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Prueba de activación de basófilos para el diagnóstico de alergia

Published: May 31, 2021 doi: 10.3791/62600
Automatic Translation
*1,2, *2, 2,3, 1,2,4,5
1Allergy Unit, Hospital Regional Universitario de Málaga, 2Allergy Research Group, Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA, 3Universidad de Málaga, Departamento de Biología celular, Genética y Fisiología, Universidad de Málaga, 4Departamento de Medicina, Universidad de Málaga, 5Nanostructures for Diagnosing and Treatment of Allergic Diseases Laboratory, Andalusian Center for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND
* These authors contributed equally

Summary

La prueba de activación basófila es una prueba diagnóstica in vitro complementaria para la evaluación de reacciones alérgicas mediadas por IgE basada en la detección de la activación basófila en presencia de un estímulo específico mediante la medida de marcadores de activación mediante citometría de flujo.

Abstract

La prueba de activación de basófilos (BAT) es una prueba diagnóstica in vitro complementaria que se puede utilizar además de la historia clínica, la prueba cutánea (ST) y la determinación específica de IgE (sIgE) en la evaluación de reacciones alérgicas mediadas por IgE a alimentos, veneno de insectos, medicamentos, así como algunas formas de urticaria crónica. Sin embargo, el papel de esta técnica en los algoritmos de diagnóstico es muy variable y no está bien determinado.

Las MTD se basan en la determinación de la respuesta basófila a la activación de IgE de reticulación alérgeno/fármaco mediante la medición de marcadores de activación (como CD63, CD203c) mediante citometría de flujo. Esta prueba puede ser una herramienta útil y complementaria para evitar las pruebas de provocación controladas para confirmar el diagnóstico de alergia, especialmente en sujetos que experimentan reacciones graves potencialmente mortales. En general, se debe considerar el rendimiento de las MTD si: i) el alérgeno/fármaco produce resultados falsos positivos en el ST; ii) no hay ninguna fuente de alérgenos/medicamentos para la determinación de ST o sIgE; iii) existe discordancia entre la historia del paciente y la determinación del ST o la sIgE; iv) los síntomas sugieren que el ST puede dar lugar a una respuesta sistémica; v) antes de considerar un CCT para confirmar el alérgeno / medicamento culpable. Las principales limitaciones de la prueba están relacionadas con la sensibilidad no óptima, especialmente en la alergia a medicamentos, la necesidad de realizar la prueba no más de 24 h después de la extracción de la muestra y la falta de estandarización entre laboratorios en términos de procedimientos, concentraciones y marcadores celulares.

Introduction

El diagnóstico de alergia mediada por IgE se basa en la historia clínica, las pruebas cutáneas (ST), la cuantificación de la IgE específica sérica (sIgE) y, si es necesario e indicado, las pruebas de provocación controlada (ECC)1,2,3,4,5,6. Sin embargo, la historia clínica puede ser poco confiable ya que puede haber una falta de información precisa, y los ST y CCT no son procedimientos libres de riesgo que pueden estar contraindicados en sujetos que experimentan reacciones graves potencialmente mortales 1,2,3,4,5,6 . Estas cuestiones, junto con el hecho de que la determinación de sIgE mediante inmunoensayos de fluoroenzimas validados y comerciales solo está disponible para unos pocos alérgenos y fármacos, han puesto de relieve el importante papel de otros ensayos funcionales in vitro, como la prueba de activación basófila (MTD).

Los basófilos son células efectoras clave involucradas en reacciones alérgicas mediadas por IgE que se activan tras la reticulación de sIgE adyacente unida a receptores de alta afinidad (FcεRI) en la superficie celular después de la exposición a alérgenos / medicamentos. La activación basófila desencadena la desgranulación celular y la liberación de mediadores inflamatorios preformados y nuevos sintetizados contenidos en gránulos de secreción intracitoplasmática 7,8,9. BAT es un método in vitro que intenta imitar la activación basófila en presencia de un estímulo (alérgeno o fármaco) y determina cambios en la expresión de marcadores de activación basófilos mediante citometría de flujo 7,10. Existen diferentes estrategias para identificar basófilos (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) y medir la activación celular (principalmente regulación positiva de CD63 y CD203c) utilizando combinaciones de anticuerpos marcados con fluorocromo 7,10. CD63, el mejor marcador de activación clínicamente validado 11,12,13,14, es una proteína de membrana anclada en los gránulos secretores que contienen histamina que, después de la activación celular y la fusión de los gránulos con la membrana, se expresa en la superficie basófila 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c es un marcador de superficie que se expresa constitutivamente en basófilos y se regula al alza después de la estimulación de FcεRI, que también ha mostrado resultados confiables en BAT 15,22,23,24,25. Además, parece co-expresarse con CD6326.

