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Medicine

एलर्जी निदान के लिए बेसोफिल सक्रियण परीक्षण

Published: May 31, 2021 doi: 10.3791/62600
Automatic Translation
*1,2, *2, 2,3, 1,2,4,5
1Allergy Unit, Hospital Regional Universitario de Málaga, 2Allergy Research Group, Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA, 3Universidad de Málaga, Departamento de Biología celular, Genética y Fisiología, Universidad de Málaga, 4Departamento de Medicina, Universidad de Málaga, 5Nanostructures for Diagnosing and Treatment of Allergic Diseases Laboratory, Andalusian Center for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND
* These authors contributed equally

Summary

बेसोफिल सक्रियण परीक्षण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सक्रियण मार्करों के माप के माध्यम से एक विशिष्ट उत्तेजना की उपस्थिति में बेसोफिल सक्रियण का पता लगाने के आधार पर आईजीई-मध्यस्थता एलर्जी प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए एक पूरक इन विट्रो नैदानिक परीक्षण है।

Abstract

बेसोफिल सक्रियण परीक्षण (बीएटी) एक पूरक इन विट्रो डायग्नोस्टिक टेस्ट है जिसका उपयोग नैदानिक इतिहास, त्वचा परीक्षण (एसटी), और विशिष्ट आईजीई (एसआईजीई) निर्धारण के अलावा भोजन, कीट विष, दवाओं के साथ-साथ पुरानी पित्ती के कुछ रूपों के लिए आईजीई-मध्यस्थता एलर्जी प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन में किया जा सकता है। हालांकि, नैदानिक एल्गोरिदम में इस तकनीक की भूमिका अत्यधिक परिवर्तनशील है और अच्छी तरह से निर्धारित नहीं है।

बीएटी फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सक्रियण मार्करों (जैसे सीडी 63, सीडी 203 सी) के माप के माध्यम से एलर्जेन / ड्रग क्रॉस-लिंकिंग आईजीई सक्रियण के लिए बेसोफिल प्रतिक्रिया के निर्धारण पर आधारित है। यह परीक्षण एलर्जी निदान की पुष्टि करने के लिए नियंत्रित चुनौती परीक्षणों से बचने के लिए एक उपयोगी और पूरक उपकरण हो सकता है, खासकर गंभीर जीवन-धमकी प्रतिक्रियाओं का सामना करने वाले विषयों में। सामान्य तौर पर, बीएटी के प्रदर्शन पर विचार किया जाना चाहिए यदि i) एलर्जेन / दवा एसटी में गलत सकारात्मक परिणाम पैदा करती है; एसटी या एसआईजीई निर्धारण के लिए उपयोग करने के लिए कोई एलर्जेन / दवा स्रोत नहीं है; iii) रोगी के इतिहास और एसटी या एसआईजीई निर्धारण के बीच मतभेद है; iv) लक्षण बताते हैं कि एसटी के परिणामस्वरूप प्रणालीगत प्रतिक्रिया हो सकती है; v) अपराधी एलर्जेन/ड्रग की पुष्टि करने के लिए सीसीटी पर विचार करने से पहले। परीक्षण की मुख्य सीमाएं गैर-इष्टतम संवेदनशीलता से संबंधित हैं, विशेष रूप से दवा एलर्जी में, नमूना निष्कर्षण के बाद 24 घंटे से अधिक समय तक परीक्षण करने की आवश्यकता नहीं है, और प्रक्रियाओं, सांद्रता और सेल मार्करों के संदर्भ में प्रयोगशालाओं के बीच मानकीकरण की कमी है।

Introduction

आईजीई-मध्यस्थता एलर्जी निदान नैदानिक इतिहास, त्वचा परीक्षण (एसटी), सीरम विशिष्ट आईजीई (एसआईजीई) की मात्रा का परिमाणीकरण, और, यदि इसकी आवश्यकता और संकेत दिया जाता है, तो नियंत्रित चुनौती परीक्षण (सीसीटी) 1,2,3,4,5,6 पर आधारित है। हालांकि, नैदानिक इतिहास अविश्वसनीय हो सकता है क्योंकि सटीक जानकारी की कमी हो सकती है, और एसटी और सीसीटी जोखिम मुक्त प्रक्रियाएं नहीं हैं जिन्हें गंभीर जीवन-धमकी देने वाली प्रतिक्रियाओं का सामना करने वाले विषयों में उल्लंघन किया जा सकता है 1,2,3,4,5,6 . इन मुद्दों के साथ-साथ इस तथ्य के साथ कि मान्य और वाणिज्यिक फ्लोरो-एंजाइम इम्यूनोएसे द्वारा एसआईजीई का निर्धारण केवल कुछ एलर्जी और दवाओं के लिए उपलब्ध है, ने बेसोफिल सक्रियण परीक्षण (बीएटी) जैसे अन्य इन विट्रो कार्यात्मक परखों की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला है।

बेसोफिल आईजीई-मध्यस्थता एलर्जी प्रतिक्रियाओं में शामिल प्रमुख प्रभावक कोशिकाएं हैं जो एलर्जी / दवा के संपर्क के बाद सेल की सतह पर उच्च-आत्मीयता रिसेप्टर्स (एफसीआरआई) पर बंधे आसन्न एसआईजीई के क्रॉस-लिंकिंग पर सक्रिय होती हैं। बेसोफिल सक्रियण सेल अपघटन और इंट्रासाइटोप्लाज्मिक स्राव कणिकाओं 7,8,9 में निहित पूर्व-गठित और नए संश्लेषित भड़काऊ मध्यस्थों की रिहाई को ट्रिगर करता है। बीएटी एक इन विट्रो विधि है जो एक उत्तेजना (एलर्जेन या दवा) की उपस्थिति में बेसोफिल सक्रियण की नकल करने की कोशिश करती है और प्रवाह साइटोमेट्री 7,10 द्वारा बेसोफिल सक्रियण मार्करों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन निर्धारित करती है। बेसोफिल (आईजीई +, सीसीआर 3 +, सीआरटीएच 2 +, सीडी 203 सी +) की पहचान करने और फ्लोरोक्रोम-लेबल एंटीबॉडी 7,10 के संयोजन का उपयोग करके सेल सक्रियण (मुख्य रूप से सीडी 63 और सीडी 203 सी के अपरेगुलेशन) को मापने के लिए विभिन्न रणनीतियां हैं। सीडी 63, सबसे अच्छा चिकित्सकीय रूप से मान्य सक्रियण मार्कर 11,12,13,14, हिस्टामाइन युक्त स्रावी कणिकाओं पर लंगर डालने वाला एक झिल्ली प्रोटीन है, जो कोशिका सक्रियण और झिल्ली के साथ कणिकाओं के संलयन के बाद, बेसोफिल सतह 15,16,17,18,19,20,21 पर व्यक्त किया जाता है . सीडी 203 सी एक सतह मार्कर है जिसे बेसोफिल पर संवैधानिक रूप से व्यक्त किया जाता है और एफसीआरआई उत्तेजना के बाद अनियमित किया जाता है, जिसने बीएटी 15,22,23,24,25 में विश्वसनीय परिणाम भी दिखाए हैं। इसके अलावा, यह सीडी 6326 के साथ सह-व्यक्त प्रतीत होता है।

