Summary
Questo protocollo presenta la preparazione del vetrino e il punteggio automatico del test dei fuochi γ-H2AX sui linfociti del sangue periferico. Per illustrare il metodo e la sensibilità del test, i linfociti isolati sono stati irradiati in vitro. Questo metodo automatizzato di rilevamento del DNA DSB è utile per applicazioni di dosimetria biologica rapida e ad alto rendimento.
Abstract
Le radiazioni ionizzanti sono un potente induttore di danni al DNA e un cancerogeno ben documentato. La dosimetria biologica comprende l'individuazione degli effetti biologici indotti dall'esposizione a radiazioni ionizzanti per effettuare una valutazione individuale della dose. Ciò è pertinente nel quadro delle emergenze radioterapiche, in cui le valutazioni sanitarie e la pianificazione del trattamento clinico per le vittime esposte sono fondamentali. Poiché le rotture a doppio filamento del DNA (DSB) sono considerate la forma più letale di danno al DNA indotto dalle radiazioni, questo protocollo presenta un metodo per rilevare il DNA DSB nei campioni di sangue. La metodologia si basa sulla rilevazione di una proteina di riparazione del DNA fosforilata marcata con fluorescenza, vale a dire γ-H2AX. L'uso di una piattaforma di microscopia automatizzata per segnare il numero di focolai γ-H2AX per cellula consente un'analisi standardizzata con una significativa diminuzione del tempo di turn-around. Pertanto, il test γ-H2AX ha il potenziale per essere uno dei saggi più veloci e sensibili per la dosimetria biologica. In questo protocollo, campioni di sangue intero di volontari adulti sani saranno elaborati e irradiati in vitro al fine di illustrare l'uso del test automatizzato e sensibile dei fuochi γ-H2AX per applicazioni di biodosimetria. Viene utilizzato un sistema automatizzato di scansione dei vetrini e una piattaforma di analisi con un microscopio a fluorescenza integrato, che consente il punteggio rapido e automatico del DNA DSB con un grado ridotto di polarizzazione.
Introduction
Dalla sua scoperta, le radiazioni ionizzanti (IR) sono diventate uno strumento indispensabile nelle attuali pratiche mediche e industriali, nonché nelle applicazioni agricole e militari. Tuttavia, l'ampio uso dell'IR aumenta anche il rischio di sovraesposizione alle radiazioni sia per i lavoratori professionisti delle radiazioni che per i membri del pubblico. L'IR è un noto cancerogeno fisico che può indurre danni al DNA in modo diretto o indiretto, portando a rischi significativi per la salute 1,2. Pertanto, è importante eseguire una valutazione della dose, poiché il grado di esposizione costituisce un importante passo iniziale nella gestione dell'incidente da radiazioni 1.
In caso di emergenze nucleari o radiologiche su larga scala, il numero di valutazioni della dose che devono essere eseguite può variare da poche a migliaia di persone a seconda delle dimensioni dell'incidente3. In questi scenari, la dosimetria fisica può anche essere ambigua (ad esempio, se il dosimetro non è indossato correttamente) o non disponibile, quando sono coinvolti membri del pubblico. Mentre i sintomi clinici potrebbero essere utilizzati per il triage, non sono necessariamente specifici delle radiazioni e possono portare a una falsa diagnosi. Pertanto, è consigliabile utilizzare la dosimetria biologica insieme alla dosimetria fisica e alle valutazioni cliniche. Questo metodo consente l'analisi dei cambiamenti indotti dalle radiazioni a livello cellulare e consente l'identificazione inequivocabile degli individui esposti che richiedono un trattamento medico4. Il medico può quindi utilizzare questa valutazione biologica della dose per integrare le ricostruzioni fisiche della dose e altre diagnosi cliniche, al fine di prescrivere le cure mediche appropriate5. La necessità di dosimetria biologica sarà particolarmente elevata per il triage e la gestione medica delle vittime quando lo scenario di esposizione non è ben noto e quando le vittime sono membri del pubblico. Lo scopo principale del triage è quello di distinguere efficacemente le persone "preoccupate bene", che potrebbero avere sintomi prodromici ma che non hanno ricevuto una dose elevata, dalle persone esposte che necessitano di aiuto medico immediato e cure specializzate. Il livello soglia della dose di radiazioni che può causare malattie da radiazioni è di circa 0,75 - 1,00 Gy. Quindi, quegli individui che ricevono > 2 Gy di esposizione sono a più alto rischio di sindrome da radiazioni acute e dovrebbero ricevere un trattamento medico tempestivo6,7. Stime tempestive e accurate della dose biologica per le vittime catturate nel fuoco incrociato di tali disastri sono fondamentali. Inoltre, può anche confortare e rassicurare le vittime minimamente esposte8.
Le autorità di radioprotezione utilizzano vari marcatori biodosimetrici, che si basano principalmente sulla rilevazione di danni citogenetici, come cromosomi dicentrici o micronuclei, in linfociti umani incoltura 9. La rilevazione del danno citogenetico può essere eseguita anche mediante il saggio di traslocazione dell'ibridazione fluorescente in situ (FISH)10. Tuttavia, il principale svantaggio dei metodi citogenetici convenzionali è il lungo tempo di consegna per ottenere i risultati in una situazione di emergenza8.
Uno dei primi passi nel processo di riconoscimento del DNA DSB è la fosforilazione della variante istone H2AX, che porta alla formazione di γ-H2AX e al successivo reclutamento di fattori di riparazione. Negli ultimi dieci anni, il rilevamento di focolai di γ-H2AX indotti da radiazioni nei linfociti del sangue periferico utilizzando la microscopia a immunofluorescenza ha ricevuto crescente attenzione come strumento di dosimetria biologica affidabile11,12,13,14,15. A seconda della qualità della radiazione e del tipo di cella, la resa massima dei fuochi γ-H2AX viene rilevata entro 0,5 - 1 ora dopo l'irradiazione16,17. Si prevede che esista una stretta correlazione tra il numero di DNA DSB e γ-H2AX, nonché tra la scomparsa dei fuochi e la riparazione del DSB. Esperimenti laser a forbice con un microfascio laser pulsato hanno dimostrato che i fuochi γ-H2AX si localizzano nei siti del DNA DSB18. Mentre rimane un argomento di dibattito attivo, uno dei primi studi con 125ho suggerito una correlazione uno-a-uno tra il numero calcolato di disintegrazioni per cellula (rappresentabile per il numero di DNA DSB indotto da radiazioni) e il numero di focolai di γ-H2AX che è stato valutato19,20.
