Summary
यह प्रोटोकॉल डीएनए निष्कर्षण से डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडीपीसीआर) के लिए प्रायोगिक सेट-अप तक के कदम प्रदान करता है, जिसमें GRNA-प्रेरित Cas9 दरार और डीएनए मरम्मत के बाद लक्षित स्थलों पर गैर-मुताबिक़ एंड-जॉइनिंग (एनएचईजे) घटनाओं की पहचान और मात्राकरण के लिए विश्लेषण शामिल है । इस विधि के अन्य उपयोगों में बहुरूपता का पता लगाने और जीन-संपादन संस्करण सत्यापन जैसे अनुप्रयोग शामिल हैं।
Abstract
मच्छर जीनोमिक्स और जेनेटिक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों में हाल की प्रगति ने बड़े पैमाने पर लक्षित डीएनए अनुक्रम भिन्नता का पता लगाने के लिए त्वरित और कुशल तरीकों की आवश्यकता को बढ़ावा दिया है । विशेष रूप से, CRISPR गाइड आरएनए (gRNA) द्वारा उत्पन्न जीन-संपादित साइटों पर सम्मिलन और विलोपन (इनडेल) का पता लगाना/Cas9-मध्यस्थता गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने (एनएचईजे) म्यूटेनेसिस की निष्ठा और अनपेक्षित परिवर्तनों की आवृत्ति का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम यहां डिजिटल-ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडीपीसीआर) के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो उच्च-थ्रूपुट एनएचईजे विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। हालांकि यह विधि व्यक्तिगत अनुक्रम भिन्नता की पहचान करने वाले डेटा का उत्पादन नहीं करती है, यह जनसंख्या के भीतर अनुक्रम भिन्नता का मात्रात्मक अनुमान प्रदान करती है। इसके अतिरिक्त, उचित संसाधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल को अगली पीढ़ी या सेंगर अनुक्रमण की तुलना में अधिक आसानी से स्थापित करने वाली फील्ड-साइट प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है। ddPCR में उन तरीकों में से किसी की तुलना में परिणामों के लिए तेजी से टर्न-अराउंड समय भी होता है, जो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जीवों के क्षेत्र परीक्षणों के दौरान जंगली आबादी में आनुवंशिक भिन्नता के अधिक त्वरित और पूर्ण विश्लेषण की अनुमति देता है।
Introduction
जीन ड्राइव में चिकित्सा और कृषि प्रासंगिकता की कीटों की आबादी को नियंत्रित करने की अपार संभावनाएं हैं1,2,3,4,5. उदाहरण के लिए, CRISPR कैस नाभिक और गाइड आरएनए (जीआरएएनए) पर आधारित जीन-ड्राइव प्रणालियों का उपयोग वेक्टर मच्छरों की आबादी को संशोधित करने के लिए किया जा सकता है जो मलेरिया परजीवी को अपवर्तन प्रदान करते हैं जिससे संचरण कम होता है और कम रोग1,4, 5होताहै । जीन-ड्राइव प्रणाली पूर्व-मेयोटिक रोगाणु कोशिकाओं में एक समरूप गुणसूत्र से दूसरे के लिए खुद को और संबद्ध विशेषता की प्रतियां करती है, और यह सुनिश्चित करता है कि अधिकांश संतान ड्राइव के वारिस हैं और क्षेत्र में लंबे समय तक चलने वाली और टिकाऊ जनसंख्या संशोधन की क्षमता पैदा करते हैं। हालांकि, कैस/जीआरएनए-आधारित तरीकों का एक नुकसान गैर-समरूप अंत-जुड़ने (एनएचईजे) डीएनए मरम्मत के माध्यम से प्रविष्टि और विलोपन (इनडेल) म्यूटेशन पैदा करने की संभावना है, जिसके परिणामस्वरूप ड्राइव प्रतिरोधी एलील्स की पीढ़ी होती है, जो जब जनसंख्या में उच्च पर्याप्त आवृत्ति तक जमा होती है, तो ड्राइव प्रणाली को1,2,3,4 से फैलने से रोक सकती है . यह प्रोटोकॉल एक उच्च-थ्रूपुट और विश्वसनीय विधि का विवरण देता है जो कैस/जीआरएनए-आधारित जीन ड्राइव के दौरान जनसंख्या और व्यक्तिगत दोनों स्तरों पर इनडेल म्यूटेशन की व्यापकता और सापेक्ष मात्रा निर्धारित कर सकता है ।
