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Cancer Research

ヒト末梢血リンパ球におけるγ-H2AX Fociアッセイの自動微視的スコアリング法

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/62623
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 4, 5, 6, 1
1Radiation Biophysics Division, Nuclear Medicine Department, iThemba LABS, 2Department of Biotechnology, University of the Western Cape, 3Department of Medical Biosciences, University of the Western Cape, 4Division of Medical Physiology, Department of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 5Biodosimetry Service, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable and Academic Unit on Radiation Protection, Faculty of Medicine, University of the Republic, 6MetaSystems Hard & Software GmbH

Summary

このプロトコルは、末梢血リンパ球に対するγ-H2AX病巣アッセイのスライド調製および自動スコアリングを提示する。アッセイの方法および感度を例示するために、単離リンパ球を インビトロで照射した。DNA DSB検出のこの自動化された方法は、高速かつハイスループットの生物学的ドシメトリーアプリケーションに有用です。

Abstract

電離放射線はDNA損傷の強力な誘導物質であり、十分に文書化された発がん性物質である。生物学的線量測定は、電離放射線への曝露によって誘導される生物学的影響の検出を含み、個々の線量評価を行う。これは、暴露された犠牲者のための健康評価と臨床治療の計画が重要である放射線緊急事態の枠組みに関連しています。DNA二本鎖切断(DSB)は放射線によるDNA損傷の最も致命的な形態であると考えられているため、このプロトコルは血液サンプル中のDNA DSBを検出する方法を提示する。この方法論は、蛍光標識されたリン酸化DNA修復タンパク質、すなわちγ-H2AXの検出に基づいています。細胞あたりのγ-H2AXの病巣の数をスコア付けするために自動顕微鏡プラットフォームを使用することで、ターンアラウンド時間の大幅な減少と標準化された分析が可能になります。したがって、γ H2AXアッセイは、生物学的ドシメトリーのための最速かつ感度のアッセイの1つになる可能性を有する。このプロトコルでは、健康な成人ボランティアからの全血サンプルを処理し、バイオドシメトリーアプリケーションのための自動化された敏感なγ H2AX病巣アッセイの使用を説明するために in vitroに 照射されます。自動スライドスキャンシステムと、統合された蛍光顕微鏡を用いた分析プラットフォームが使用され、バイアスの程度を低減したDNA DSBの高速かつ自動スコア付けが可能です。

Introduction

その発見以来、電離放射線(IR)は、現在の医療や産業の実践、農業や軍事用途において不可欠なツールとなっています。しかし、IRの広い使用はまた、プロの放射線労働者だけでなく、一般のメンバーのための放射線過剰暴露のリスクを高めます。IRは、直接的または間接的にDNA損傷を誘発する可能性のあるよく知られた物理的発癌物質であり、重大な健康上のリスクを1、2に導く。従って、被ばくの程度が放射線事故1の管理において重要な初期工程を形成するので、線量評価を行うことが重要である。

大規模な核や放射線の緊急事態が発生した場合、実施する必要のある線量評価の数は、事故の規模に応じて数千人から数千人に及ぶ可能性があります 3.これらのシナリオでは、物理的な量体測定は、一般の人々が関与している場合、あいまい(例えば、ドシメータが適切に摩耗していない場合)または利用できない場合があります。臨床症状はトリアージに使用できますが、必ずしも放射線特異的ではなく、誤った診断を引き起こす可能性があります。したがって、物理的なドシメトリーおよび臨床評価と共に生物学的ドシメトリーを使用することが推奨される。この方法は、放射線誘発性変化を細胞レベルで分析することを可能にし、治療4を必要とする被ばく個体の明確な同定を可能にする。医師は、適切な医療5を処方するために、この生物学的線量評価を使用して、物理的な線量再建および他の臨床診断を補完することができる。生物学的線量測定の必要性は、暴露シナリオがよく知られていない場合、および犠牲者が一般市民である場合、死傷者のトリアージおよび医療管理のために特に高くなります。トリアージの主な目的は、直接的に「心配している人、早血症状を持つことができるが、高用量を受け取らなかった人」を、即時の医療援助と専門的なケアを必要とする暴露者と区別することです。放射線病を引き起こす可能性のある放射線量の閾値レベルは、約0.75-1.00 Gyです。その後、>2 Gyの被ばくを受ける人は、急性放射線症候群のリスクが高く、迅速な治療6,7を受けるべきである。このような災害のクロスファイアに巻き込まれた犠牲者のためのタイムリーかつ正確な生物学的線量推定値は重要です。さらに、それはまた、最小限の露出した犠牲者8を慰め、安心させることができます。

放射線防護当局は、培養ヒトリンパ球9において、ジセントリック染色体またはミクロ核などの細胞遺伝学的損傷の検出に主に基づく様々なバイオドシメトリーマーカーを使用する。細胞遺伝学的損傷の検出は、蛍光イン ザシチュハイブリダイ ゼーション(FISH)転座アッセイ10によっても行うことができる。しかしながら、従来の細胞遺伝学的方法の大きな欠点は、緊急事態8で結果を得るために長いターンアラウンドタイムである。

