Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

OnePot PURE cellefritt system

Published: June 23, 2021 doi: 10.3791/62625
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Bioengineering, School of Engineering, École Polytechnique Fédérale de Lausanne
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en rask og kostnadseffektiv metode for å produsere det rekombinante PURE cellefrie TX-TL-systemet ved hjelp av standard laboratorieutstyr.

Abstract

Det definerte PURE(proteinsyntesen ved hjelp av rekombinante elementer) transkripsjonsoversettelsessystem gir et tiltalende chassis for cellefri syntetisk biologi. Dessverre er kommersielt tilgjengelige systemer kostbare, og deres tunability er begrenset. Til sammenligning kan en hjemmelaget tilnærming tilpasses basert på brukernes behov. Imidlertid er utarbeidelsen av hjemmelagde systemer tidkrevende og vanskelig på grunn av behovet for ribosomer samt 36 mellomstore proteinrensinger. Effektivisering av proteinrensing ved kokulturering og korensing gjør det mulig å minimere tids- og arbeidskrav. Her presenterer vi en enkel, justerbar, tids- og kostnadseffektiv metode for å produsere alle PURE-systemkomponenter innen 1 uke, ved hjelp av standard laboratorieutstyr. Videre er ytelsen til OnePot PURE sammenlignbar med kommersielt tilgjengelige systemer. OnePot PURE-forberedelsesmetoden utvider tilgjengeligheten til PURE-systemet til flere laboratorier på grunn av sin enkelhet og kostnadseffektivitet.

Introduction

Cellefrie transkripsjonsoversettelsessystemer (TX-TL) utgjør en lovende plattform for utredning og prosjektering av biologiske systemer. De gir forenklede og justerbare reaksjonsforhold, da de ikke lenger er avhengige av livsoppholdende prosesser, inkludert vekst, homeostase eller regulatoriskemekanismer 1. Dermed forventes det at cellefrie systemer vil bidra til utredning av biomolekylære systemer, tilby et rammeverk for å teste rasjonelle biodesignstrategier2, og gi et chassis for en fremtidig syntetisk celle3,4. Det fullt rekombinante PURE-systemet tilbyr et spesielt tiltalende kabinett på grunn av den definerte og minimale sammensetningen, i tillegg til justerbarheten og justerbarheten5.

Siden det første funksjonelle, fullt rekombinante PURE-systemet ble etablert i 20015, er det gjort forsøk på å utvide systemgrensene og optimalisere systemets sammensetning for å forbedre systemutbyttet6,7,8, tillate transkripsjonsregulering9, membran10,11 og sekretorisk proteinsyntese12, og for å lette proteinfolding13,14 . I dag er det tre kommersielt tilgjengelige systemer: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) og Magic PURE (Creative Biolabs). Imidlertid er disse systemene kostbare, deres eksakte sammensetning er proprietær og dermed ukjent, og tilpasningsevnen er begrenset.

PURE-systemer utarbeidet internt viste seg å være det mest kostnadseffektive og justerbare alternativet15,16. Imidlertid er de nødvendige 37 rensetrinnene for protein- og ribosomefraksjoner tidkrevende og kjedelige. Det er gjort flere forsøk på å forbedre effektiviteten til PURE-systemforberedelsene17,18,19. Vi viste nylig at det er mulig å kokulturere og korense alle nødvendige ikke-ribosomale proteiner som finnes i PURE-systemet. Denne OnePot-metoden har vist seg å være kostnadseffektiv og tidseffektiv, og reduserer tilberedningstiden fra flere uker til 3 arbeidsdager. Tilnærmingen genererer et PURE-system med en proteinproduksjonskapasitet som kan sammenlignes med det kommersielt tilgjengelige PURExpress-systemet20. I motsetning til de tidligere tilnærmingene for å forenklePURE-preparatet 17,18,19, i OnePot-tilnærmingen er alle proteiner fortsatt uttrykt i separate stammer. Dette gjør det mulig for brukeren å justere sammensetningen av OnePot PURE-systemet ved bare å utelate eller legge til spesifikke stammer eller justere inokulasjonsvolumene, og dermed generere dropout PURE-systemer eller endre henholdsvis de endelige proteinforholdene.

Protokollen som presenteres her gir en detaljert metode for å lage OnePot PURE-systemet som beskrevet tidligere20, selv om β-mercaptoetanol ble erstattet med tris (2-karboksyetyl)fosfin (TCEP). Videre er to metoder for ribosomrensing beskrevet: tradisjonell tag-fri ribosomrensing ved hjelp av hydrofob interaksjon og sukrosepute, tilpasset fra Shimizu et al.15, og Ni-NTA ribosomrensing basert på Wang et al.18 og Ederth et al.21, men betydelig modifisert. Sistnevnte metode letter videre utarbeidelsen av PURE-systemet og gjør det tilgjengelig for flere laboratorier, da det bare er nødvendig med standard laboratorieutstyr.

Den eksperimentelle protokollen oppsummerer utarbeidelsen av et allsidig PURE cellefritt TX-TL-system for å gi en enkel, justerbar, kostnadseffektiv cellefri plattform, som kan tilberedes ved hjelp av standard laboratorieutstyr innen en uke. I tillegg til å introdusere standard PURE-komposisjon, angir vi hvordan og hvor den kan justeres, med hovedfokus på kritiske trinn i protokollen for å sikre systemets funksjonalitet.

Protocol

MERK: Denne protokollen beskriver klargjøring av cellefritt TX-TL-system fra rekombinante komponenter. For enkelhets skyld er arbeidet delt inn i fem deler. Den første delen beskriver forberedelsestrinn, som bør gjøres før du starter protokollen. Den andre delen beskriver utarbeidelsen av OnePot proteinoppløsningen. Den tredje delen beskriver ribosomrensinger, den fjerde delen beskriver utarbeidelsen av energiløsningen, og den siste delen gir en håndbok for å sette opp en PURE-reaksjon. For enkelhets skyld er protokollene delt inn i dager og oppsummert i daglige tidsplaner i tabell 1. Etter tidsplanen kan hele systemet utarbeides om 1 uke av en person.