En las últimas décadas, las MTD han demostrado ser útiles en el diagnóstico de reacciones alérgicas mediadas por IgE inducidas por diferentes desencadenantes como medicamentos, alimentos o inhalantes, así como en algunas formas de urticaria crónica, como se describe a continuación. Sin embargo, la posición de esta técnica en los algoritmos diagnósticos es muy variable y no está bien determinada.

Hipersensibilidad a los medicamentos
Las MTD han demostrado ser útiles como prueba complementaria para fármacos y pacientes seleccionados, especialmente para aquellos que experimentan reacciones graves debido al hecho de que el valor diagnóstico del ST no está bien establecido para la mayoría de los medicamentos, ya que están validados y estandarizados para un número limitado de fármacos27,28,29,30. Además, la cuantificación de sIgE está disponible sólo para un número limitado de fármacos, con menor sensibilidad que ST 27,28,29,30,31,32. Por lo tanto, el diagnóstico de hipersensibilidad a los medicamentos generalmente se basa en la prueba de provocación de drogas, que puede estar contraindicada en sujetos que experimentan reacciones graves que amenazan la vida33.

Se han reportado resultados prometedores para el uso de MTD en pacientes seleccionados que informaron reacciones de hipersensibilidad inmediata a diferentes fármacos como betalactámicos (BL)20,34,35,36,37,38,39, agentes bloqueadores neuromusculares (NMBA)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluoroquinolonas (FQ)46,47,48,49, pirazolonas 50,51,52, medios de radiocontraste (RCM)53,54,55,56 y compuestos de platino57,58,59 . Se ha informado que las MTD tienen una sensibilidad y especificidad entre 51,7-66,9% y 89,2-97,8%, respectivamente; y se describen valores predictivos positivos y negativos que oscilan entre 93,4% y 66,3%, respectivamente27,31. Además, el BAT ha sido propuesto como un biomarcador predictivo para reacciones innovadoras durante la desensibilización con compuestos de platino, ya que la expresión de CD203c está aumentada en comparación con CD63 en pacientes con alto riesgo de reacciones adversas durante la desensibilización del fármaco57.

Cabe destacar que las MTD sólo son útiles en la hipersensibilidad a los medicamentos cuando la reacción implica la degranulación basófila; Por lo tanto, no es útil en reacciones resultantes de la inhibición enzimática de la ciclooxigenasa 142.

Alergia alimentaria
Las MTD se han convertido en una herramienta diagnóstica potencial para la alergia alimentaria porque la determinación de la sIgE sérica para todo el extracto alergénico o alérgenos individuales es a menudo ambigua, lo que requiere un desafío alimentario oral para confirmar el diagnóstico, que, de manera similar a la hipersensibilidad al medicamento, es un procedimiento costoso y no exento de riesgos60. Varios estudios han mostrado resultados relevantes con leche de vaca 61,62, huevo 61,63, trigo 64,65,66,67,68, cacahuete 63,69,70,71,72, avellana 73,74,75,76 ,77, mariscos78, melocotón 79,80,81, manzana 21, apio y zanahoria82,83.

El principal valor añadido de las MTD en el diagnóstico de la alergia alimentaria en comparación con las ST y la IgE en suero es que muestra una mayor especificidad y una sensibilidad similar. Por lo tanto, las MTD son una herramienta útil para diferenciar a los pacientes clínicamente alérgicos de los sujetos sensibilizados, pero tolerantes, que tienen alta especificidad (75-100%) y sensibilidad (77-98%)63,69,84. Los valores de sensibilidad y especificidad dependen del alérgeno y otros factores como fenotipos (p. ej., síndrome de alergia oral versus anafilaxia), edad y patrones de sensibilización relacionados con la geografía63,85.