DNA DSB認識プロセスの最も初期のステップの1つはヒストン変異体H2AXのリン酸化であり、γ-H2AXの形成、および修復因子のその後の採用につながる。過去10年間、免疫蛍光顕微鏡を用いた末梢血リンパ球における放射線誘導γ-H2AX病巣の検出は、信頼できる生物学的線量測定ツール11、12、13、14、15として注目を集めている。放射線の質と細胞の種類に応じて、γ H2AXの最大収量は、照射後0.5〜1時間以内に検出される16、17。DNA DSBとγ-H2AX病巣の数、ならびに病巣の消失とDSB修復の間には密接な相関関係があることが予想される。パルスレーザーマイクロビームを用いたレーザーはさみ実験は、γ-H2AXの病巣がDNA DSB18の部位に局地化することを実証した。それは活発な議論の話題のままですが、125で最も初期の研究の1つは、計算された細胞あたりの崩壊数(放射線誘発DNADSBの数に対して表される)と19、20を獲得したγ-H2AX病巣の数との間に1対1の相関関係を示唆した。

過去10年間、欧州連合(EU)は、生物的および遡及的な量体系における持続可能なネットワークを構築するために、MULTIBIODOSE(高規模の放射線障害を管理するための多分野バイオドーシメトリックツール)とRENEB(欧州生物線学ネットワークの実現)プロジェクトに資金を提供しました。21,22.このプロジェクトには、放射線緊急事態が発生した場合の緊急対応能力を評価するために、ヨーロッパ各地の様々な研究所が含まれていました。14,21,22.γ-H2AXのフォチアッセイは、迅速な処理時間、高スループットを可能にするバッチ処理の可能性、および暴露後数時間以内に使用した場合の高感度など、多くのかなりの利点を有する13,23,24.低線量域におけるアッセイの高感度化により、放射線照射と画像診断用途の両方において、γ-H2AX病巣アッセイが医療放射線被曝の効果の指標として使用された多くの研究が行われました。25,26,27,28,29,30.これらの特徴は、γ-H2AXフォチアッセイは、リスクの低い個人から重大に暴露された人を分離するために、大規模な原発事故の早期トリアージのための他の方法に代わる非常に競争の激しい代替手段です。いくつかの最適化実験は、血液の滴だけでγ-H2AX病巣アッセイを行うことが可能であると報告したMoquetらの研究など、少量の血液でγ-H2AX病巣アッセイを行うことが可能であることを示している(指プリック)31.同様のアプローチは、指スティック由来の血液サンプルからγ-H2AXの収量を測定するために最適化された完全に自動化されたハイスループットRABIT(急速自動バイオドシメトリーツール)システムの開発にも使用されました。32,33.全体として、MULTIBIODOSEとRENEBの比較研究の結果は、γ-H2AX病巣アッセイが最近(最大24時間)の急性放射線被ばく後に非常に有用なトリアージツールである可能性があることを示唆している12,13,14.低用量範囲の比較研究では、10mGy以下の用量を、低用量範囲でのアッセイの感度を強調して、恥に照射された対照サンプルと区別することができる。34.なお、このアッセイの感度が高いのはリンパ球に特に当てはまり、低用量曝露の評価に最も適した細胞タイプの1つとなる。リンパ球は、主に非循環細胞であり、同期集団を表す。後者は、γ-H2AXの発現を回避し、DNA複製に関連付けられており、細胞周期のG2およびS相中の放射線誘発DSBを検出するアッセイの感受性を大幅に低下させる35.リンパ球の低用量に対する感受性に加えて、γ-H2AX病巣アッセイのターンアラウンドタイムは、リンパ球の刺激を必要としないため、二心核および微小核アッセイなどの細胞遺伝学的技術よりも大幅に速い。したがって、細胞遺伝学的手法の数日以内に比べて数時間以内に結果を得ることができる。アッセイの大きな欠点は、DNA修復運動に応じて放射線被ばく後数日以内にベースラインレベルに減少するγ-H2AX病巣信号の急速な消失である36.したがって、バイオドシメトリーコンテキストにおけるアッセイの最も適切な適用は、初期トリアージ目的と、特定の犠牲者に対してより時間のかかる細胞遺伝学的生物学的系統的フォローアップを優先することです。しかし、正確な遡及的バイオドシメトリーと長期的な効果のためには、数年前に暴露が起こった場合に備えて、安定した染色体収差の検出のために3色のFISH分析などの細胞遺伝学的技術に頼る必要があります。10.

