecane, såsom DOPC38,39. Afhængigt af ansøgningen og især for cellemembran efterligne bilayers, kan det være tilrådeligt at udføre sammenligning permeabilitet undersøgelser mellem suspenderet lipid bilayers og celle monolayers dannet på porøse skær42,43,44.

Der er mange trin i denne protokol, der kan tilpasses eller ændres til et bestemt program. Lipider og de anvendte sammensætninger, koncentrationen af lipid vesikel suspension, volumen af vesikler forberedt, vesikel rehydrering buffer, antallet af passerer gennem ekstruder, polycarbonat membran pore størrelse, kvarts krystal substrat materiale, QCM-D flow sats, de molekylære interaktioner undersøgt, længden af tid til interaktion, og temperaturen kan alle tilpasses, hvilket gør dette til en alsidig tilgang. Ekstruderingsprocesserne, der er beskrevet her, kan også bruges til at danne terapeutiske liposomer. For eksempel er både mini ekstruder og stor ekstruder blevet brugt til at danne svampedræbende liposomer, der forbliver stabile i mindst 140 dage ved 4 °C i ultrapurt vand45. Andre metoder til vesikel eller lipid bilayer dannelse og karakterisering kan også overvejes til sammenligning eller yderligere verifikation. For eksempel er sonikering en anden teknik, der bruges til at danne lipid vesikler46, og teknikker som kryo-transmission elektronmikroskopi kan bruges til at bekræfte lamellaritet15,45. Atomprøvesprængning mikroskopi47, overflade plasmon resonans48, og neutron reflektionsevne49 kan også bruges i kombination med QCM-D til at studere støttede lipid bilayers50. Suspenderet lipid bilayers er også blevet dannet i mikrofluidiske enheder30,51 ud over at bruge filteret og modtageren godt plader diskuteret i denne protokol.