1. Forarbeid

  1. Forbered bakteriekulturmedier og medietilskudd som beskrevet i Supplerende tabell 1. Forbered og steriliser materialene som kreves, inkludert pipettespisser, 96 dypbrønnplater.
  2. Sil av preparatet
    1. Transformer uttrykksstammene som er angitt i tabell 2, med de tilsvarende uttrykksvektorene ved hjelp av varmesjokkmetoden.
      1. Tilsett renset plasmid til de kjemisk kompetente bakteriene og inkuber på is i 20-30 min.
      2. Plasser blandingen ved 42 °C i 30 s (varmesjokk) og legg den deretter tilbake på is i 2 minutter.
      3. Pipette 20 μL av bakteriene direkte på agarplater som inneholder ampicillin (AMP) og inkuberer ved 37 °C over natten. Oppbevar platene ved 4 °C i opptil 1 uke.
      4. Inokuler 3 ml LB-medier som inneholder AMP med en enkelt koloni av bakterier fra agarplatene. Inkuber ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min over natten.
      5. Bland 250 μL av kulturen med 250 μL 50% (v / v) glyserol og lagre ved -80 °C.
        MERK: For raskere tilberedning i fremtiden, oppbevar stammene i en 96-brønnsplate som glyserollagre.
    2. Bekreft alle vektortransformasjoner etter koloni PCR og sekvensering. Sekvenser genet, promotorregionen og ribosomets bindingssted.
  3. Test av uttrykk
    1. Inokkuler 300 μL LB-medier som inneholder AMP med rundt 1 μL av de tilberedte glyserollagrene i en 1,3 ml dypbrønnplate. Forsegle platen med en pustende membran og inkuber deretter ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min over natten.
      MERK: Alle uttrykk gjøres separat på dette tidspunktet.
    2. Inokuler 300 μL ferske LB-medier som inneholder AMP med 1 μL av nattkulturene. Inkuber ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min over natten. Etter 2 timer induser cellene med 100 μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og vokse i ytterligere 3 timer.
    3. Bland 10 μL av kulturen med 10 μL 2x Laemmli buffer og varme til 95 °C i 10 minutter. Snurr prøvene i 1 min ved hjelp av en bordsentrifuge og last 10 μL av supernatanten på en PAGE gel. Kjør gelen i Tris/Glycine/SDS buffer ved 200 V i 30 min. Skyll det godt med deionisert vann. Dekk gelen med en Coomassie proteinflekk og inkuber i 1 time. Destain gelen i vann om nødvendig (representative resultater for uttrykkstesten i figur 1).
      MERK: Bruk gradient (4%-15% eller 4%-20%) PAGE gels for å oppnå en god separasjon.
  4. IMAC Sepharose harpiks restaurering og rengjøring
    1. Kolonneforberedelse.
      1. Bland Sepharose harpiks godt ved virveling.
      2. Pipette den nødvendige mengden harpiks inn i en tom gravitasjonsstrømningskolonne.
        MERK: Mengden harpiks som kreves varierer mellom his-ribosomrensing og proteinrensing og er spesifisert i de respektive seksjonene.
      3. Vask harpiksen med 30 ml deionisert vann.
      4. Fortsett med kolonneoppladning som angitt i avsnitt 1.4.4.
        MERK: La alltid all væsken passere gjennom kolonnen før du fortsetter med neste trinn. Pass imidlertid på at kolonnen aldri går tørr. Når du kjører væske gjennom kolonnen, må du sørge for å stoppe strømmen eller fortsette til neste trinn så snart væsken når harpiksen.
    2. Restaurering.
      1. Vask kolonnen med 30 ml deionisert vann.
      2. Påfør 10 ml av en 0,2 M EDTA- og 0,5 M NaCl-løsning.
      3. Tilsett 30 ml av en 0,5 M NaCl-løsning.
      4. Vask kolonnen med 50 ml deionisert vann.
      5. Oppbevars i 20 % (v/v) etanol ved 4 °C, eller fortsett med neste trinn.
    3. Renhold.
      FORSIKTIG: Bruk verneutstyr.
      1. Vask kolonnen med 30 ml 0,5 M NaOH.
      2. Vask kolonnen med 30 ml deionisert vann.
      3. Vask kolonnen med 30 ml 0,1 M eddiksyre.
      4. Vask kolonnen med 30 ml deionisert vann.
      5. Vask kolonnen med 30 ml 70% (v / v) etanol.
      6. Vask kolonnen med 50 ml deionisert vann.
      7. Oppbevars i 20 % (v/v) etanol ved 4 °C, eller fortsett med neste trinn.
    4. Lader på nytt.
      1. Tilsett 10 ml 0,1 M nikkelsulfatoppløsning i kolonnen.
        FORSIKTIG: Nikkelsulfat er giftig. Nikkelsulfatavfall må kastes med forholdsregler som er angitt av leverandøren.
      2. Vask kolonnen med 50 ml deionisert vann.
      3. Oppbevares i 20 % (v/v)) etanol ved 4 °C eller fortsett med kolonnelikevekten.
        MERK: Hvis kolonnen er lagret i etanol mellom trinnene, må du sørge for å fjerne alle spor av etanol ved å vaske kolonnen med vann.

2. OnePot proteinløsningsuttrykk og rensing

MERK: Protokollen består av tre deler delt inn i dager (figur 2). En ideell forberedelsesprosedyre produserer 1,5 ml 13,5 mg/ml OnePot proteinoppløsning, som tilsvarer mer enn tusen 10 μL PURE-reaksjoner. Mengden og den ideelle konsentrasjonen av løsningen vil imidlertid variere fra batch til batch. Erfarne brukere kan utføre flere OnePot PURE-preparater om gangen.

Dag 1:

  1. Forbered bakteriekulturmedier og medietilskudd som beskrevet i Supplerende tabell 1.
  2. Forbered og steriliser de nødvendige materialene, inkludert pipettespisser, to 96 dypbrønnplater og en 1 L forbløffet Erlenmeyer-kolbe.
  3. Klargjør buffere og tillegg som beskrevet i Supplerende tabell 2. Filtrer steriliser alle buffere ved hjelp av flaske toppfiltre (0,45 μm) og oppbevar dem ved 4 °C. Suppler alle bufferne med 1 mM TCEP rett før bruk, med mindre annet er angitt.
  4. Bruk 2 ml sepharoseharpiks til OnePot proteinrensing. Klargjør kolonnen som beskrevet i avsnitt 1.4.
  5. For å forberede startkulturene, kombiner 20 ml LB-medier med 20 μL AMP. I en steril 96, 1,3 ml dyp brønnplate, tilsett 300 μL av mediet i 35 brønner. Inokuler hver av dem med sin respektive stamme, unntatt forlengelsesfaktor termo ustabil (EF-Tu), og forsegle platen med en pustende membran.
    MERK: Inokuler platen ved hjelp av en 96-brønns replikator (se Materialtabell). Brønnvolumet på dypbrønnplaten og volumet av startkulturen er avgjørende. Større medievolumer eller mindre brønnvolumer vil føre til en annen bakteriell tetthet på grunn av lufting inkonsekvenser.
  6. For EF-Tu-kulturen inokulerer du 3 ml LB-medier i et 14 ml kulturrør med en snap cap. En enkelt 3 ml kultur for EF-Tu er tilstrekkelig for en OnePot-uttrykkskultur.
  7. Inkuber ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min over natten.

Dag 2:
MERK: Utfør alle trinnene ved romtemperatur med mindre annet er angitt.

  1. Overfør 500 ml LB-medier og 500 μL AMP til den sterile, forvirrede kolben.
  2. Inokuler OnePot PURE-kulturen med 1675 μL ef-tu-kulturen og 55 μL av hver av kulturene fra dypbrønnplaten (Tabell 2).
    MERK: I løpet av dette trinnet kan den totale proteinsammensetningen justeres ved å justere inokulasjonsforholdene. Pass på at det totale inokulasjonsvolumet forblir konstant ved 3,6 ml.
    VALGFRITT: For å bekrefte at alle stammer har vokst over natten, måler du den optiske tettheten til nattkulturene ved 600 nM (OD600) i en 96-brønnsplate ved hjelp av en plateleser. Bruk en fortynning på 10x for måling av optisk tetthet.
  3. Inkuber kulturen i 2 timer ved 37 °C med en risting på 260 o/min, eller til OD600 i kulturen når 0,2-0,3.
  4. Induser kulturen med 500 μL 0,1 mM IPTG og vokse i ytterligere 3 timer.
  5. Høst cellene ved sentrifugering ved 4 °C og 3220 x g i 10 minutter og oppbevar cellepellet ved -80 °C inntil videre bruk.
    MERK: For å optimalisere timingen, klargjør du energiløsningen som er beskrevet i avsnitt 4 under inkubasjonstidene på dag 2 (tabell 1).