Negli ultimi dieci anni, l'Unione Europea ha finanziato i progetti MULTIBIODOSE (Multi-disciplinary biodosimetric tools to manage high scale radiological casualties) e RENEB (Realizing the European Network of Biodosimetry) per creare una rete sostenibile nella dosimetria biologica e retrospettiva21,22. Questo progetto ha incluso vari laboratori in tutta Europa per valutare le capacità di risposta alle emergenze in caso di emergenza radiologica14,21,22. Il test dei fuochi γ-H2AX presenta una serie di vantaggi considerevoli, come un tempo di elaborazione rapido, il potenziale per l'elaborazione batch che consente un'elevata produttività, nonché la sua elevata sensibilità se utilizzato entro poche ore dall'esposizione13,23,24. L'elevata sensibilità del test nell'intervallo di basse dosi ha portato a una serie di studi in cui il test dei fuochi γ-H2AX è stato utilizzato come indicatore dell'effetto dell'esposizione alle radiazioni mediche, sia in radioterapia che in applicazioni di diagnostica per immagini25,26,27,28,29,30. Queste caratteristiche rendono il test dei fuochi γ-H2AX un'alternativa altamente competitiva ad altri metodi per il triage precoce in incidenti nucleari di grandi dimensioni per separare gli individui esposti criticamente da quelli a basso rischio. Diversi esperimenti di ottimizzazione hanno dimostrato che è possibile eseguire il test dei fuochi γ-H2AX con piccoli volumi di sangue, come lo studio di Moquet et al. che hanno riferito che è possibile eseguire il test dei fuochi γ-H2AX con solo una goccia di sangue (puntura del dito)31. Un approccio simile è stato utilizzato nello sviluppo del sistema RABIT (Rapid Automated Biodosimetry Tool) ad alto rendimento completamente automatizzato, ottimizzato per misurare i rendimenti γ-H2AX da campioni di sangue derivati dal polpastrello32,33. Nel complesso, i risultati degli studi di confronto inter-confronto MULTIBIODOSE e RENEB suggeriscono che il test dei fuochi γ-H2AX potrebbe essere uno strumento di triage molto utile a seguito di una recente esposizione alle radiazioni acute (fino a 24 ore)12,13,14. In uno studio di confronto tra intervalli di basse dosi, una dose fino a 10 mGy potrebbe essere distinta dai campioni di controllo irradiati in modo fittizio, evidenziando la sensibilità del saggio nell'intervallo di dose bassa34. È importante notare che l'elevata sensibilità del test è particolarmente vera per i linfociti, il che li rende uno dei tipi di cellule più adatti per la valutazione delle esposizioni a basse dosi. I linfociti sono principalmente cellule non cicliche e rappresentano una popolazione sincrona. Quest'ultimo evita l'espressione di γ-H2AX è associato alla replicazione del DNA, che riduce significativamente la sensibilità del saggio per rilevare il DSB indotto dalle radiazioni durante la fase G2 e S del ciclo cellulare35. Oltre alla sua sensibilità a basse dosi per i linfociti, il tempo di risposta del test dei fuochi γ-H2AX è significativamente più veloce rispetto alle tecniche citogenetiche come il test dicentrico e micronucleo, poiché non richiede la stimolazione dei linfociti. Pertanto, i risultati possono essere ottenuti entro poche ore rispetto a un paio di giorni per le tecniche citogenetiche. Uno dei principali svantaggi del test è la rapida scomparsa del segnale dei fuochi γ-H2AX, che normalmente sarà ridotto ai livelli basali entro pochi giorni dall'esposizione alle radiazioni a seconda della cinetica di riparazione del DNA36. Pertanto, l'applicazione più adatta del test in un contesto di biodosimetria è per scopi di triage iniziale e per dare priorità a un follow-up della dosimetria biologica citogenetica più dispendioso in termini di tempo per alcune vittime. Tuttavia, per una biodosimetria retrospettiva precisa e effetti a lungo termine, si deve fare affidamento su tecniche citogenetiche come le analisi FISH a tre colori per la rilevazione di aberrazioni cromosomiche stabili nel caso in cui l'esposizione abbia avuto luogo diversi anni fa.10.
Nell'ambito di diverse iniziative di biodosimetria, sono stati valutati più saggi a scopo di triage accanto al test dei fuochi γ-H2AX per il triage delle persone in emergenze radiologiche su larga scala; come il test dicentrico, il test del micronucleo del blocco citochinesi, la risonanza paramagnetica elettronica (EPR), il saggio delle proteine sieriche (SPA), il saggio dello speckle cutaneo (SSA), la luminescenza stimolata otticamente (OSL), nonché l'analisi dell'espressione genica 37,38. Il test dei fuochi γ-H2AX può essere utilizzato quantitativamente per la valutazione della formazione e riparazione del DNA DSB39. Tuttavia, il test è dipendente dal tempo in quanto il livello di γ-H2AX varia con il tempo dopo l'irradiazione a causa della cinetica di riparazione del DNA DSB40. Uno studio comparativo ha dimostrato che il punteggio microscopico con capacità dello stadio z offre i risultati più accurati dopo 1 Gy di irradiazione, mentre la citometria a flusso fornisce risultati affidabili solo a dosi più elevate di IR41. Ci sono molti rapporti sullo sviluppo di soluzioni di analisi delle immagini per l'uso nel punteggio automatizzato42,43,44,45,46. In questo protocollo, una piattaforma di microscopia fluorescente automatizzata e ad alto rendimento viene utilizzata per analizzare i focolai di γ-H2AX nei linfociti del sangue periferico. L'uso di un sistema di punteggio automatico evita sia il bias di punteggio inter-laboratorio che inter-osservatore, mentre consente comunque una sensibilità sufficiente per rilevare dosi inferiori a 1 Gy47. Il vantaggio principale di questo sistema rispetto al software open source gratuito per il punteggio dei fuochi è il fatto che l'intero processo dalla scansione delle diapositive all'acquisizione e al punteggio è automatizzato. Il concetto di classificatori definibili e memorizzabili dall'utente garantisce una riproducibilità che aggiunge un grado imparziale di qualità ai risultati. Pertanto, questo lavoro illustra come i risultati dei focolai γ-H2AX possono essere ottenuti utilizzando un metodo automatizzato di scansione microscopica e punteggio che può essere utilizzato quando campioni di sangue di individui potenzialmente sovraesposti vengono ricevuti dai laboratori di radiobiologia per scopi di dosimetria biologica.