पिछले दशकों में, बीएटी ने दवाओं, भोजन, या इनहेलेंट्स जैसे विभिन्न ट्रिगर्स के साथ-साथ क्रोनिक पित्ती के कुछ रूपों में प्रेरित आईजीई-मध्यस्थता एलर्जी प्रतिक्रियाओं के निदान में उपयोगी साबित किया है, जैसा कि नीचे वर्णित है। हालांकि, नैदानिक एल्गोरिदम में इस तकनीक की स्थिति अत्यधिक परिवर्तनशील है और अच्छी तरह से निर्धारित नहीं है।

दवा अतिसंवेदनशीलता
बीएटी चयनित दवाओं और रोगियों के लिए एक पूरक परीक्षण के रूप में उपयोगी साबित हुआ है, विशेष रूप से उन लोगों के लिए जो इस तथ्य के कारण गंभीर प्रतिक्रियाओं का अनुभव करते हैं कि एसटी का नैदानिक मूल्य अधिकांश दवाओं के लिए अच्छी तरह से स्थापित नहीं है, क्योंकि वे सीमित संख्या में दवाओं 27,28,29,30 के लिए मान्य और मानकीकृत हैं। इसके अलावा, एसआईजीई का परिमाणीकरण केवल सीमित संख्या में दवाओं के लिए उपलब्ध है, जिसमें एसटी 27,28,29,30,31,32 की तुलना में कम संवेदनशीलता है। इसलिए, दवा अतिसंवेदनशीलता का निदान आमतौर पर दवा उत्तेजना परीक्षण पर निर्भर करता है, जिसे गंभीर जीवन-धमकी देने वाली प्रतिक्रियाओं का सामना करने वाले विषयों में उल्लंघन किया जा सकताहै।

चुनिंदा रोगियों में बीएटी के उपयोग के लिए आशाजनक परिणाम बताए गए हैं, जो बीटालैक्टम (बीएल) 20,34,35,36,37,38,39, न्यूरोमस्कुलर ब्लॉकिंग एजेंट (एनएमबीए) 19,22,40,41,42, जैसे विभिन्न दवाओं के लिए तत्काल अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं की रिपोर्ट करते हैं। 43,44,45, फ्लोरोक्विनोलोन (एफक्यू) 46,47,48,49, पाइराज़ोलोन 50,51,52, रेडियोकंट्रास्ट मीडिया (आरसीएम) 53,54,55,56, और प्लैटिनम यौगिक 57,58,59 . बीएटी को क्रमशः 51.7-66.9% और 89.2-97.8% के बीच संवेदनशीलता और विशिष्टता की सूचना दी गई है; और सकारात्मक और नकारात्मक पूर्वानुमानमूल्यक्रमक्रमशः 93.4% और 66.3% के बीच वर्णित हैं,क्रमशः 27,31। इसके अलावा, बैट को प्लेटिनम यौगिकों के साथ डिसेन्सिटाइजेशन के दौरान ब्रेकथ्रू प्रतिक्रियाओं के लिए एक पूर्वानुमानित बायोमार्कर के रूप में प्रस्तावित किया गया है, क्योंकि सीडी 203 सी अभिव्यक्ति दवा डिसेन्सिटाइजेशन के दौरान प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं के उच्च जोखिम वाले रोगियों में सीडी 63 की तुलना में बढ़जाती है।

यह ध्यान देने योग्य है कि बीएटी केवल दवा अतिसंवेदनशीलता में उपयोगी है जब प्रतिक्रिया में बेसोफिल डीग्रानुलेशन शामिल होता है; इसलिए, यह साइक्लोऑक्सीजिनेज 142 के एंजाइमेटिक निषेध के परिणामस्वरूप प्रतिक्रियाओं में उपयोगी नहीं है।

खाद्य एलर्जी
बीएटी खाद्य एलर्जी के लिए एक संभावित नैदानिक उपकरण के रूप में उभरा है क्योंकि पूरे एलर्जेन अर्क या एकल एलर्जी के लिए सीरम एसआईजीई का निर्धारण अक्सर अस्पष्ट होता है, निदान की पुष्टि करने के लिए मौखिक खाद्य चुनौती की आवश्यकता होती है, जो दवा अतिसंवेदनशीलता के समान, एक महंगी और जोखिममुक्त प्रक्रिया नहीं है। कई अध्ययनों ने गाय के दूध61,62, अंडा61,63, गेहूं 64,65,66,67,68, मूंगफली 63,69,70,71,72, हेज़लनट 73,74,75,76 के साथ प्रासंगिक परिणाम दिखाए हैं , 77, शेलफिश78, आड़ू 79,80,81, सेब21, अजवाइन, और गाजर82,83।

सीरम में एसटी और एसआईजीई की तुलना में खाद्य एलर्जी के निदान में बीएटी का मुख्य अतिरिक्त मूल्य यह है कि यह एक उच्च विशिष्टता और समान संवेदनशीलता दिखाता है। इस प्रकार, बीएटी चिकित्सकीय एलर्जी रोगियों को संवेदनशील, लेकिन सहिष्णु, विषयों से अलग करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, जिनमें उच्च विशिष्टता (75-100%) और संवेदनशीलता (77-98%) 63,69,84 दोनों हैं। संवेदनशीलता और विशिष्टता मूल्य एलर्जेन और अन्य कारकों पर फेनोटाइप (जैसे, मौखिक एलर्जी सिंड्रोम बनाम एनाफिलेक्सिस), आयु और भूगोल से संबंधित संवेदीकरण पैटर्न63,85 पर निर्भर करते हैं।