Dag 3:

  1. Mål mengdene buffere som trengs for rensingen som er beskrevet i trinnene nedenfor, og legg TCEP til dem alle som angitt i Supplerende tabell 2. Oppbevar de resterende bufferne uten TCEP ved 4 °C for fremtidige rensinger.
  2. Likevekt den ladede kolonnen (avsnitt 2.4) med 30 ml buffer A. Etter at 25 ml buffer A har passert, lukker du kolonnen fra bunnen. Parallelt fortsetter du med trinn 2.15-2.17.
  3. Tine cellene og bruk en serologisk pipette for å resuspendere cellepellet i 7,5 ml buffer A.
  4. Lyse cellene ved hjelp av en 130-watts sonde soniker (se Tabell over materialer, sondespissdiameter: 6 mm) med følgende parametere: 4 x 20 s puls på, 20 s puls av, 70% amplitude. Hvis sonikeringen er vellykket, blir løsningen mørkere (figur 2).
    MERK: Sørg for å holde cellene på is under sonikering. Plasser sonden dypt nok inn i oppløsningen uten å berøre røret. Hvis en stor mengde skum genereres, vil energioverføringen bli dempet. I så fall, la skummet slå seg ned, senk sonden dypere inn i løsningen, og utvid sonikeringstiden.
  5. Fjern celleavfallet ved sentrifugering ved 21130 x g i 20 minutter ved 4 °C umiddelbart etter sonikering. Hold lysatet på isen.
  6. Legg til supernatanten i kolonnen med likevekt. Lukk kolonnen fra toppen og sørg for at det ikke er noen lekkasje. Inkuber søylen i 3 timer ved 4 °C under rotasjon ved hjelp av en rørrotator.
  7. Elute ubundne komponenter fra kolonnen og vask med 25 ml buffer A.
  8. Vask kolonnen med 25 ml 25 mM imidazolbuffer (23,95 ml buffer A og 1,25 ml buffer B).
  9. Elute proteinene med 5 ml 450 mM imidazolbuffer (0,5 ml buffer A og 4,5 ml buffer B). Hold de eluterte proteinene på is til enhver tid.
  10. Fortynn eluatet med 25 ml HT-buffer, hold blandingen på is. Tilsett 15 ml til et 15 ml sentrifugalfilter og konsentrer deg til et volum på 1,5 ml. Tilsett de resterende 15 ml til filteret med den konsentrerte løsningen og konsentrer deg til 1,5 ml igjen.
  11. Tilsett 10 ml HT-buffer i den konsentrerte prøven og konsentrer deg til 1 ml. Tilsett en lik mengde lagerbuffer B og oppbevar ved -80 °C inntil videre bruk.
    MERK: En runde med utveksling/konsentrasjon tar ca. 60 min å spinne ved 3220 x g ved 4 °C.
  12. Under bufferutvekslingen gjenoppretter du kolonnen som angitt i del 1.4.

Dag 4:

  1. Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-analysen som beskrevet av leverandøren. Konsentrer prøven med en 0,5 ml 3 kDa avskåret sentrifugalfilter til 20 mg/ml.
    MERK: Fortynn proteinoppløsningen 25 ganger eller 50 ganger før konsentrasjonsmålingene for å unngå å oversaturere Bradford-analysen.
  2. For å etablere den ideelle proteinkonsentrasjonen, utfør en uttrykkstest på dette stadiet (avsnitt 5.2) med forskjellige konsentrasjoner av proteinoppløsningen. For å utføre titreringen, hold det totale volumet av løsningen konstant og pipette OnePot proteinoppløsningen, inkludert lagerbuffer B, ved fem forskjellige forhold (Supplerende tabell 7).
  3. Kontroller OnePot PURE-proteinsammensetningen ved hjelp av SDS-PAGE (figur 3A). Fortynn 2,5 μL av prøven med 7,5 μL vann, bland med 10 μL 2x Laemmli buffer og last deretter 5 μL og 2,5 μL av prøvene til gelen. Kjør SDS-PAGE som angitt i avsnitt 1.3.3.
  4. Aliquot proteinoppløsningen i 50 μL aliquots etter å ha bekreftet uttrykket og justert konsentrasjonen. Oppbevar OnePot PURE-proteinløsningen ved -80 °C inntil videre bruk.
    MERK: Hvis en proteinkomponent mistenkes å ikke være til stede, eller er til stede i en lavere konsentrasjon enn forventet i OnePot PURE, utfører du følgende trinn.
  5. Sjekk om nattkulturen til den respektive stammen har vokst i sammenlignbar hastighet med de andre kulturene ved å utføre optiske tetthetsmålinger (OD600) av alle kulturer.
  6. Utfør en ekstra uttrykkstest av den spesifikke stammen for å verifisere uttrykket av det mistenkte proteinet.

3. Ribosomløsning

MERK: To forskjellige ribosomrensingsstrategier er introdusert, en for heksahekshistidin-merket og en for ikke-taggede ribosomer. Den største fordelen med rensingsmetoden ved hjelp av his-rensing på en standard affinitet Ni-NTA gravitasjonsstrømningskolonne er at rensingen er enkel, rask og ikke krever ekstra laboratorieutstyr, for eksempel et FPLC-system og en ultracentrifuge. Proteinproduksjonskapasiteten i OnePot PURE-reaksjoner er imidlertid rundt en tredjedel sammenlignet med tagfrie ribosomer. Velg derfor metoden for ribosomproduksjon basert på om et høyt utbytte er viktig for den gitte applikasjonen.

  1. Hans-tagget ribosom rensing
    MERK: Denne protokollen bruker E. coli RB1-stammen, en gave fra professor Wang (Columbia University, USA)18. Denne stammen har en genomisk innsetting av en heksamhistidin tag på C-endestasjonen av 50S ribosomalt protein (L7/ L12), noe som muliggjør rensing ved hjelp av en Ni-NTA tyngdekraftsstrømningskolonne. Det vanlige utbyttet er rundt 0,5 ml 3,45 μM ribosomer, noe som er tilstrekkelig for mer enn fem hundre 10 μL PURE-reaksjoner.

Dag 1:

  1. Forbered bakteriekulturmedier og medietilskudd som beskrevet i Supplerende tabell 1.
  2. Forbered og steriliser de nødvendige materialene, inkludert pipettespisser, en 5 L Erlenmeyer-kolbe og en 100 ml Erlenmeyer-kolbe.
  3. Klargjør buffere og tillegg som beskrevet i Supplerende tabell 2. Filtrer steriliser alle bufferne ved hjelp av flaske toppfiltre (0,45 μm) og oppbevar dem ved 4 °C.

Dag 2:

  1. Pipette 5 ml harpiks til en kolonne og klargjør kolonnen som angitt i pkt. 1.4.
    MERK: På grunn av det høyere volumet av harpiksen tar restaureringen og rensingen betydelig lengre tid. Bruk en annen kolonne for ribosomrensing for å unngå krysskontaminering og rengjør den grundig før rensingen.
  2. Forbered en nattkultur av E. coli RB1-stammen ved å inokulere 35 ml LB-medier i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe. Inkuber ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min.

Dag 3:
MERK: Utfør alle trinnene ved romtemperatur med mindre annet er angitt.

  1. Tilsett 2 L LB-medier i en 5 L steril kolbe, inokuler med 12 ml av nattkulturen, og inkuber deretter i 3-4 timer ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min.
    MERK: Alternativt kan du utføre bakteriell dyrking i 4 x 500 ml kulturer i 1 L forbløffet kolber.
  2. Pellet cellene ved sentrifugering i 10 min ved 3220 x g og 4 °C. Oppbevars ved -80 °C til videre bruk.

Dag 4:

  1. Likevekt kolonnen som er utarbeidet i trinn 3.1.4. med 30 ml lysisbuffer.
  2. Resuspend pellet i 20 ml lysisbuffer ved hjelp av en serologisk pipette.
  3. Lyse cellene med en 130-watts sonde soniker (se Tabell over materialer, sondespissdiameter: 6 mm) på is med følgende parametere: 11 x 20 s puls på; 20 s puls av, 70% amplitude (se trinn 2.16 for prosedyredetaljer).
  4. Umiddelbart etter sonikering, fjern celleavfallet ved sentrifugering i 20 minutter ved 21130 x g ved 4 °C. Hold lysatet på isen.
  5. Last supernatanten til kolonnene og la den passere gjennom.
  6. Vask kolonnen med følgende blandinger av lysis og elutionbuffere.
    1. Vask 0: Bruk 30 ml lysisbuffer.
    2. Vask 1: Bruk 30 ml 5 mM imidazol (29 ml lysisbuffer, 1 ml elutionbuffer).
    3. Vask 2: Bruk 60 ml 25 mM imidazol (50 ml lysisbuffer, 10 ml elutionbuffer).
    4. Vask 3: Bruk 30 ml 40 mM imidazol (22 ml lysisbuffer, 8 ml elutionbuffer).
    5. Vask 4: Bruk 30 ml 60 mM imidazol (18 ml lysisbuffer, 12 ml elutionbuffer).
  7. Elute ribosomene med 7,5 ml av elutionbufferen. Hold de eluterte proteinene på is til enhver tid.
  8. Tilsett 22 μL ren β-mercaptoetanol til 45 ml ribosolebuffer.
    FORSIKTIG: β-mercaptoetanol er giftig. Ta sikkerhetsforanstaltninger og arbeid i en avtrekkshette.
  9. Tilsett eluatet i et 15 ml sentrifugalfilter og konsentrer deg til 1 ml.
  10. Tilsett 15 ml ribosomebuffer i den konsentrerte prøven og konsentrer igjen til 1 ml.
    MERK: Gjenta forrige trinn to ganger.
  11. Oppbevars ved -80 °C til videre bruk.
    MERK: En runde utveksling/konsentrasjon tar ca. 60 min sentrifugering ved 3220 x g ved 4 °C.
  12. Under bufferutvekslingen gjenoppretter du kolonnen som angitt i del 1.4.