Protocol
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della Ricerca Biomedica del Comitato Etico dell'Università del Capo Occidentale - Codice BM18/6/12.
1. Preparazione delle soluzioni48
- Soluzione di fissazione cellulare (3% PFA in PBS)
- Indossare gli appositi dispositivi di protezione individuale (DPI) e lavorare in una cappa aspirante, aggiungere 20 g di paraformaldeide a 200 ml di H2O distillato. Riscaldare la miscela a 60 °C per favorire la dissoluzione.
- Una volta sciolto il PFA, aggiungere 40 gocce di 5 N NaOH con attenzione nell'arco di 30 minuti e raffreddare a temperatura ambiente. Regolare a pH 7 utilizzando 1 M HCl e portare a un volume finale di 250 mL con H2O distillato (le aliquote possono essere conservate a -20 °C per 1 anno). Aggiungere 25 ml da questa soluzione a 41,7 ml di PBS per ottenere una soluzione PFA al 3%.
- Soluzione di albumina sierica bovina all'1% (BSA): aggiungere 10 g di BSA a 1000 ml di PBS e mescolare fino a quando non si scioglie. Conservare a 4 °C fino all'uso (massimo 72 ore).
- Soluzione di Triton-X in concentrazione di 1:500: Aggiungere 1 μL di Triton-X a 500 μL di PBS, conservare a 4 °C fino all'uso (massimo 24 ore).
- Soluzioni anticorpali
- Anticorpo primario - Anti-γ-H2AX in concentrazione di 1:500: Aggiungere 1 μL di anti-γ-H2AX a 500 μL di soluzione di BSA all'1%, conservare a 4 °C fino all'uso (massimo 24 ore).
- Anticorpo secondario - DAM-TRITC in concentrazione di 1:1000: Aggiungere 1 μL di DAM-TRITC a 1000 μL di soluzione BSA all'1%, conservare a 4 °C fino all'uso (massimo 24 ore).
- Complete Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) Media
- Aggiungere il siero bovino fetale filtrato (FBS) e la penicillina-streptomicina ai mezzi RPMI 1640 in un flacone sterile per ottenere una concentrazione finale del 10% di FBS e dell'1% di penicillina-streptomicina.
2. Preparazione dei campioni
NOTA: Per questo protocollo, i campioni di sangue intero periferico vengono raccolti per venipuntura in provette di raccolta di litio-eparina da volontari adulti sani (con consenso informato - BM18/6/12 Biomedical Research Ethics Committee of The University of Western Cape Ethics Committee). Prima di iniziare, assicurarsi che il sangue e il mezzo di densità di 1,077 g/ml siano acclimatati alla temperatura ambiente.
- In un armadio di biosicurezza preparato, diluire il sangue intero periferico in un volume 1:1 con PBS e stratificare delicatamente il sangue diluito su un volume uguale a due volumi di mezzo con una densità di 1.077 g / mL. È importante stratificare gradualmente il sangue sul mezzo di densità tenendo il tubo inclinato a 45 °, assicurandosi che il sangue e il mezzo di densità non si mescolino.
- Trasferire con attenzione la sospensione in una centrifuga e ruotare a 900 x g per 20 minuti. Successivamente, pipettare lo strato "nuvoloso" solo su un nuovo tubo conico sterile e riempire il tubo con PBS e centrifuga per 10 minuti a 1000 x g. Successivamente, aspirare il surnatante con una pipetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet, risospese il pellet PBMC con attenzione in 1 mL PBS e riempire il tubo con PBS.
- Ripeti il passaggio di lavaggio di cui sopra altre due volte per arrivare a un totale di tre lavaggi.
- Contare il numero di PBMC utilizzando un emocitometro, consapevoli che ogni ml di sangue periferico da un donatore adulto si tradurrà in una media approssimativa di 1 - 1,5 x 106 PBMC49. Dopo il conteggio, diluire il pellet PBMC ad una concentrazione di 8 x10 5 linfociti in 1 mL di cRPMI. Quindi aggiungere circa 2 x 106 PBMC o 2,5 mL dalla soluzione PBMC isolata in un tubo conico sterile per irradiazioni.
3. Irradiazioni del campione
ATTENZIONE: Maneggiare l'unità di radiazione secondo le linee guida per la protezione dalle radiazioni e indossare un dosimetro fisico in ogni momento. Assicurarsi che il sistema di irradiazione utilizzato sia calibrato e impostato in modo tale da ottenere le dosi previste corrette.
- Irradiare PBMC a temperatura ambiente utilizzando una sorgente a 60Co. Calibrare (protocollo TRS-398) con una camera Farmer 117 per la quale un fattore di calibrazione della camera ottenuto dal National Metrology Institute of South Africa (NMISA)50.
- Per questo test, posizionare i tubi conici tra un foglio acrilico da 5 mm (utilizzato per l'accumulo di ingresso del fascio) e un materiale di backscatter da 50 mm con l'attuale dose della sorgente di 60Co di 0,57 Gy/min per una dimensione del campo omogenea di 300 mm × 300 mm a 750 mm Distanza sorgente-superficie.