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) विधियां अद्वितीय अनुक्रमण संकल्प प्रदान करती हैं। हालांकि, एनजीएस से जुड़ी लागत और तकनीकी आवश्यकताएं नियमित परीक्षण को प्रतिबंधित करतीहैं और6,7,8के अंत में उपयोग को उच्च-थ्रूपुट विधि के रूप में सीमित करती हैं। पारंपरिक पीसीआर क्वांटिफिकेशन विधियों का उपयोग लंबे समय से जीनोम इनडेल्स के लिए मानक मूल्यांकन प्रक्रिया के रूप में किया जाता रहा है; हालांकि, ये विधियां श्रम-प्रधान हैं, डेटा खरीदने के लिए एक लंबा समय लेते हैं, और उच्च स्तर की परिवर्तनशीलता होती है। डिजिटल-ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडीपीसीआर) कुछ अनुप्रयोगों में सेंगर अनुक्रमण की तुलना में म्यूटेशन का पता लगाने में अधिक संवेदनशील साबित हुई है और अन्य6,7,8,9में एनजी की तुलना में कम पहचान सीमा है। इसके अलावा, परिणाम प्राप्त करने के लिए एक नमूना सेट और टर्न-अराउंड समय का आकलन करने की लागत क्रमशः कम खर्चीला और तेज है, डीडीपीसीआर के लिए या तो सेंगर अनुक्रमण या एनजीएस9की तुलना में । दोहरी जांच प्रणाली का उपयोग करते हुए, ड्रॉप-ऑफ परख GRNA निर्देशित लक्ष्य Cas9 कट साइट पर जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) अनुक्रम की अनुपस्थिति के आधार पर NHEJ alleles की पहचान करता है । इस परख में, कैस/gRNA आधारित प्रणाली की भविष्यवाणी की कटौती साइट सहित एक छोटी एम्प्लिकॉन एक विशिष्ट प्राइमर जोड़ी के साथ परिलक्षित होता है । एक फ्लोरोसेंट जांच एम्प्लिकॉन के एक संरक्षित क्षेत्र के लिए बाध्य करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और एक और फ्लोरोसेंट जांच कट साइट के डब्ल्यूटी अनुक्रम को पहचानता है । एनएचईजे एलील की उपस्थिति में, बाद में एम्प्लिकॉन से बांध नहीं होगा।
डीडीपीसीआर का उपयोग हटाने, एकल आधार-जोड़ी मतभेदों और सम्मिलन को लक्षित करने के लिए प्राइमर डिजाइन करने की क्षमता प्रदान करता है, जो मच्छर आबादी में एनएचईजे प्रोफाइलिंग के लिए अनुमतिदेगा 9का विश्लेषण करता है। इन आकर्षक विशेषताओं को देखते हुए, हमने मच्छरों में कैस/जीआरएनए आधारित जीन-ड्राइव प्रणाली से उत्पन्न इनल्ड का उच्च-थ्रूपुट डिटेक्शन के लिए डीडीपीसीआर के लिए एक प्रोटोकॉल बनाया ।
Protocol
1. डीएनए निष्कर्षण
- ईएफटीए/न्यूक्लिय लाइसिस बफर (EDTA/NLS) को एनएलएस के 500 माइक्रोन और प्रति सैंपल ईडीटीए के 120 माइक्रोन के अनुपात के साथ तैयार करें। कई नमूनों के लिए स्केल-अप। मिश्रण को बर्फ पर ठंडा करें।
नोट: मात्रा के आधार पर ठंडा होने पर समाधान 2-5 मिनट में बादल छा जाएगा। - ठंडा EDTA/NLS के ६०० μL से भरा १.५ एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 10-15 एस के लिए एक यांत्रिक समरूप का उपयोग कर मच्छर के नमूने को समरूप; अच्छी तरह से मिलाएं।
- ट्यूब में प्रोटीनेज के 20 मिलीग्राम/एमएल का 17.5 माइक्रोन जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
- रात भर 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। बारी-बारी से, हर 1 घंटे में नमूने को हिलाने और भंवर के साथ 3 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट करें।
- कमरे के तापमान के नमूने और भंवर के लिए 200 माइक्रोन प्रोटीन वर्षा समाधान 20 s के लिए सख्ती से जोड़ें ।
- बर्फ पर 5 मिनट के लिए नमूना ठंडा।
- 4 मिनट के लिए 15,890 आरसीएफ पर पैलेट प्रोटीन के लिए नमूना अपकेंद्रित्र।