Dag 5:

  1. Bestem ribosomkonsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 260 nM av en prøve fortynnet 1:100 i ribosombuffer. En absorbansverdi på 10 av den fortynnede løsningen tilsvarer 23 μM ufortynnet løsning som tidligere beskrevet16.
  2. Implementer en endelig lagerkonsentrasjon på 3,45 μM. For å justere konsentrasjonen, fortynn ribosomene med ribosomebuffer eller konsentrer dem videre ved sentrifugering ved 14000 x g i et 3 kDa 0,5 ml sentrifugalfilter ved 4 °C.
    MERK: For å oppnå optimalt systemuttrykk, utfør en ribosomekonsentrasjonstitrering (pkt. 5.2, supplerende tabell 7).
  3. Kontroller ribosomesammensetningen ved hjelp av SDS-PAGE (figur 3A) som angitt i avsnitt 1.3.3. Fortynn 2,5 μL av prøven med 7,5 μL vann, bland med 10 μL 2x Laemmli buffer, og last deretter 5 μL og 2,5 μL av prøvene på gelen.

  1. Tag-fri ribosome rensing
    MERK: Tag-fri ribosomrensing utføres ved hjelpavet FPLC-system ( Tabell over materialer ) og er basert på hydrofob interaksjonskromatografi ved hjelp av 2 x 5 ml butylkolonner (Materialtabell). Selv om ribosomer kan renses fra enhver stamme, er det fordelaktig å bruke E. coli A19 (E. coli Genetic Resources ved Yale CGSC) på grunn av RNase I-slettingen22. Utfør rensingen ved 4 °C i enten et kaldt rom eller et kjøleskap. Det vanlige utbyttet er rundt 0,5 ml 10 μM ribosomer, noe som tilsvarer mer enn fem hundre 10 μL PURE-reaksjoner.

Dag 1:

  1. Forbered bakteriekulturmedier og medietilskudd som beskrevet i Supplerende tabell 1.
  2. Forbered og steriliser de nødvendige materialene, inkludert pipettespisser, 5 L Erlenmeyer-kolbe og 100 ml Erlenmeyer-kolbe.
  3. Klargjør buffere og tillegg som beskrevet i Supplerende tabell 2. Filtrer steriliser alle bufferne ved hjelp av flaske toppfiltre (0,45 μm) og oppbevar dem ved 4 °C.

Dag 2:

  1. For å forberede en nattkultur av E. coli A19-stammen, inokulere 35 ml LB-medier i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe. Inkuber ved 37 °C mens du rister ved 260 o/min.

Dag 3:

  1. Overfør 2 L LB-medier til den sterile 5 L-hvelvede kolben, inokuler med 30 ml av nattkulturen, og inkuber deretter i 3-4 timer ved 37 °C mens du rister ved 200 o/min.
  2. Pellet cellene ved sentrifugering ved 4000 x g i 15 min ved 4 °C. Resuspend pellet i 25 ml suspensjon buffer og lagre ved -80 °C til videre bruk.

Dag 4:

  1. Utfør trinn 3.2.8-3.2.12 parallelt med trinn 3.2.13-3.2.19.
  2. Tine og lyse cellene ved hjelp av en 130-watts sonde soniker (se Tabell over materialer og sondespissdiameter: 6 mm) på is med følgende parametere: 12 x 20 s puls på; 20 s puls av, 70% amplitude (se trinn 2.16 prosedyredetaljer).
  3. Fjern celleavfallet umiddelbart ved sentrifugering ved 20000 x g i 20 minutter ved 4 °C.
  4. Aspirer supernatanten og mål volumet. Tilsett et likt volum suspensjonsbuffer (høyt salt) for å justere den endelige konsentrasjonen av ammoniumsulfat til 1,5 M og bland godt.
  5. Fjern bunnfallet ved sentrifugering ved 20000 x g i 20 minutter ved 4 °C.
  6. Filtrer supernatanten ved hjelp av et 0,45 μm polyetersulfonmembransprøytefilter før FPLC-rensing og samle filtratet i en 100 ml glassflaske. Hold supernatanten ved 4 °C til enhver tid.
  7. Sett opp FPLC-systemet for hydrofob interaksjonskromatografirensing ved hjelp av en dobbel Butyl-kolonne (2 x 5 ml) som følger. For dette oppsettet refererer ett kolonnevolum (CV) til et volum på 10 ml.
  8. Tre innløp vil være nødvendig: to som bufferlinjer og én som eksempellinje. På grunn av standardinnstillingene til renseren er det praktisk å velge linje A1 og B1 for henholdsvis buffer C og buffer D og linje A2 som prøvelinje. Bruk en standard strømningshastighet på 4 ml/min, med unntak av pumpevask (10 ml/min) eller med mindre annet er angitt.
    MERK: Siden TCEP er et kostbart reagens, legger du det tilsvarende beløpet til bufferne C og D først etter likevektstrinnet.
  9. Utfør en systempumpevask i 20% ((v/v)) etanol for å rengjøre systemet og fjerne potensiell forurensning fra tidligere rensinger. Still inn en strømningshastighet på 0,2 ml/min manuelt, og monter kolonnen. Stopp flyten.
  10. Utfør en systempumpevask med vann. Vask kolonnen med 3 CV vann.
  11. Likevekt: Plasser inlets A1 og A2 i buffer C og innløp B1 i buffer D uten TCEP. Utfør en pumpevask og likevekt kolonnen med 4 CV buffer C.
  12. Legg til TCEP i bufferne C og D.
  13. Forbered 15 ml rør eller klare runde fraksjonssamlerrør til fraksjonssamleren for å samle 4-5 ml elutionfraksjoner.
  14. Lasting: Plasser innløpet A2 i flasken med den filtrerte prøven. Last inn omtrent 90 % av prøvevolumet på kolonnen. Fortynn prøven med 20 ml TCEP-inneholdende buffer C, og last 10 ml av prøven på kolonnen. Gjenta fortynningstrinnet minst to ganger og last så mye prøve på kolonnen som mulig. Det er viktig å sikre at det ikke suges luft inn i maskinen.
  15. Vask trinn 1: vask med 3 CV buffer C for å fjerne de ubundne komponentene.
  16. Vask trinn 2: vask med 5 CV med 80% buffer C og 20% buffer D.
  17. Elution: elute produktet ved å bruke 50% av buffer C og 50% av buffer D, med et totalt elutionvolum på 5 CV. Samle denne fraksjonen i samlerrørene.
  18. Vasketrinn 3: Elute alle sterkt interagerende forurensninger ved hjelp av 100% buffer D med et totalt volum på 5 CV.
  19. Analyser absorpsjonsspekteret for prøvefraksjonen ved 260 eller 280 nM (figur 4). Den første toppen viser de ikke-absorberte proteinene som ble eluted under lasting og det første vasketrinnet; Den andre toppen viser forurensninger som har blitt unngått i løpet av det andre vasketrinnet. Den tredje toppen overvåker sluttproduktet, og den siste toppen viser de sterkt interagerende forurensningene. Samle alle utvalgsfraksjoner som tilsvarer den tredje toppen for videre behandling. Hold de eluterte proteinene på is til enhver tid.
  20. Legg den gjenvunne fraksjonen forsiktig over på 15 ml av putebufferen i fire ultrasentrifugasjonsrør av polykarbonat. Tilsett maksimalt 15 ml av prøven til 15 ml av putebufferen. Sørg for å balansere vekten av røret godt. Pellet ribosomene ved ultracentrifugation ved 100000 x g ved 4 °C i 16 timer.
    MERK: Pass på at det ikke er sprekker i ultracentrifugation rørene.
  21. Rengjør og tilbakestill kolonnen på følgende måte. En strømningshastighet på 5 ml/min fungerer bra. Plasser alle innløpene i vannet og utfør en pumpevask. Vask kolonnen med 2 CV vann.
    1. Plasser innløpet i en 0,5 M NaOH-løsning, utfør en pumpevask, og vask deretter kolonnen med 3 CV naoh.
    2. Plasser innløpet i vann, utfør en pumpevask, og vask deretter kolonnen i 2 CV vann.
    3. Plasser innløpet til en 0,1 M eddiksyreoppløsning, utfør en pumpevask, og vask deretter kolonnen med 3 CV eddiksyreoppløsning.
    4. Pump vask og vask kolonnen med 2 CV vann.
    5. Plasser alle innløp i 20% ((v/ v)) etanol, utfør et pumpevasktrinn og oppbevar kolonnen i 20% ((v / v)) etanol ved å vaske den med 3 CV av en 20% ((v / v)) etanolløsning.
      MERK: Sørg for at systemet aldri går tørt eller suger inn luft. Bruk aldri buffer direkte på etanol eller etanol på bufferen. Legg alltid til et vannvasktrinn i mellom, da det ellers er fare for at utfellinger tetter kolonnen. Sørg for å legge til nok prøveoppsamlingsrør.