- Irradiare i PBMC con dosi graduali di 0,125, 0,500, 1,000, 1,500 e 2,000 Gy e mantenere i campioni di controllo irradiati in modo fittizio, nella sala di controllo, ricevendo solo l'esposizione alle radiazioni ambientali.
- Incubare i campioni irradiati per 1 ora a 37 °C in un incubatore a CO2 umidificato al 5% per raggiungere il numero massimo di focolai γ-H2AX.
NOTA: Il tempo di incubazione può essere modificato in base al disegno sperimentale.
4. Preparazione delle diapositive
NOTA: vedere la Figura 1 per la configurazione delle diapositive.
- Preparare 3 vetrini (ripetizioni tecniche) utilizzando vetrini rivestiti con una superficie caricata positivamente per migliorare l'adesione per condizione di irradiazione (o per tubo conico). Posiziona la diapositiva nel supporto della clip, aggiungi la scheda filtro sopra di essa e infine l'imbuto. Fissare le clip del vetrino e inserirle nella citocentrifuga.
- Aggiungere 250 μL della sospensione cellulare all'imbuto (200.000 cellule/vetrino) e ruotare per 30 x g per 5 minuti usando una citocentrifuga.
- Dopo la citocentrifugazione, rimuovere il vetrino dal supporto della clip e utilizzando una penna idrofoba, disegnare un cerchio attorno al punto con le cellule per mantenere la macchia immunofluorescente sulle cellule legate durante il processo di colorazione.
5. Fissazione e immunofluorescenza γ-H2AX
NOTA: Tutte le soluzioni vengono accuratamente aggiunte direttamente sull'area cellulare contrassegnata da un cerchio idrofobo. Le soluzioni coloranti vengono erogate leggermente sopra il vetrino senza consentire alla punta della pipetta di interrompere le celle. Le soluzioni NON vengono aggiunte all'intera diapositiva.
- Fissare i vetrini in PFA al 3% appena preparato per 20 minuti.
NOTA: I vetrini possono essere conservati in PBS contenente lo 0,5% di PFA a 4 °C per un massimo di 2 giorni prima dell'immunocolorazione. Successivamente, lavare i vetrini in un barattolo coplin con PBS per 5 minuti, quindi coprire le cellule con 100 μL della soluzione fredda triton-X per 10 minuti per consentire la permeabilizzazione. - Versare la soluzione di Triton-X su carta velina e lavare i vetrini tre volte in soluzione di BSA all'1% per 10 minuti. Questo viene fatto per prevenire lo sfondo indesiderato bloccando il legame anticorpale non specifico.
- Incubare vetrini a temperatura ambiente con 100 μL dell'anticorpo primario anti-γ-H2AX diluito 1:500 per 1 ora in una camera umidificante, facilmente realizzabile aggiungendo carta velina bagnata alla base di una scatola rettangolare.
- Versare la soluzione anticorpale su carta velina ed eseguire tre lavaggi con una soluzione di BSA all'1% per 10 minuti in un barattolo di Coplin per rimuovere l'anticorpo primario non legato e prevenire il legame non specifico dell'anticorpo secondario.
- Incubare vetrini con 100 μL della soluzione anticorpale secondaria DAM-TRITC diluita 1:1000 per 1 ora nella camera umidificante. Versare la soluzione anticorpale su carta velina e lavare i vetrini in PBS per 10 minuti tre volte.
- Infine asciugare i vetrini all'esterno del cerchio idrofobico con carta velina morbida e priva di polvere e aggiungere 1-2 gocce di DAPI risolte in un mezzo di montaggio acquoso e coprire delicatamente il vetrino con un coperchio di copertura 24 x 50 mm, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria intrappolate e metterlo in frigorifero a 4 °C durante la notte. Le diapositive possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane prima della scansione.
6. Scansione automatica e punteggio delle diapositive
NOTA: il sistema di scansione deve avere un microscopio fluorescente, una telecamera CCD (dispositivo accoppiato caricato) ad alta risoluzione collegata a un frame grabber per la digitalizzazione in tempo reale delle immagini video, una fase di scansione, trackball per movimenti manuali, mouse 3D, PC e monitor veloci e disco rigido per l'archiviazione (Figura 2).
- Configurazione del classificatore
NOTA: il classificatore è un insieme di parametri che definiscono il modo in cui il sistema rileva le celle. Risulta dalla formazione basata su campi immagine pre-classificati. Un classificatore è specifico per l'ingrandimento di un microscopio, il tipo di cellula e il laboratorio. I classificatori possono quindi richiedere modifiche dei seguenti parametri per adattarli alle condizioni attuali. Si consiglia di testare le impostazioni con una diapositiva di riferimento prima della valutazione.- Acquisizione di immagini: utilizzare un obiettivo a secco 40x per l'imaging. Per ottenere una qualità dell'immagine comparabile in tutte le celle, impostare il tempo di integrazione della fotocamera in modalità automatica. Impostare il tempo massimo di integrazione su almeno 1 secondo per entrambi i canali di colore (guadagno fotocamera 4.0). Il canale del segnale viene acquisito con 10 piani di messa a fuoco e 14/40 μm tra i piani.
- Selezione delle celle: vengono rilevati PBMC entro un intervallo di 20,00μm 2 e 76,00μm 2. Impostate la profondità massima di concavità su 0,05 e le proporzioni massime su 1,4. Impostare la soglia relativa del livello di grigio su 20%.
- Elaborazione delle celle: elabora il canale di controcolorazione DAPI con un algoritmo di massima istogramma per ridurre lo sfondo. Il canale del segnale viene elaborato con un filtro TopHat (forza 7, fattore di levigatura 0) per ridurre lo sfondo e migliorare i segnali.
- Conteggio dei segnali: conta i fuochi utilizzando la funzione Conteggio oggetti del dispositivo. Per evitare la valutazione falsamente positiva dei segnali di fondo rimanenti, vengono conteggiati solo quei segnali che mostrano almeno il 30% dell'intensità rispetto all'oggetto più luminoso nella cella.