एकल एलर्जेन घटकों का उपयोग करके बीएटी संभावित रूप से कुछ खाद्य एलर्जी61,80 के लिए नैदानिक सटीकता में सुधार कर सकता है। बीज भंडारण प्रोटीन (जैसे, आरा एच 1, आरा एच 2, आरा एच 3 और मूंगफली से आरा एच 6) 86 का उपयोग करने वाले अध्ययन हैं; लिपिड ट्रांसफर प्रोटीन (उदाहरण के लिए, आड़ू से प्रू पी 3 और मूंगफली से आरा एच 9) 80,86; और बेट वी 1 होमोलॉग (उदाहरण के लिए, मूंगफली से आरा एच 8) 87। अन्य संभावित उपयोगिताएं पराग-खाद्य एलर्जी सिंड्रोम 21,87,88, लाल मांस 89 से एलर्जी, या खाद्य-निर्भर व्यायाम-प्रेरित एनाफिलेक्सिस66 के मामलों में अपराधी एलर्जेन की पहचान से संबंधित हैं।

दिलचस्प बात यह है कि बीएटी एलर्जी प्रतिक्रियाओं की गंभीरता और दहलीज के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है क्योंकि अधिक गंभीर प्रतिक्रियाओं वाले रोगी सक्रिय बेसोफिल का अधिक अनुपात दिखाते हैं, जैसा कि मूंगफली और गाय के दूध-एलर्जी रोगियों के अध्ययन में देखा गयाहै 84,90,91; और एलर्जेन की ट्रेस मात्रा पर प्रतिक्रिया करने वाले रोगी अधिक बेसोफिल संवेदनशीलता 84,90,92 दिखाते हैं। इन आंकड़ों से पता चलता है कि बीएटी उच्च जोखिम वाले एलर्जी रोगियों की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है, जिन्हें निकट अनुवर्ती और अधिक गहन शिक्षा की आवश्यकता होतीहै। इसके अलावा, यह बताया गया है कि बीएटी खाद्य चुनौती प्रतिक्रियाओं 70,91,92,94 और प्रतिक्रियाशीलता की सीमा 90,95 की भविष्यवाणी कर सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि भोजन को सुरक्षित रूप से कब पेश किया जा सकता है। हालांकि, ये निष्कर्ष कुछ अध्ययनों में विवादास्पद हैं63,96 और अधिक शोध की आवश्यकता है।

दूसरी ओर, बीएटी का उपयोग समय के साथ प्राकृतिक रूप से या इम्यूनोमॉड्यूलेटरी उपचार के तहत खाद्य एलर्जी के समाधान की निगरानी के लिए किया गया है, जो अब तक केवल मौखिक खाद्य चुनौती द्वारा मूल्यांकन किया गया है, जिसमें संबंधित जोखिम और लागत 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 है। , 107,108। इसके अलावा, इसका उपयोग खाद्य एलर्जी में ओमेलिज़ुमाब के प्रभाव की निगरानी के लिए भी किया गया है क्योंकि ओमेलिज़ुमाब के साथ उपचार के दौरान बेसोफिल सक्रियण कम हो जाता है, लेकिन उपचार109 की समाप्ति के बाद यह बढ़ जाता है।

इनहेलेंट एलर्जी
बीएटी इनहेलेंट एलर्जी में शायद ही कभी फायदेमंद होता है क्योंकि निदान नियमित रूप से एसआईजीई परिमाणीकरण और एसटी द्वारा स्थापित किया जा सकता है। हालांकि, स्थानीय एलर्जी राइनाइटिस (सकारात्मक नाक उत्तेजना परीक्षणों के साथ एसआईजीई और नकारात्मक एसटी के अज्ञात स्तर) केमामलों में, बीएटी ने 50% मामलों में निदान की अनुमति दी है। ब्रोन्कियल उत्तेजना परीक्षणों के लिए बेसोफिल संवेदनशीलता और प्रतिक्रिया के साथ-साथ अस्थमा की गंभीरता और ओमेलिज़ुमाब111,112 के साथ उपचार की प्रभावकारिता के बीच एक सहसंबंध की सूचना दी गई है।

बीएटी का उपयोग घर की धूल के कण और पराग के लिए एलर्जेन इम्यूनोथेरेपी की निगरानी के लिए भी किया गया है, क्योंकि इम्यूनोथेरेपी के दौरान बेसोफिल संवेदनशीलता कम हो जाती है, संभवतः आईजीजी एंटीबॉडी 113,114,115,116,117 को अवरुद्ध करने के हस्तक्षेप के कारण।

हाइमनोप्टेराजहर एलर्जी
हाइमनोप्टेरा विष एलर्जी का निदान नियमित रूप से एसटी और सीरम एसआईजीई पर आधारित है। बीएटी ने एक उच्च संवेदनशीलता (85-100%) और विशिष्टता (83-100%) दिखाई है और यह उन मामलों में उपयोगी बताया गया है जो अस्पष्ट परिणाम देते हैं या जहर एलर्जी के विचारोत्तेजक नैदानिक इतिहास वाले रोगियों में लेकिन अज्ञात एसआईजीई और नकारात्मक एसटी118,119। हालांकि, बीएटी इन प्रतिक्रियाओं120,121 के लिए गंभीरता का पूर्वानुमान नहीं प्रतीत होता है।

60% तक रोगी ततैया और मधुमक्खी के जहर दोनों के लिए एसआईजीई प्रदर्शित करते हैं, और पर्याप्त इम्यूनोथेरेपी उपचार के लिए प्रमुख एलर्जेन की पहचान महत्वपूर्ण है। इन मामलों में, बीएटी को प्रमुख एलर्जेन119,122,123,124 की पहचान में उपयोगी बताया गया है। यद्यपि मधुमक्खी और ततैया के जहर के प्रमुख एलर्जी के लिए एसआईजीई दोनों जहरों के लिए दोहरी सकारात्मकता वाले रोगियों में बीएटी की उपयोगिता को कम कर सकता है, यह मुख्य रूप से एसआईजीई निर्धारण123 में नकारात्मक परिणामों वाले विषयों में उपयोगी जानकारी प्रदान करता है।