Dag 5:

  1. Kast den supernatante og forsiktig, uten å forstyrre den gjennomsiktige pelletsen, vask hver pellets med 0,5 ml iskald ribosomebuffer. Gjenta dette trinnet to ganger.
  2. Resuspend hver av de klare pellets i 100 μL ribosole buffer på is ved hjelp av en magnetisk rørestang (3 mM diameter, 10 mM lengde) på en magnetisk rører ved hjelp av lavest mulig hastighet. Samle de resuspended ribosomer og vask rørene med ytterligere 50 μL ribosombuffer.
    MERK: Den gjennomskinnelige pelletsen er vanskelig å se. Vask derfor pelletsen forsiktig fra sidene av røret.
  3. Bestem ribosomkonsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 260 nM av prøven fortynnet med et forhold på 1:100 i ribosombuffer. En absorbans på 10 av den fortynnede løsningen tilsvarer 23 μM ufortynnet løsning som tidligere beskrevet16.
  4. Implementer en endelig lagerkonsentrasjon på 10 μM. For å justere konsentrasjonen, fortynn ribosomene med ribosomebuffer eller konsentrer dem videre ved sentrifugering ved 14000 x g i et 3 kDa sentrifugalfilter ved 4 °C.
    MERK: For å oppnå optimalt systemuttrykk, utfør ribosomtitrering (pkt. 5.2, supplerende tabell 7).
  5. Kontroller ribosomesammensetningen med SDS-PAGE (figur 3A) som angitt i avsnitt 1.3.3. Fortynn 2,5 μL av prøven med 7,5 μL vann, bland med 10 μL 2x Laemmli buffer, og last deretter 5 μL og 2,5 μL av prøvene til gelen.

4. Energiløsning

MERK: Sammensetningen for 2,5x energiløsning introdusert her er et eksempel på en løsning som fungerte bra for en standard TX-TL-reaksjon. For å optimalisere timingen, forberede energiløsningen i løpet av dag 2. Utarbeidelsen av aminosyreoppløsningen forklares i detalj, etterfulgt av den endelige forberedelsesprosedyren.

  1. Aminosyreoppløsning
    MERK: Klargjør aminosyreoppløsningen i bulk. Forberedelse av mengden aminosyre lagerløsninger som kreves for et sluttvolum på minst 2000 μL, vil redusere veiefeilen for de ellers svært små mengdene. Den totale konsentrasjonen av aminosyreoppløsningen er begrenset av løseligheten av aminosyrene og de respektive lagerløsningskonsentrasjonene. For standard PURE-systemet, lag en løsning med en endelig konsentrasjon på 3,25 mM. Bruk beregningstabellen for aminosyreoppløsningen (Supplerende tabell 3) som mal. Bruk cystein i saltform for å sikre tilstrekkelig løselighet. Unngå å bruke KOH-baserte aminosyreforberedelsesmetoder. Det er mulig å direkte veie de nøyaktige mengdene aminosyrer inn i den endelige aminosyreoppløsningen uten å forberede lagerløsning for alle aminosyrene. Dette er imidlertid mer utfordrende og mindre presist.
    1. Forbered lagerløsninger for hver aminosyre som beskrevet i supplerende tabell 3, med unntak av Tyrosin.
      MERK: På grunn av de forskjellige løselighetene til aminosyrene i vann, varierer de respektive foreslåtte konsentrasjonene av lagerløsningen.
    2. Minimal masse [mg] gir den omtrentlige minimumsmassen som kreves for å oppnå en tilstrekkelig mengde lagerløsning for målvolumet, som referanse.
      MERK: Den minimale massen beregnes med et overskudd på 10%.
    3. For en enklere forberedelse av løsningene, ikke vei den nøyaktige mengden aminosyre, men i stedet, for den aktuelle massen, juster mengden vann for å oppnå ønsket konsentrasjon. Beregn mengden deionisert vann (Vann for å legge til [μL]) som trengs, basert på den faktiske massen som er fylt ut (lysegule celler) og ønsket konsentrasjon ved hjelp av regnearket i Supplerende tabell 3.
    4. Solubiliser aminosyrebestandsløsningene ved å virvelere til alt bunnfall er oppløst. De enkelte aminosyrebestandsløsningene kan lagres ved -20 °C i flere uker.
      MERK: Noen aminosyrer er vanskelige å oppløse i vann; prosessen kan ta litt tid.
    5. Vei den nøyaktige mengden tyrosin som kreves for å oppnå en endelig konsentrasjon på 3,25 mM direkte inn i røret for aminosyreoppløsningen.
      MERK: Tyrosin er svært vanskelig å oppløse i vann. Legg den til direkte i stedet for å forberede en lagerløsning.
    6. Tilsett de tilsvarende mengdene aminosyre lagerløsninger og vann som angitt i det endelige volumet for å legge til [μL] kolonne (lyseblå celler) og virvel løsningen godt. Oppbevar den ferdige aminosyreoppløsningen ved -80 °C inntil videre bruk.
  2. Forberedelse av energiløsningen
    MERK: Totalt inneholder 2,5x energioppløsning 0,75 mM av hver aminosyre, 29,5 mM magnesiumacetat, 250 mM kaliumglutamat, 5 mM ATP og GTP hver, 2,5 mM CTP, UTP og TCEP, henholdsvis 8,75 mg/ml tRNA fra E. coli MRE 600, 50 mM kreatinfosfat, 0,05 mM folinsyre, 5 mM spermidin og 125 mM HEPES. Førstegangsbrukere klargjør energiløsningen i små grupper på 200 μL. Oppbevar de enkelte løsningene som er tilberedt i henhold til supplerende tabell 4 ved -20 °C eller -80 °C til senere bruk.
    1. Tine alle vandige løsninger som er nevnt i supplerende tabell 5 på is.
    2. I mellomtiden klargjør du lagerløsningene for de resterende komponentene som er oppført i Supplerende tabell 4. Hold alle løsningene på is etter tilberedning.
      MERK: Tilsett 500 μL RNase- og DNase-fritt vann direkte til hetteglasset for å løse opp de lyofiliserte tRNAene. Bland godt ved skånsom virveling; begrense pipettering for å unngå å introdusere RNases.
    3. Tilsett de beregnede volumene (Supplementary Table 5) med lagerløsninger og vann og bland godt ved hjelp av en virvel. Hold løsningen på is til enhver tid.
    4. Mål pH i oppløsningen ved å pipettere 1 μL på en pH-stripe, for å sikre at pH i løsningen er nøytral.
    5. Aliquot energiløsningen ved 50-100 μL per rør på is og oppbevar ved -80 °C til videre bruk. Mens aliquoting, virvel hovedbestanden ofte for å hindre komponentene fra å utfelle.
      MERK: Eventuelt gjennomføre en aktivitetsanalyse av den nylagde energiløsningen mot kommersielle energiløsninger, for eksempel løsning A i PURExpress. Hvis en betydelig lavere ytelse av systemet med energiløsningen observeres, kan optimalisering av ionkonsentrasjonene, spesielt magnesiumioner, ved titrering (5-20 mM) være fordelaktig.