Las MTD que utilizan componentes de alérgenos individuales pueden mejorar potencialmente la precisión diagnóstica de algunos alérgenos alimentarios61,80. Existen estudios que utilizan proteínas de almacenamiento de semillas (por ejemplo, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 y Ara h 6 del maní)86; proteínas de transferencia de lípidos (p. ej., Pru p 3 del melocotón y Ara h 9 del maní)80,86; y homólogos de Bet v 1 (por ejemplo, Ara h 8 de maní)87. Otras utilidades potenciales están relacionadas con la identificación del alérgeno culpable en casos de síndrome de alergia polen-alimentos 21,87,88, alergia a la carne roja 89 o anafilaxia inducida por el ejercicio dependiente de alimentos66.

Curiosamente, las MTD pueden proporcionar información sobre la gravedad y el umbral de las reacciones alérgicas, ya que los pacientes con reacciones más graves muestran una mayor proporción de basófilos activados, como se observó en estudios de pacientes alérgicos al maní y a la leche de vaca 84,90,91; y los pacientes que reaccionan a trazas del alérgeno muestran una mayor sensibilidad basófila 84,90,92. Estos datos sugieren que las MTD pueden ser útiles para identificar a los pacientes alérgicos de alto riesgo que requieren un seguimiento más estrecho y una educación más intensa93. Además, se ha informado que las MTD pueden predecir las respuestas al desafío alimentario 70,91,92,94 y los umbrales de reactividad90,95 para ayudar a determinar cuándo los alimentos pueden ser (re)introducidos de manera segura 84. Sin embargo, estos hallazgos son controvertidos en algunos estudios63,96 y se requiere más investigación.

Por otro lado, las MTD se han utilizado para monitorizar la resolución de la alergia alimentaria, ya sea de forma natural o bajo tratamientos inmunomoduladores, a lo largo del tiempo, que hasta ahora solo se ha evaluado mediante provocación alimentaria oral, con los riesgos y costes asociados 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Además, también se ha utilizado para controlar el efecto de omalizumab en la alergia alimentaria, ya que la activación basófila disminuye durante el tratamiento con omalizumab, pero aumenta después del cese del tratamiento109.

Alergia por inhalación
Las MTD rara vez son beneficiosas en la alergia por inhalación, ya que el diagnóstico se puede establecer de forma rutinaria mediante la cuantificación de sIgE y ST. Sin embargo, en casos de rinitis alérgica local (niveles indetectables de sIgE y ST negativos con pruebas de provocación nasal positivas), la MTD ha permitido el diagnóstico en el 50% de los casos110. Se ha reportado además una correlación entre la sensibilidad basófila y la respuesta a las pruebas de provocación nasal/bronquial, así como entre la gravedad del asma y la eficacia del tratamiento con omalizumab111,112.

Las MTD también se han utilizado para controlar la inmunoterapia con alérgenos para los ácaros del polvo doméstico y el polen, ya que la sensibilidad basófila disminuye durante la inmunoterapia, probablemente debido a la interferencia del bloqueo de anticuerpos IgG 113,114,115,116,117.

Alergia al veneno de himenópteros
El diagnóstico de la alergia al veneno de himenópteros se basa rutinariamente en ST y sIgE sérica. La MTD ha mostrado una alta sensibilidad (85-100%) y especificidad (83-100%) y se ha informado que es útil en casos que arrojan resultados equívocos o en pacientes con una historia clínica sugestiva de alergia al veneno pero sIgE indetectable y ST118,119 negativo. Sin embargo, las MTD no parecen ser predictivas de la gravedad de estas reacciones120,121.

