Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.
Modelcelmembranen zijn een nuttig screeningsinstrument met toepassingen variërend van vroege ontdekking van geneesmiddelen tot toxiciteitsstudies. Het celmembraan is een cruciale beschermende barrière voor alle celtypen, die de interne cellulaire componenten scheidt van de extracellulaire omgeving. Deze membranen bestaan grotendeels uit een lipide bilayer, die buitenste hydrofiele kopgroepen en binnenste hydrofobe staartgroepen bevat, samen met verschillende eiwitten en cholesterol. De samenstelling en structuur van de lipiden zelf spelen een cruciale rol bij het reguleren van de biologische functie, inclusief interacties tussen cellen en de cellulaire micro-omgeving, die geneesmiddelen, biologische toxines en milieutoxische stoffen kunnen bevatten. In deze studie worden methoden beschreven om uni-lipide en multi-lipide ondersteunde en gesuspendeerde cel nabootsende lipide bilayers te formuleren. Eerder werden uni-lipide fosfatidylcholine (PC) lipide bilayers en multi-lipid placentale trophoblast-geïnspireerde lipide bilayers ontwikkeld voor gebruik bij het begrijpen van moleculaire interacties. Hier zullen methoden voor het bereiken van beide soorten tweelaagse modellen worden gepresenteerd. Voor celimitoren met meerdere lipiden wordt de gewenste lipidesamenstelling eerst bepaald via lipide-extractie uit primaire cellen of cellijnen, gevolgd door vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). Met behulp van deze samenstelling worden lipideblaasjes vervaardigd met behulp van een dunne film hydratatie- en extrusiemethode en hun hydrodynamische diameter en zeta-potentieel worden gekarakteriseerd. Ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayers kunnen vervolgens worden gevormd met behulp van kwartskristal microbalans met dissipatiemonitoring (QCM-D) en op een poreus membraan voor gebruik in een parallelle kunstmatige membraandoorlaatbaarheidstest (PAMPA), respectievelijk. De representatieve resultaten benadrukken de reproduceerbaarheid en veelzijdigheid van in vitro celmembraan lipide bilayer modellen. De gepresenteerde methoden kunnen helpen bij een snelle, gemakkelijke beoordeling van de interactiemechanismen, zoals permeatie, adsorptie en inbedding, van verschillende moleculen en macromoleculen met een celmembraan, wat helpt bij de screening van kandidaat-geneesmiddelen en voorspelling van potentiële cellulaire toxiciteit.
Het celmembraan, voornamelijk samengesteld uit fosfolipiden, cholesterol en eiwitten, is een cruciaal onderdeel van alle levende cellen1. Met organisatie gedreven door lipide amfififilie, functioneert het celmembraan als een beschermende barrière en reguleert het hoe de cel interageert met zijn omgeving2. Verschillende cellulaire processen zijn afhankelijk van de lipide- en eiwitsamenstelling van hetmembraan 1,2. Celmembraaninteracties zijn bijvoorbeeld belangrijk voor effectieve medicijnafgifte3. Farmaceutische producten, biologische geneesmiddelen, nanomaterialen, biologische toxines en milieutoxische stoffen kunnen de integriteit van een celmembraan beïnvloeden, waardoor de cellulaire functie wordt beïnvloed4. De constructie van in vitro cel nabootsende membraanmodellen op basis van de lipidesamenstelling van celmembranen heeft het potentieel om gemakkelijke hulpmiddelen te bieden om de studie van de potentiële impact van deze materialen op cellen aanzienlijk te verbeteren.
Model lipide bilayers omvatten lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers, en gesuspendeerde lipide bilayers. Ondersteunde lipide bilayers zijn een model van het fosfolipide celmembraan dat vaak wordt gebruikt in biotechnologische toepassingen waarbij lipideblaasjes worden gescheurd op een ondersteund substraatmateriaal5,6,7,8,9. Een veelgebruikte techniek om de vorming van twee lagen te monitoren is kwartskristal microbalans met dissipatiemonitoring (QCM-D), die de adsorptie van blaasjes onderzoekt in vergelijking met de bulkvloeistofeigenschappen in situ8,10,11,12,13,14 . Eerder is QCM-D gebruikt om aan te tonen dat onder stroomomstandigheden, zodra een kritische blaasjesdekking van fosfatidylcholine (PC) lipideblaasjes op het oppervlak wordt bereikt, ze spontaan scheuren in stijve lipide bilayers15. Eerder werk heeft ook de vorming van ondersteunde lipide bilayer onderzocht met verschillende lipidesamenstellingen16, opname van lipide-eiwitten17,18,19en het gebruik van polymeerkussens20, wat ondersteunde lipide bilayers oplevert die in staat zijn om verschillende aspecten van de celmembraanfunctie na te bootsen.
Lipide bilayers zijn gebruikt om verschillende biologische barrières na te bootsen van subcellulaire tot orgaanniveaus, waaronder mitochondrion, rode bloedcel en levercelmembranen door de fosfolipide-, cholesterol- en glycolipidecomponenten te veranderen21. Deze complexere multi-lipide blaasjes kunnen aanvullende methoden vereisen om vesikelruptuur te bereiken, afhankelijk van de lipidesamenstelling. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld een α-spiraalvormig (AH) peptide gebruikt dat is afgeleid van het niet-structurele eiwit 5A van het hepatitis C-virus om dubbellaagse vorming te induceren door de geadsorbeerde lipidenblaasjes te destabiliseren22,23. Met behulp van dit AH-peptide zijn eerder ondersteunde lipide bilayers gevormd die placentacellen nabootsen24. Het grote potentieel van ondersteunde lipide bilayers voor biomedische toepassingen is aangetoond met onderzoeken die moleculair en nanodeeltjestransportomvatten 25,26,omgevingstoxische interacties27,eiwitassemblage en -functie17,18,19,peptide-arrangement en insertie28,29,medicijnscreening30en microfluïdische platforms31.