5. OnePot PURE reaksjon

  1. DNA-mal
    MERK: Proteiner kodet nedstrøms for T7-promotoren kan uttrykkes i PURE fra enten lineært eller sirkulært DNA. Ved å generere en lineær DNA-mal ved hjelp av utvidelsen PCR, kan kjedelige kloningstrinn utelates. De lineære malene for denne studien ble generert av PCR som beskrevet nedenfor, ved hjelp av en DNA-polymerase med høy kvalitet (Materialfortegnelser). Primersekvenser, smeltetemperaturer og termosirkuleringsinnstillingene som brukes i denne studien, er angitt i Supplerende tabell 6. Utarbeidelsen av DNA-malen er ikke inkludert i den daglige tidsplanen.
    1. Sett opp en PCR-reaksjon som anbefalt av polymeraseleverandøren.
      MERK: Optimaliserte parametere for en DNA-polymerase med høy gjengivelse (Materialfortegnelser) er gitt i supplerende tabell 6.
    2. Forsterke målgenet (f.eks. eGFP) som en lineær mal fra en plasmid eller et genom ved hjelp av genspesifikke primere (500 nM) (for parametrene, se Supplerende tabell 6).
    3. Forsterkningen genererer korte utvidelser for å gi glødsekvenser for følgende utvidelse PCR-trinn.
    4. Kontroller amplikonen på en agarosegel for riktig størrelse og renhet.
    5. Bruk det forsterkede DNA-et som mal for de påfølgende forlengelsestrinnene. Sett opp en reaksjon på minst 50 μL.
    6. Kjør 10 PCR-forsterkningssykluser med forlengelsesprimerne (2,5 nM). Etter å ha fullført forsterkningssyklusene, legg umiddelbart de endelige primerne (500 nM) til samme reaksjon og kjør 30 sykluser for å forsterke det utvidede PCR-produktet. Finn smeltetemperaturer og primersekvenser i Supplerende tabell 6.
    7. Rens DNA-fragmentene ved hjelp av et DNA-rensesett og elute DNA i nukleasefritt vann i stedet for EDTA som inneholder elutionbuffer.
    8. Kontroller den lineære malen på en agarosegel for riktig størrelse og renhet.
    9. Mål DNA-konsentrasjonen i ng/μL ved hjelp av et UV-Vis spektrofotometer.
  2. Sette opp PURE-reaksjonen
    MERK: Den endelige reaksjonssammensetningen er 1x energiløsning, tagfrie ribosomer eller his-tag ribosomer, OnePot PURE-proteiner og DNA-mal. Reaksjonsvolumforholdet består av 40% energiløsning, 30% protein- og ribosomløsning og 30% DNA og vann. Typiske reaksjonsvolumer varierer mellom 5 μL og 25 μL. Kvantifisere uttrykket av et fluorescerende protein kontinuerlig på en plateleser. Bruk et grønt lys in vitro Oversettelsesmerkingssystem, som inkorporerer fluorescerende merket Lysine rester i nylig syntetiserte proteiner, for å verifisere uttrykket av ikke-fluorescerende proteiner på en SDS-PAGE gel. Et eksempel på en reaksjonsmal er angitt i Supplerende tabell 7 for å bidra til å etablere en PURE cellefri uttrykksreaksjon. Celler i gult indikerer brukerinndataverdier, og celler i oransje indikerer flere reagenser som eventuelt skal legges til reaksjonen. Hold volumforholdene til komponentene presise for å sikre riktig ionbalanse. For eksempel, for å oppnå en høyere proteinkonsentrasjon, øke OnePot proteinløsningskonsentrasjonen; Men ikke øk volumet av proteinoppløsning lagt til reaksjonen.
    1. Fyll ut konsentrasjonen [ng/μL] og lengden [basepar] av DNA i de tilsvarende gule cellene i regnearket. Bruk 2-10 nM DNA for reaksjonen.
    2. Fyll ut ønsket totalreaksjonsvolum i μL.
    3. Fjern de nødvendige reagensene fra fryseren og tine dem på is.
      MERK: Det er mulig å fryse komponentene på nytt uten at funksjonaliteten reduseres. Minimer imidlertid antall fryse-tine sykluser og tidsprøver lagres på is så mye som mulig.
    4. Pipette de beregnede mengdene vann, DNA og energiløsning på den ene siden av PCR-røret eller et hjørne av en brønn på 384-brønnsplaten. Tilsett den nødvendige mengden ekstra reagens på samme side. Minimer antall prøver per eksperiment for å unngå prøvefordampning og eksperimentell starttidsbias.
      MERK: Det er avgjørende å holde energikomponenten fysisk adskilt fra proteinkomponentene for å unngå for tidlig forbruk av energikildene og lavere utbytter.
    5. Pipette de beregnede mengdene protein og ribosomløsning til den andre siden av et PCR-rør eller motsatt hjørne av 384-brønnsplaten.
      MERK: Bruk hovedblandinger når det er mulig for å redusere virkningen av pipetteringsfeil. Etter første testing kan ribosomet og proteinløsningene blandes og lagres som en løsning.
    6. Snurr i en kort periode (30 s) for å slå sammen reaksjonskomponentene. For å unngå fordampning under platelesereksperimenter, tilsett 35 μL flytende voks og forsegle platen med et gjennomsiktig tetningsmiddel (se Materialbord).
    7. Inkuber i minst 3 timer ved 37 °C.
    8. For avlesning på en plateleser, mål fluorescensintensiteten ved ønsket bølgelengde hvert 2.
    9. Utfør følgende trinn for Green Lys-merkede prøver.
    10. Etter det cellefrie uttrykket inkuberer du prøven med 0,16 μg/μL RNase A i 30 minutter ved 37 °C for å fjerne den fluorescerende bakgrunnen til Green Lys-merkingssettet.
      MERK: Bruk RNase A, da andre typer RNases ikke fjerner bakgrunnen tilstrekkelig godt.
    11. Visualiser proteinuttrykket ved å kjøre SDS-PAGE som angitt i avsnitt 1.3.3. Vask den unstained gelen forsiktig i deionisert vann, og bilde den på en fluorescerende imager ved hjelp av en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm.
    12. Deretter flekker gelen ved hjelp av konvensjonelle Coomassie fargingsmetoder. For passende parametere se pkt. 1.3.3.
      MERK: Utfør en titrering av proteinoppløsningen med den anbefalte ribosolekonsentrasjonen og, om nødvendig, titrat ribosomer med den optimale OnePot-proteinkonsentrasjonen etterpå. Bruk det kommersielle PURExpress ΔRibosome-settet som en positiv kontroll. Løsning A, faktorblanding og ribosomeoppløsningen tilsvarer henholdsvis den tilberedte energien, OnePot-proteinløsningen og de rensede ribosomene.