Hasta el 60% de los pacientes presentan sIgE tanto para el veneno de avispa como de abeja, y la identificación del alérgeno dominante es crucial para un tratamiento adecuado de inmunoterapia. En estos casos, se ha informado que las MTD son útiles para identificar el alérgeno dominante119,122,123,124. Aunque la sIgE a los principales alérgenos de los venenos de abeja y avispa puede reducir la utilidad de las MTD en pacientes con doble positividad a ambos venenos, proporciona información útil principalmente en sujetos con resultados negativos en las determinaciones de IgE123.

Algunos estudios sugieren que las MTD pueden ser útiles como biomarcador predictivo de los efectos secundarios durante la fase de acumulación de la inmunoterapia con veneno, ya que se ha informado que esta opción de tratamiento disminuye la sensibilidad basófila. Sin embargo, la reactividad no disminuye y esta utilidad BAT es hoy controvertida 13,120,125,126,127,128,129,130.

Urticaria y angioedema
Un subconjunto de pacientes con urticaria crónica tiene una fisiopatología autoinmune, debido a los autoanticuerpos IgE contra autoalérgenos y autoanticuerpos IgG que se dirigen a los complejos FcεRI o IgE-FcεRI presentes en la superficie de los mastocitos131,132. En la práctica clínica, el diagnóstico de este tipo de urticaria crónica se ha basado en ST sérico autólogo positivo, que tiene riesgo de infección accidental. Las MTD se han propuesto como una prueba in vitro para diagnosticar y monitorizar a los pacientes con sospecha de urticaria crónica. Se ha informado que la expresión de CD63 y CD203c en la superficie de los basófilos aumenta después de la estimulación con sueros de pacientes con urticaria crónica, mostrando la detección de autoanticuerpos activos 133,134,135,136,137. Recientemente, se ha informado que los pacientes con BAT positivas a menudo experimentan el estado de enfermedad más activo, evaluado por la puntuación de actividad de la urticaria, y requieren dosis más altas de antihistamínicos junto con tratamientos de tercera línea (ciclosporina A u omalizumab), en comparación con aquellos con BAT138 negativo.

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Protocol

El cumplimiento del protocolo se llevó a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y aprobado por el Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, España. Todos los sujetos fueron informados oralmente sobre el estudio de investigación y firmaron el correspondiente término de consentimiento informado.

NOTA: El presente protocolo detalla el procedimiento de MTD que los autores utilizan diariamente. Sin embargo, este no es un método estandarizado y existen diferencias con los procedimientos publicados por otros autores. Las principales modificaciones del protocolo están relacionadas con el uso de IL-3 en el tampón de estimulación, el tiempo de incubación con el estímulo, el método para detener la degranulación basófila y las estrategias de citometría de flujo. Además, los diferentes kits disponibles comercialmente para las MTD incluyen protocolos específicos recomendados por el fabricante.

1. Preparación de la muestra

  1. Recolectar sangre periférica en tubos heparinizados de 9 ml y mantener la muestra a temperatura ambiente (RT) en un rotor hasta que sea necesario para el protocolo experimental.
  2. Etiquete los tubos del citómetro de 5 ml para controles negativos (2 tubos), controles positivos (2 tubos) y diferentes concentraciones de alérgeno/fármaco (1 tubo por cada concentración de alérgeno/fármaco analizada). Coloque los tubos en una rejilla donde los tubos encajen perfectamente sin resbalar.
  3. Preparar tampón de estimulación en agua destilada doble que contenga 2% (v/v) de HEPES, 78 mg/L de NaCl, 3,7 mg/L de KCl, 7,8 mg/L de CaCl 2, 3,3 mg/L de MgCl2, 1 g/L de HSA. Ajuste el pH a 7.4 y agregue IL-3 a 2 ng / ml. Por lo general, preparar 100 mL y dividir en 2.5 mL las alícuotas para congelar a -20 °C.
  4. Preparar controles positivos en PBS-Tween-20 0.05% (v/v) (PBS-T): Control positivo 1, N-Formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) (4 μM), para confirmar la calidad de los basófilos; Control positivo 2, Anti-IgE (0,05 mg/ml) como control positivo mediado por IgE.
  5. Prepare el alérgeno/fármaco en PBS-T a 2 veces la concentración final deseada.
    NOTA: Las concentraciones óptimas de alérgenos/fármacos a utilizar deben determinarse previamente utilizando un amplio rango de concentraciones, mediante curvas dosis-respuesta y mediante estudios de citotoxicidad siguiendo los mismos pasos del protocolo139.