いくつかのバイオドシメトリーの取り組みの一環として、大規模な放射線緊急事態の人々をトリアージするために、γ-H2AX病巣アッセイの隣にトリアージ目的で複数のアッセイが評価されています。二心基アッセイなどの二心性アッセイは、サイトカネシスブロックマイクロ核アッセイ、電子常磁性共鳴(EPR)、血清タンパク質アッセイ(SPA)、皮膚斑点アッセイ(SSA)、光学刺激型発光(OSL)、ならびに遺伝子発現解析37、38である。γ-H2AX病巣アッセイは、DNADSB形成および修復39の評価のために定量的に使用することができる。しかしながら、DNADSB修復動態40による照射後の時間によってγ-H2AX病巣のレベルが変化するので、アッセイは時間依存性である。比較研究は、z段階容量を有する顕微鏡スコアリングが照射の1 Gy後に最も正確な結果を提供し、フローサイトメトリーはIR41のより高用量で信頼できる結果しか与え出すことを示した。自動採点42, 43,44,45,46で使用する画像解析ソリューションの開発の多くの報告があります。このプロトコルでは、末梢血リンパ球におけるγ-H2AX病巣の解析に、自動化されたハイスループット蛍光顕微鏡プラットフォームが使用されます。自動スコアリングシステムの使用は、実験室間および観測者間のスコアリングバイアスの両方を回避しますが、それでも1 Gy47未満の用量を検出するのに十分な感度を可能にします。このシステムの主な利点は、fociスコアリングのための無料のオープンソースソフトウェアと比較して、スライドのスキャンからキャプチャとスコアリングまでの完全なプロセスが自動化されているという事実です。ユーザー定義可能で、かつ、ストレート可能な分類器の概念は、結果に公平な程度の品質を追加する再現性を保証します。したがって、この研究は、潜在的に露出し過ぎる個体からの血液サンプルが生物学的線ジメトリー目的で放射線生物学研究所によって受け取られるときに使用できる自動化された顕微鏡スキャンおよびスコアリング方法を使用して、γ H2AX病巣結果を得ることができる方法を示している。

Protocol

この研究は、西ケープ大学倫理委員会の生物医学研究倫理委員会によって承認されました - コードBM18/6/12。

1. ソリューションの準備48

  1. 細胞固定液(PBS中3%PFA)
    1. 適切な個人用保護具(PPE)を着用し、ヒュームフードで作業し、200 mLの蒸留H2Oに20gのパラホルムアルデヒドを加え、混合物を60°Cに加熱して溶解を助けます。
    2. PFAが溶解したら、30分間にわたって慎重に5 N NaOHの40滴を加え、室温まで冷却します。1 M HClを使用してpH 7に調整し、蒸留H2Oで250 mLの最終容積までを作ります(アリコートは-20°Cで1年間保存することができます)。この溶液から25 mLを41.7 mL PBSに加えると、3%のPFA溶液が得られます。
  2. 1%牛血清アルブミン(BSA)溶液:1000 mLのPBSにBSAの10gを加え、溶解するまで混ぜます。使用するまで4°C(最大72時間)で保管してください。
  3. 1:500の濃度でTriton-X溶液:1μLのTriton-XをPBSの500 μLに加え、使用するまで4°Cで保存します(最大24時間)。
  4. 抗体ソリューション
    1. 一次抗体 - 抗γ-H2AX濃度1:500:1%BSA溶液の500 μLに抗γ-H2AXを1μL加え、使用するまで4°Cで保存します(最大24時間)。
    2. 二次抗体 - 1:1000の濃度でDAM-TRITC:1%BSA溶液の1000 μLに1μLのダム-TRITCを加え、使用するまで4°Cで保存します(最大24時間)。
  5. コンプリート・ロズウェル・パーク記念研究所(cRPMI)メディア
    1. 濾過した牛胎児血清(FBS)とペニシリンストレプトマイシンを無菌ボトルのRPMI 1640培地に加え、10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンの最終濃度を与える。

2. サンプルの作成

注:このプロトコルでは、末梢全血サンプルは、健康な成人ボランティアからリチウムヘパリンコレクションチューブの静脈穿刺によって収集されます(インフォームド・コンセント付き - BM18/6/12西ケープ大学倫理委員会生物医学研究倫理委員会)。始める前に、血液および1.077 g/mLの密度媒体が室温に順応していることを確認してください。

  1. 準備されたバイオセーフティキャビネットで、PBSで末梢全血を1:1体積で希釈し、希釈した血液を1.077g/mLの密度で2体積の培地に穏やかに重ねます。45°で傾斜したチューブを保持することで、密度媒体上に血液を徐々に重ね、血液と密度媒体が混ざらないようにすることが重要です。
  2. 慎重に遠心分離機にサスペンションを転送し、20分間900 x gで回転します。その後、新しい滅菌の円錐管にのみ「曇り」層をピペットし、1000 x gで10分間PBSと遠心分離機でチューブを充填する。その後、ピペットで上清を吸引し、ペレットを乱さないよう慎重に、PBMCペレットを1mLPBSで慎重に再懸濁し、PBSでチューブを充填する。
  3. 上記の洗浄工程をさらに2回繰り返して、合計3回の洗浄を行います。
  4. 血球計を使用してPBMCの数を数え、成人ドナーからの末梢血の各mLは1 - 1.5 x 106 PBMCs49の大まかな平均をもたらすことを認識する。カウント後、PBMCペレットを1mLのcRPMI中の8 x 105 リンパ球の濃度に希釈します。次に、分離されたPBMC溶液から約2 x 106 PBMCまたは2.5mLを、照射用の無菌で円錐形のチューブに加えます。

3. サンプル照射

注意:放射線防護ガイドラインに従って放射線単位を取り扱い、常に物理的な線量計を着用してください。使用する照射システムが校正され、正しい期待される線量が達成されるように設定されていることを確認します。