- Inserire/Posizionare le diapositive sulla piattaforma di scansione automatizzata o sullo stadio di scorrimento, dopo essere state pulite delicatamente con etanolo al 70%, per rimuovere eventuali polveri.
- Impostazione diapositiva - Aprire il menu di dialogo Impostazione diapositiva (Figura 3)
- Selezionare il percorso daticorretto, specifica dove sono archiviati i file di diapositiva risultanti dalla ricerca.
- Assegna un nome alla diapositiva, a ogni diapositiva deve essere assegnato un nome univoco. Se una serie di diapositive viene immessa sotto forma di elenco enumerato, il '?' può essere utilizzato come carattere jolly per il numero di diapositiva.
- Selezionare il classificatore appropriato, come descritto in sezione 1.1 - 1.4 (Figura 4).
- Selezionare la finestra di ricerca e selezionare Predefinito se esiste una definizione della finestra di ricerca corrispondente al cerchio cellulare della citocentrifuga, selezionare la rispettiva definizione nella colonna Dimensioni o selezionare Manuale se non è disponibile una definizione predefinita della finestra di ricerca. In questo caso, non è necessario impostare la colonna Dimensioni.
- Selezionare Numero massimo di celle e aggiungere il numero massimo di celle necessarie per la scansione. La ricerca viene terminata anche se la finestra di ricerca selezionata non è stata ancora scansionata completamente non appena viene raggiunto il numero massimo di celle. Per le applicazioni di biodosimetria, è sufficiente il punteggio automatico di 1000 cellule per vetrino, considerando che vengono preparati 3 vetrini per campione di sangue. Fare clic su OK per confermare le impostazioni.
- Impostazione della scansione delle diapositive
- Fai clic sul pulsante Cerca nella barra laterale. Se l'impostazione Finestra di ricerca manuale è stata selezionata nella configurazione della diapositiva, si aprirà una finestra di dialogo che consente di determinare l'area di scansione (Figura 5). Utilizzando l'obiettivo 10x, selezionare l'area di ricerca rettangolare sulla diapositiva in modo interattivo fissando due angoli del campo di ricerca con il tasto sinistro del mouse. Questo può essere confermato con il pulsante OK. Se la finestra di ricerca fa riferimento a una finestra di ricerca predefinita, questo passaggio verrà omesso.
- All'utente viene richiesto di regolare una posizione iniziale di messa a fuoco. Un oggetto di riferimento verrà quindi selezionato automaticamente, il software chiederà all'utente di mettere a fuoco e centrare un nucleo di riferimento (utilizzando l'obiettivo 40x) per ogni diapositiva e di confermare le impostazioni con OK. Il sistema si sposterà automaticamente su tutte le diapositive in sequenza. Se necessario, regolare Live Image Setup - Tempo di integrazione per questo passaggio ( Figura5).
- Controllare tutte le impostazioni del microscopio e confermare il prompt del sistema con OK. Il sistema avvierà la procedura automatizzata di messa a fuoco e scansione. Una volta completata la scansione, i dati vengono salvati sul computer per le analisi. Il sistema di scansione si spegne automaticamente al termine della scansione.
NOTA: Assicurarsi che la leva del tubo del microscopio sia in una posizione che devii tutta la luce verso la fotocamera. - Fine ricerca, la ricerca viene terminata se l'intera ricerca è stata scansionata, se è stato raggiunto il numero massimo di celle o se la ricerca è stata annullata.
- Analisi delle diapositive
NOTA: l'analisi completata è rappresentata nella Figura 6.- Al termine della scansione, fare clic sul pulsante Galleria nella barra laterale. Esamina la galleria, che consiste in piccole immagini di cellule rilevate. In questa finestra (Figura 7), specificare se le celle memorizzate nella galleria in base a un criterio da scegliere da un menu a discesa. Le celle vengono generalmente visualizzate nell'ordine in cui sono state rilevate.
- Fare clic su Istogramma di qualità/Diagramma del valore delle caratteristiche ( Figura8) per fornire la distribuzione della misura di qualità per le cellule rilevate, nonché i mezzi e la deviazione standard dei fuochi valutati.
Representative Results
Per questo protocollo, le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PMBC) sono state isolate dal sangue intero di quattro volontari adulti sani e sono state esposte a dosi di radiazioni di 0,125, 0,250, 0,500, 1,000 e 2,000 Gy. Successivamente, i campioni sono stati incubati per 1 ora a 37 °C in un incubatore a CO2 umidificato al 5%. Dopo la fissazione e la colorazione immunofluorescenza, i vetrini vengono automaticamente scansionati e valutati. Le figure 6,7 e 8 forniscono una rappresentazione di ciò che il software restituisce all'utente. Una volta completata la scansione viene visualizzata una finestra di analisi, che fornisce una panoramica dei fuochi valutati. La galleria fornisce tutti i fuochi valutati con un menu interattivo che può eliminare i valori anomali e infine viene fornito un istogramma con un riepilogo dettagliato dei dati.
I fuochi γ-H2AX dopo l'esposizione ai raggi γ sono presentati nella Figura 9. C'è stato un graduale aumento del numero di focolai di γ-H2AX con l'aumentare della dose. Questo grafico non solo illustra la dipendenza dalla dose e la sensibilità del test, ma l'adattamento può anche essere utilizzato per eseguire una stima della dose quando un campione viene ricevuto da un individuo che è stato esposto a una dose sconosciuta. È importante notare che non si avrà un controllo irradiato fittizio o livelli di focolai di fondo per questo individuo. Pertanto, la Figura 9 include il valore di 0 Gy dei campioni di controllo irradiati con finzione, che era di 0,57 ± 0,23 Gy per i quattro donatori adulti in questo studio.