2. Preparación de la mezcla de tinción

  1. Agregue anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromo al tampón de estimulación después de la concentración de anticuerpos recomendada por el fabricante o por titulación previa de anticuerpos. En este protocolo añadimos 1 μL de cada anticuerpo (CCR3-APC y CD203c-PE para la identificación basófila; CD63-FITC para la activación basófila)140 por 20 μL de tampón de estimulación.
    NOTA: Proteja la preparación de la mezcla de tinción de la luz.
  2. Agregue 23 μL de mezcla de tinción a cada tubo.

3. Estimulación sanguínea

  1. Agregue 100 μL de PBS-T a los tubos 1 y 2 (control negativo), 100 μL de fMLP al tubo 3, 100 μL de anti-IgE al tubo 4 y 100 μL de las diferentes concentraciones de alérgenos/fármacos a los siguientes tubos. Incubar durante 10 min a 37 °C en un baño termostático con agitación media para precalentar los reactivos.
  2. Agregue suavemente 100 μL de sangre a cada tubo para evitar la hemólisis. Suavemente tubos de vórtice e incubar durante 25 min a 37 °C en un baño termostático con agitación media.
  3. Detener la desgranulación, manteniendo los tubos a 4 °C durante al menos 5 min.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí a 4 °C durante 30-45 min si es necesario141,142,143.

4. Lising de eritrocitos

  1. Agregue 2 ml de 1x tampón de lisado a cada tubo para lisar los eritrocitos. Vortex cada tubo e incubar durante 5 min en RT.
    NOTA: En este paso, las células se fijan debido a los agentes fijadores (formaldehído) contenidos en el tampón.
  2. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Decantar el sobrenadante, volcando la rejilla en un fregadero. Las células permanecen en la parte inferior de los tubos.
  3. Agregue 3 ml de PBS-T a cada tubo para lavar las células. Vórtice cada tubo.
  4. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Decantar el sobrenadante, volcando la rejilla en un fregadero.
    NOTA: Mantener las muestras a 4 °C, protegidas de la luz hasta la adquisición del citómetro de flujo.

5. Adquisición de citometría de flujo

  1. Adquiera muestras por citómetro de flujo (por ejemplo, BD FACSCalibur Flow Cytometer). Conecte el citómetro de flujo al software de la computadora y espere a que el citómetro esté listo. Cargue la plantilla y la configuración del instrumento (Tabla 1).
  2. Iniciar la adquisición de muestras.
  3. Utilice las siguientes estrategias de citómetro para la selección de basófilos activados139.
    1. Puerta de los linfocitos de la gráfica de dispersión lateral (SSC) - dispersión directa (FSC).
    2. Puerta de los basófilos de la población de linfocitos como células CCR3 + CD203c +. Adquirir al menos 500 basófilos por tubo.
    3. Muestre una gráfica CCR3 - CD63 para analizar la activación utilizando CD63 como marcador de activación. Establezca el umbral negativo de CD63 en aproximadamente 2.5% usando los tubos de control negativo.
    4. Adquiere todas las muestras.

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Representative Results

Las MTD realizadas con alérgenos o fármacos permiten investigar las reacciones de hipersensibilidad dependientes de IgE. La reactividad basófila debe medirse en al menos dos concentraciones óptimas para obtener los mejores resultados34 y la activación se visualiza mediante la regulación positiva de CD63 en la superficie celular. En el caso de los alérgenos, además, para confirmar la reactividad basófila, la sensibilidad basófila debe analizarse midiendo la reactividad a múltiples concentraciones decrecientes de alérgenos114. Esta medida permite determinar la concentración de alérgenos que induce la respuesta de basófilos al 50% (EC50), que puede expresarse como "CD-sens"141. La medición del área bajo la curva de dosis (AUC) ha sido propuesta recientemente para evaluar tanto la reactividad basófila como la sensibilidad basófila juntas58.