- ध्यान से उस सुपरनेट को एस्पिएरेट करें जिसमें डीएनए होता है और इसे एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करता है जिसमें आइसोप्रोपेनॉल का 600 माइक्रोल होता है।
- धीरे-धीरे ट्यूब को 5-10 बार उलटा करके घोल मिलाएं। 15,890 आरसीएफ पर 1 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। डीएनए पेलेट को संरक्षित करते समय सुपरनेट को सावधानी से डिकंट करें।
- कमरे के 600 माइक्रोन जोड़ें- तापमान 70% इथेनॉल। ट्यूब को धीरे-धीरे उलटा करके पैलेट किए गए डीएनए को धोएं।
- 15,890 आरसीएफ पर 1 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। कांच के पिपेट टिप का उपयोग करके आकांक्षा द्वारा सुपरनैट को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- ट्यूब को साफ शोषक कागज पर पलटें और हवा-10-15 मिनट के लिए गोली को सुखा लें।
- डीएनए को पीसीआर ग्रेड के पानी से रिस व्यय करें। 10 पूल्ड मच्छरों के लिए प्रति व्यक्तिगत मच्छर नमूना या 100 माइक्रोन का उपयोग करें।
नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके मच्छर के नमूनों के लिए डीएनए निष्कर्षण विधियों को ऊतक संस्कृति कोशिकाओं और पशु ऊतक प्रोटोकॉल से निर्माता के अलग जीनोमिक डीएनए से अनुकूलित किया जाता है।
2. ddPCR प्रतिक्रियाओं और बूंद पीढ़ी की तैयारी
- फ्लोरोमीटर का उपयोग करके डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।
नोट: ड्रॉप-ऑफ परख के लिए, प्रति प्रतिक्रिया 3,000-30,000 हैप्लॉयड जीनोम प्रतियों की एक श्रृंखला का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जिसे एचएक्स-लेबलिंग जांच के साथ एनएचईजे घटनाओं का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो लक्षित कट साइट के डब्ल्यूटीई अनुक्रम से बांधता है और यदि लक्ष्य स्थल पर कोई विलोपन या प्रविष्टि है तो एनील (ड्रॉप-ऑफ) नहीं होगा, यदि लक्ष्य स्थल पर कोई विलोपन या प्रविष्टि है, एनएचईजे संस्करण की उपस्थिति का संकेत। - निकालने में हैप्लॉयड जीनोम वजन और डीएनए की एकाग्रता का उपयोग कर प्रतिलिपि संख्या की गणना करें। यह कुल डीएनए द्रव्यमान प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली मात्रा द्वारा निकाले गए डीएनए की एकाग्रता को गुणा करके किया जाता है, फिर इसे हैप्लॉयड जीनोम वजन द्वारा विभाजित किया जाता है। सुनिश्चित करें कि जोड़ा गया वॉल्यूम 1-10 माइक्रोल के बीच है। अनुशंसित हैप्लॉयड जीनोम कॉपी रेंज में होना आवश्यक है।
नोट: एक एनोफेल्स गैम्बिया हैप्लोइड जीनोम 0.27 पीजी प्रति वयस्क मच्छर10होने का अनुमान है। - डिजाइन प्राइमर और जांच। 55-60 डिग्री सेल्सियस की सीमा में प्राइमर मेल्टिंग टेम्परेचर (टीएम) के साथ आगे और रिवर्स ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर डिजाइन करें जो 150-400 बीपी के एम्प्लाइसन का उत्पादन करने वाली 5'और 3'-सिरों को ग्रण लक्ष्य स्थल के पार्श्व करते हैं।
- एचेक्स (हेक्साक्लोरो-फ्लोरोसेसिन) - एनएचईजे डिटेक्शन के लिए लेबल की गई जांच: लक्ष्य स्थल के पूरक लंबाई में ~ 15-20 बीपी का एक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिजाइन करें और एचेक्स-प्रोब को 5'-अंत और बीएचक्यू1 (BLack होल क्वेंचर 1) को 3 के अंत में जोड़ें। हाइड्रोलिसिस प्रोब का टीएम प्राइमर के टीएम से 3-10 डिग्री सेल्सियस अधिक होना चाहिए।
- एफएएम (6-carboxyfluorescein) संदर्भ WT के लिए लेबल जांच: लक्ष्य स्थल से एक संरक्षित जीनोम साइट दूर (लगभग 25 बीपी) के पूरक लंबाई में एक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ~ 15-20 बीपी डिजाइन करें और एफएएम-प्रोब को 5'-अंत और बीएचक्यू1 को 3' के अंत में जोड़ें। हाइड्रोलिसिस प्रोब का टीएम प्राइमर के टीएम से 3-10 डिग्री सेल्सियस अधिक होना चाहिए।