कुछ अध्ययनों से पता चलता है कि बैट विष इम्यूनोथेरेपी के बिल्ड-अप चरण के दौरान साइड इफेक्ट्स के लिए एक पूर्वानुमानित बायोमार्कर के रूप में उपयोगी हो सकता है क्योंकि इस उपचार विकल्प को बेसोफिल संवेदनशीलता को कम करने के लिए बताया गया है। हालांकि, प्रतिक्रियाशीलता कम नहीं होती है और यह बीएटी उपयोगिता आजकल विवादास्पद 13,120,125,126,127,128,129,130 है।

पित्ती और एंजियोएडेमा
क्रोनिक अर्टिकारिया रोगियों के एक उप-समूह में एक ऑटोइम्यून पैथोफिज़ियोलॉजी होती है, जिसके कारण आईजीई ऑटोएंटीबॉडीज ऑटोएलर्जेंस और आईजीजी ऑटोएंटीबॉडीज होते हैं जो मस्तूल सेल की सतह131,132 पर मौजूद एफसीआरआई या आईजीई-एफसीआरआई कॉम्प्लेक्स को लक्षित करते हैं। नैदानिक अभ्यास में, इस प्रकार के क्रोनिक अर्टिकारिया का निदान सकारात्मक ऑटोलॉगस सीरम एसटी पर निर्भर है, जिसमें आकस्मिक संक्रमण का खतरा है। बीएटी को संदिग्ध क्रोनिक पित्ती वाले रोगियों के निदान और निगरानी के लिए इन विट्रो परीक्षण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। बेसोफिल की सतह पर सीडी 63 और सीडी 203 सी अभिव्यक्ति दोनों को क्रोनिक अर्टिकारिया रोगियों से सेरा के साथ उत्तेजना के बाद बढ़ने की सूचना मिली है, जो सक्रिय ऑटोएंटीबॉडीज 133,134,135,136,137 का पता लगाते हैं। हाल ही में, यह बताया गया है कि सकारात्मक बीएटी वाले रोगी अक्सर सबसे सक्रिय रोग स्थिति का अनुभव करते हैं, जो पित्ती गतिविधि स्कोर द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, और नकारात्मक बीएटी138 वाले लोगों की तुलना में तीसरी पंक्ति के उपचार (साइक्लोस्पोरिन ए या ओमेलिज़ुमैब) के साथ एंटीथिस्टेमाइंस की उच्च खुराक की आवश्यकता होती है।

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Protocol

प्रोटोकॉल प्रदर्शन हेलसिंकी सिद्धांतों की घोषणा के अनुसार आयोजित किया गया था और स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (कॉमिटे डे एटिका पैरा ला इन्वेस्टिगासियोन प्रांतीय डी मलागा, स्पेन)। सभी विषयों को शोध अध्ययन के बारे में मौखिक रूप से सूचित किया गया था और उन्होंने संबंधित सूचित सहमति फॉर्म पर हस्ताक्षर किए थे।

नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल बीएटी प्रक्रिया का विवरण देता है जो लेखक दैनिक उपयोग करते हैं। हालांकि, यह एक मानकीकृत विधि नहीं है और अन्य लेखकों द्वारा प्रकाशित प्रक्रियाओं के साथ मतभेद मौजूद हैं। मुख्य प्रोटोकॉल संशोधन उत्तेजना बफर में आईएल -3 के उपयोग से संबंधित हैं, उत्तेजना के साथ इनक्यूबेशन समय, बेसोफिल डिग्रेनुलेशन को रोकने की विधि, और प्रवाह साइटोमेट्री रणनीतियों। इसके अलावा, बीएटी के लिए विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में निर्माता द्वारा अनुशंसित विशिष्ट प्रोटोकॉल शामिल हैं।

1. नमूना तैयार करना

  1. 9 एमएल हेपरिनाइज्ड ट्यूबों में परिधीय रक्त एकत्र करें और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक होने तक रोटर में कमरे के तापमान (आरटी) पर नमूने को बनाए रखें।
  2. नकारात्मक नियंत्रण (2 ट्यूब), सकारात्मक नियंत्रण (2 ट्यूब) और एलर्जेन / दवा की विभिन्न सांद्रता (प्रत्येक एलर्जेन / दवा एकाग्रता परीक्षण के लिए 1 ट्यूब) के लिए लेबल 5 एमएल साइटोमीटर ट्यूब। ट्यूबों को एक रैक में रखें जहां ट्यूब फिसलने के बिना पूरी तरह से फिट होते हैं।
  3. डबल आसुत जल में उत्तेजना बफर तैयार करें जिसमें 2% (v/v) HEPES, 78 mg/L NaCl, 3.7 mg/L KCl, 7.8 mg/L CaCl2, 3.3 mg/L MgCl2, 1 g/L HSA हो। पीएच को 7.4 में समायोजित करें और आईएल -3 को 2 एनजी / एमएल पर जोड़ें। आमतौर पर 100 एमएल तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए होने के लिए 2.5 एमएल एलिकोट में विभाजित करें।
  4. बेसोफिल की गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए पीबीएस-ट्वीन -20 0.05% (वी / वी) (पीबीएस-टी) में सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें: सकारात्मक नियंत्रण 1, एन-फॉर्मिलमिथाइल-ल्यूसिल-फेनिलएलनिन (एफएमएलपी) (4 μM); सकारात्मक नियंत्रण 2, एंटी-आईजीई (0.05 मिलीग्राम / एमएल) आईजीई-मध्यस्थता सकारात्मक नियंत्रण के रूप में।
  5. वांछित अंतिम एकाग्रता पर 2 गुना पर पीबीएस-टी में एलर्जेन / दवा तैयार करें।
    दवा सांद्रता का उपयोग पहले सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करके, खुराक-प्रतिक्रिया वक्रों द्वारा, और साइटोटॉक्सिसिटी अध्ययनों द्वारा एक ही प्रोटोकॉल चरण139 का पालन करके निर्धारित किया जाना चाहिए।