Figura 1: Preparazione di vetrini per citocentrizzazione. Posiziona la diapositiva nel supporto della clip, aggiungi la scheda filtro sopra di essa e infine l'imbuto. Fissare le clip del vetrino e inserirle nella citocentrifuga. Dopo la citocentrifugazione, rimuovere il vetrino dal supporto della clip e disegnare un cerchio attorno al punto con le cellule usando una penna idrofoba. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La piattaforma di scansione automatizzata utilizzata in questo protocollo, contenente uno scanner automatizzato collegato a un microscopio fluorescente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Menu per la configurazione delle diapositive. Apri la finestra di dialogo facendo clic sul pulsante SETUP nella barra laterale. Selezionare o immettere la directory di destinazione per i file dei risultati Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Menu di configurazione del classificatore. Assicurarsi che le impostazioni del classificatore selezionato corrispondano al tipo di cella corrente, alle condizioni di preparazione e ai modelli di colorazione del campione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Menu di configurazione per la finestra di ricerca manuale. La finestra è stata selezionata nella configurazione della diapositiva; si aprirà un dialogo che consentirà di determinare l'area di scansione. Utilizzando l'obiettivo 10x, l'area di ricerca rettangolare sulla diapositiva viene selezionata in modo interattivo fissando due angoli del campo di ricerca con il tasto sinistro del mouse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Finestra analisi, una volta completata la scansione, la finestra di analisi mostra i risultati della scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Vista Galleria per la diapositiva selezionata. La scheda Galleria si trova nella barra laterale. La galleria di immagini è costituita da piccole immagini delle celle rilevate, visualizzate come un'immagine combinata DAPI-TRITC. Nell'angolo in basso a sinistra e a destra di ogni immagine vengono visualizzati il conteggio dei fuochi diretti e i conteggi dei fuochi corretti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Immagini dell'istogramma per la diapositiva selezionata. Questa finestra si apre facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'istogramma. Cliccando sull'istogramma, la scheda dell'istogramma fornisce un riepilogo dei dati che elenca i valori medi, deviazione standard, coefficiente di variazione, minimo, massimo e mediano delle cellule analizzate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Il numero di focolai di γ-H2AX in funzione della dose per i linfociti esposti a raggi γ 60Co. Le barre di errore sono le deviazioni standard che rappresentano la variazione interindividuale tra i donatori. I dati rappresentano il numero medio di focolai di γ-H2AX ± deviazione standard di quattro volontari sani. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo descrive una procedura graduale per il punteggio automatizzato basato sulla microscopia fluorescente del test dei fuochi γ-H2AX. Illustra l'utilità del test dei fuochi come metodo efficiente in termini di tempo per analizzare il numero di DNA DSB indotto da radiazioni nei linfociti del sangue periferico per eseguire una valutazione della dose biologica in uno scenario di incidente da radiazioni in cui gli individui potrebbero essere esposti a livelli sconosciuti di IR.
In questo protocollo specifico, i PBMC sono stati irradiati in vitro per imitare un'esposizione alle radiazioni in vivo. Una volta completata l'irradiazione e il tempo di incubazione di un'ora, i vetrini vengono realizzati utilizzando un citocentrifuga per creare un punto di concentrazione di cellule sul vetrino. L'uso di una citocentrifuga è vitale per ottenere condizioni standardizzate per il punteggio automatizzato. Una volta completata, una penna idrofobica viene utilizzata per fare un cerchio intorno alle cellule, per ridurre lo spreco di reagenti consentendo all'utente di localizzare i reagenti di colorazione. Questo tipo di penna può essere utilizzato in varie tecniche di immunocolorazione come su sezioni di paraffina, sezioni congelate e preparati di citologia. Inoltre, è importante selezionare una penna idrofoba compatibile con i sistemi di rilevamento enzimatici e fluorescenti. Dopo la preparazione del vetrino, si è verificata la fissazione e l'immunofluorescenza γ-H2AX. In questo protocollo, le cellule vengono fissate utilizzando il 3% di PFA in una soluzione PBS per 20 minuti. Affinché l'immunocolorazione abbia successo, è essenziale che la morfologia delle cellule sia mantenuta e che i siti antigenici siano accessibili ai reagenti di rilevamento utilizzati. Il PFA è un agente relativamente delicato per la fissazione e stabilizza le cellule preservando le strutture proteiche51. Esperimenti di ottimizzazione con concentrazioni di PFA più elevate e tempi di fissazione più lunghi hanno avuto un impatto negativo sulla qualità del vetrino, ma un'ulteriore conservazione (durante la notte) in PFA allo 0,5% fino a 24 ore ha prodotto buoni risultati.
L'anticorpo monoclonale primario 2F3 utilizzato in questo protocollo reagisce alla variante istone H2AX quando fosforilato a Serina 139 dopo l'induzione del DNA DSB. L'anticorpo è in grado di legarsi al residuo fosforilato senza reattività crociata con altri istoni fosforilati52. Poiché si tratta di un anticorpo monoclonale primario di topo, è stato selezionato un anticorpo secondario contro la specie ospite dell'anticorpo primario mentre è allevato in un ospite alternativo, vale a dire asino-anti-topo (DAM)-TRITC. Mentre la colorazione immunofluorescente si basa sul legame anticorpo-epitopo specifico, diverse forze intermolecolari possono anche provocare una colorazione di fondo non specifica. Al fine di ridurre il legame non specifico, è importante utilizzare un reagente bloccante nei protocolli di colorazione immunofluorescente53; abbiamo usato una soluzione BSA. Inoltre, a questa fase di blocco deve essere dedicato un tempo sufficiente lasciando i vetrini nella soluzione per almeno 20 minuti prima della colorazione degli anticorpi primari e secondari. Inoltre, la soluzione BSA deve essere utilizzata anche come diluente per gli anticorpi primari e secondari. A seconda dell'anti-γ-H2AX e dell'anticorpo secondario utilizzato per la colorazione, si dovrebbe prendere in considerazione la possibilità di testare diverse diluizioni anticorpali al fine di determinare la concentrazione ottimale. Per un punteggio più preciso, è possibile condurre una doppia colorazione, aggiungendo ulteriori anticorpi della proteina di riparazione del DNA DSB.