Mens den metode, der er beskrevet her, kan give letkøbte lipid-bilayers, der efterligner cellulær lipidsammensætning, giver de kun oplysninger om molekylære interaktioner med disse lipider. Proteiner er også centrale komponenter i cellemembranen og kan påvirke adsorption, permeabilitet og aktive og passive transportegenskaber. Således fremme disse model lipid bilayers at indarbejde proteiner vil resultere i yderligere celle efterligne egenskaber, der kan forbedre de oplysninger, der opnås fra disse tilgange. For eksempel, en nylig undersøgelse indarbejdet proteiner i understøttede lipid bilayers ved hjælp af mesoporous silica substrater giver mulighed for en skræddersyet overflade pore størrelse til at indarbejde indfødte transmembrane proteiner52. Applikationer , hvor disse bilayers vil være særligt vigtige, omfatter toksicitetstest og farmaceutiske screeningsundersøgelser24,27. Samlet set alsidighed og reproducerbarhed af disse celle efterligne modeller tilføjer til deres nytte for en række undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt eller konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette materiale er baseret på arbejde, der støttes af National Science Foundation under Grant No. 1942418 tildelt A.S., og en National Science Foundation Graduate Research Fellowship tildelt C.M.B.H., under Grant No. 1644760. Eventuelle udtalelser, resultater og konklusioner eller anbefalinger udtrykt i dette materiale er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundation's synspunkter. Forfatterne takker Dr. Noel Vera-González for lipid vesicle karakterisering dataindsamling. Forfatterne takker professor Robert Hurt (Brown University) for brugen af hans Zetasizer. Forfatterne takker Brown University Mass Spectrometry Facility, især Dr. Tun-Li Shen for hjælp til kvantificering lipid sammensætning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC) Avanti Polar Lipids 850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) Avanti Polar Lipids 850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) Avanti Polar Lipids 850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) Avanti Polar Lipids 850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) Avanti Polar Lipids 890703
3 mL Luer-Loc syringes BD 309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner Duran Wheaton Kimble W224605
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Alconox Fisher Scientific 50-821-781
Ammonium formate Millipore Sigma LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire Waters  186002551
Chloroform Millipore Sigma LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK Sarstedt 67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) Millipore Sigma 36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma LSAC472301
Ethanol Pharmco 111000200
Filter supports, 10 mm Avanti Polar Lipids 610014 Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell Malvern Panalytical DTS1070
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764-4L
Kimwipes Kimberly Clark 34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) Avanti Polar Lipids 840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 840051
LiposoFast ® LF-50 Avestin, Inc.
Methanol Sigma-Aldrich 179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating block Avanti Polar Lipids 610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile Millipore Sigma MAIPS4510 for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure TechAir NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um Whatman 800309 Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um Whatman 110605 Size for large extruder
Parafilm Bemis PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x Genesee Scienfitic 25-507X Dilute to 1x
Qsoft 401 software Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL Duran Wheaton Kimble 986561
Silicon Dioxide, thin QSensors Biolin Scientific QSX 303
Sodium chloride (NaCl) Millipore Sigma LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-100
Solvent Safe pipette tips Sigma-Aldrich S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 860061
Trizma base Millipore Sigma LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid Caisson Labs TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm Whatman 230600 Size for large extruder
Zetasizer ZS90 Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software Malvern Panalytical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lucio, M., Lima, J. L. F. C., Reis, S. Drug-Membrane Interactions: Significance for Medicinal Chemistry. Current Medicinal Chemistry. 17 (17), 1795-1809 (2010).
  2. Mayne, C. G., et al. The cellular membrane as a mediator for small molecule interaction with membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1858 (10), 2290-2304 (2016).
  3. Bunea, A. I., Harloff-Helleberg, S., Taboryski, R., Nielsen, H. M. Membrane interactions in drug delivery: Model cell membranes and orthogonal techniques. Advances in Colloid and Interface Science. 281, 102177 (2020).
  4. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: Applications in drug discovery and drug delivery. Molecular Pharmaceutics. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  5. Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of Lipid Vesicle Deposition on Solid Surfaces: A Combined QCM-D and AFM Study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
  6. Lind, T. K., Cárdenas, M., Wacklin, H. P. Formation of supported lipid bilayers by vesicle fusion: Effect of deposition temperature. Langmuir. 30 (25), 7259-7263 (2014).
  7. Mingeot-Leclercq, M. -P., Deleu, M., Brasseur, R., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy of supported lipid bilayers. Nature protocols. 3 (10), 1654-1659 (2008).
  8. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  9. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  10. Edvardsson, M., Svedhem, S., Wang, G., Richter, R., Rodahl, M., Kasemo, B. QCM-D and reflectometry instrument: applications to supported lipid structures and their biomolecular interactions. Analytical chemistry. 81 (1), 349-361 (2009).
  11. Rodahl, M., et al. Simultaneous frequency and dissipation factor QCM measurements of biomolecular adsorption and cell adhesion. Faraday Discussions. 107, 229-246 (1997).
  12. Keller, C. A., Glasmästar, K., Zhdanov, V. P., Kasemo, B. Formation of Supported Membranes from Vesicles. Physical Review Letters. 84 (23), 5443-5446 (2000).
  13. Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical journal. 75 (3), 1397-1402 (1998).
  14. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature protocols. 5 (6), 1096-1106 (2010).
  15. Bailey, C. M., Tripathi, A., Shukla, A. Effects of Flow and Bulk Vesicle Concentration on Supported Lipid Bilayer Formation. Langmuir. 33 (43), 11986-11997 (2017).
  16. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature reviews. Molecular cell biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  17. Rossi, C., Chopineau, J. Biomimetic tethered lipid membranes designed for membrane-protein interaction studies. European Biophysics Journal. 36 (8), 955-965 (2007).