2. धुंधला मिश्रण तैयारी

  1. निर्माता की अनुशंसित एंटीबॉडी एकाग्रता या पिछले एंटीबॉडी अनुमापन के बाद उत्तेजना बफर में फ्लोरोक्रोम के साथ लेबल किए गए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जोड़ें। इस प्रोटोकॉल में हम बेसोफिल पहचान के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी (सीसीआर 3-एपीसी और सीडी 203 सी-पीई) के 1 μL जोड़ते हैं; बेसोफिल सक्रियण के लिए सीडी 63-एफआईटीसी) 140 प्रति 20 μL उत्तेजना बफर।
    नोट: प्रकाश से धुंधला मिश्रण तैयारी की रक्षा करें।
  2. प्रत्येक ट्यूब में 23 μL धुंधला मिश्रण जोड़ें।

3. रक्त उत्तेजना

  1. ट्यूब 1 और 2 (नकारात्मक नियंत्रण) में पीबीएस-टी के 100 μL जोड़ें, ट्यूब 3 में fMLP का 100 μL, ट्यूब 4 में एंटी-आईजीई का 100 μL, और निम्नलिखित ट्यूबों में विभिन्न एलर्जेन / ड्रग सांद्रता का 100 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए थर्मोस्टेटिक स्नान में मध्यम आंदोलन के साथ प्रीवार्म अभिकर्मकों को इनक्यूबेट करें।
  2. हेमोलिसिस से बचने के लिए धीरे से प्रत्येक ट्यूब में 100 μL रक्त जोड़ें। धीरे-धीरे भंवर ट्यूबों को हल्का करें और मध्यम आंदोलन के साथ थर्मोस्टेटिक स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. कम से कम 5 मिनट के लिए ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखते हुए, अपघटन को रोकें।
    नोट: प्रोटोकॉल को 30-45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रोका जा सकता है यदि आवश्यकहो तो 141,142,143।

4. एरिथ्रोसाइट्स लाइसिंग

  1. लाइस एरिथ्रोसाइट्स के लिए प्रत्येक ट्यूब में 2 एमएल 1x लाइसिंग बफर जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब को भंवर करें और आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस चरण में, बफर में निहित फिक्सेटिव एजेंटों (फॉर्मलाडेहाइड) के कारण कोशिकाओं को तय किया जाता है।
  2. सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x g पर। सुपरनैटेंट को डिकेंट करें, रैक को एक सिंक में पलट दें। कोशिकाएं ट्यूबों के तल पर रहती हैं।
  3. कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 3 एमएल पीबीएस-टी जोड़ें। वोर्टेक्स प्रत्येक ट्यूब।
  4. सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x g पर। सुपरनैटेंट को डिकेंट करें, रैक को एक सिंक में पलट दें।
    नोट: नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें, प्रवाह साइटोमीटर अधिग्रहण तक प्रकाश से सुरक्षित रहें।

5. फ्लो साइटोमेट्री अधिग्रहण

  1. प्रवाह साइटोमीटर (जैसे, बीडी एफएसीएसकैलिबर फ्लो साइटोमीटर) द्वारा नमूने प्राप्त करें। प्रवाह साइटोमीटर को कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर से कनेक्ट करें और साइटोमीटर तैयार होने की प्रतीक्षा करें। टेम्पलेट और उपकरण सेटिंग्स लोड करें (तालिका 1).
  2. नमूना अधिग्रहण प्रारंभ करें.
  3. सक्रिय बेसोफिल139 के चयन के लिए निम्न साइटोमीटर रणनीतियों का उपयोग करें।
    1. साइड स्कैटर (एसएससी) - फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) प्लॉट से लिम्फोसाइटों को गेट करें।
    2. लिम्फोसाइट आबादी से बेसोफिल को सीसीआर 3 + सीडी 203 सी + कोशिकाओं के रूप में गेट करें। प्रति ट्यूब कम से कम 500 बेसोफिल प्राप्त करें।
    3. सक्रियण मार्कर के रूप में CD63 का उपयोग करसक्रियण का विश्लेषण करने के लिए CCR3 - CD63 प्लॉट दिखाएँ. नकारात्मक नियंत्रण ट्यूबों का उपयोग करके सीडी 63 नकारात्मक सीमा को लगभग 2.5% पर सेट करें।
    4. सभी नमूने प्राप्त करें।

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Representative Results

एलर्जी या दवाओं के साथ किया गया बीएटी आईजीई-निर्भर अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं की जांच की अनुमति देता है। सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए बेसोफिल प्रतिक्रिया को कम से कम दो इष्टतम सांद्रता में मापा जाना चाहिएऔर सक्रियण को सेल की सतह पर सीडी 63 के अपरेग्यूलेशन द्वारा देखा जाता है। एलर्जी के मामले में, इसके अलावा, बेसोफिल प्रतिक्रिया की पुष्टि करने के लिए, बेसोफिल संवेदनशीलता का विश्लेषण कई घटते एलर्जेन सांद्रता114 पर प्रतिक्रियाशीलता को मापकर किया जाना चाहिए। यह उपाय एलर्जेन एकाग्रता के निर्धारण की अनुमति देता है जो 50% बेसोफिल (ईसी 50) की प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है, जिसे "सीडी-सेंस" 141 के रूप में व्यक्त किया जा सकता है। खुराक वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र का माप हाल ही में बेसोफिल प्रतिक्रिया और बेसोफिल संवेदनशीलता दोनों का आकलन करने के लिए प्रस्तावित किया गयाहै।