Representative Results

Protokollen ovenfor er utformet for å lette etableringen av PURE cellefritt TX-TL-system i ethvert laboratorium. Protokollen inneholder en detaljert beskrivelse av utarbeidelsen av de tre forskjellige delene av PURE-systemet: OnePot-proteinet, ribosomet og energiløsningen. En detaljert daglig tidsplan, som optimaliserer arbeidsflyten, vises i Tabell 1. Arbeidsflyten er optimalisert for rensing av hans taggede ribosomer, og tidsrammer kan variere noe hvis tag-fri ribosomrensing utføres. Ett preparat gir tilstrekkelig mengde PURE for minst fem hundre 10 μL reaksjoner. Videre er de forberedte løsningene stabile i mer enn et år ved -80 °C og tåler flere fryse-tine sykluser.

Tilstrekkelig overekspressjonsnivå for alle stammer er avgjørende for funksjonaliteten til den endelige proteinløsningen. Figur 1 viser vellykket overekspresjon i alle de 36 individuelle stammene som senere brukes til OnePot-proteinpreparatet. Variasjon i de over-uttrykte proteinenes båndintensiteter skjedde mest sannsynlig på grunn av en skjevhet i lastevolumene på SDS-PAGE gelen. De forventede proteinstørrelsene er oppsummert i tabell 2. GlyRS og PheRS består av to underenheter av ulike molekylvekter; De resterende 34 proteinene består av en enkelt underenhet. Nøkkelen til denne protokollens enkelhet og tidseffektivitet er trinnet for kokulturering og korensing (figur 2). OnePot-proteinløsningen ble utarbeidet ved å øke forholdet mellom EF-Tu-stammen med hensyn til alle de andre uttrykksstammene. Den totale sammensetningen av de endelige proteinene ble analysert av SDS-PAGE (Figur 3A). Fra gelene (baner 2, 3) er det merkbart at EF-Tu (43,3 kDa) er tilstede i en høyere konsentrasjon sammenlignet med de andre proteinene, som forventet. Mens gelen gir en god første indikasjon på proteinuttrykksforhold, er det vanskelig å avgjøre om og på hvilket nivå hvert enkelt protein ble uttrykt. Derfor anbefales det på det sterkeste å bekrefte overekspressjonen i hver stamme før kokulturering, som vist ovenfor.

E. coli ribosomet er en kompleks molekylær maskin som består av over 50 individuelle proteinunderenheter23. Et representativt absorpsjonsspekter ved 260 nm for tag-fri ribosomrensing er vist i figur 4; Den tredje toppen er karakteristisk for vellykket ribosom elution. For begge ribosomrensingsmetodene ble det forventede løpemønsteret på SDS-PAGE gel (figur 3A)18 observert. Vi observerte forurensninger for begge rensingene, om enn i små mengder (<10%). Spesielt var forskjellige forurensninger til stede i tag-free (baner 5, 6) og His-tagget (baner 11, 12) ribosomer på grunn av variasjonen i metoden. For brukerreferanse er SDS-PAGE gels for de kombinerte systemene også inkludert (bane 8, 9 og 14, 15).

Til slutt sammenlignes ytelsen til de forberedte systemene (figur 3) ved hjelp av de forskjellige ribosomvariantene. Tidsforløpene for in vitro eGFP-uttrykk viser at begge PURE-systemene er funksjonelle og produserer fluorescerende eGFP. Imidlertid ga OnePot-proteinløsningen kombinert med his-taggede ribosomer, ved hjelp av ribosomekonsentrasjonen optimalisert ved titrering, bare en tredjedel av uttrykksnivået til den ikke-taggede ribosomversjonen (Figur 3B). Lignende resultater ble observert når tre proteiner av forskjellige størrelser ble uttrykt og merket ved hjelp av Green Lys tRNA in vitro merkingssystem (Figur 3C). Som sett på fluorescerende gel, ble produkter i full lengde vellykket uttrykt i begge systemene; Imidlertid ble bare rundt halvparten av uttrykksnivået oppnådd med His-tag ribosome-systemet. I tillegg til fluorescensmerkingen skiller de forventede båndene for alle tre proteinene seg på en Coomassie-farget gel (Figur 3D). Resultatene viser at det introduserte uttrykkssystemet, som kan utarbeides innen en uke i et laboratorium med standardutstyr, kan brukes til in vitro-uttrykket av proteiner kodet nedstrøms for T7-promotoren fra lineære maler.

Figure 1
Figur 1: Representative resultater for overekspressjonstesten for alle uttrykksstammer i PURE-systemet. PURE-proteintall og -størrelser er oppsummert i tabell 2. Proteintallene 21, 24 og 27 er merket med en stjerne for bedre visualisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: OnePot proteinrensing. Den skjematiske skildringen og tilsvarende fotografier av alle trinn som er involvert i produksjonen av OnePot-proteinløsningen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Ytelsen til de klargjorte systemene ved hjelp av de forskjellige ribosolevariantene. (A) Coomassie blåfargede SDS-PAGE geler av OnePot proteinoppløsning (baner 2, 3), tagfrie ribosomer uten proteinoppløsning (baner 5, 6) og med proteinoppløsning (baner 8, 9), Hans taggede ribosomer uten proteinoppløsning (baner 11, 12) og med proteinløsning (baner 14, 15). To forskjellige konsentrasjoner ble lastet per prøve. (B) Sammenligning av eGFP-uttrykk for hans taggede ribosomer og tagfrie ribosomer. Fluorescensintensiteten til in vitro eGFP-uttrykket overvåkes over tid for en PURE-reaksjon ved hjelp av tagfrie ribosomer (1,8 μM, blå) og hansmerkede ribosomer (0,62 μM, rød). Konsentrasjonene av den lineære malen og OnePot proteinoppløsningen var henholdsvis 4 nM og 2 mg/ml. Paneler (C) og (D) viser SDS-PAGE gel av proteiner syntetisert i OnePot med tag-free (1,8 μM, blå, baner 3, 4, 5) og His-tag ribosomer (0,62 μM, rød, baner 6, 7, 8) merket med et GreenLys in vitro-merkingssett (C) og farget med Coomassie blå (D), henholdsvis. De svarte pilene indikerer de forventede båndene av syntetiserte proteiner: eGFP (26,9 kDa), ArgRS (64,7 kDa), T7 RNAP (98,9 kDa). Den lineære malen og OnePot proteinoppløsningskonsentrasjonene var henholdsvis 4 nM og 1,6 mg/ml. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Absorbansspektra ved 260 nm. Representative resultater av absorbansspektra ved 260 nm under hydrofob interaksjonsrensing av tagfrie ribosomer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: En daglig tidsoptimalisert tidsplan for utarbeidelse av alle OnePot PURE-løsningene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: PURE protein liste Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 1: Reagenser. Tabellen viser konsentrasjoner, volumer og andre spesifikke detaljer om reagensene og komponentene som ble brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: Buffere. Regnearket viser de nøyaktige buffersammensetningene for protein, tagfritt ribosot og His-tag ribosomrensing, samt konsentrasjonene av lagerløsningene som brukes til forberedelsen. I tillegg beregner den de nødvendige mengdene komponenter basert på buffervolumet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 3: Aminosyreberegninger. Regnearket viser aminosyrene og deres anbefalte lagerløsningskonsentrasjoner som kreves for energiløsningen. Den beregner mengden vann som skal tilsettes hver aminosyre basert på den faktiske veide massen, og beregner også volumet av aminosyreoppløsningen som skal legges til den endelige aminosyreblandingen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 4: Lagerløsninger for energiløsningen. Tabellen viser konsentrasjonene og volumene av lagerløsninger som trengs for energiløsningen og indikerer ytterligere detaljer, inkludert lagringsforhold. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 5: Energiløsning. Tabellen viser energiløsningskomponentene og deres anbefalte konsentrasjoner. I tillegg beregner den de nødvendige volumene som skal legges til den endelige løsningen basert på deres lagerløsningskonsentrasjoner og volumet av energiløsningen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 6: PCR. Tabellen viser sekvenser og konsentrasjoner av primerne som brukes for utvidelsen PCR og indikerer smeltetemperaturer og termosycler trinn optimalisert for en høy-troskap DNA polymerase. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 7: PURE reaksjon. Regnearket viser et eksempeloppsett av en PURE-reaksjon. Den viser de brukte konsentrasjonene og volumene til komponentene for en PURE-reaksjon ved hjelp av tagfrie ribosomer eller His-tag ribosomer. Videre beregner den volumforholdene for protein- og ribosomtitreringer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Protokollen som presenteres her beskriver en enkel, tids- og kostnadseffektiv metode for å forberede et allsidig PURE-uttrykkssystem20 basert på standardsammensetningen15. Ved å bruke protokollen sammen med de medfølgende daglige tidsplanene (tabell 1), kan alle komponenter fremstilles om 1 uke og gi beløp som er tilstrekkelige for opptil fem hundre 10 μL PURE-reaksjoner. Siden proteinene som brukes i denne protokollen er overekspressert fra høye kopiplasmider og har lav toksisitet til E. coli, observeres gode uttrykksnivåer for alle nødvendige proteiner (Figur 1). Dette muliggjør enkel justering av stammer, og derfor også proteinsammensetning i kokulturer, bare ved å endre forholdene i inokulasjonsstammene20. Foruten ribosomale proteiner viste konsentrasjonen av EF-Tu å være av grunnleggende betydning for uttrykk gir6. Endringer i konsentrasjonen av de andre proteinkomponentene hadde derimot en relativt lav innvirkning på robustheten til PURE-systemet7,24. Derfor, ved å justere inokulasjonsforholdet til EF-Tu med hensyn til alle de andre komponentene, kan en sammenlignbar sammensetning til standard PURE-sammensetningen oppnås, og et PURE-system med tilsvarende utbytte20 kan oppnås. Ved tilberedning av proteinoppløsningen er det avgjørende å sikre at alle stammer vokser godt og overekspresserer det kodede proteinet etter induksjon (figur 1).