Uno dei principali svantaggi di questo tipo di analisi è la necessità di acquisire campioni di sangue il prima possibile dopo l'esposizione, poiché è noto che il numero massimo di focolai diminuisce a livelli normali entro 48 ore dall'irradiazione. Pertanto, quando il momento dell'incidente da radiazioni e il successivo prelievo di sangue sono noti, potrebbe essere utile lavorare con diverse curve di calibrazione che sono state stabilite in diversi punti temporali dopo l'irradiazione in vitro (ad esempio, 4, 8, 12 e 24 ore). Tuttavia, come già accennato nella sezione introduttiva del manoscritto, la forza del test dei fuochi γ-H2AX risiede in scopi di triage iniziale e veloce e dovrebbe essere utilizzato per dare la priorità a una dosimetria biologica citogenetica più dispendiosa in termini di tempo. Uno scenario combinato in cui più biomarcatori di biodosimetria vengono utilizzati in parallelo, genererà la stima della dose più affidabile e vari laboratori di biodosimetria in tutto il mondo hanno unito le forze per creare reti nazionali che possono essere attivate e utilizzate per consentire valutazioni di biodosimetria multiple e parallele da parte di laboratori con competenze diverse37,54,55 . Inoltre, sono in corso sviluppi per analisi superveloci come un laboratorio mobile sul o vicino al luogo dell'incidente56. Nuovi e promettenti metodi di biodosimetria sono costantemente in fase di sviluppo, che si spera si tradurranno in una produttività ancora più veloce e affidabile in futuro57.
Per il sistema automatizzato di analisi delle immagini, le diapositive vengono inserite o posizionate sulla piattaforma di scansione automatizzata o sullo stadio di diapositiva. Successivamente, assegnare un nome e salvare i dettagli della diapositiva nella cartella appropriata sul computer collegato. Per questo esperimento, il rilevamento automatico di nuclei e fuochi si basa sulle rispettive impostazioni del classificatore. Al momento della creazione di un classificatore, assicurarsi che le impostazioni del classificatore selezionate corrispondano al tipo di cella corrente, alle condizioni di preparazione e alla colorazione immunofluorescente del campione. Nel classificatore sono impostati canali fluorescenti appropriati che corrispondono allo spettro di eccitazione degli anticorpi primari e secondari. Il classificatore consente di impostare parametri di punteggio aggiuntivi, se necessario (ad esempio, dimensione del nucleo, intensità fluorescente, come descritto nella sezione 6.1). Se due o più proteine di riparazione del DNA (ad esempio, γ-H2AX e 53BP1) sono combinate in un esperimento, il sistema è anche in grado di rilevare co-localizzazioni di segnali. In primo luogo, il sistema acquisisce immagini DAPI, applica l'elaborazione delle immagini e identifica i nuclei utilizzando i criteri morfologici impostati nel classificatore. I segnali TRITC vengono acquisiti utilizzando 10 z-stack con una dimensione del passo di 0,35 mm tra i piani focali47. Il classificatore ha utilizzato il Direct Foci Count, in cui viene valutato il numero di segnali TRITC distinti all'interno del nucleo. Qui, è importante prendere in considerazione che con l'aumentare della dose di radiazioni, i segnali dei fuochi tendono a fondersi in oggetti più grandi, con conseguente sottovalutazione del numero effettivo di fuochi se gli oggetti vengono contati direttamente. Non è stato richiesto per l'analisi qui descritta, ma è possibile implementare un ulteriore passaggio con Corrected Foci Count per risolvere questo problema. Quest'ultimo consente al sistema di ottenere le dimensioni dei segnali rilevati e li pesa di conseguenza. L'utilizzo di entrambi i metodi di conteggio può fornire una stima più realistica del numero effettivo di focolai a dosi più elevate.
Per iniziare la scansione automatica, l'area di scansione viene determinata utilizzando l'obiettivo 10x del microscopio per creare un'area di ricerca rettangolare fissando due angoli del campo di ricerca facendo clic sinistro del mouse (Figura 5), seguito dalla messa a fuoco della posizione iniziale. L'oggetto di riferimento viene selezionato automaticamente e il software richiede all'utente di mettere a fuoco e centrare un nucleo di riferimento (utilizzando l'obiettivo 40x) per ogni diapositiva. Dopo l'inizio della ricerca, il sistema si sposterà al centro della finestra di ricerca della prima diapositiva selezionata e richiederà di centrare e mettere a fuoco l'oggetto di riferimento. Questo oggetto verrà successivamente utilizzato come riferimento di posizione per correggere qualsiasi spostamento nelle posizioni della cella. Il secondo scopo del campo di riferimento è la regolazione automatica della luce, in modalità luce trasmessa la luce viene regolata fino al raggiungimento del livello di luce ottimale. In modalità fluorescenza il livello di luce è fisso, ma il tempo di integrazione della telecamera CCD può essere aumentato fino a misurare il segnale richiesto. Per consentire una corretta regolazione della luce, il riferimento deve contenere oggetti con colorazione tipica. È importante non utilizzare un campo che presenta artefatti con intensità di colorazione molto elevata. Dopo la regolazione della luce, il sistema avvia l'autofocus della griglia nella posizione della griglia più vicina al campo di riferimento. Continua a focalizzare i campi su una griglia regolare, muovendosi in un meandro verso la parte anteriore e posteriore della finestra di ricerca. La scansione inizia al termine della messa a fuoco automatica della griglia. Lo stage viene spostato in un campo di pattern a meandro dopo campo per acquisire i dati. Quando viene rilevata una cella, la sua posizione e l'immagine della galleria vengono memorizzate e visualizzate sullo schermo e il conteggio delle celle viene aggiornato. Se si verifica un errore al microscopio, allo stadio o all'alimentatore, la ricerca viene automaticamente annullata. L'unico passaggio in cui vi è un intervento manuale da parte dell'operatore, è durante il set-up della scansione delle diapositive. Questo è anche il punto