La estrategia de citometría de flujo para analizar los resultados de BAT se muestra en la Figura 1 y la Figura 2 e incluye linfocitos de compuerta de la gráfica SSC-FSC (paso 1), basófilos de activación de la población de linfocitos como células CCR3 + CD203c + (paso 2), mostrando una gráfica CCR3 - CD63 para analizar la activación utilizando CD63 como marcador de activación (paso 3). Las figuras muestran ejemplos representativos de resultados de MTD obtenidos para medicamentos (Figura 1) y alérgenos (Figura 2).

Figure 1
Figura 1: Análisis representativo de la prueba de activación basófila del fármaco por citometría de flujo . (A) Gráfica SSC-FSC para seleccionar población de linfocitos + basófilos. (B) CCR3-CD203c trazan para bloquear basófilos de la población de linfocitos como células CCR3 + CD203c. (C) Gráfica CCR3-CD63 para analizar la activación utilizando CD63 como marcador de activación para control negativo, control positivo y fármaco. Los valores mostrados en cada panel representan el porcentaje de celdas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis representativo de la prueba de activación de basófilos alérgenos mediante citometría de flujo. (A) Diagrama SSC-FSC para seleccionar población de linfocitos + basófilos. (B) CCR3-CD203c trazan para bloquear basófilos de la población de linfocitos como células CCR3 + CD203c +. (C) Gráfica CCR3-CD63 para analizar la activación utilizando CD63 como marcador de activación mostrando resultados para control negativo y disminución de concentraciones de alérgeno (Ara h 9). Los valores mostrados en cada panel representan el porcentaje de celdas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fuentes de luz (láseres) Láser de iones argón refrigerado por aire Coherent SapphireTM de 488 nm; 20 mW; Láser refrigerado por aire JDS UniphaseTM HeNe de 633 nm; 17 mW
Longitud de onda excitatoria de la luz Láser azul: 488 nm; Láser rojo: 633 nm
Potencia de la fuente de luz en la longitud de onda excitatoria Láser azul: 20 mW; Láser rojo: 17 mW
Filtros ópticos CSS: 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20
Detectores ópticos FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC
Detectores ópticos tye Láser de iones de argón refrigerado por aire
Rutas ópticas Octágono BD (línea láser de 488 nm); BD Trigons (línea láser de 633 nm)

Tabla 1: Requisitos del citómetro de flujo

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Discussion

BAT es una prueba diagnóstica in vitro complementaria para la evaluación de reacciones alérgicas mediadas por IgE que ha demostrado ser útil en el diagnóstico de reacciones inducidas por diferentes desencadenantes como medicamentos, alimentos o inhalantes, así como en algunas formas de urticaria crónica. En general, se debe considerar el rendimiento de las MTD si: i) el alérgeno/fármaco produce resultados falsos positivos en el ST; ii) el alérgeno/fármaco no está disponible para ser utilizado para la cuantificación de ST o sIgE; iii) existe discordancia entre la historia clínica y la determinación del ST o la sIgE; iv) los síntomas sugieren que el ST puede inducir una reacción sistémica; v) antes de CCT para la confirmación de alérgenos/medicamentos culpables10.