बीएटी परिणामों का विश्लेषण करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री रणनीति चित्रा 1 और चित्रा2 में दिखाई गई है और इसमें एसएससी-एफएससी प्लॉट (चरण 1) से लिम्फोसाइटों को गेट करना, लिम्फोसाइट आबादी से बेसोफिल को सीसीआर 3 + सीडी 203 सी + कोशिकाओं (चरण 2) के रूप में गेट करना शामिल है, जो सक्रियण मार्कर (चरण 3) के रूप में सीडी 63 का उपयोग करके सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए सीसीआर 3 - सीडी 63 प्लॉट दिखाता है। आंकड़े दवाओं (चित्रा 1) और एलर्जी (चित्रा 2) के लिए प्राप्त बीएटी परिणामों के प्रतिनिधि उदाहरण दिखाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: फ्लो साइटोमेट्री द्वारा दवा बेसोफिल सक्रियण परीक्षण का प्रतिनिधि विश्लेषण। (ए) लिम्फोसाइट + बेसोफिल आबादी का चयन करने के लिए एसएससी-एफएससी प्लॉट। (बी) सीसीआर 3-सीडी 203 सी लिम्फोसाइट आबादी से बेसोफिल को सीसीआर 3 + सीडी 203 सी कोशिकाओं के रूप में गेट करने की साजिश रचता है। (सी) सीसीआर 3-सीडी 63 नकारात्मक नियंत्रण, सकारात्मक नियंत्रण और दवा के लिए सक्रियण मार्कर के रूप में सीडी 63 का उपयोग करके सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए साजिश करता है। प्रत्येक पैनल में दिखाए गए मान कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एलर्जेन बेसोफिल सक्रियण परीक्षण का प्रतिनिधि विश्लेषण। (ए) लिम्फोसाइट + बेसोफिल आबादी का चयन करने के लिए एसएससी-एफएससी प्लॉट। (बी) सीसीआर 3-सीडी 203 सी लिम्फोसाइट आबादी से बेसोफिल को सीसीआर 3 + सीडी 203 सी + कोशिकाओं के रूप में गेट करने की साजिश रचता है। (सी) सीसीआर 3-सीडी 63 सक्रियण मार्कर के रूप में सीडी 63 का उपयोग करके सक्रियण का विश्लेषण करने की साजिश करता है जो नकारात्मक नियंत्रण और एलर्जेन की घटती सांद्रता के परिणाम दिखाता है (आरा एच 9)। प्रत्येक पैनल में दिखाए गए मान कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रकाश स्रोत (लेजर) 488 एनएम सुसंगत सफायरटीएम एयर-कूल्ड आर्गन-आयन लेजर; 20 mW; 633-एनएम जेडीएस यूनिफेजटीएम हेने एयर-कूल्ड लेजर; 17 mW
प्रकाश उत्तेजक तरंग दैर्ध्य ब्लू लेजर: 488 एनएम; लाल लेजर: 633 एनएम
उत्तेजक तरंगदैर्ध्य पर प्रकाश स्रोत शक्ति ब्लू लेजर: 20 mW; लाल लेजर: 17 mW
ऑप्टिकल फिल्टर एसएससी: 488/10; एफआईटीसी: 530/30, पीई: 585/42, एपीसी: 660/20
ऑप्टिकल डिटेक्टर एफएससी, एसएससी, एफएल 1-एच एफआईटीसी, एफएल 2-एच पीई, एफएल 4-एच एपीसी
ऑप्टिकल डिटेक्टर ों की पहचान एयर-कूल्ड आर्गन-आयन लेजर
ऑप्टिकल पथ बीडी ऑक्टागन (488 एनएम लेजर लाइन); बीडी ट्रिगॉन्स (633 एनएम लेजर लाइन)

तालिका 1: फ्लो साइटोमीटर आवश्यकताएं

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Discussion

बीएटी आईजीई-मध्यस्थता एलर्जी प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए एक पूरक इन विट्रो डायग्नोस्टिक टेस्ट है जो दवाओं, भोजन या इनहेलेंट्स जैसे विभिन्न ट्रिगर्स के साथ-साथ क्रोनिक पित्ती के कुछ रूपों से प्रेरित प्रतिक्रियाओं के निदान में उपयोगी साबित हुआ है। सामान्य तौर पर, बीएटी प्रदर्शन पर विचार किया जाना चाहिए यदि i) एलर्जेन / दवा एसटी में गलत सकारात्मक परिणाम पैदा करती है; (ii) एलर्जेन/दवा एसटी या एसआईजीई परिमाणीकरण के लिए उपयोग किए जाने के लिए उपलब्ध नहीं है; iii) नैदानिक इतिहास और एसटी या एसआईजीई निर्धारण के बीच मतभेद मौजूद है; iv) लक्षण बताते हैं कि एसटी एक प्रणालीगत प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकता है; (v) अपराधी एलर्जेन/ड्रग कन्फर्मेशन के लिए सीसीटी से पहले।