in cui avviene un rapido controllo di qualità (bolle d'aria, basso numero di cellule, sbiadimento dei manufatti di colorazione del segnale fluorescente) e dove si può decidere di interrompere la scansione di un vetrino di qualità inferiore. Una ricerca viene terminata se l'intera diapositiva è stata analizzata, se è stato raggiunto il numero massimo di celle o se la ricerca è stata annullata. Una volta completata la scansione, i dati vengono presentati come mostrato in Figura 6. Per visualizzare le celle scansionate, viene aperta la finestra Galleria e ogni cella può essere visualizzata (Figura 7). Questo è un altro punto in cui l'operatore può eseguire un controllo di qualità controllando la messa a fuoco delle immagini della galleria e il numero totale di celle che sono state valutate. Se troppe cellule sono fuori fuoco o troppo poche cellule sono state rilevate dal sistema per effettuare una stima realistica della dose (ad esempio, 100 cellule invece delle 1000 cellule previste), allora dovrebbe essere presa la decisione di escludere il vetrino e il punteggio automatico dalla valutazione finale. Tutti i dati sono riassunti in istogrammi (Figura 8), unitamente alle informazioni sulla distribuzione, le medie e la deviazione standard dei fuochi valutati per ciascuna cella. Gli istogrammi possono anche essere utilizzati per selezionare e visualizzare sottopopolazioni di nuclei in base ai risultati automatizzati per la revisione. Le analisi statistiche sui risultati vengono eseguite dopo che la distribuzione, la media e la deviazione standard del numero di focolai per cella sono state registrate manualmente. Il grafico può essere utilizzato come curva di calibrazione per effettuare una stima della dose di un campione di biodosimetria. Questo può essere fatto usando l'equazione della linea di tendenza per fare una stima approssimativa della dose ricevuta. Inoltre Figura 9 illustra che la scansione automatizzata è abbastanza sensibile da rilevare i focolai indotti a basse dosi. Inoltre, i risultati mostrano un chiaro aumento lineare del numero di focolai per cellula con dose. Va notato che i risultati sono rappresentativi solo per il classificatore utilizzato, i risultati differiranno per i diversi parametri del classificatore. Pertanto, nel caso di un'analisi biodosimetrica, è importante che per i campioni di biodosimetria vengano utilizzati lo stesso classificatore e la stessa preparazione del vetrino di quelli che sono stati utilizzati per stabilire la curva di calibrazione utilizzata per eseguire la stima della dose. Mentre era fuori dallo scopo di questo studio, è importante notare che il test dei fuochi γ-H2AX può anche essere utilizzato per determinare le irradiazioni parziali del corpo. La maggior parte delle esposizioni accidentali alle radiazioni sono esposizioni corporee disomogenee o parziali, in cui solo una regione localizzata del corpo ha ricevuto un'esposizione ad alte dosi. Diversi studi hanno dimostrato che è possibile utilizzare il test dei fuochi γ-H2AX per stimare la frazione del corpo che è stata irradiata e la dose alla frazione irradiata42. Quando avviene un'irradiazione di tutto il corpo, ci sarà un'induzione casuale del DNA DSB in tutte le cellule e ci si può aspettare di trovare una distribuzione di Poisson. Simile ai metodi citogeni in cui l'induzione delle aberrazioni cromosomiche tende ad essere sovradispersa nei linfociti del sangue periferico dove c'è un'elevata abbondanza di cellule con aberrazioni multiple e cellule con metafasi normali, analisi della dispersione dei focolai di γ-H2AX utilizzando un metodo di Poisson contaminato suggerito su distribuzioni di focolai dispersi58. Quest'ultimo è stato confermato anche in in vivo esperimenti con minipigs e un macaco rhesus59.
Disclosures
C. Schunck è un dipendente di MetaSystems Hard & Software GmbH, Altlussheim, Germania.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i partecipanti allo studio per le loro donazioni di sangue, così come l'infermiera V. Prince per la raccolta di campioni di sangue. L'assistenza finanziaria della South African National Research Foundation (NRF) per questa ricerca è qui riconosciuta. Le opinioni espresse e le conclusioni a cui si è giunti sono quelle degli autori e non sono necessariamente da attribuire alla NRF. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dall'Agenzia internazionale per l'energia atomica (AIEA), attraverso un progetto di cooperazione tecnica (numero: URU6042) per sostenere W. Martínez-López, nonché il progetto di ricerca coordinato E35010 (numero di contratto: 22248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin - BSA | Merck | A3059 | |
| Coplin Jar | Sigma | S6016 | |
| Cover Slips (Size 24 x 50 mm) | Lasec | Glass2C29M2450Rec | |
| Cryogenic Vials (1.2 mL) | WhiteSci | 607101 | |
| Cytospin | Healthcare Technologies | JC370-12-L | |
| Cytospin Clips | Healthcare Technologies | JC302 | |
| Cytospin filter cards | Healthcare Technologies | JC307 | |
| Cytospin Funnels | Healthcare Technologies | JC372 | |
| DAM-TRITC | Invitrogen | A16022 | |
| DAPI-Fluroshield | Sigma/Merck | F6057 | |
| Ethanol | Kimix | ETD901 | |
| Filter tips | WhiteSci | 200ul (312012) and 1000ul (313012) | |
| Hydrochloric acid- HCl | Merck | ||
| Histopaque | Sigma/Merck | 10771 | |
| lithium–heparin collection tubes | The Scientific Group | 367526 | |
| MetaSystems - Metafer | Metasystems | Azio Imager Z2: 195-041848 | |
| NaOH | Merck | 221465 | |
| NovoPen | Leica Biosystems | NCL-PEN | |
| Paraformaldehyde | Sigma/Merck | 158127 | |
| Phosphate-buffered saline Tablets | Separations | SH30028,02 | |
| Pipettes | WhiteSci | P11037 and P1033 | X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage. |
| Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613402 / 100 μg | |
| RPMI medium | WhiteSci | BE12-702F | |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Sigma/Merck | T-9284 | |
| Tubes (15ml) | WhiteSci | 601002 | |
| X-Tra adhesive slides – corner clipped | SMM Technologies | 3800200E |
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