Gesuspendeerde lipide bilayers zijn gebruikt voor farmaceutische screeningstudies via een parallelle kunstmatige membraandoorlaatbaarheidstest (PAMPA) waarbij een lipide bilayer wordt gesuspendeerd over een poreuze hydrofobe insert32,33,34,35. PAMPA lipide modellen zijn ontwikkeld voor verschillende biologische interfaces, waaronder de bloed-hersenen, buccale, intestinale en transdermale interfaces36. Door zowel de ondersteunde lipide bilayer als PAMPA technieken te combineren, kunnen adsorptie, permeabiliteit en inbedding van verbindingen in lipidecomponenten van een gewenst weefsel- of celtype grondig worden bestudeerd.
Dit protocol beschrijft de fabricage en toepassing van in vitro celmembraan lipide bilayer modellen om verschillende moleculaire interacties te onderzoeken. Voorbereiding van zowel uni-lipide als multi-lipide ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayers is gedetailleerd. Om een ondersteunde lipide bilayer te vormen, worden lipideblaasjes eerst ontwikkeld met behulp van dunne-film hydratatie- en extrusiemethoden gevolgd door fysisch-chemische karakterisering. Vorming van een ondersteunde lipide bilayer met behulp van QCM-D monitoring en fabricage van gesuspendeerde lipidembranen voor gebruik in PAMPA wordt besproken. Ten slotte worden multi-lipide blaasjes voor de ontwikkeling van complexere celnabootsende membranen onderzocht. Met behulp van beide soorten gefabriceerde lipidemembranen laat dit protocol zien hoe deze tool kan worden gebruikt om moleculaire interacties te bestuderen. Over het algemeen construeert deze techniek cel nabootsende lipide bilayers met een hoge reproduceerbaarheid en veelzijdigheid.
Dit protocol zorgt voor de vorming van lipideblaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Hier worden kritieke stappen gepresenteerd om elk van deze structuren te vormen. Bij het vormen van lipideblaasjes is het belangrijk om boven de overgangstemperatuur van het lipide uit te extruderen39. Wanneer het onder de overgangstemperatuur ligt, is het lipide fysiek aanwezig in de geordende gelfase39. In deze geordende fase zijn de koolwaterstoflipidens…
The authors have nothing to disclose.
Dit materiaal is gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door de National Science Foundation onder Grant No. 1942418 toegekend aan AS, en een National Science Foundation Graduate Research Fellowship toegekend aan C.M.B.H., onder Grant No. 1644760. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de National Science Foundation. De auteurs bedanken Dr. Noel Vera-González voor lipide vesikel karakterisering data acquisitie. De auteurs bedanken professor Robert Hurt (Brown University) voor het gebruik van zijn Zetasizer. De auteurs bedanken de Brown University Mass Spectrometry Facility, in het bijzonder Dr. Tun-Li Shen voor hulp bij het kwantificeren van de lipidensamenstelling.
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC, 16:0-18:1 PC) | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840034 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) | Avanti Polar Lipids | 850757 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) | Avanti Polar Lipids | 890703 | |
3 mL Luer-Loc syringes | BD | 309657 | |
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner | Duran Wheaton Kimble | W224605 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
Alconox | Fisher Scientific | 50-821-781 | |
Ammonium formate | Millipore Sigma | LSAC70221 | |
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire | Waters | 186002551 | |
Chloroform | Millipore Sigma | LSAC288306 | |
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK | Sarstedt | 67.758.001 | |
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) | Millipore Sigma | 36735 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | LSAC472301 | |
Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Filter supports, 10 mm | Avanti Polar Lipids | 610014 | Size for mini extruder |
Folded capillary zeta cell | Malvern Panalytical | DTS1070 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764-4L | |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34256 | |
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
LiposoFast ® LF-50 | Avestin, Inc. | ||
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 – 4L | |
Mini-extruder set with holder/heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile | Millipore Sigma | MAIPS4510 | for PAMPA studies |
Nitrogen gas, ultrapure | TechAir | NI T5.0 | |
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um | Whatman | 800309 | Size for mini extruder |
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um | Whatman | 110605 | Size for large extruder |
Parafilm | Bemis | PM999 | |
Phosphate buffer saline (PBS), 10x | Genesee Scienfitic | 25-507X | Dilute to 1x |
Qsoft 401 software | Biolin Scientific | ||
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer | Biolin Scientific | ||
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL | Duran Wheaton Kimble | 986561 | |
Silicon Dioxide, thin QSensors | Biolin Scientific | QSX 303 | |
Sodium chloride (NaCl) | Millipore Sigma | LSACS5886 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-100 | |
Solvent Safe pipette tips | Sigma-Aldrich | S8064 | |
Sphingomyelin (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 860061 | |
Trizma base | Millipore Sigma | LSACT1503 | |
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid | Caisson Labs | TRL01-6X100ML | |
Whatman drain disc, 25 mm | Whatman | 230600 | Size for large extruder |
Zetasizer ZS90 | Malvern Panalytical | ||
Zetasizer 7.01 software | Malvern Panalytical |