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के बारे में, परीक्षण के लिए उपयुक्त रक्त के नमूने प्राप्त करने के लिए विभिन्न महत्वपूर्ण पहलुओं पर विचार किया जाना है। प्रणालीगत स्टेरॉयड146 और इम्यूनोसुप्रेसर्स, मौखिक कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स सहित, 147 को बेसोफिल प्रतिक्रिया146 (एंटीथिस्टेमाइंस और सामयिक स्टेरॉयड बीएटी परिणामों को प्रभावित नहीं करते हैं) की कमी के कारण परीक्षण से पहले टाला जाना चाहिए। संक्रमण या सक्रिय पुरानी भड़काऊ स्थितियोंके दौरान परीक्षण नहीं किया जाना चाहिए। प्रतिक्रिया और परीक्षण के बीच अंतराल समय 1 वर्ष से अधिक नहीं होना चाहिए क्योंकि समय के साथ एसआईजीई स्तरों की नकारात्मकता की सूचना दी गईहै 42,52,149। परीक्षण ताजा पूरे रक्त के साथ किया जाता है और रक्त निष्कर्षण150,151 के बाद 24 घंटे से अधिक नहीं किया जाना चाहिए। हेपरिन-स्थिर ट्यूबों में रक्त एकत्र किया जाना चाहिए क्योंकि बेसोफिल डीग्रानेट नहीं होते हैं यदि ईडीटीए या एसिड-साइट्रेट डेक्सट्रोज को स्टेबलाइजर के रूप में उपयोग किया जाता है, हालांकि इसका उपयोग कैल्शियम152 जोड़ने के बाद किया जा सकता है। दूसरी ओर, परीक्षण में उपयोग की जाने वाली उत्तेजना में कोई एक्सिपिएंट्स शामिल नहीं होना चाहिए; इस कारण से, मानकीकृत एलर्जेन अर्क, पुनः संयोजक या शुद्ध एलर्जी, शुद्ध सक्रिय सामग्री या अंतःशिरा इंजेक्शन योग्य दवा की तैयारी की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, दवाओं की रासायनिक विशेषताओं पर विचार करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, कुछ दवाएं समाधान में अस्थिर होती हैं और प्रत्येक परीक्षण से पहले ताजा तैयार की जानी चाहिए, और अन्य फोटो लेबिल हैं और परख को प्रकाश48 से बचाते हुए किया जाना चाहिए। प्रत्येक परीक्षण किए गए एलर्जेन / दवा और आरओसी कर्व्स के लिए विषाक्तता और गैर-विशिष्ट सक्रियण का मूल्यांकन पुष्टि किए गए रोगियों के साथ किया जाना चाहिए और कट-ऑफ निर्धारित करने के लिए सहिष्णु नियंत्रणों का विश्लेषण किया जाना चाहिए। अंत में, बीएटी के विश्लेषण में दोनों सकारात्मक नियंत्रणों के महत्व पर प्रकाश डाला जाना चाहिए। एफएमएलपी एक जीवाणु पेप्टाइड है जो जी-प्रोटीन युग्मित एफएमएलपी रिसेप्टर के माध्यम से बेसोफिल सक्रियण को प्रेरित करता है। इस कारण से, इसका उपयोग अक्सर गैर-आईजीई-मध्यस्थता सक्रियण16 के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। एंटी-आईजीई या वैकल्पिक रूप से एंटी-एफसीआरआई का उपयोग आईजीई-मध्यस्थता बेसोफिल सक्रियण के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। गैर-आईजीई और आईजीई-मध्यस्थता सकारात्मक नियंत्रण दोनों की उपस्थिति में कोई बेसोफिल सक्रियण प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में बेसोफिल या गलतियों की पर्याप्त गुणवत्ता का सुझाव नहीं देता है। इसके विपरीत, एफएमएलपी के साथ सक्रिय बेसोफिल को गैर-उत्तरदाता बेसोफिल के रूप में नामित किया जाता है, लेकिन एंटी-आईजीई या एंटी-एफसीआरआई के साथ नहीं, अनुमान लगाया जा रहा है कि सामान्य आबादी का 6-17% बीएटी 63,84,153 में एफसीआरआई के माध्यम से उत्तेजना के लिए गैर-उत्तरदाता है, हालांकि वे कोशिकाओं की सतह आईजीई के सामान्य घनत्व को व्यक्त करते हैं। गैर-जवाबदेही सीडी45 157 के बढ़े हुए स्तर के साथ साइक फॉस्फेट 154,155,156 के निम्न स्तर से संबंधित हो सकती है। हालांकि अध्ययनों से पता चला है कि गैर-उत्तरदाता बेसोफिल इन विट्रो परखों में आईएल -3158 की उपस्थिति में उत्तरदाताओं में बदल सकते हैं, गैर-उत्तरदाता बेसोफिल अभी भी बीएटी में पाए जा सकते हैं और, इन मामलों में, परिणामों को मूल्यांकन के लिए नहीं माना जा सकता है।

आईएल -3, एक बेसोफिल प्राइमिंग साइटोकिन को शामिल करने के बारे में, कोई सामान्य सहमति मौजूद नहीं है। आईएल-3 के उपयोग से सीडी63 आधारित बीएटी में बेसोफिल प्रतिक्रिया को बढ़ाने की सूचना मिली है, जबकिसीडी63 को 7,159,160 के बाद अपने आप में ऊपर की ओर उत्प्रेरित नहीं किया जा सकता है। हालांकि, एक अन्य अध्ययन से पता चलता है कि आईएल -3 बेसलाइन161 पर सीडी 63 अभिव्यक्ति को विनियमित करता है। इसके विपरीत, सीडी 203 सी-आधारित बीएटी के मामले में, अध्ययन इस बात की पुष्टि करते हैं कि आईएल -3 प्राइमिंग बेसोफिल को आराम करके सीडी 203 सी अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, उत्तेजित और उत्तेजित बेसोफिल के बीच अंतर को कम करता है और बीएटी संवेदनशीलता 159,161 को कम करता है।

बेसोफिल आबादी की पहचान करने और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा बेसोफिल सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न गेटिंग रणनीतियों का उपयोग किया जा सकता है। बेसोफिल कम साइड स्कैटर कोशिकाएं हैं जिन्हें विभिन्न चयन मार्करविकल्पों 162,163,164 के माध्यम से पहचाना जा सकता है, एक महत्वपूर्ण बिंदु है जो बीएटी165,166 की नैदानिक दक्षता को प्रभावित कर सकता है। सेल मार्कर चयन अन्य कोशिकाओं की आबादी से बेसोफिल के साथ-साथ आराम करने और सक्रिय कोशिकाओं पर सेल मार्कर अभिव्यक्ति पर भेदभाव करने के लिए विशिष्टता पर आधारित होना चाहिए। सबसे प्रसिद्ध और आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले बेसोफिल चयन मार्कर हैं: सीडी 193 (सीसीआर 3) (मस्तूल कोशिकाओं, टीएच 2 लिम्फोसाइट्स162, और ईोसिनोफिल पर भी व्यक्त किया जाता है), सीडी 123 (एचएलए-डीआर + प्लाज्मासाइटोइड डेंड्राइटिक कोशिकाओं पर भी व्यक्त किया जाता है), सीडी 203 सी (विशेष रूप से बेसोफिल पर व्यक्त किया जाता है और बेसोफिल सक्रियण के बाद अनियंत्रित), और एफसीआरआई (मस्तूल कोशिकाओं के प्लुरिपोटेंट पूर्वजों पर भी व्यक्त किया जाता है) 139। इन सेल मार्करों के आधार पर और एसएससी के साथ संयोजन में, अधिक सामान्य चयन रणनीतियां एसएससीकमसीसीआर 3 +, एसएससीकमसीसीआर 3 + सीडी 203 सी + (इस प्रोटोकॉल में लागू), एसएससीकमसीडी 123 + एचएलए-डीआर -, एसएससीलोसीडी 203 सी + सीडी 123 + एचएलए-डीआर -, एसएससीलोएफसीआरआई + एचएलए-डीआर - (एंटीजन प्रेजेंटिंग कोशिकाओं और मोनोसाइट्स को बाहर करने के लिए 146,161) हैं। (162,163), एसएससीलोसीडी 203 सी + सीआरटीएच 2 + सीडी 3 - (टी कोशिकाओं को बाहर करने के लिए) 164, एसएससीलोसीडी 203 सी + या एसएससीलोसीसीआर 3 + सीडी 123 + 10,162,166, एसएससीलोसीडी 123 + (सीडी 3-सीडी 14-सीडी 19-सीडी 20-) 167,168, और एसएससीकमआईजीई + 169,170, हालांकि कम आईजीई स्तर वाले रोगियों में सीमाओं के कारण उत्तरार्द्ध की सिफारिश नहीं की जाती है। बेसोफिल आबादी के सटीक चयन के बाद, सक्रियण का पता आमतौर पर सीडी 63 का पता लगाने के माध्यम से लगाया जाता है, जो स्रावी कणिकाओं16,171 की झिल्ली में स्थित होता है, जिसकी बेसोफिल सतह पर अभिव्यक्ति सीधे बेसोफिल डीग्रेनुलेशन और हिस्टामाइन रिलीज 16,172,173 के साथ सहसंबद्ध होती है। एक अन्य विकल्प सीडी 203 सी का विश्लेषण है, हालांकि आईएल -3159,161 द्वारा इसके अपरेग्यूलेशन के कारण संवेदनशीलता कम है, जो बेसोफिल को आराम करने पर संवैधानिक रूप से व्यक्त की जाती है और सक्रिय बेसोफिल पर अनियमित होती है।