En cuanto al protocolo experimental, hay diferentes aspectos importantes a considerar para obtener muestras de sangre adecuadas para la prueba. Los esteroides sistémicos 146 y los inmunosupresores, incluidos los corticosteroides orales147, deben evitarse antes de la prueba debido a la disminución de la respuesta basófila 146 (los antihistamínicos y los esteroides tópicos no afectan los resultados de las MTD)146. La prueba no debe realizarse durante la infección o condiciones inflamatorias crónicas activas148. El intervalo de tiempo entre la reacción y la prueba no debe ser superior a 1 año debido a la negativización reportada de los niveles de sIgE a lo largo del tiempo42,52,149. La prueba se realiza con sangre entera fresca y debe realizarse no más de 24 h después de la extracción de sangre150,151. La sangre debe recogerse en tubos estabilizados con heparina porque los basófilos no se desgranulan si se usan EDTA o dextrosa de citrato ácido como estabilizador, aunque podría usarse después de agregar calcio152. Por otro lado, el estímulo utilizado en la prueba no debe incluir ningún excipiente; Por esta razón, se recomiendan extractos de alérgenos estandarizados, alérgenos recombinantes o purificados, ingredientes activos puros o preparaciones de medicamentos inyectables intravenosos. Además, las características químicas de los medicamentos deben ser consideradas. Por ejemplo, algunos medicamentos son inestables en solución y deben ser recién preparados antes de cada prueba, y otros son fotolábiles y deben realizarse protegiendo el ensayo de la luz48. La toxicidad y la activación inespecífica deben evaluarse para cada alérgeno/fármaco probado y las curvas ROC con pacientes confirmados y se deben analizar los controles tolerantes para determinar el punto de corte. Por último, en el análisis de las mejores técnicas disponibles debe destacarse la importancia de ambos controles positivos. fMLP es un péptido bacteriano que induce la activación basófila a través del receptor fMLP acoplado a proteína G. Por esta razón, a menudo se utiliza como un control positivo de la activación no mediada por IgE16. Anti-IgE o, alternativamente, anti-FcεRI se utilizan como controles positivos de la activación basófila mediada por IgE. La ausencia de activación basófila en presencia de controles positivos no mediados por IgE e IgE sugiere que no hay suficiente calidad de los basófilos o errores en el protocolo experimental. En contraste, los basófilos activados con fMLP pero no con anti-IgE o anti-FcεRI se designan como basófilos no respondedores, estimándose que el 6-17% de la población general no responde a la estimulación a través de FcεRI en BAT 63,84,153, aunque expresan densidades normales de IgE de superficie celular. La falta de respuesta podría estar relacionada con niveles bajos de fosfatasa Syk 154,155,156 junto con niveles aumentados de CD45 157. Aunque los estudios han demostrado que los basófilos no respondedores pueden convertirse en respondedores en presencia de IL-3158 en ensayos in vitro, los basófilos no respondedores aún pueden detectarse en MTD y, en estos casos, los resultados no pueden considerarse para la evaluación.

Con respecto a la inclusión de IL-3, una citocina de cebado basófilo, no existe un consenso general. Se ha informado que el uso de IL-3 mejora la capacidad de respuesta basófila en las MTD basadas en CD63 sin inducir la regulación positiva de CD63 por sí sola después de un breve pretratamiento 7,159,160. Sin embargo, otro estudio sugiere que la IL-3 regula al alza la expresión de CD63 al iniciodel estudio 161. En contraste, en el caso de las BAT basadas en CD203c, los estudios confirman que el cebado de IL-3 mejora la expresión de CD203c al descansar basófilos, disminuyendo las diferencias entre basófilos no estimulados y estimulados y disminuyendo la sensibilidad BAT 159,161.

Se pueden utilizar diferentes estrategias de compuerta para identificar la población basófila y analizar la activación basófila mediante ciotmetría de flujo. Los basófilos son células de baja dispersión lateral que pueden ser identificadas a través de diferentes opciones de marcadores de selección 162,163,164, siendo un punto clave que podría afectar la eficiencia diagnóstica de BAT165,166. La selección del marcador celular debe basarse en la especificidad para discriminar basófilos de otras poblaciones celulares, así como en la expresión del marcador celular en células en reposo y activadas. Los marcadores de selección basófilos más conocidos y comúnmente utilizados son: CD193 (CCR3) (también expresado en mastocitos, linfocitos Th2162 y eosinófilos), CD123 (también expresado en células dendríticas plasmocitoides HLA-DR+), CD203c (expresado exclusivamente en basófilos y regulado al alza después de la activación basófila) y FcεRI (también expresado en progenitores pluripotentes de mastocitos)139. Con base en estos marcadores celulares y en combinación con SSC, las estrategias de selección más comunes son SSC CCR3+ bajo, SSCCCR3+CD203c+ bajo (aplicado en este protocolo), SSC bajo CD123+HLA-DR−, SSC bajo CD203c+CD123+HLA-DR−, SSCbajoFcεRI+HLA-DR− (para excluir células presentadoras de antígeno y monocitos 146,161 ,162,163), SSC bajo CD203c+CRTH2+CD3- (para excluir linfocitos T)164, SSC bajo CD203c+ o SSC bajo CCR3+CD123+10,162,166, SSC bajoCD123+(CD3-CD14-CD19-CD20-)167,168, y SSCbajaIgE+169.170, aunque esta última no se recomienda debido a limitaciones en pacientes con niveles bajos de IgE. Después de una selección precisa de la población basófila, la activación generalmente se detecta a través de la detección de CD63, localizada en la membrana de gránulos secretores 16,171 cuya expresión en la superficie basófila está directamente correlacionada con la desgranulación basófila y la liberación de histamina16,172,173. Otra opción es el análisis de CD203c, aunque la sensibilidad es menor debido a su regulación positiva por IL-3159,161, expresada constitutivamente en basófilos en reposo y regulada al alza en basófilos activados.