3. पीसीआर रिएक्शन की तैयारी
- निम्नलिखित घटकों के साथ डीडीपीसीआर नमूना मिश्रण के 25 माइक्रोन तैयार करें: जांच के लिए डीडीपीसीआर सुपरमिक्स (कोई यूटीपी): 12.5 माइक्रोल, फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर (10 माइक्रोन): 1 μL प्रत्येक, HEX/FAM जांच (10 μM): ०.६२५ μL प्रत्येक, डीएनए: 1-5 μL (3,750-37,500 हैप्लाइड जीनोम प्रतियां) और पानी: 25 μL तक ।
- अच्छी तरह से भंवर या भाटा पाइपिंग (ऊपर और नीचे) (20x) द्वारा प्रतिक्रियाओं मिश्रण ।
नोट: यदि प्रतिक्रियाएं 96-अच्छी प्लेट में हैं, तो बुलबुला गठन से बचने के लिए भंवर के बजाय पूरी मात्रा को 20 बार ऊपर और नीचे करें। - संक्षेप में नमूनों को ट्यूब या अच्छी तरह से नीचे मिश्रण व्यवस्थित करने के लिए अपकेंद्रित्र करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रियाएं बूंद पीढ़ी के लिए कमरे के तापमान पर हैं। प्रत्येक कारतूस में अतिरिक्त/अप्रयुक्त कुओं के लिए 1x ddPCR मिश्रण तैयार करें (प्रत्येक कारतूस में 8 कुएं हैं)।
4. बूंद पीढ़ी
- 50 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, डीडीपीसीआर नमूने के 20 माइक्रोन को कारतूस की मध्य पंक्ति मेंमिलाएं (चित्रा 1A,शीर्ष)।
- तेल के 70 माइक्रोन को निचली पंक्ति में लोड करें। अप्रयुक्त कुओं में 1x ddPCR सुपरमिक्स के 20 माइक्रोन लोड करें।
नोट: बुलबुले पेश न करें। - गैसकेट को केवल किनारों को छूते हुए रखें, केंद्र concaved क्षेत्र(चित्रा 1B)से परहेज करें।
- प्लेट को बूंद जनरेटर में सुरक्षित रूप से रखें और रन शुरू करने के लिए कवर बंद करें।
- मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, कारतूस की शीर्ष पंक्ति(चित्रा 1A,नीचे) से 96-अच्छी प्लेट में 40 माइक्रोन मिश्रण स्थानांतरित करें।
- 45-30 डिग्री कोण पर 3-5 एस के लिए तरल नमूना खींचें। मिश्रण को धीरे-धीरे 3 एस से अधिक कुएं के किनारे में 45 डिग्री कोण पर निष्कासित करें, जिससे यह साइड को ड्रिप कर सके। सभी तरल को निष्कासित करने के लिए पिपेट के दूसरे स्टॉप (पूर्ण निष्कासन) पर जाना ठीक है।
- पन्नी गर्मी जवानों का उपयोग करना, 180 डिग्री सेल्सियस पर 5 एस के लिए प्लेटों को सील करें।
5. पीसीआर
- सील की गई प्लेट को थर्मोसाइकिलर(चित्रा 1C)में रखें और एनएचईजे ड्रॉप-ऑफ दिशानिर्देशों का पालन करते हुए अनुशंसित पीसीआर शर्तों को इस प्रकार निर्धारित करें:
- 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक डेनैचेशन।
- 30 एस को डेनेचर के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 1 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस एनील के लिए, और 2 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस का विस्तार करने के लिए सेट करें।
- 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
नोट: विशिष्ट प्राइमर और जांच सेट के लिए एनीलिंग तापमान थर्मल ढाल का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है। सभी चरणों के लिए 2 डिग्री सेल्सियस/s के रैंप दर का उपयोग करें। पीसीआर शर्तों को प्रत्येक प्रयोगात्मक डिजाइन और सेट-अप के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए।
6. बूंद पढ़ना
- शीर्ष बाईं ओर अच्छी तरह से ए-1 के साथ बूंद पाठक में प्लेट को सुरक्षित रखें (चिकनी कोने, अन्य तीन धार हैं)(चित्रा 1D)।
- कार्यक्रम में प्लेट सेट करें: FAM को ज्ञात संदर्भ चैनल और एचेक्स को अज्ञात(चित्रा 2 ए)के रूप में नामित करना।