  1. 60Coソースを使用して、室温でPBMCsを照射します。南アフリカ国立計量研究所(NMISA)50から得られたチャンバーキャリブレーション因子を持つファーマー117チャンバーでキャリブレーション(TRS-398プロトコル)
    1. このアッセイでは、5 mm アクリル シート(ビーム入力ビルドに使用)と、現在の 60Co ソース線量率 0.57 Gy/min の 50 mm 背面散乱材料の間に円錐チューブを配置 ×し、300 mm の 300 mm の均質フィールド サイズを 300 mm で 300 mm の距離から表面距離まで置きます。
  2. 0.125、0.500、1.000、1.500および2.000 Gyの等級線でPBMCsを照射し、シャム照射された対照サンプルを維持し、コントロールルームで周囲の放射線被ばくを受け取る。
  3. γ-H2AX病巣の最大数に達するために、加湿した5%CO2 インキュベーターで37°Cで1時間照射したサンプルをインキュベートします。
    メモ:インキュベーション時間は、実験設計に従って変更することができます。

4. スライド準備

注: スライドの設定については 、図 1 を参照してください。

  1. 正に帯電した表面でコーティングされたスライドを使用して3枚のスライド(技術的な繰り返し)を準備し、照射状態(または円錐管あたり)の接着性を向上させます。スライドをクリップホルダに入れ、フィルターカードを上に追加し、最後に漏斗を追加します。スライドクリップを固定し、サイト遠心分離機に配置します。
  2. 細胞懸濁液の250 μLを漏斗(200,000細胞/スライド)に加え、細胞遠心分離機を使用して30 x gで5分間回転します。
  3. 細胞内心分離後、クリップホルダからスライドを取り出し、疎水性ペンを使用して、染色プロセス中に結合細胞上の免疫蛍光染色を保持するために、細胞と一緒にスポットの周りに円を描く。

5. 固定および免疫蛍光γ-H2AX染色

注:すべてのソリューションは、疎水性円によってマークされている細胞領域に慎重に直接追加されます。染色液は、ピペットチップが細胞を破壊することなく、スライドの上にわずかに分配されます。ソリューションはスライド全体に追加されません。

  1. 20分間、準備したばかりの3%PFAでスライドを固定します。
    注:スライドは、免疫染色が行われる前に最大2日間、4°Cで0.5%PFAを含むPBSに保存することができます。その後、PBSでコプリン瓶のスライドを5分間洗浄し、10分間冷たいTriton-X溶液の100 μLで細胞を覆い、透過を可能にします。
  2. トリトン-X溶液をティッシュペーパーで外し、スライドを1%BSA溶液で10分間3回洗います。これは、非特異的抗体結合を遮断することによって不要な背景を防止するために行われる。
  3. 1:500希釈された一次抗γ H2AX抗体の100 μLを加えて室温で、加湿室で1時間、長方形スライド保存ボックスの基部に湿ったティッシュペーパーを加えることで容易に実現します。
    1. 抗体溶液をティッシュペーパーにチップオフし、1%BSA溶液を用いて10分間コプリンジャーで3回のスッシュを行い、非結合一次抗体を除去し、二次抗体の非特異的結合を防止します。
  4. 1:1000希釈二次二次DAM-TRITC抗体溶液の100 μLを加湿室で1時間インキュベートします。組織紙に抗体溶液を傾け、PBSでスライドを3回10分間洗浄します。
  5. 最後に、疎水性円の外に柔らかく、ほこりのないティッシュペーパーでスライドを乾燥させ、水性取り付け媒体で分解されたDAPIの1〜2滴を加え、24 x 50 mmのカバースリップでスライドを静かに覆い、閉じ込められた気泡がなく、一晩で冷蔵庫に置かないようにします。スライドは、スキャン前に最大2週間、4°Cで保存することができます。

6. スライドの自動スキャンとスコアリング

注:スキャンシステムには、蛍光顕微鏡、ビデオ画像のリアルタイムデジタル化のためのフレームグラバに接続された高解像度CCD(荷電結合デバイス)カメラ、スキャンステージ、手動移動用トラックボール、3Dマウス、高速PCとモニタ、アーカイブ用ハードドライブが必要です(図2)。