La activación de basófilos se detecta midiendo el porcentaje de células CD63 positivas (BAT basado en CD63) o variaciones en la intensidad media de fluorescencia (MFI) de CD203c (MTD basado en CD203c) en comparación con un control negativo establecido como valor umbral para cada ensayo. Se recomienda un umbral de 2,5% de células CD63 positivas en el control negativo (células no estimuladas) para determinar los resultados BAT más precisos en comparación con una prueba de provocación controlada. La consideración de la positividad depende del estímulo probado. La activación de basófilos se considera positiva para un estímulo si el porcentaje de basófilos CD63 positivos en presencia del estímulo dividido por el porcentaje de basófilos CD63 positivos en el control negativo es mayor que el punto de corte calculado por el análisis de la curva ROC de los datos obtenidos de pacientes alérgicos confirmados y donantes sanos.

El rendimiento de las MTD permite distinguir entre la activación basófila dependiente de IgE e independiente de IgE mediante el análisis del efecto inhibitorio de la wortmannina (WTM)16,174,175, un inhibidor potente y específico de la fosfoinositida 3-quinasa implicada en la activación basófila mediada por IgE. El ensayo de inhibición se realiza incubando sangre con WTM (1 μM) a 37 °C durante 5 min antes de la incubación con el estímulo. Para confirmar que la inhibición de las MTD con WTM es correcta, se debe observar la inhibición del control positivo anti-IgE pero no del control positivo de la fMLP.

Desafortunadamente, no existe una estandarización entre los diferentes laboratorios en términos de procedimientos, concentraciones y marcadores. Se requieren estudios multicéntricos futuros para estandarizar el método para comparar los resultados entre centros y para estandarizar y validar clínicamente la prueba.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Claudia Corazza por su invaluable apoyo en el idioma inglés. Este trabajo ha contado con el apoyo del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) del MINECO (subvención cofinanciada por FEDER: "Una manera de hacer Europa"; Subvenciones Nº PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 y RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Consejería de Sanidad de la Junta de Andalucía (Subvención Nº PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID es Investigador Clínico (B-0001-2017) y AA es titular de un Contrato Postdoctoral Senior (RH-0099-2020), ambos apoyados por la Consejería de Sanidad de la Junta de Andalucía (cofinanciado por ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile Corning 352008
APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody BioLegend 310708
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Biosciences
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
FITC anti-human CD63 Antibody BioLegend 353006
HEPES (1 M) Thermo-Fisher 15630106
Lysing Solution 10x concentrated BD Biosciences 349202
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
N-Formyl-Met-Leu-Phe Sigma-Aldrich F3506
PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody BioLegend 324606
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Purified Mouse Anti-Human IgE BD Biosciences 555857
Recombinant Human IL-3 R&D Systems 203-IL
Sheath Fluid BD Biosciences 342003
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
TUBE 9 mL LH Lithium Heparin Greiner Bio-One 455084
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379

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Medicina Número 171 Basófilo alérgeno medicamento alergia diagnóstico método in vitro CD63 CD203c
Prueba de activación de basófilos para el diagnóstico de alergia
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Doña, I., Ariza, A., Fernández, T. D., Torres, M. J. Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis. J. Vis. Exp. (171), e62600, doi:10.3791/62600 (2021).

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