- ड्रॉपलेट रीडिंग प्रयोग को प्रत्यक्ष मात्राकरण के रूप में चलाएं। रन खत्म होने के बाद, प्रयोग प्रकार को विश्लेषण(चित्रा 2 ए)के लिए ड्रॉप-ऑफ (डीओएफ) में बदलें।
7. विश्लेषण
- सही प्रायोगिक मापदंडों को नामित करें(चित्रा 2A): नमूना जानकारी, सुपरमिक्स, लक्ष्य नाम (डब्ल्यूटीई या एनएचईजे), लक्ष्य प्रकार (रेफरी या अज्ञात), सिग्नल Ch1 (हेक्स या एफएएम), सिग्नल Ch2 (हेक्स या एफएएम), और मैन्युअल रूप से बूंद गिनती के लिए सीमा निर्धारित करें (विश्वसनीय परिणामों के लिए 10,000 से ऊपर की सिफारिश करें)। सॉफ्टवेयर निर्धारित पैरामीटर के साथ अधिकांश विश्लेषण करेगा।
- ड्रॉपलेट टैब में ड्रॉपलेट काउंट की जांच करें; सुनिश्चित करें कि सभी 10,000(चित्रा 2B) सेऊपर हैं।
- नकारात्मक से कुशल संकेत जुदाई के लिए 1 डी आयाम की जांच करें ।
- प्लेट एडिटरमें पूरी प्लेट को हाइलाइट करें और प्रयोग प्रकार को छोड़ दें।
- एक संदर्भके रूप में डब्ल्यूटीई लक्ष्य निर्धारित करें, एफएएम के लिए चैनल एक को नामित करें और हेक्स के लिए दो चैनल करें।
- NHEJ लक्ष्य को अज्ञात के रूप में सेट करें, एफएएम के लिए चैनल एक को नामित करें और दो चैनल को किसी के रूप में न करें।
- 2D आयाम टैब में, प्रत्येक नमूने के लिए ग्राफ टूल के साथ क्लस्टर थ्रेसहोल्ड सेट करें। डब्ल्यूटी क्लस्टर से जुड़ी पूंछ पर विचार करें; यह NHEJ परख(चित्रा 3A)के लिए सामान्य है ।
नोट: अनुपात टैब के तहत, ग्राफ के ऊपर-दाई से गियर आइकन पर क्लिक करें। आंशिक बहुतायतका चयन करें । ग्राफ अब NHEJ घटनाओं(चित्रा 3B)के प्रतिशत के अनुरूप एक बिंदु की साजिश होगी ।
Representative Results
इस प्रक्रिया का एक आवेदन कार्बालर-लेजाराज़ू एट अल 9 में दिखाईदेताहै। DDPCR ड्रॉप-ऑफ परख डब्ल्यूटीई और इनडेल दृश्यों को समझने के लिए दो फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करता है: एक एफएएम जांच एम्प्लिकॉन के भीतर एक संरक्षित अनुक्रम से बांधती है, जबकि एचईएक्स जांच लक्षित साइट(चित्रा 4A)के डब्ल्यूटीई अनुक्रम को लक्षित करती है। इंडेल की मौजूदगी में हेक्स जांच नहीं बांधेगी । प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2,तालिका 1, और कार्बालर-Lejarazú एट अल 9 के तालिका2में पाया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, डीडीपीसीआर को CRISPR-Cas9 प्रेरित NHEJ घटनाओं की एक विस्तृत विविधता का पता लगाने और किसी व्यक्ति या पूल किए गए नमूने में एनएचईजे आवृत्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए साबित किया गया है। 10 मच्छरों के पंद्रह अलग-अलग पूल किए गए नमूनों में विभिन्न एनएचईजे एलील्स (कार्बालर-लेजाराज़ू एट अल9)की तालिका 2) शामिल थी। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल और मापदंडों का उपयोग करके डीडीपीसीआर के साथ इनका विश्लेषण किया गया। तालिका 19 के परिणाम बताते हैं कि सभी 15 नमूनों में ड्रॉप-ऑफ परख(चित्रा 4B)द्वारा पहचाने गए 100% इंडेल एलील्स किए गए हैं। एक अन्य प्रयोग में, विभिन्न एनएचईजे प्रतिशत (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, और 100%) के साथ डब्ल्यूटीई मच्छरों और एनएचईजे मच्छरों के 11 पूल्डनमूनोंकी जांच की गई । कार्बालर-लेजाराज़ू एट अल9)से पता चला है कि पहचाना गया प्रतिशत एम्प्लिकॉन एनालिसिस(चित्रा 4C)द्वारा इंडेल डिटेक्शन की तुलना में तकनीक के करीब है ।
चित्रा 1:प्रायोगिक सेट-अप और प्रक्रिया। (एक)बूंद पीढ़ी के लिए कारतूस की तैयारी। (शीर्ष) नमूने कारतूस की मध्य पंक्ति में भरे जाते हैं, जबकि तेल नीचे की पंक्ति में भरा जाता है। (नीचे) बूंद पीढ़ी के बाद पायस बूंदों से भरी शीर्ष पंक्ति। (ख)बूंद जनरेटर के साथ एक कारतूस नमूना से भरा और जगह में एक गैसकेट द्वारा कवर किया । (ग)थर्मो-साइकिलर में पन्नी सील से ढकी 96-अच्छी प्लेट। (घ)बूंद पाठक ९६-अच्छी तरह से थाली के साथ जगह में एक धातु कवर के साथ प्लेट पर latched इसे सुरक्षित करने के लिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:बूंदें पढ़ना। (1)ड्रॉपलेट रीडिंग के लिए सॉफ्टवेयर इंटरफेस। नारंगी बक्से नमूनों के साथ कुओं दिखाते हैं । ग्रे बक्से खाली कुएं हैं। प्रयोगात्मक पैरामीटर संपादित उपकरण पैनल (दाएं हाथ की ओर) में स्थापित किए जाते हैं। प्रत्येक नमूने को संबंधित नमूना बॉक्स पर क्लिक करके संपादित किया जा सकता है। प्रायोगिक प्रकारके लिए ड्रॉप ऑफ (डीओएफ) का चयन करें । नमूना जानकारी में, नमूने के नाम और प्रकारके साथ-साथ सुपरमिक्स के लिए उचित जानकारी भरें। परख की जानकारीके लिए बेसिक ड्रॉप-ऑफ चुनें । डब्ल्यूटीई नमूनेके लिए, लक्ष्य नाम के लिए डब्ल्यूटीई, टारगेट टाइपके लिए रेफरी, और सिग्नल सीएच 1 और सीएच 2के लिए क्रमशः एफएएम और हेक्स दोनों चुनें। NHEJ नमूनों के लिए, लक्ष्य नामके लिए उपयुक्त नाम भरें, लक्ष्य प्रकारके लिए अज्ञात चुनें, और सिग्नल Ch1के लिए FAM चुनें। कोई भी पर संकेत Ch2 छोड़ दें । (ख)कई नमूनों के लिए ड्रॉपलेट काउंट परिणाम । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3:ड्रॉप-ऑफ परख विश्लेषण। (A)डब्ल्यूटीई और एनएचईजे एलील्स की बूंद गिनती के लिए क्लस्टर 2डी प्लॉट । 2D आयाम टैब में, सभी बूंदों को डिफ़ॉल्ट रूप से अवर्गीकृत किया गया है। इस आंकड़े में, रंगों को मैन्युअल रूप से भेद करने के लिए सौंपा जाता है। ऑरेंज डॉट्स क्लस्टर क्रमशः संदर्भ अनुक्रम और लक्ष्य साइट अनुक्रम पर एफएएम और एचईएक्स दोनों जांचों के बाध्यकारी द्वारा प्राप्त डब्ल्यूटीएल काउंट हैं। ब्लू डॉट्स बूंदों के स्कोर का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनमें संदर्भ अनुक्रम के लिए एफएएम बाध्यकारी होता है लेकिन लक्ष्य साइट अनुक्रम पर कोई एचेक्स बाध्यकारी नहीं होता है (इसलिए हेक्स का ड्रॉप-ऑफ)। ग्रे डॉट्स खाली बूंदें हैं जिनमें या तो एफएएम या हेक्स बाध्यकारी नहीं है। (ख)एनएचईजे घटनाओं का अनुपात/बहुतायत रेखांकन । अनुपात टैब के तहत, NHEJ घटनाओं के संवाददाता प्रतिशत के साथ एक ग्राफ के लिए आंशिक बहुतायत का चयन करें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:ट्रांसजेनिक एनोफेल्स स्टीफेंसी लाइन, AsMCRkh1 में गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने की पहचान और मात्राकरण के लिए डीडीपीसीआर के साथ ड्रॉप-ऑफ परख का आवेदन। (क)दोहरी जांच प्रणाली के साथ लक्षित डीएनए साइट पर म्यूटेशन का पता लगाने के लिए डीडीपीसीआर ड्रॉप-ऑफ परख की योजनाबद्ध प्रस्तुति । 150-400 बीपी का एक एम्प्लिकॉन आगे और रिवर्स प्राइमर के साथ परिलक्षित होता है। एक एफएएम-लेबल जांच एम्प्लिकॉन के संरक्षित अनुक्रम को बांधने के लिए डिज़ाइन की गई है, जबकि एक हेक्स-लेबल जांच को डब्ल्यूटी जीएनए लक्षित साइट से बांधने के लिए डिज़ाइन किया गया है। (ख)डीडीपीसीआर के साथ विभिन्न प्रकार के इनलों का पता लगाना। 10 AsMCRkh1 मच्छरों के पंद्रह पूल प्रत्येक प्रविष्टि, हटाने, और प्रतिस्थापन सहित विभिन्न प्रकार के इंडेल युक्त, ddPCR ड्रॉप-ऑफ परख के साथ विश्लेषण किया गया । म्यूटेशन और दृश्यों का विवरण कार्बालर एट अलके टेबल 2 और टेबल एस 3 में पाया जा सकता है। 9. (C)विभिन्न अनुपातों (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, और 0:10) का उपयोग कर ddPCR और एम्प्लिकॉन विश्लेषण द्वारा इंडेल डिटेक्शन की तुलना में तकनीक9। कार्बालर-लेजाराज़ू एट अल बायोटेक्निक्ससे अनुकूलित छवियां। 68 (4): 172-179 (2020)9. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| प्राइमर/प्रोब | अनुक्रम (5' » 3') |
| डीडीपीसीआर फॉरवर्ड प्राइमर | ATGATCAAATGTCGACCG |
| डीडीपीसीआर रिवर्स प्राइमर | ACCGTACTGGTTGAACA |
| DDPCR हेक्स जांच (BHQ1) | [हेक्स]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1] |
| DDPCR FAM जांच (BHQ1) | [6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1] |
| HEX: हेक्साक्लोरो-फ्लोरोसेन, एफएएम: 6-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन, बीएचक्यू: ब्लैक होल क्वेंचर | |
तालिका 1: प्राइमर और जांच के दृश्य।
Discussion
डिजिटल-ड्रॉपलेट पीसीआर कैस/जीआरएनए-आधारित जीन-ड्राइव प्रणाली में एनएचईजे घटनाओं के परिणामस्वरूप इनडेल एलील्स की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए एक कुशल तरीका है और व्यक्तियों या आबादी में इन एलील्स की आवृत्ति की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है । विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए विशेष सावधानी के साथ प्रोटोकॉल के कुछ चरणों का पालन करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण को उच्च गुणवत्ता और पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक प्रदर्शन करने की आवश्यकता है। एक अच्छा निष्कर्षण प्रतिक्रिया प्रति हैप्लॉयड जीनोम प्रतियों के सटीक निर्धारण की अनुमति देगा। हमारे अनुभव में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) लगातार उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए निष्कर्षण प्रदान की है । हालांकि, व्यक्तिगत मच्छरों के अर्क विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण साबित हो सकते हैं क्योंकि डीएनए गोली कल्पना करना मुश्किल हो जाता है और सावधान नहीं होने पर आसानी से सुपरनैंट के साथ चूसा जा सकता है। दूसरे, प्राइमर और जांच को सावधानीपूर्वक डिजाइन किया जाना चाहिए । डीडीपीसीआर प्रयोग को पूरा करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि डिज़ाइन किए गए प्राइमर पहले पारंपरिक पीसीआर का प्रदर्शन करके एक ही पीसीआर उत्पाद का परिणाम देते हैं और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के माध्यम से एक उत्पाद की कल्पना करते हैं। संदर्भ एफएएम जांच को भी डिजाइन किया जाना चाहिए ताकि यह एक उच्च संरक्षित अनुक्रम के पूरक हो। यह एक विविध आबादी में WT alleles का सटीक पता लगाने सुनिश्चित करेगा । प्रत्येक अनूठे प्रयोग के लिए प्राइमर/प्रोब संयोजनों में अलग-अलग थर्मोसाइकिलर की स्थिति होगी, और थर्मल ढाल का उपयोग करके उन स्थितियों को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है।
इनलों की पहचान करने के लिए अन्य तरीके मौजूद हैं, जैसे सेंगर अनुक्रमण या एनजीएस। सेंगर अनुक्रमण सीमित है क्योंकि इसमें उपन्यास वेरिएंट की पहचान करने के लिए पता लगाने और कम खोज शक्ति की सीमा कम है। सेंगर अनुक्रमण भी श्रम-प्रधान है और उच्च-थ्रूपुट नहीं है। सेंगर अनुक्रमण की तुलना में, एनजीस के पास कम संवेदनशीलता, खोज शक्ति और थ्रूपुट की समान सीमाएं नहीं हैं। एनजी का एक और लाभ एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNPs) से पुनर्व्यवस्थाओं के लिए विभिन्न प्रकार के उत्परिवर्तनों का पता लगाने की क्षमता है। हालांकि, NGS Cas9/gRNA से जुड़े indels का निर्धारण करने के आवेदन में एक अधिक महंगा और समय लेने वाली विधि है क्योंकि वहां ब्याज का केवल एक ही लक्ष्य क्षेत्र है, और यह सबसे बड़ा जीनोम व्यापक विश्लेषण के लिए अनुकूल है । उपर्युक्त तरीकों की तुलना में, डीडीपीसीआर उच्च थ्रूपुट है और इसमें त्वरित मोड़-चारों ओर समय है। यदि डीडीपीसीआर सामग्री और उपकरण घर में उपलब्ध हैं, तो 1-2 दिनों के भीतर 96 नमूनों को संसाधित किया जा सकता है, जिससे यह Cas9/gRNA-संशोधित जीवों के बड़े परीक्षणों के त्वरित विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हो जाता है।
जबकि डीडीपीसीआर के लिए कई लाभ मौजूद हैं, सीमाएं भी हैं। सबसे पहले, डीडीपीसीआर उपकरण एक स्वतंत्र प्रयोगशाला वातावरण में अक्सर उपलब्ध नहीं है। डीडीपीसीआर उपकरण बड़े अनुसंधान संस्थानों में सांप्रदायिक रूप से उपलब्ध हो सकते हैं, लेकिन यह संस्थान के बाहर डेटा उत्पादन और विश्लेषण में आसानी के लिए अनुमति नहीं देता है। दूसरे, विकल्पों के विपरीत, डीडीपीसीआर पहचाने गए इनडेल म्यूटेशन के व्यक्तिगत अद्वितीय दृश्य प्रदान नहीं करता है। डिजिटल-ड्रॉपलेट पीसीआर आबादी के भीतर इंडेल म्यूटेशन की आवृत्ति प्रदान करेगी, लेकिन अनुक्रम के बिना, कोई यह निर्धारित नहीं कर सकता कि मौजूद इनडेल ब्याज के जीन के कार्य को संरक्षित या बाधित करने की अधिक संभावना रखते हैं या नहीं। DDPCR विधि शायद सबसे अच्छा अनुकूल है एक Cas9/gRNA आधारित ड्राइव जीव के एक क्षेत्र रिलीज परीक्षण के बाद जंगली आबादी का विश्लेषण करने के लिए क्योंकि यह कुशलता से देशी आबादी में ट्रांसजीन की शुरूआत की आवृत्ति और वास्तविक समय के करीब में आबादी के भीतर indels की पीढ़ी निर्धारित कर सकते हैं । डीडीपीसीआर क्विक टर्न-अराउंड टाइम के कारण, यदि सामग्री स्थानीय रूप से उपलब्ध थी तो साप्ताहिक रूप से एक क्षेत्र परीक्षण क्षेत्र में आबादी का नमूनाकरण करना और विश्लेषण करना संभव होगा। डीडीपीसीआर उपकरण खरीदने, आयात करने और स्थापित करने के लिए शुरू की लागत दूरदराज की प्रयोगशालाओं में उच्च होगी, लेकिन एक जंगली आबादी का कड़ाई से आकलन करने में सक्षम होने के लाभों के रूप में यह एक ड्राइव प्रणाली से संशोधन के दौर से गुजर रहा है लागत का औचित्य साबित होगा ।
Disclosures
लेखकों के पास कोई खुलासे नहीं हैं ।
Acknowledgments
वित्त पोषण कैलिफोर्निया इरविन मलेरिया पहल विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया था । AAJ कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में एक डोनाल्ड Bren प्रोफेसर है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
References
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).
- Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Boëte, C. Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control. EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Wang, Z., et al. Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).
- Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection. Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).
- Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).
- Carballar-Lejarazú, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi. Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).
- Holt, R. A., et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298 (5591), 129-149 (2002).