  1. 分類子の設定
    注: 分類子は、システムがセルを検出する方法を定義するパラメーターのセットです。事前に分類された画像フィールドに基づくトレーニングから得られます。分類器は顕微鏡の拡大、細胞のタイプおよび実験室のために特定である。したがって、分類子は、現在の条件に適合させるために、次のパラメータの変更を必要とします。評価前に、参照スライドで設定をテストすることをお勧めします。
    1. 画像取得: 40倍のドライ目的を使用してイメージングします。すべてのセルで同等の画質を実現するには、カメラ統合時間を自動モードに設定します。両方のカラーチャンネル(カメラゲイン4.0)の最大統合時間を少なくとも1秒に設定します。信号チャネルは、10のフォーカスプレーンと平面間の14/40 μmで獲得されます。
    2. セル選択:20.00 μm2 および76.00 μm2 の範囲内のPBMCが検出されます。最大凹度深度を 0.05 に、最大アスペクト比を 1.4 に設定します。相対グレーレベルのしきい値を 20% に設定します。
    3. セル処理: DAPI カウンターステイン チャネルをヒストグラム最大アルゴリズムで処理し、バックグラウンドを減らします。信号チャネルは、バックグラウンドを低減し、信号を強化するために、TopHatフィルタ(強度7、平滑係数0)で処理されます。
    4. 信号カウント: デバイスのオブジェクトカウント機能を使用して、フォシをカウントします。残りのバックグラウンド信号の誤検出評価を避けるために、セル内で最も明るい物体と比較した場合に、強度の少なくとも30%を示す信号のみがカウントされます。
  2. 70%エタノールで静かに洗浄した後、自動スキャンプラットフォームまたはスライドステージにスライドを挿入/配置して、ほこりを取り除きます。
  3. スライド設定 - スライド設定ダイアログメニューを開く (図 3)
    1. [正しい データ パス] を選択すると、検索結果のスライド ファイルの保存場所を指定します。
    2. スライドに名前を付け、各スライドには一意の名前を付ける必要があります。一連のスライドを列挙リストの形式で入力する場合は、スライド番号のワイルドカードとして '?' を使用できます。
    3. セクション 1.1 - 1.4 (図 4)で説明されているように、適切な分類子を選択します。
    4. [検索ウィンドウ] を選択し、サイト遠心分離セルの円に一致する検索ウィンドウ定義が存在する場合は [事前定義] を選択し、[サイズ] 列で該当する定義を選択するか、定義済みの検索ウィンドウ定義がない場合は [手動] を選択します。この場合、[サイズ] 列を設定する必要はありません。
    5. [ 最大セル数] を 選択し、スキャンに必要なセルの最大数を追加します。選択した検索ウィンドウが最大セル数に達した直後に完全にスキャンされていない場合でも、検索は終了します。バイオドシメトリー用途では、1スライド当たり1000個の細胞の自動採点で十分であり、血液試料当たり3枚のスライドが調製されることを考慮する。 [OK] を クリックして設定を確定します。
  4. スライド スキャンのセットアップ
    1. サイドバーの 検索 ボタンをクリックします。スライド設定で[手動検索ウィンドウ]を選択した場合、スキャン領域を決定するためのダイアログが開きます(図5)。10xの目的を使用して、マウスの左クリックで検索フィールドの2つのコーナーを固定することにより、インタラクティブにスライド上の長方形の検索領域を選択します。 これはOK ボタンで確認できます。検索ウィンドウが定義済みの検索ウィンドウを参照している場合、この手順は省略されます。
    2. フォーカス開始位置を調整するよう求められます。参照オブジェクトが自動的に選択され、ソフトウェアは、各スライドの(40x目標を使用して)参照核をフォーカスし、中央に配置し、OKで設定を確認するようにユーザーに求めます。システムは自動的にすべてのスライドに連続して移動します。必要に応じて、このステップのライブイメージ設定 - 統合時間を調整します(図5)。
    3. すべての顕微鏡の設定を確認し、システムプロンプトを 確認します。自動焦点とスキャン手順が開始されます。スキャンが完了すると、データは分析のためにコンピュータに保存されます。スキャンシステムは、スキャンが完了すると自動的にオフになります。
      メモ:顕微鏡チューブのレバーが、すべての光をカメラに流す位置に置かないようにしてください。
    4. 検索終了は、検索全体がスキャンされた場合、最大セル数に達した場合、または検索がキャンセルされた場合に、検索が終了します。
  5. スライド分析
    注 : 完了したスキャンは 図 6に示されています。
    1. スキャンが完了したら、サイドバーの ギャラリー ボタンをクリックします。検出されたセルの小さな画像で構成されるギャラリーを確認します。このウィンドウ (図 7)では、ドロップダウン メニューから選択する条件によってギャラリーに保存されているセルを指定します。セルは通常、検出された順に表示されます。
    2. 検出されたセルの品質測定の分布と平均値、およびスコア付けされた病巣の標準偏差を指定するには、[ ヒストグラム/特徴値図 ](図8)をクリックします。

Representative Results

このプロトコルでは、ヒト末梢血単核球(PMBC)は、4人の健康な成人ボランティアの全血から隔離され、0.125、0.250、0.500、1.000および2.000 Gyの放射線量にさらされた。その後、サンプルを加湿した5%CO2インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートした。固定および免疫蛍光染色の後、スライドは自動的にスキャンされ、スコア付けされる。図6、7、および 8 は、ソフトウェアがユーザーに何を出力するかの表現を示しています。スキャンが完了すると分析ウィンドウが表示され、スコア付けされた病巣の概要が示されます。ギャラリーは、外れ値を削除することができ、最終的に詳細なデータの概要を持つヒストグラムが与えられるインタラクティブなメニューで採点されたすべてのfociを与えます。

γ線に曝された後のγ-H2AXの病巣収率を 図9に示す。用量の増加に伴ってγ-H2AX病巣の数が徐々に増加しました。このグラフは、アッセイの用量依存性および感受性を示すだけでなく、未知の用量にさらされた個体からサンプルを受け取ったときに、適量の推定を行うためにも使用することができる。この個人に対しては、恥に照射されたコントロールや背景の病巣レベルを持たないことに注意することが重要です。したがって、 図9 は、この研究における4人の成人ドナーに対して0.57±0.23Gyであった、恥照射対照サンプルの0Gy値を含む。

Figure 1
図1:サイト遠心分離用のスライドの調製スライドをクリップホルダに入れ、フィルターカードを上に追加し、最後に漏斗を追加します。スライドクリップを固定し、サイト遠心分離機に配置します。細胞内心分離後、クリップホルダからスライドを取り外し、疎水性ペンを使って細胞を使ってその場の周りに円を描きます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2: このプロトコルで使用されていた自動スキャンプラットフォームで、蛍光顕微鏡に取り付けられた自動スキャナーを含む。

Figure 3
図3: スライド設定用メニュー サイドバーの[SETUP]ボタンをクリックしてダイアログを開きます。結果ファイルのターゲットディレクトリを選択または入力 してください この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4: 分類器設定メニュー 選択した分類子の設定が、サンプルの現在のセルの種類、準備条件、および染色パターンと一致していることを確認します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5: 手動検索ウィンドウのセットアップメニュー スライド設定でウィンドウが選択されました。対話が開き、スキャン領域の決定が可能になります。10xの目的を使用することにより、マウスの左クリックで検索フィールドの2つのコーナーを固定することにより、スライド上の長方形の検索領域がインタラクティブに選択されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6: 分析ウィンドウで、スキャンが完了すると、分析ウィンドウにスキャン結果が表示されます。

Figure 7
図 7: 選択したスライドのギャラリービュー サイドバーにギャラリータブがあります。イメージギャラリーは、検出されたセルの小さな画像で構成され、DAPI-TRITC画像を組み合わせて表示されます。各画像の左下隅と右隅には、直接病巣数と補正された病巣数が表示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8: 選択したスライドのヒストグラム画像 このウィンドウはヒストグラムを右クリックして開きます。ヒストグラムをクリックすると、ヒストグラムタブシートは、分析されたセルの平均値、標準偏差、変動係数、最小値、最大値、中央値をリストしたデータサマリーを提供します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図9:60コγ線に曝露したリンパ球の用量の関数としてのγ-H2AX病巣の数。誤差範囲は、ドナー間の個人間変動を表す標準偏差です。データは、4人の健康なボランティアの標準偏差±γ-H2AX病巣の平均数を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

このプロトコルは、γ-H2AX病巣アッセイの自動蛍光顕微鏡ベースのスコアリングのステップワイズ手順を説明する。これは、末梢血リンパ球における放射線誘発DNADSBの数を分析し、個人が未知のレベルのIRにさらされる可能性のある放射線事故シナリオで生物学的線量評価を行う時間効率の良い方法としての病巣アッセイの有用性を示す。

この特定のプロトコルでは、PBMCsを インビトロに 照射し、 生体内 被ばくを模倣した。照射と1時間のインキュベーション時間が完了すると、スライドは、スライド上の細胞の濃度スポットを作成するために、サイト遠心分離機を使用して作られます。細胞遠心分離機の使用は、自動採点のための標準化された条件を達成するために不可欠です。完成すると、疎水性ペンを使用して細胞の周りに円を作り、染色試薬を局所化させることによって試薬の浪費を減らします。このタイプのペンは、パラフィン切片、凍結切片および細胞診製剤上の様々な免疫染色技術に使用することができる。さらに、酵素や蛍光系の検出システムと互換性のある疎水性ペンを選択することが重要です。スライド調製後、γ−H2AX染色の固定および免疫蛍光が生じた。このプロトコルでは、細胞は20分間PBS溶液中で3%PFAを使用して固定される。免疫染色を成功させるためには、細胞の形態が保持され、抗原部位が使用されている検出試薬にアクセスできることが不可欠です。PFAは、タンパク質構造51を保存しながら、固定化し、細胞を安定化させる比較的穏やかな薬剤である。PFA濃度が高く、固定時間が長い最適化実験は、スライドの品質にマイナスの影響を与えましたが、0.5%PFAで24時間までのさらなる保存(一晩)は良好な結果をもたらしました。

本プロトコルで使用される第一次、2F3モノクローナル抗体は、DNA DSB誘導後にセリン139でリン酸化した場合にヒストン変異体H2AXに反応する。抗体は、他のリン酸化ヒストン52と交差反応性を有しないリン酸化残基に結合することができる。これは一次マウスモノクローナル抗体であるため、代替宿主、すなわちロバ抗マウス(DAM)-TRITCで飼育されている間に、一次抗体の宿主種に対して二次抗体を選択した。免疫蛍光染色は特定の抗体-エピトープ結合に基づいているが、いくつかの分子間力はまた、非特異的なバックグラウンド染色をもたらす可能性がある。非特異的結合を低減するためには、免疫蛍光染色プロトコル53においてブロッキング試薬を用いることが重要である。BSA ソリューションを使用しました。さらに、一次および二次抗体染色の前に少なくとも20分間、溶液中にスライドを残すことによって、このブロッキングステップに十分な時間を割り当てる必要があります。さらに、BSA溶液は、一次および二次抗体の希釈剤としても使用すべきである。染色に使用される抗γ H2AXおよび二次抗体に応じて、最適な濃度を決定するために異なる抗体希釈を試験することを検討する必要があります。より正確なスコアリングのために、DNA DSB修復タンパク質抗体を追加することで、二重染色を行うことができます。

このタイプの分析の大きな欠点は、照射後48時間以内に正常レベルに戻って血流の最大数が知られているように、できるだけ早く血液サンプルを取得する必要性です。したがって、放射線事故とその後の血液サンプリングの時間が知られている場合、インビトロ照射後の異なる時点で確立された異なる較正曲線(例えば、4、8、12および24時間)で作業することが有用である可能性がある。しかし、既に原稿の紹介セクションで述べたように、γ-H2AX病巣アッセイの強さは、初期の高速トリアージ目的にあり、より時間のかかる細胞遺伝学的生物学的線量測定を優先するために使用されるべきである。複数のバイオドシメトリーバイオマーカーを並行して使用し、最も信頼性の高い線量推定を生み出し、世界中の様々なバイオドシメトリー研究所が協力して、異なる専門知識を持つ研究所による複数の並列バイオドシメトリー評価を可能にする全国的なネットワークを設定しました。.また、事故現場56の上または近くにある移動式研究所などの超高速分析の開発が進行中です。新しい有望なバイオドシメトリー法が絶えず開発されており、将来的には、より高速で信頼性の高いスループットが得られることを期待しています。

自動画像解析システムでは、自動スキャンプラットフォームまたはスライドステージにスライドを挿入または配置します。その後、スライドの詳細を名前を付けて、接続されているコンピュータの適切なフォルダに保存します。この実験では、核および病巣検出の自動化は、それぞれの分類器設定に基づいています。分類器を作成する際には、選択した分類器の設定が、サンプルの現在の細胞タイプ、調製条件、および免疫蛍光染色と一致していることを確認します。一次抗体および二次抗体の励起スペクトルに一致する適切な蛍光チャネルは、分類器に設定される。分類器は、必要に応じて追加のスコアリングパラメータを設定することができます(例えば、核サイズ、蛍光強度、セクション6.1で説明されているように)。2つ以上のDNA修復タンパク質(例えば、γ-H2AXおよび53BP1)を実験に組み合わせれば、このシステムはシグナルの共局在化を検出することもできる。まず、DAPI画像を取得し、画像処理を適用し、分類器に設定された形態学的基準を使用して核を識別します。TRITC信号は、焦点面47の間のステップサイズ0.35 mmの10 zスタックを使用して取得される。分類器は、核内の異なるTRITC信号の数がスコア付けされるダイレクトフォチカウントを使用しました。ここでは、放射線量が増加すると、病巣信号はより大きな物体に結合する傾向があり、オブジェクトが直接カウントされる場合、実際の病巣数の過小評価が生じることを考慮することが重要です。ここで説明した分析には必要ありませんが、この問題を解決するために、修正された Foci Count を使用した追加の手順を実装できます。後者は、検出された信号のサイズを取得し、それに応じてそれらを計量することができます。両方のカウント方法を使用すると、より高用量での病巣の実際の数のより現実的な推定を提供することができます。

スキャン領域の自動スキャンを開始するには、顕微鏡の10倍の目的を使用して、マウスの左クリックで検索フィールドの2つのコーナーを固定して矩形検索領域を作成します(図 5)、続いて開始位置に焦点を合わせます。参照オブジェクトが自動的に選択され、ソフトウェアは、各スライドの参照核(40x目標を使用)に焦点を合わせ、中央に配置するようユーザーに求めます。検索が開始されると、最初に選択したスライドの検索ウィンドウの中央に移動し、参照オブジェクトの中央にフォーカスを移動するように要求します。このオブジェクトは、後でセルの位置のシフトを修正する位置参照として使用されます。基準分野の第2の目的は自動光調整であり、透過光モードでは、光が最適な光レベルに達するまで調整される。蛍光モードでは光レベルは固定されていますが、必要な信号が測定されるまでCCDカメラの集積時間を長くすることができます。正しい光調整を有効にするには、参照に一般的な染色を含むオブジェクトを含める必要があります。染色強度が非常に高いアーティファクトを持つフィールドを使用しないことが重要です。ライト調整の後、グリッドの自動焦点は参照フィールドに最も近いグリッド位置で開始されます。通常のグリッドにフィールドをフォーカスし続け、検索ウィンドウの前面と背面に向かって蛇行します。スキャンは、グリッドの自動焦点が完了すると開始されます。ステージは、データをキャプチャするためにフィールドの後に蛇行パターンフィールド内で移動されます。セルが検出されると、その位置とギャラリーの画像が保存され、画面に表示され、セル数が更新されます。顕微鏡、ステージ、フィーダーのエラーが発生した場合、検索は自動的にキャンセルされます。オペレータからの手動操作がある唯一のステップは、スライドスキャンのセットアップ中です。これはまた、迅速な品質管理チェック(気泡、低細胞数、蛍光シグナル染色物の退色)が行われ、劣った品質のスライドの走査を中止することが決定できるポイントです。スライド全体がスキャンされた場合、セルの最大数に達した場合、または検索がキャンセルされた場合、検索は終了します。スキャンが完了すると、データは 図 6.スキャンしたセルを表示するには、[ギャラリー] ウィンドウが開き、各セルを表示できます (図 7).これは、ギャラリー画像のフォーカスとスコア付けされたセルの総数をチェックすることで、オペレータが品質管理を行うことができるもう一つのポイントです。あまりにも多くの細胞が焦点を合っていないか、または現実的な用量推定を行うためにシステムによって検出された細胞が少なすぎる場合(例えば、意図した1000細胞の代わりに100個の細胞)、最終的な評価からスライドと自動スコアを除外することを決定する必要があります。すべてのデータはヒストグラムで要約されます (図 8)、分布、平均、および各細胞に対してスコア付けされた病巣の標準偏差に関する情報を含む。ヒストグラムは、レビューのための自動化された所見に基づいて、核のサブ集団を選択して表示するためにも使用できます。結果に関する統計分析は、分布、平均、および細胞あたりの数の病巣の標準偏差が手動で記録された後に実行されます。このグラフは、バイオドシメトリーサンプルの線量推定を行う検量線として使用できます。これは、受け取った線量の概算を行うために傾向線の式を使用して行うことができます.さらに 図 9 自動化されたスキャンは、低用量で誘導された病巣を検出するのに十分に敏感であることを示しています。さらに、結果は、用量を有する細胞当たりの病巣数の明確な線形増加を示す。なお、結果は使用される分類子の代表のみであり、結果は異なる分類子パラメータで異なることを示す。したがって、バイオドシメトリー解析の場合、線量推定を行うために使用される検量線の確立に使用されたものと同じ分類器およびスライド調製物をバイオドシメトリーサンプルに使用することが重要である。この研究の範囲外であったが、γ-H2AX病巣アッセイは部分的な身体照射を決定するためにも使用できることに注意することが重要である。ほとんどの偶発的な放射線被ばくは、身体の局所領域だけが高線量暴露を受けた不均一または部分的な身体被ばくである。いくつかの研究は、照射された体の割合と照射された画分への用量を推定するためにγ-H2AX病巣アッセイを使用することができることを示した42.全身照射が行われると、すべての細胞にDNA DSBがランダムに誘導され、ポアソン分布が見つかることが期待できます。染色体収差の誘導が、複数の収差を有する細胞および正常なメタ相を有する細胞が多い末梢血リンパ球に過剰に分散する傾向がある細胞原性法と同様に、汚染されたポアソン法を用いたγ-H2AX病巣の分散分析は、分散した病巣分布に対して示唆された58.後者も確認された in vivo ミニピッグとアカゲザルの実験59.

Disclosures

C. Schunck は、ドイツのアルトラスハイムのメタシステムハード &ソフトウェア GmbH の従業員です。

Acknowledgments

著者らは、研究参加者の献血に感謝し、血液サンプル採取のためのナースV.プリンスに感謝したいと考えています。この研究に対する南アフリカ国立研究財団(NRF)の資金援助はここに認められている。表明された意見と結論は著者のものであり、必ずしもNRFに起因するとは限らない。この研究は、W.マルティネス・ロペスを支援する技術協力プロジェクト(番号:ウルル6042)と協調研究プロジェクトE35010(契約番号:22248)を通じて、国際原子力機関(IAEA)によって財政的に支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin - BSA Merck A3059
Coplin Jar Sigma S6016
Cover Slips (Size 24 x 50 mm) Lasec Glass2C29M2450Rec
Cryogenic Vials (1.2 mL) WhiteSci 607101
Cytospin Healthcare Technologies JC370-12-L
Cytospin Clips Healthcare Technologies JC302
Cytospin filter cards Healthcare Technologies JC307
Cytospin Funnels Healthcare Technologies JC372
DAM-TRITC Invitrogen A16022
DAPI-Fluroshield Sigma/Merck F6057
Ethanol Kimix ETD901
Filter tips WhiteSci  200ul (312012) and 1000ul (313012)
Hydrochloric acid- HCl Merck
Histopaque Sigma/Merck 10771
lithium–heparin collection tubes The Scientific Group 367526
MetaSystems - Metafer Metasystems Azio Imager Z2: 195-041848
NaOH Merck 221465
NovoPen Leica Biosystems NCL-PEN
Paraformaldehyde Sigma/Merck 158127
Phosphate-buffered saline Tablets Separations SH30028,02
Pipettes WhiteSci P11037 and P1033 X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage.
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody Biolegend 613402 / 100 μg
RPMI medium WhiteSci BE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9) Sigma/Merck T-9284
Tubes (15ml) WhiteSci 601002
X-Tra adhesive slides – corner clipped SMM Technologies 3800200E

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がん研究、178号、
ヒト末梢血リンパ球におけるγ-H2AX Fociアッセイの自動微視的スコアリング法
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Nair, S., Cairncross, S., Miles, X., … More

Nair, S., Cairncross, S., Miles, X., Engelbrecht, M., du Plessis, P., Bolcaen, J., Fisher, R., Ndimba, R., Cunningham, C., Martínez-López, W., Schunck, C., Vandevoorde, C. An Automated Microscopic Scoring Method for the γ-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes. J. Vis. Exp. (178), e62623, doi:10.3791/62623 (2021).

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