बेसोफिल सक्रियण का पता सीडी 63 पॉजिटिव कोशिकाओं (सीडी 63-आधारित बीएटी) के प्रतिशत को मापने या सीडी 203 सी औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) (सीडी 203 सी-आधारित बीएटी) में भिन्नताओं को मापकर लगाया जाता है, जो प्रत्येक परख के लिए थ्रेशोल्ड मान के रूप में नकारात्मक नियंत्रण सेट की तुलना में होता है। नियंत्रित चुनौती परीक्षण की तुलना में सबसे सटीक बीएटी परिणाम निर्धारित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण (उत्तेजित कोशिकाओं) में 2.5% सीडी 63 सकारात्मक कोशिकाओं की सीमा की सिफारिश की जाती है। सकारात्मकता पर विचार परीक्षण किए गए उत्तेजना पर निर्भर करता है। बेसोफिल सक्रियण को उत्तेजना के लिए सकारात्मक माना जाता है यदि नकारात्मक नियंत्रण में सीडी 63 सकारात्मक बेसोफिल के प्रतिशत से विभाजित उत्तेजना की उपस्थिति में सीडी 63 सकारात्मक बेसोफिल का प्रतिशत पुष्टि किए गए एलर्जी रोगियों और स्वस्थ दाताओं से प्राप्त डेटा के आरओसी वक्र विश्लेषण द्वारा गणना की गई कट-ऑफ से अधिक है।

बीएटी प्रदर्शन आईजीई-मध्यस्थता बेसोफिल सक्रियण में शामिल फॉस्फोइनोसिटाइड 3-काइनेज के एक शक्तिशाली और विशिष्ट अवरोधक वोर्टमैनिन (डब्ल्यूटीएम) 16,174,175 के निरोधात्मक प्रभाव का विश्लेषण करके आईजीई-निर्भर और आईजीई-स्वतंत्र बेसोफिल सक्रियण के बीच अंतर करने की अनुमति देता है। अवरोध परख उत्तेजना के साथ इनक्यूबेशन से पहले 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डब्ल्यूटीएम (1 μM) के साथ रक्त को इंजेक्ट करके किया जाता है। यह पुष्टि करने के लिए कि डब्ल्यूटीएम के साथ बीएटी निषेध सही है, सकारात्मक नियंत्रण एंटी-आईजीई का निषेध लेकिन सकारात्मक नियंत्रण एफएमएलपी का नहीं देखा जाना चाहिए।

दुर्भाग्य से, प्रक्रियाओं, सांद्रता और मार्करों के संदर्भ में विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच कोई मानकीकरण नहीं है। केंद्रों के बीच परिणामों की तुलना करने और नैदानिक रूप से मानकीकृत और परीक्षण को मान्य करने के लिए विधि को मानकीकृत करने के लिए भविष्य के बहुआयामी अध्ययनों की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम क्लाउडिया कोराज़ा को उनके अमूल्य अंग्रेजी भाषा समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को MINECO के इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ 'कार्लोस III' (ISCIII) द्वारा समर्थित किया गया था (ईआरडीएफ द्वारा वित्त पोषित अनुदान: "उना मनेरा डी हैसर यूरोपा"; अनुदान संख्या पीआई 20/01715; पीआई 18/00095; पीआई 17/01410; पीआई 17/01318; PI17/01237 और RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; अंडालूसी क्षेत्रीय स्वास्थ्य मंत्रालय (अनुदान संख्या पीआई-0127-2020, पीआईओ-0176-2018; पीई-0172-2018; पीई-0039-2018; पीसी-0098-2017; पीआई-0075-2017; पीआई-0241-2016)। आईडी एक नैदानिक अन्वेषक (बी-0001-2017) है और एए के पास एक वरिष्ठ पोस्टडॉक्टरल अनुबंध (आरएच-0099-2020) है, दोनों अंडालूसी क्षेत्रीय स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा समर्थित हैं (ईएसएफ द्वारा वित्त पोषित: "अंडालुसिया से मुवे कॉन यूरोपा")।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile Corning 352008
APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody BioLegend 310708
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Biosciences
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
FITC anti-human CD63 Antibody BioLegend 353006
HEPES (1 M) Thermo-Fisher 15630106
Lysing Solution 10x concentrated BD Biosciences 349202
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
N-Formyl-Met-Leu-Phe Sigma-Aldrich F3506
PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody BioLegend 324606
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Purified Mouse Anti-Human IgE BD Biosciences 555857
Recombinant Human IL-3 R&D Systems 203-IL
Sheath Fluid BD Biosciences 342003
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
TUBE 9 mL LH Lithium Heparin Greiner Bio-One 455084
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379

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Doña, I., Ariza, A., Fernández, T. D., Torres, M. J. Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis. J. Vis. Exp. (171), e62600, doi:10.3791/62600 (2021).

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