  18. Hatty, C. R., et al. Investigating the interactions of the 18 kDa translocator protein and its ligand PK11195 in planar lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (3), 1019-1030 (2014).
  19. Min, Y., Kristiansen, K., Boggs, J. M., Husted, C., Zasadzinski, J. a, Israelachvili, J. Interaction forces and adhesion of supported myelin lipid bilayers modulated by myelin basic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3154-3159 (2009).
  20. Heath, G. R., et al. Layer-by-layer assembly of supported lipid bilayer poly-l-lysine multilayers. Biomacromolecules. 17 (1), 324-335 (2016).
  21. Alberts, B., Lewis, J. The Lipid Bilayer. Molecular Biology of the Cell. , 6-11 (2013).
  22. Cho, N. J., Wang, G., Edvardsson, M., Glenn, J. S., Hook, F., Frank, C. W. Alpha-helical peptide-induced vesicle rupture revealing new insight into the vesicle fusion process as monitored in situ by quartz crystal microbalance-dissipation and reflectometry. Analytical Chemistry. 81 (12), 4752-4761 (2009).
  23. Hardy, G. J., Nayak, R., Munir Alam, S., Shapter, J. G., Heinrich, F., Zauscher, S. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by α-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22 (37), 19506-19513 (2012).
  24. Bailey-Hytholt, C. M., Shen, T. L., Nie, B., Tripathi, A., Shukla, A. Placental Trophoblast-Inspired Lipid Bilayers for Cell-Free Investigation of Molecular Interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (28), 31099-31111 (2020).
  25. Domenech, O., Francius, G., Tulkens, P. M., Van Bambeke, F., Dufrêne, Y., Mingeot-Leclercq, M. -P. Interactions of oritavancin, a new lipoglycopeptide derived from vancomycin, with phospholipid bilayers: Effect on membrane permeability and nanoscale lipid membrane organization. Biochimica et biophysica acta. 1788 (9), 1832-1840 (2009).
  26. Bailey, C. M., Kamaloo, E., Waterman, K. L., Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. a Size dependence of gold nanoparticle interactions with a supported lipid bilayer: A QCM-D study. Biophysical Chemistry. 203-204, 51-61 (2015).
  27. Bailey-Hytholt, C. M., Puranik, T., Tripathi, A., Shukla, A. Investigating interactions of phthalate environmental toxicants with lipid structures. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 190, 110923 (2020).
  28. Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Antimicrobial peptide alamethicin insertion into lipid bilayer: a QCM-D exploration. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 116, 472-481 (2014).
  29. Lozeau, L. D., Rolle, M. W., Camesano, T. A. A QCM-D study of the concentration- and time-dependent interactions of human LL37 with model mammalian lipid bilayers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167 (1), 229-238 (2018).
  30. Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
  31. Ren, X., et al. Design, fabrication, and characterization of archaeal tetraether free-standing planar membranes in a PDMS-and PCB-based fluidic platform. ACS Applied Materials & Interfaces. 6 (15), 12618-12628 (2014).
  32. Seo, P. R., Teksin, Z. S., Kao, J. P. Y., Polli, J. E. Lipid composition effect on permeability across PAMPA. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 29 (3-4), 259-268 (2006).
  33. Avdeef, A. The rise of PAMPA. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 1 (2), 325-342 (2005).
  34. Avdeef, A., Artursson, P., Neuhoff, S., Lazorova, L., Gråsjö, J., Tavelin, S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA method. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 24 (4), 333-349 (2005).
  35. Campbell, S. D., Regina, K. J., Kharasch, E. D. Significance of Lipid Composition in a Blood-Brain Barrier-Mimetic PAMPA Assay. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 437-444 (2014).
  36. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  37. Schmidt, D., Lynch, J. Evaluation of the reproducibility of Parallel Artificial Membrane Permation Assays (PAMPA). EMD Millipore Corporation. , (2020).
  38. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  39. Nayar, R., Hope, M. J., Cullis, P. R. Generation of large unilamellar vesicles from long-chain saturated phosphatidylcholines by extrusion technique. BBA - Biomembranes. 986 (2), 200-206 (1989).
  40. Lind, T. K., Skida, M. W. A., Cárdenas, M. Formation and Characterization of Supported Lipid Bilayers Composed of Phosphatidylethanolamine and Phosphatidylglycerol by Vesicle Fusion, a Simple but Relevant Model for Bacterial Membranes. ACS Omega. 4 (6), 10687-10694 (2019).
  41. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  42. Bermejo, M., et al. PAMPA-a drug absorption in vitro model: 7. Comparing rat in situ, Caco-2, and PAMPA permeability of fluoroquinolones. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (4), 429-441 (2004).
  43. Kerns, E. H., Di, L., Petusky, S., Farris, M., Ley, R., Jupp, P. Application of parallel artificial membrane permeability assay and Caco-2 permeability. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (6), 1440-1453 (2004).
  44. Masungi, C., et al. Parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) combined with a 10-day multiscreen Caco-2 cell culture as a tool for assessing new drug candidates. Pharmazie. 63 (3), 194-199 (2008).
  45. Vera-González, N., et al. Anidulafungin liposome nanoparticles exhibit antifungal activity against planktonic and biofilm Candida albicans. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (11), 2263-2276 (2020).
  46. Barenholz, Y., Gibbes, D., Litman, B. J., Goll, J., Thompson, T. E., Carlson, F. D. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (1), 2806-2810 (1977).
  47. El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1798 (4), 750-765 (2010).
  48. Tawa, K., Morigaki, K. Substrate-supported phospholipid membranes studied by surface plasmon resonance and surface plasmon fluorescence spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (4), 2750-2758 (2005).
  49. Koenig, B. W., et al. Neutron Reflectivity and Atomic Force Microscopy Studies of a Lipid Bilayer in Water Adsorbed to the Surface of a Silicon Single Crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  50. Lind, T. K., Cárdenas, M. Understanding the formation of supported lipid bilayers via vesicle fusion-A case that exemplifies the need for the complementary method approach (Review). Biointerphases. 11 (2), 020801 (2016).
  51. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  52. Isaksson, S., et al. Protein-Containing Lipid Bilayers Intercalated with Size-Matched Mesoporous Silica Thin Films. Nano Letters. 17 (1), 476-485 (2017).

Tags

Bioengineering udgave 174
Samling af cell mimicking Understøttet og suspenderet Lipid Bilayer Modeller for studiet af molekylære interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., … More

Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., Shukla, A. Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions. J. Vis. Exp. (174), e62599, doi:10.3791/62599 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter