Summary
이 프로토콜은 말초 혈액 림프구에 대한 γ-H2AX 포시 분석의 슬라이드 준비 및 자동 채점을 제공합니다. 분석의 방법 및 민감도를 설명하기 위해, 격리된 림프구는 시험관내에서조사되었다. DNA DSB 검출의 이 자동화된 방법은 빠르고 높은 처리량 생물학 도시법 응용에 유용합니다.
Abstract
이온화 방사선은 DNA 손상과 잘 문서화된 발암물질의 강력한 유도제입니다. 생물학적 도시미트리는 개별 투여량 평가를 위해 이온화 방사선에 노출되어 유도된 생물학적 효과의 검출을 포함한다. 이것은 노출된 피해자를 위한 임상 처리의 건강 평가 그리고 계획이 중요한 방사선 비상 사태의 틀에 관련있습니다. DNA 이중 가닥 휴식(DSB)은 방사선 유도 DNA 손상의 가장 치명적인 형태로 간주되기 때문에, 이 프로토콜은 혈액 샘플에서 DNA DSB를 검출하는 방법을 제시한다. 방법론은 형광 표시 인지질 DNA 수리 단백질, 즉 γ-H2AX의 검출에 기초한다. 자동 현미경 플랫폼을 사용하여 셀당 γ-H2AX foci 수를 득점하면 턴어라운드 시간이 현저히 감소하여 표준화된 분석을 할 수 있습니다. 따라서, γ-H2AX 분석은 생물학적 도시에 대한 가장 빠르고 민감한 분석의 하나가 될 가능성이 있다. 이 프로토콜에서, 건강한 성인 자원봉사자에게서 전혈 견본은 생체도시모법 응용을 위한 자동화되고 민감한 γ-H2AX foci 분석의 사용을 설명하기 위하여 시험관에서 처리되고 조사될 것입니다. 통합형 형광 현미경을 갖춘 자동화된 슬라이드 스캐닝 시스템 및 분석 플랫폼이 사용되어 DNA DSB의 빠른 자동 점수를 통해 편향도 가정도가 줄어듭니다.
Introduction
발견 이후, 이온화 방사선 (IR)은 현재의 의료 및 산업 관행뿐만 아니라 농업 및 군사 응용 분야에서 필수 불가결한 도구가되었습니다. 그러나, IR의 넓은 사용은 또한 전문 방사선 노동자 뿐만 아니라 대중의 구성원둘 다에 대한 방사선 과다 노출의 위험을 증가시킨다. IR은 직접 또는 간접적으로 DNA 손상을 유도할 수 있는 잘 알려진 물리적 발암물질로, 1,2. 따라서, 노출 정도가 방사선 사고 의 관리에 중요한 초기 단계를 형성하기 때문에, 용량 평가를 수행하는 것이 중요하다 1.
대규모 핵 또는 방사선 적 비상 사태의 경우, 수행해야 할 투여량 평가의 수는 사고 의 크기에 따라 몇 명에서 수천 명에 이르기까지 다양할 수 있습니다3. 이러한 시나리오에서 물리적 도시계는 일반인이 관여하는 경우(예: 도지계가 제대로 마모되지 않은 경우) 모호하거나 사용할 수 없을 수도 있습니다. 임상 증상은 심사를 위해 사용될 수 있는 동안, 그(것)들은 반드시 방사선 특정하지 않으며 거짓 진단귀착될 수 있습니다. 따라서 물리적 인 dosimetry 및 임상 평가와 함께 생물학적 dosimetry를 사용하는 것이 좋습니다. 이 방법은 세포 수준에서 방사선 유발 변화를 분석할 수 있게 하고 치료가 필요한 노출된 개인의 명백한 식별을 가능하게한다 4. 의사는 적절한 의료 를 처방하기 위해, 물리 용량 재건 및 기타 임상 진단을 보완하기 위해이 생물학적 투여 량 평가를 사용할 수있습니다 5. 생물학적 도시에 대한 필요성은 노출 시나리오가 잘 알려지지 않은 경우와 피해자가 대중의 구성원일 때 사상자의 심사 및 의료 관리에 특히 높을 것입니다. 심사의 주요 목적은 "걱정스러운 우물"을 효과적으로 구별하는 것입니다, 누가 prodromal 현상이 있을 수 있었습니다 그러나 고용량을 수신하지 않은 사람, 즉각적인 의료 도움 및 특화된 배려를 필요로 하는 노출된 사람에서. 방사선 질병을 일으키는 원인이 될 수 있는 방사선 량의 임계값 수준은 대략 0.75 - 1.00 Gy입니다. 그런 다음, > 2 Gy 노출을 받는 사람들은 급성 방사선 증후군에 대한 고위험에 있으며 신속한 치료를 받아야한다6,7. 이러한 재해의 크로스 파이어에 잡힌 피해자에 대한 시기 적이고 정확한 생물학적 복용량 추정은 매우 중요합니다. 또한, 최소한의 노출 피해자8을편안하고 안심시킬 수도 있습니다.
방사선 보호 당국은 주로 배양 된 인간림프구9에서심혈성 염색체 또는 미세 핵과 같은 세포 유전학 적 손상의 검출에 기초한 다양한 생체 도시계 마커를 사용합니다. 세포유전학적 손상의 검출은 또한 시상 혼성화(FISH) 전좌분석서(10)에서형광에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 종래의 세포유전학적 방법의 주요 단점은 비상상황에서 결과를 얻기 위한 긴소요시간(8)이다.
DNA DSB 인식 프로세스의 초기 단계 중 하나는 히스톤 변종 H2AX의 인산화이며, 이는 γ-H2AX의 형성으로 이어지고, 후속 수리 요인 모집이다. 지난 10년 동안 면역형광 현미경을 이용한 말초 혈액 림프구에서 방사선 유발 γ-H2AX 포시의 검출은 신뢰할 수 있는 생물학적 실시법도구(11,12,13,14,15)로서주목받고 있다. 방사선 품질 및 세포 유형에 따라 γ-H2AX 포시의 최대 수율은 조사 후 0.5 - 1시간 이내에 검출된다16,17. DNA DSB와 γ-H2AX 초점의 수와 foci 및 DSB 수리가 사라지는 사이에는 밀접한 상관 관계가 있을 것으로 예상됩니다. 펄스 레이저 마이크로빔을 이용한 레이저 가위 실험은 γ-H2AX 포시가 DNA DSB18의부위로 국소화되는 것을 입증하였다. 그것은 활성 논쟁의 주제로 남아 있는 동안, 125와초기 연구 중 하나 나는 세포 당 붕괴의 계산 된 수 (방사선 유도 된 DNA DSB의 수에 대 한 표현) 및19,20득점 된 γ-H2AX foci의 수 사이의 일대일 상관 관계를 제안 했다.
지난 10년 동안 유럽 연합은 다단계 방사선 사고(고규모 방사선 사고를 관리하기 위한 다분야 생체도인식 도구)와 RENEB(유럽 생물도시메트리 네트워크 실현) 프로젝트에 자금을 지원하여 생물학적 및 회고적 도시성 분야에서 지속 가능한 네트워크를 조성하는 프로젝트에 자금을 지원했습니다.21,22. 이 프로젝트에는 방사선 비상 사태 발생 시 비상 대응 능력을 평가하기 위해 유럽 전역의 다양한 실험실이 포함되었습니다.14,21,22. γ-H2AX 포시 분석은 빠른 처리 시간, 높은 처리량을 허용하는 배치 처리 가능성, 노출 후 몇 시간 이내에 사용되는 경우 높은 감도 등 상당한 이점을 가지고 있습니다.13,23,24. 저용량 범위에서 분석의 고감도는 γ-H2AX foci 분석이 방사선 요법뿐만 아니라 진단 이미징 응용 분야에서 의료 방사선 노출의 효과의 지표로 사용된 다수의 연구를 초래했습니다.25,26,27,28,29,30. 이러한 특성으로 인해 γ-H2AX 포시 분석은 저위험 개인으로부터 비판적으로 노출되는 대규모 원자력 사고의 조기 심사를 위한 다른 방법에 대한 경쟁이 매우 경쟁력 있는 대안입니다. 몇몇 최적화 실험은 혈액의 한 방울만으로 γ-H2AX 포시 분석(손가락 찌르기)을 수행하는 것이 가능하다고 보고한 Moquet et al.의 연구와 같은 소량의 혈액을 가진 γ-H2AX foci 분석체를 수행하는 것이 가능하다는 것을 보여주었습니다.31. 손가락에서 파생된 혈액 샘플에서 γ-H2AX 수율을 측정하도록 최적화된 완전 자동화된 고처리량 RABIT(신속한 자동 생체도시메트리 도구) 시스템의 개발에도 이와 유사한 접근법이 사용되었습니다.32,33. 전반적으로, MULTIBIODOSE 및 RENEB 상호 비교 연구의 결과는 γ-H2AX foci 분석이 최근 (최대 24 시간) 급성 방사선 노출 에 이어 매우 유용한 심사 도구가 될 수 있음을 시사합니다.12,13,14. 저용량 범위 간 비교 연구에서, 낮은 복용량 10 mGy 는 낮은 용량은 낮은 용량 범위에서 분석의 감도를 강조, sham 조사 제어 샘플에서 구별 될 수있다34. 분석의 고감도는 림프구에 특히 사실이며, 이는 저용량 노출의 평가를 위해 가장 적합한 세포 유형 중 하나입니다. 림프구는 주로 비 사이클링 세포이며 동기 집단을 나타냅니다. 후자는 dna 복제와 γ-H2AX의 발현을 방지하여 세포 주기의 G2 및 S-phase 동안 방사선 유발 DSB를 검출하는 분석의 감도를 현저히 감소시킵니다.35. 림프구에 대한 저용량에 대한 민감성 외에도 γ-H2AX 포시 분석의 처리 시간은 림프구의 자극을 필요로하지 않기 때문에 심노심 및 미세 핵 분석과 같은 세포 유전학 기술보다 훨씬 빠릅니다. 따라서, 결과는 세포 유전학 기술에 대한 며칠에 비해 몇 시간 이내에 얻을 수있다. 분석의 주요 단점은 일반적으로 DNA 복구 운동학에 따라 방사선 노출 후 며칠 이내에 기준 수준으로 감소 될 γ-H2AX 포시 신호의 빠른 실종이다36. 따라서, 생체도시메트리 문맥에서 분석법의 가장 적합한 적용은 초기 심사 목적을 위한 것이며 특정 피해자를 위해 더 많은 시간이 소요되는 세포유전학 생물학적 dosimetry 후속의 우선 순위를 정하는 것이다. 그러나, 정확한 회고적 생체도시메트리 및 장기 효과에 대해서는 몇 년 전에 노출이 일어났을 경우에 안정된 염색체 수차의 검출을 위한 3색 FISH 분석과 같은 세포유전학 기술에 의존해야 합니다.10.
여러 생물도시메트리 이니셔티브의 일환으로, 대규모 방사선 비상 사태에서 사람들을 선별하기 위해 γ-H2AX 초점 분석 옆에 있는 심사 목적으로 다중 분석이 평가되었습니다. 이러한 다심심분석, 사이토카네시스-블록 미세핵 분석, 전자 파라마그네틱 공명(EPR), 혈청 단백질 분석(SPA), 피부 반점 분석(SSA), 광학 자극발광(OSL), 유전자 발현 분석 37,38등. γ-H2AX 포시 분석은 DNA DSB 형성 및수리(39)의평가를 위해 정량적으로 사용될 수 있다. 그러나, 분석은 dna DSB 수리운동학(40)으로인해 조사 후 시간에 따라 γ-H2AX 포시의 수준이 다르기 때문에 시간에 따라 달라진다. 비교 연구는 z 단계 용량과 현미경 점수가 조사 의 1 Gy 후 가장 정확한 결과를 제공하는 것을 보여 주었다, 흐름 세포 측정은 IR41의높은 용량에서 신뢰할 수있는 결과를 제공하는 동안. 자동 점수42,43,44,45,45, 46에사용하기 위한 이미지 분석 솔루션의 개발에 대한 많은 보고가 있습니다. 이 프로토콜에서 자동화된 고처리량 형광 현미경 플랫폼은 말초 혈액 림프구에서 γ-H2AX 포시를 분석하는 데 사용됩니다. 자동 채점 시스템의 사용은 실험실 간 및 관찰자 간 득점 편향을 모두 방지하지만 여전히 1 Gy47미만의 용량을 감지하기에 충분한 감도를 허용합니다. foci 채점을 위한 무료 오픈 소스 소프트웨어와 비교하여 이 시스템의 주요 장점은 슬라이드 스캔에서 캡처 및 채점에 이르는 전체 프로세스가 자동화되었다는 사실입니다. 사용자 정의 및 보관 가능한 분류기의 개념은 결과에 편견없는 수준의 품질을 추가하는 재현성을 보장합니다. 따라서, 본 연구는 생물학적 실시법을 위해 방사선생물학 실험실에서 혈액 샘플을 수신할 때 사용할 수 있는 자동화된 현미경 스캐닝 및 채점 방법을 사용하여 γ-H2AX 포시 결과를 얻을 수 있는 방법을 보여 준다.
Protocol
이 연구는 웨스턴 케이프 윤리위원회의 생물 의학 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다 - 코드 BM18/6/12.
1. 솔루션 준비48
- 셀 고정 솔루션(PBS의 PFA 3%
- 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 연기 후드에서 작업하고, 200mL의 증류된 H2O. 혼합물을 60°C로 가열하여 용해를 돕습니다.
- PFA가 용해되면 30분 동안 N NaOH 50 방울40방울을 조심스럽게 넣고 실온으로 식힙니다. 1M HCl을 사용하여 pH 7에 적응하고 증류된 H2O로250mL의 최종 부피를 구성합니다(알리쿼트는 1년 동안 -20°C로 저장할 수 있음). 이 솔루션에서 25mL를 41.7 mL PBS에 추가하여 3% PFA 솔루션을 제공합니다.
- 1% 소세럼 알부민(BSA) 용액: PBS 1000mL에 BSA 10g을 넣고 용해될 때까지 섞는다. 사용(최대 72시간)까지 4°C에 보관하십시오.
- Triton-X 용액은 1:500의 농도로: TRIton-X의 1 μL ~ PBS 500 μL을 추가하고, 사용(최대 24시간)까지 4°C에 저장합니다.
- 항체 솔루션
- 1차 항체 - 1:500의 농도에서 γ-H2AX 방지: 1%BSA 용액의 500 μL에 안티-γ-H2AX1 μL을 추가하고, 사용(최대 24시간)까지 4°C에 저장합니다.
- 이차 항체 - 1:1000의 농도의 DAM-TRITC: 1% BSA 용액의 1000 μL에 DAM-TRITC의 1 μL을 추가하고, 사용(최대 24시간)까지 4°C에 저장합니다.
- 완전한 로스웰 공원 기념 연구소 (cRPMI) 미디어
- 여과된 태아 보빈 혈청(FBS)과 페니실린-스트렙토마이신을 멸균 병에 RPMI 1640 미디어에 추가하여 최종 농도를 10% FBS와 1% 페니실린-연쇄 절제술을 제공합니다.
2. 샘플 준비
참고: 이 프로토콜의 경우, 말초 전혈 샘플은 건강한 성인 자원봉사자로부터 리튬 헤파린 수집 튜브의 venipuncture에 의해 수집됩니다 (통보 된 동의 - BM18/6/12 웨스턴 케이프 윤리위원회의 생물 의학 연구 윤리위원회). 시작하기 전에 혈액과 1.077 g/mL의 밀도 배지가 실온에 적응되는지 확인하십시오.
- 준비된 생물안전 캐비닛에서, PBS로 1:1 부피로 말초 전혈을 희석하고 1.077 g/mL의 밀도로 2부분량의 매질로 희석된 혈액을 부드럽게 겹쳐냅니다. 45°에서 기울어진 튜브를 잡고 혈액과 밀도 가혼합되지 않도록 하여 밀도 배지에 혈액을 점차적으로 층으로 쌓는 것이 중요합니다.
- 서스펜션을 원심분리기로 조심스럽게 옮기고 900 x g에서 20분간 회전합니다. 그 후, '흐린' 층은 새로운 멸균 원문 튜브에만 피펫을 하고 1000 x g에서 10분 동안 PBS와 원심분리기로 튜브를 채웁니다. 그 후, 피펫으로 상류체를 흡인시키고, 펠릿을 방해하지 않도록 주의하고, PBMC 펠릿을 1mL PBS에서 조심스럽게 재중단하고, PBS로 튜브를 채웁니다.
- 위의 세탁 단계를 두 번 더 반복하여 총 3 개의 세척을 얻습니다.
- 혈류계를 사용하여 PBMC의 수를 계산, 성인 기증자에서 말초 혈액의 각 mL의 거친 평균귀착될 것을 알고 1 - 1.5 x 106 PBMC49. 계산 후, PBMC 펠릿을 cRPMI 의 1 mL에서 8 x 105 림프구의 농도로 희석하십시오. 그런 다음 격리된 PBMC 용액에서 약 2 x 106 PBMC 또는 2.5mL를 멸균, 원상 튜브에 추가하여 조사를 한다.
3. 샘플 조사
주의: 방사선 보호 지침에 따라 방사선 장치를 처리하고 항상 물리적 측정기를 착용하십시오. 사용되는 조사 시스템이 보정되고 설정되어 올바른 예상 용량이 달성되도록 하십시오.
- 60°C의공동 소스를 사용하여 실온에서 PBMC를 조사합니다. 남아프리카 국립 계측 연구소 (NMISA)에서 얻은 챔버 교정 인자가 있는 농부 117 챔버 (TRS-398 프로토콜)와 캘리브 레이트 (TRS-398 프로토콜)50.
- 이 분석의 경우, 원추형 튜브(빔 엔트리 빌드업에 사용) 및 50mm 백스캐터 소재와 현재 60m의 원/소감 량0.57 Gy/min300mm × 의 300mm 동질필드 크기 750mm 소스에서 표면 거리까지 의 정색 튜브를 배치한다.
- 0.125, 0.500, 1.000, 1.500 및 2.000 Gy의 등급 투여량으로 PBMC를 조사하고, 대조군실에서 샴조사 제어 샘플을 유지하여 주변 방사선 노출만 수신한다.
- 조사된 샘플을 가습 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 배양하여 최대 γ-H2AX 포시 수에 도달한다.
참고: 인큐베이션 시간은 실험 설계에 따라 수정할 수 있습니다.
4. 슬라이드 준비
참고: 슬라이드 설정의 그림 1을 참조하십시오.
- 조사 조건(또는 원문 튜브당)에 대한 접착력을 개선하기 위해 양전하 표면으로 코팅된 슬라이드를 사용하여 3개의 슬라이드(기술적 반복)를 준비합니다. 슬라이드를 클립 홀더에 넣고 필터 카드를 위에 추가하고 마지막으로 깔때기를 넣습니다. 슬라이드 클립을 고정하고 사이토센심분리기에 넣습니다.
- 셀 서스펜션의 250 μL을 깔때기(200,000셀/슬라이드)에 넣고 사이토센심분리기를 사용하여 5분간 30xg로 회전합니다.
- 세포원심분리 후, 클립 홀더로부터 슬라이드를 제거하고 소수성 펜을 사용하여 염색 과정에서 결합된 세포상에 면역형광 얼룩을 유지하기 위해 세포와 함께 그 자리에서 원을 그립니다.
5. 고정 및 면역 불면 γ-H2AX 염색
참고: 모든 솔루션은 소수성 원으로 표시된 셀 영역에 직접 직접 추가됩니다. 염색 솔루션은 파이펫 팁이 세포를 방해할 수 있도록 하지 않고 슬라이드 위에 약간 분배됩니다. 솔루션은 전체 슬라이드에 추가되지 않습니다.
- 20 분 동안 갓 준비 된 3 % PFA에서 슬라이드를 수정합니다.
참고: 슬라이드는 면역스테인링이 수행되기 전에 최대 2일 동안 4°C에서 0.5% PFA를 함유한 PBS에 저장할 수 있다. 그 후 PBS가 있는 코플린 항아리에서 슬라이드를 5분 간 세척한 다음, 차가운 트리톤-X 용액의 100 μL로 세포를 10분 동안 덮어 투과화를 허용합니다. - Triton-X 용액을 티슈 페이퍼에 팁으로 넣고 1% BSA 용액으로 슬라이드를 10분 동안 세 번 세척합니다. 이것은 비특이적 항체 결합을 차단하여 원치 않는 배경을 방지하기 위해 수행됩니다.
- 1:500 희석 된 1 차장 γ-H2AX 항체의 100 μL로 실온에서 100 μL로 낙선하는 배양은 가습 챔버에서 1 시간 동안 직사각형 슬라이드 저장 상자의 베이스에 젖은 티슈 페이퍼를 추가하여 쉽게 수행 할 수 있습니다.
- 티슈 페이퍼상에서 항체 용액을 제거하고 코플린 항아리에서 10분 동안 1% BSA 용액으로 3개의 세차스를 수행하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거하고 이차 항체의 비특이적 결합을 방지한다.
- 가습 챔버에서 1시간 동안 1:1000 희석 된 이차 DAM-TRITC 항체 용액의 100 μL을 가진 인큐베이트 슬라이드. 티슈 페이퍼에 항체 용액을 팁과 PBS에서 슬라이드를 3회 10분간 세척합니다.
- 마지막으로 부드럽고 먼지가 없는 티슈 페이퍼로 소수성 원 바깥의 슬라이드를 건조하고 수성 장착 매체에 해결된 1-2방울의 DAPI를 추가하고 24 x 50mm 커버 슬립으로 슬라이드를 부드럽게 덮어 밤새 4°C의 냉장고에 갇힌 기포와 배치가 없도록 합니다. 슬라이드는 스캔하기 전에 최대 2 주 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
6. 슬라이드의 자동 스캔 및 점수 매기기
참고: 스캐닝 시스템은 비디오 이미지의 실시간 디지털화를 위해 프레임 그래버에 연결된 형광 현미경, 고해상도 CCD(충전 된 결합 장치) 카메라가 있어야하며, 스캔 단계, 수동 움직임을위한 트랙볼, 3D 마우스, 빠른 PC 및 모니터 및 보관을위한 하드 드라이브(그림 2).
- 분류자 설정
참고: 분류기는 시스템이 셀을 감지하는 방법을 정의하는 매개 변수 집합입니다. 미리 분류된 이미지 필드를 기반으로 하는 교육에서 발생합니다. 분류기는 현미경 배율, 세포 유형 및 실험실에 대해 특이적입니다. 따라서 분류자는 현재 조건에 맞게 조정하기 위해 다음 매개 변수를 수정해야 할 수 있습니다. 평가하기 전에 참조 슬라이드로 설정을 테스트하는 것이 좋습니다.- 이미지 수집: 이미징에 40배 의 건조 목표를 사용합니다. 모든 셀에서 유사한 이미지 품질을 얻으려면 카메라 통합 시간을 자동 모드로 설정합니다. 두 색상 채널(카메라 게인 4.0)에 대해 최대 통합 시간을 1초 이상 설정합니다. 신호 채널은 10개의 초점 평면과 비행기 사이에 14/40 μm로 획득됩니다.
- 셀 선택: 20.00 μm2 및 76.00 μm2 범위 내의 PBMC가 검출됩니다. 최대 굴착 도도 깊이를 0.05로 설정하고 최대 종횡비를 1.4로 설정합니다. 상대 회색 수준 임계값을 20%로 설정합니다.
- 셀 처리: DAPI 카운터스테인 채널을 히스토그램 최대 알고리즘으로 처리하여 배경을 줄입니다. 신호 채널은 배경을 줄이고 신호를 향상시키기 위해 TopHat 필터(강도 7, 스무딩 팩터 0)로 처리됩니다.
- 신호 계산: 장치의 개체 수 피쳐를 사용하여 foci 수를 계산합니다. 남은 배경 신호에 대한 거짓 긍정 평가를 피하기 위해 셀에서 가장 밝은 물체와 비교할 때 강도의 30% 이상을 표시하는 신호만 계산됩니다.
- 70%에탄올로 부드럽게 청소한 후 자동 스캐닝 플랫폼 또는 슬라이드 스테이지에 슬라이드를 삽입/배치하여 먼지를 제거합니다.
- 슬라이드 설정 - 슬라이드 설정 대화 메뉴 열기(그림 3)
- 올바른 데이터 경로를선택하면 검색에서 생성된 슬라이드 파일이 저장되는 위치를 지정합니다.
- 슬라이드에 이름을 지정하면 각 슬라이드에 고유한 이름이 지정되어야 합니다. 일련의 슬라이드가 열거된 목록의 형태로 입력되면 '?'는 슬라이드 번호의 와일드카드로 사용할 수 있습니다.
- 섹션 1.1 - 1.4(그림 4)에설명된 대로 적절한 분류기를 선택합니다.
- 검색 창을 선택하고 시토센심분리기 셀 서클과 일치하는 검색 창 정의가 존재하거나 크기 열에 각각의 정의를 선택하거나 미리 정의된 검색 창 정의가 없는 경우 수동을 선택합니다. 이 경우 크기 열을 설정할 필요가 없습니다.
- 최대 셀 카운트를 선택하고 스캔하는 데 필요한 최대 셀 수를 추가합니다. 최대 셀 카운트에 도달하는 즉시 선택한 검색 창이 아직 완전히 검색되지 않은 경우에도 검색이 종료됩니다. 생물학적 실증 응용의 경우, 혈액 샘플 당 3 개의 슬라이드가 준비된다는 점을 고려하여 슬라이드 당 1000 세포의 자동 채점만으로도 충분합니다. 확인을 클릭하여 설정을 확인합니다.
- 슬라이드 스캐닝 설정
- 측면 막대의 검색 단추를 클릭합니다. 슬라이드 설정에서 수동 검색 창을 설정하면 대화가 열리므로 스캔영역(그림 5)을결정할 수 있습니다. 10x 목표를 사용하여 마우스왼쪽 클릭으로 검색 필드의 두 모서리를 고정하여 슬라이드의 직사각형 검색 영역을 상호 식으로 선택합니다. 이 확인 버튼으로 확인할 수 있습니다. 검색 창이 미리 정의된 검색 창을 참조하는 경우 이 단계는 생략됩니다.
- 사용자는 포커스 시작 위치를 조정하라는 메시지가 표시됩니다. 그런 다음 참조 개체가 자동으로 선택되고, 소프트웨어는 사용자에게 각 슬라이드에 대한 참조 핵(40배 목표 사용)을 집중하고 중앙에 표시하고 OK로설정을 확인하라는 메시지를 표시합니다. 시스템은 자동으로 모든 슬라이드로 이동합니다. 필요한 경우 라이브 이미지 설정 조정 - 이 단계에 대한 통합 시간(그림5)을조정합니다.
- 모든 현미경 설정을 확인하고 확인으로 시스템 프롬프트를 확인합니다. 시스템은 자동화된 초점 및 스캔 절차를 시작합니다. 스캔이 완료되면 데이터를 컴퓨터에 저장하여 분석을 합니다. 스캔이 완료된 후 스캔 시스템이 자동으로 꺼지게 됩니다.
참고: 현미경 튜브의 레버가 모든 빛을 카메라로 전환하는 위치에 있는지 확인합니다. - 검색 끝, 전체 검색검색이 검색된 경우, 최대 셀 수에 도달한 경우 또는 검색이 취소된 경우 검색이 종료됩니다.
- 슬라이드 분석
참고: 완료된 검사는 그림 6로표시됩니다.- 스캔이 완료되면 측면 막대의 갤러리 버튼을 클릭합니다. 검출된 셀의 작은 이미지로 구성된 갤러리를 검토합니다. 이창(그림 7)에서드롭다운 메뉴에서 선택될 기준에 의해 갤러리에 저장된 셀을 지정합니다. 셀은 일반적으로 검출된 순서대로 표시됩니다.
- 품질 히스토그램/기능 값 다이어그램(그림 8)을클릭하여 검출된 세포에 대한 품질 측정값의 분포와 수단 및 초점 의 표준 편차를 득점하였다.
Representative Results
이 프로토콜을 위해, 인간 말초 혈액 단핵세포(PMBC)는 4명의 건강한 성인 자원봉사자의 전혈에서 격리되고 0.125, 0.250, 0.500, 1.000 및 2.000Gy의 방사선 량에 노출되었다. 그 후, 샘플은 가습 된 5 % CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 1 시간 동안 배양되었다. 고정 및 면역 불면 얼룩에 따라 슬라이드를 자동으로 스캔하고 득점합니다. 그림 6,7 및 8은 소프트웨어가 사용자에게 출력하는 것을 나타냅니다. 스캔이 완료되면 분석 창이 나타나고 foci 점수에 대한 개요를 제공합니다. 갤러리는 이상값을 삭제하고 마지막으로 자세한 데이터 요약이 있는 히스토그램을 삭제할 수 있는 대화형 메뉴로 점수를 매깁니다.
γ 선에 노출된 후 γ-H2AX 포시 수율은 도 9에제시된다. 증가 복용량으로 γ-H2AX foci의 수에 점진적인 증가 했다. 이 그래프는 분석의 용량 의존성 및 감도를 설명할 뿐만 아니라, 알 수 없는 복용량에 노출된 개인으로부터 샘플을 수신할 때 적합성을 사용하여 투여량 추정을 수행하는 데도 사용할 수 있다. 이 개인에 대한 가짜 조사 제어 또는 배경 초점 수준이 없는 것이 중요합니다. 따라서, 도 9는 이 연구에서 4명의 성인 기증자를 위한 0.57 ± 0.23 Gy였던 샴조사 대조료의 0 Gy 값을 포함한다.
그림 1: 사이토원심 분리슬라이드 준비. 슬라이드를 클립 홀더에 넣고 필터 카드를 위에 추가하고 마지막으로 깔때기를 넣습니다. 슬라이드 클립을 고정하고 사이토센심분리기에 넣습니다. 세포원심분리 후 클립 홀더에서 슬라이드를 제거하고 소수성 펜을 사용하여 셀로 그 자리에서 원을 그립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 형광 현미경에 부착 된 자동화 된 스캐너를 포함하는이 프로토콜에 사용 된 자동 스캐닝 플랫폼.
그림 3: 슬라이드 설정 메뉴입니다. 사이드바의 SETUP 버튼을 클릭하여 대화를 엽니다. 결과 파일의 대상 디렉터리를 선택하거나 입력하려면 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 4: 분류자 설정 메뉴. 선택한 분류기 설정이 샘플의 현재 셀 유형, 준비 조건 및 염색 패턴과 일치하는지 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 수동 검색 창용 설정 메뉴입니다. 슬라이드 설정에서 창이 선택되었습니다. 대화가 열리면 스캔 영역의 결단이 허용됩니다. 10x 목표를 사용하여 슬라이드의 직사각형 검색 영역은 마우스왼쪽 클릭으로 검색 필드의 두 모서리를 고정하여 상호 식으로 선택됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 분석 창, 스캔이 완료되면 분석 창은 스캔의 결과를 보여줍니다.
그림 7: 선택한 슬라이드에 대한 갤러리 뷰입니다. 갤러리 탭은 측면 막대에 있습니다. 이미지 갤러리는 검출된 세포의 작은 이미지로 구성되며, 결합된 DAPI-TRITC 이미지로 표시됩니다. 각 이미지의 왼쪽 아래와 오른쪽 모서리에 직접 foci 카운트와 수정된 foci 수가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 선택한 슬라이드에 대한 히스토그램 이미지. 이 창은 히스토그램을 마우스 오른쪽 으로 클릭하여 열립니다. 히스토그램을 클릭하여 히스토그램 탭 시트는 분석된 셀의 평균, 표준 편차, 변형 계수, 최소, 최대 및 중앙값을 나열하는 데이터 요약을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 60Co γ 선에 노출된 림프구에 대한 투여의 함수로서 γ-H2AX 포시의 수. 오류 막대는 기부자 간의 개인 간 변형을 나타내는 표준 편차입니다. 데이터는 4명의 건강한 자원봉사자의 표준 편차에 γ-H2AX foci± 의 평균 수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 γ-H2AX 포시 분석의 자동화된 형광 현미경 검사법 기반 점수에 대한 단계별 절차를 설명합니다. 그것은 개인이 IR의 알 수없는 수준에 노출 될 수있는 방사선 사고 시나리오에서 생물학적 용량 평가를 수행하기 위해 말초 혈액 림프구에서 방사선 유도 DNA DSB의 수를 분석하기위한 시간 효율적인 방법으로 foci 분석의 유용성을 보여줍니다.
이 특정 프로토콜에서, PBMC는 생체 내 방사선 노출을 모방하기 위하여 시험관에서 조사되었습니다. 조사와 1시간의 잠복시간이 완료되면, 슬라이드는 슬라이드에 세포의 농도 지점을 만들기 위해 사이토센트심분리기를 사용하여 만들어집니다. 사이토센심분리기의 사용은 자동화된 채점을 위한 표준화된 조건을 달성하는 데 필수적입니다. 완료되면 소수성 펜을 사용하여 세포 주위의 원을 만들고 사용자가 염색 시약을 국소화할 수 있도록 하여 시약의 낭비를 줄입니다. 펜의이 유형은 파라핀 섹션, 냉동 섹션 및 세포학 제제와 같은 다양한 면역 염색 기술에 사용될 수 있습니다. 또한 효소 및 형광 계 검출 시스템과 호환되는 소수성 펜을 선택하는 것이 중요합니다. 슬라이드 준비 후 고정 및 면역 불발성 γ-H2AX 염색이 발생했습니다. 이 프로토콜에서, 세포는 20 분 동안 PBS 용액에서 3 % PFA를 사용하여 고정된다. 면역 염색이 성공하려면 세포의 형태가 유지되고 항원 부위가 사용되는 검출 시약에 액세스 할 수 있어야합니다. PFA는 단백질 구조를 보존하면서 고정및 세포를 안정화하기 위한 비교적 부드러운제제이다(51). PFA 농도가 높고 고정 시간이 길어지는 최적화 실험으로 슬라이드 품질에 부정적인 영향을 미쳤지만, 0.5% PFA에서 최대 24시간 동안 추가 저장(하룻밤)이 좋은 결과를 낳았습니다.
이 프로토콜에 사용되는 1차, 2F3 단클론 항체는 DNA DSB 유도 후 Serine 139에서 인광될 때 히스톤 변이체 H2AX에 반응한다. 항체는 다른 인성히스톤(52)과교차 반응성 없이 인광재류에 결합할 수 있다. 이는 1차 마우스 단일클론 항체이기 때문에, 이차 항체는 대체 숙주, 즉 당나귀 항마우스(DAM)-TRITC에서 제기하는 동안 1차 항체의 숙주 종에 대하여 선택되었다. 면역형성 염색은 특정 항체-에피토프 결합을 기반으로 하지만, 여러 분자 간 힘은 비특이적 배경 염색을 초래할 수 있다. 비특이적 결합을 줄이기 위해서는 면역형 염색프로토콜(53)에서차단 시약을 사용하는 것이 중요하다. 우리는 BSA 솔루션을 사용했습니다. 더욱이, 1차 및 이차 항체 염색 전에 적어도 20분 동안 용액에 슬라이드를 남겨두면 이 차단 단계에 충분한 시간을 할당해야 한다. 또한, BSA 용액은 또한 1차 및 이차 항체에 대한 희석제로 사용되어야 한다. 염색에 사용되는 항-γ-H2AX 및 이차 항체에 따라 최적의 농도를 결정하기 위해 상이한 항체 희석제 검사를 고려해야 한다. 보다 정확한 점수를 위해 DNA DSB 수리 단백질 항체를 추가하여 이중 염색을 수행할 수 있습니다.
이러한 유형의 분석의 주요 단점은 최대 포시 수가 조사 후 48시간 이내에 정상 수준으로 다시 감소하는 것으로 알려져 있기 때문에 노출 후 가능한 한 빨리 혈액 샘플을 획득할 필요가 있다는 것입니다. 따라서 방사선 사고 및 후속 혈액 샘플링 시체 조사 후 다른 시점에 설정된 상이한 교정 곡선(예: 4, 8, 12 및 24시간)으로 작업하는 것이 유용할 수 있다. 그러나, 원고의 소개 섹션에서 이미 언급 한 바와 같이, γ-H2AX foci 분석의 강도는 초기에 놓여, 빠른 심사 목적과 더 많은 시간이 소요 되는 세포 유전학 생물학적 dosimetry를 우선 순위를 사용하는 데 사용되어야한다. 다중 생체도시메트리 바이오마커가 병렬로 사용되는 결합시나리오는 전 세계적으로 가장 신뢰할 수 있는 용량 추정및 다양한 생체도시메트리 실험실을 생성하여 다양한 전문 지식을 보유한 실험실에 의한 다중 병렬생체도시메트리 평가를 가능하게 하는 전국적인 네트워크를 설치하기 위해 힘을 합쳤습니다. . 또한 사고현장(56)또는 그 근처에서 이동식 실험실과 같은 초고속 분석을 위한 개발이 진행 중이다. 새롭고 유망한 생물도시메트리 방법이 지속적으로 개발되고 있으며, 이는 향후57에서더욱 빠르고 신뢰할 수 있는 처리량을 초래할 수 있기를 바랍니다.
자동화된 이미지 분석 시스템의 경우 슬라이드가 자동화된 스캐닝 플랫폼 또는 슬라이드 스테이지에 삽입되거나 배치됩니다. 그 후, 이름 및 첨부 된 컴퓨터에 적절한 폴더에 슬라이드 세부 정보를 저장합니다. 이 실험의 경우, 자동화된 핵 및 포시 검출은 각각의 분류자 설정을 기반으로 합니다. 분류기 생성시 선택한 분류기 설정이 시료의 현재 셀 유형, 준비 조건 및 면역 형광 얼룩과 일치하는지 확인합니다. 1차 및 이차 항체의 흥분 스펙트럼과 일치하는 적절한 형광 채널은 분류기에서 설정된다. 분류기는 필요한 경우 추가 득점 매개변수를 설정할 수 있습니다 (예를 들어, 핵 크기, 형광 강도, 섹션 6.1에 설명된 바와 같이). 두 개 이상의 DNA 수리 단백질(예: γ-H2AX 및 53BP1)이 실험에서 결합되면, 시스템은 또한 신호의 공동 국소화를 검출할 수 있다. 첫째, 시스템은 DAPI 이미지를 획득하고, 이미지 처리를 적용하며, 분류기에 설정된 형태학적 기준을 사용하여 핵을 식별한다. TRITC 신호는 초점평면(47)사이의0.35mm 의 스텝 크기로 10 z 스택을 사용하여 획득된다. 분류자는 직접 포시 카운트를 사용, 여기서 핵 내에서 고유 한 TRITC 신호의 수가 득점된다. 여기서, 방사선 량이 증가함에 따라, 포시 신호가 더 큰 물체로 병합되는 경향이 있어 물체가 직접 계산되는 경우 실제 포시 수의 과소 평가가 발생한다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 여기에 설명된 분석에는 필요하지 않았지만 이 문제를 해결하기 위해 수정된 Foci Count를 사용하여 추가 단계를 구현할 수 있습니다. 후자는 시스템이 감지 된 신호의 크기를 얻을 수 있으며 그에 따라 무게를 측정할 수 있습니다. 두 계산 방법을 모두 사용하면 더 높은 용량의 실제 초점 수에 대한 보다 현실적인 추정을 제공할 수 있습니다.
자동 스캐닝을 시작하기 위해, 스캔 영역은 현미경의 10배 목표를 사용하여 마우스의 왼쪽 클릭으로 검색 필드의 두 모서리를 고정하여 직사각형 검색 영역을 만들어 결정된다(그림 5) 그 다음에 시작 위치에 초점을 맞추게 됩니다. 참조 개체가 자동으로 선택되고 소프트웨어는 사용자에게 각 슬라이드에 대한 참조 핵(40배 목표 사용)에 초점을 맞추고 중앙집중하도록 요청합니다. 검색이 시작된 후 시스템은 첫 번째 선택한 슬라이드의 검색 창의 중심으로 이동하고 참조 개체의 중심및 포커스를 요청합니다. 이 개체는 나중에 셀 위치의 변화를 수정하기 위해 위치 참조로 사용됩니다. 기준 필드의 두 번째 목적은 자동 광 조정이며, 전송된 조명 모드에서 는 최적의 광 레벨에 도달할 때까지 빛이 조정된다. 형광 모드에서광 레벨은 고정되지만 필요한 신호를 측정할 때까지 CCD 카메라의 통합 시간을 늘릴 수 있습니다. 올바른 라이트 조정을 사용하려면 참조에 일반적인 염색이 있는 개체가 포함되어야 합니다. 염색 강도가 매우 높은 아티팩트가 있는 필드를 사용하지 않는 것이 중요합니다. 라이트 조정 후 시스템은 참조 필드에 가장 가까운 그리드 위치에서 그리드 자동 초점시작됩니다. 그것은 일반 그리드에 필드를 계속 초점을 맞추고, 검색 창의 전면과 뒷면을 향해 구불 구불한이동. 그리드 자동 초점이 완료되면 스캐닝이 시작됩니다. 스테이지는 데이터를 캡처하기 위해 필드 후 구불 구불 한 패턴 필드로 이동됩니다. 셀이 감지되면 위치와 갤러리 이미지가 저장되고 화면에 표시되고 셀 수가 업데이트됩니다. 현미경, 스테이지 또는 피더 오류가 발생하면 검색이 자동으로 취소됩니다. 작업자의 수동 개입이 있는 유일한 단계는 슬라이드 스캐닝 설정 중에 있습니다. 이것은 또한 빠른 품질 관리 검사가 일어나는 지점입니다 (기포, 낮은 세포 번호, 형광 신호 염색 유물의 퇴색) 그리고 열등한 품질의 슬라이드의 스캔을 중단하기로 결정할 수있는 곳. 전체 슬라이드를 검색한 경우, 최대 셀 수에 도달한 경우 또는 검색이 취소된 경우 검색이 종료됩니다. 스캔이 완료되면 데이터는 그림 6. 스캔된 셀을 보려면 갤러리 창이 열리고 각 셀을 볼 수 있습니다.그림 7). 이는 작업자가 갤러리 이미지의 초점과 점수가 매겨진 총 셀 수를 확인하여 품질 관리를 수행할 수 있는 또 다른 지점입니다. 너무 많은 세포가 초점이 없거나 너무 적은 세포가 시스템에 의해 검출되어 현실적인 용량 추정(예를 들어, 의도된 1000세포 대신 100세포)을 하는 경우, 최종 평가에서 슬라이드 및 자동 점수를 배제하기로 결정해야 한다. 모든 데이터는 히스토그램으로 요약되어 있습니다(그림 8) 각 셀에 대해 점수가 매겨지는 포시의 분포, 수단 및 표준 편차에 대한 정보와 함께. 히스토그램은 또한 검토를 위한 자동화된 사실 인정에 근거를 둔 핵의 하위 인구를 선택하고 표시하는 것을 이용할 수 있습니다. 결과에 대한 통계 적 분석은 셀 당 숫자 foci의 표준 편차가 수동으로 기록 된 후 분포, 평균 및 표준 편차가 수행된 후에 수행됩니다. 그래프는 생체도시메트리 샘플의 투여량 추정을 위한 교정 곡선으로 사용될 수 있다. 이것은 수신된 복용량의 대략적인 추정을 만들기 위하여 추세선의 방정식을 사용하여 행해질 수 있습니다. 더욱이 그림 9 자동 스캐닝은 저용량에서 유도된 포시를 감지할 수 있을 만큼 민감하다는 것을 보여줍니다. 더욱이, 결과는 복용량을 가진 세포 당 foci의 수의 명확한 선형 증가를 보여줍니다. 결과는 사용된 분류기의 대표일 뿐이며 결과는 다른 분류기 매개 변수에 대해 다릅니다. 따라서, 생체도시메트리 분석의 경우, 동일한 분류기 및 슬라이드 제제는 용량 추정을 수행하는 데 사용되는 교정 곡선을 확립하는 데 사용된 샘플과 같은 생체도시메트리 샘플에 사용되는 것이 중요하다. 이 연구의 범위를 벗어났지만 γ-H2AX 포시 분석이 부분 신체 조사를 결정하는 데 사용할 수도 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 대부분의 우발적 인 방사선 노출은 신체의 지역화 된 영역만이 고용량 노출을받은 불동성 또는 부분 신체 노출입니다. 여러 연구는 조사 된 신체의 분획과 조사 된 분획에 용량을 추정하기 위해 γ-H2AX foci 분석기를 사용할 수 있음을 보여 주었다42. 전신 조사가 일어날 때, 모든 세포에 있는 DNA DSB의 무작위 유도가 있을 것이고 하나는 푸아송 분포를 찾아기대할 수 있습니다. 염색체 수차의 유도가 말초 혈액 림프구에 분산되는 경향이 있는 세포원암 방법과 유사하게, 정상적인 담수상이 있는 다중 수차 및 세포를 가진 세포의 풍부가 높은 세포가 있는, 오염된 푸아송 방법을 사용하여 γ-H2AX 포시의 분산 분석58. 후자는 또한 확인되었다 in vivo 미니피그와 코초원숭이실험59.
Disclosures
C. Schunck은 독일 알트루스하임 메타시스템하드 & 소프트웨어 GmbH의 직원입니다.
Acknowledgments
저자는 혈액 샘플 수집을 위한 간호원 V. 프린스뿐만 아니라 그들의 혈액 기증을 위한 연구 참가자를 감사하고 싶습니다. 이 연구를 향한 남아프리카 국립 연구 재단 (NRF)의 재정 적 지원은 여기에서 인정됩니다. 표현된 의견과 결론에 도달한 것은 저자들의 의견이며 반드시 NRF에 기인할 필요는 없습니다. 이 작품은 W. 마르티네스-로페즈를 지원하기 위한 기술 협력 프로젝트(번호: URU6042)와 협력 연구 프로젝트 E35010(계약 번호: 22248)을 통해 국제 원자력 기구(IAEA)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin - BSA | Merck | A3059 | |
| Coplin Jar | Sigma | S6016 | |
| Cover Slips (Size 24 x 50 mm) | Lasec | Glass2C29M2450Rec | |
| Cryogenic Vials (1.2 mL) | WhiteSci | 607101 | |
| Cytospin | Healthcare Technologies | JC370-12-L | |
| Cytospin Clips | Healthcare Technologies | JC302 | |
| Cytospin filter cards | Healthcare Technologies | JC307 | |
| Cytospin Funnels | Healthcare Technologies | JC372 | |
| DAM-TRITC | Invitrogen | A16022 | |
| DAPI-Fluroshield | Sigma/Merck | F6057 | |
| Ethanol | Kimix | ETD901 | |
| Filter tips | WhiteSci | 200ul (312012) and 1000ul (313012) | |
| Hydrochloric acid- HCl | Merck | ||
| Histopaque | Sigma/Merck | 10771 | |
| lithium–heparin collection tubes | The Scientific Group | 367526 | |
| MetaSystems - Metafer | Metasystems | Azio Imager Z2: 195-041848 | |
| NaOH | Merck | 221465 | |
| NovoPen | Leica Biosystems | NCL-PEN | |
| Paraformaldehyde | Sigma/Merck | 158127 | |
| Phosphate-buffered saline Tablets | Separations | SH30028,02 | |
| Pipettes | WhiteSci | P11037 and P1033 | X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage. |
| Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613402 / 100 μg | |
| RPMI medium | WhiteSci | BE12-702F | |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Sigma/Merck | T-9284 | |
| Tubes (15ml) | WhiteSci | 601002 | |
| X-Tra adhesive slides – corner clipped | SMM Technologies | 3800200E |
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