Ribosomfunksjon er nøkkelen for den generelle ytelsen til PURE-systemet24. I denne protokollen demonstreres to forskjellige metoder for å forberede ribosomets løsning, det vil si tag-fri og his-tag ribosome rensing. Den tagfrie ribosomerensingen er basert på hydrofob interaksjonskromatografi etterfulgt av sentrifugering med en sukrosepute, som krever tilgang til et FPLC-rensesystem og en ultracentrifuge15. I motsetning krever metoden som bruker hismerkede ribosomer18 og tyngdekraftens strømningskromatografirensing ikke spesialisert utstyr og kan utføres i de fleste laboratorier. Sistnevnte metode gir derfor fordeler som enkelhet og tilgjengelighet. Vi observerte imidlertid et betydelig lavere synteseutbytte ved bruk av de hismerkede ribosomene i OnePot PURE sammenlignet med den tagfrie varianten (figur 3). Basert på applikasjonstypen kan dette lavere utbyttet være akseptabelt.

Energiløsningen gir de lave molekylvektkomponentene og tRNAene som kreves for å gi drivstoff til in vitro TX-TL-reaksjoner. Denne protokollen gir en oppskrift på en typisk energiløsning, som enkelt kan justeres basert på brukernes behov. Sammen med tRNA, NTP og kreatinfosfat har overflod og konsentrasjon av Mg2+ ioner vært avgjørende for den generelle ytelsen til PURE-systemet8, da de er kritiske kofaktorer for transkripsjon og oversettelse. I noen tilfeller kan titrering av ioner derfor i stor grad forbedre den generelle PURE-ytelsen. DNA-integritet er avgjørende for PURE-ytelsen. Dermed vil sekvens som verifiserer promotorregionen, ribosomets bindingssted og målgen og sikre at en tilstrekkelig DNA-konsentrasjon (<2 nM) vil bidra til å feilsøke problemer som kan oppstå mens du setter opp en PURE-reaksjon.

PURE-systemet er et minimalt TX-TL-system, og spesifikke applikasjoner kan dermed kreve ytterligere justeringer25. Disse kan omfatte å inkorporere forskjellige RNA-polymeraser9,26, anstander13og proteinfaktorer som EF-P eller ArfA8. Selv om uttrykksstammene for disse proteinene kan inkluderes i kokulturene, kan det å legge dem separat til det forberedte systemet gi bedre kontroll over de nødvendige proteinnivåene. Videre er inkludering av vesicles avgjørende for produksjon av membranproteiner10,11. Oksidasjon i stedet for å redusere miljøer og en disulfidbinding isomerase letter riktig disulfidbindingsdannelse, som for eksempel kreves for sekretoriske proteiner12.

Det er viktig å sikre at eventuelle tilleggskomponenter ikke forstyrrer reaksjonen. De viktigste faktorene å være oppmerksom på når du setter opp en reaksjon eller legger til andre komponenter, er oppført nedenfor. Kontroller at verken inkompatible buffere brukes eller at ionkonsentrasjonene forstyrres. Unngå løsninger som inneholder glyserol, høye konsentrasjoner av kalium, magnesium, kalsiumioner, osmolytter, pyrofosfat, antibiotika eller EDTA, så mye som mulig. For eksempel kan det være gunstig å erstatte en elutionbuffer med vann under DNA-rensing, da EDTA er et vanlig tilsetningsstoff i denne bufferen. Å forsyne løsningene med ekstra negativt ladede molekyler som NTP eller dNTP krever justering av magnesiumkonsentrasjonen8, da de negativt ladede molekylene oppfører seg som chelateringsmidler og binder positivt ladede molekyler. En nøytral pH er ideell for reaksjonen. Følgelig bør alle komponenter bufres til tilsvarende pH; Dette er spesielt viktig for svært sure eller grunnleggende molekyler som NTPs. Til slutt er temperatur og volum nøkkelparametere for reaksjonen. For å oppnå et godt utbytte, bør man implementere en temperatur rundt 37 °C, da temperaturer under 34 °C vil redusere utbyttetbetydelig 27.

Det er relevant å merke seg at før man forbereder OnePot PURE, bør man vurdere målapplikasjonen og de tilknyttede kravene, for eksempel volum, renhet, enkel modifikasjon og inkludering eller utelatelse av komponenter. For mange applikasjoner vil systemet være et utmerket valg, men andre kan kreve utbytte, justerbarhet og andre faktorer, som OnePot-systemet ikke kan gi. Uansett vil den introduserte protokollen være gunstig for utarbeidelsen av ethvert hjemmelaget system, da alle kritiske trinn for slik forberedelse er oppsummert her.

En av de viktigste fordelene med OnePot-systemet er kompatibiliteten med det kommersielt tilgjengelige PURExpress-systemet, som gir muligheten til å teste funksjonaliteten og integriteten til alle komponenter separat ved å erstatte hver PURExpress-komponent sekvensielt med sin OnePot-ekvivalent. Fordelene med OnePot PURE-systemet, som tunability og enkel, rask og kostnadseffektiv forberedelse, vil gjøre cellefri TX-TL tilgjengelig for flere laboratorier over hele verden og bidra til å utvide implementeringen av denne kraftige plattformen i cellefri syntetisk biologi.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av European Research Council under EUs Horizon 2020 Research and Innovation Program Grant 723106, swiss National Science Foundation Grant (182019) og EPFL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine/SDS buffer Bio-Rad Laboratories 1610732
15 mL centrifuge tubes VWR International 525-0309
384-well Black Assay Plates Corning 3544
4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels Bio-Rad Laboratories 4561096
50 mL centrifuge tubes VWR International 525-0304
96-Well Polypropylene DeepWell plate Nunc 260252
Acetic acid, 99.8 % Acros 222140010
Äkta purifier GE Healthcare purification of tag free ribosomes
AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa Merck Millipore UFC500324
AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa Merck Millipore UFC900324
Amino acids Sigma-Aldrich LAA21-1KT
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 09718-250G
Ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin Condalab 6801
BenchMark Fluorescent Protein Standard ThermoFisher LC5928
Breathe-Easy sealing membrane Diversified Biotech Z380059-1PAK
Centrifuge tubes polycarbonate Beckman 355631 purification of tag free ribosomes
Chill-out Liquid Wax Bio-Rad Laboratories CHO1411
Creatine phosphate Sigma-Aldrich 27920
DNA Clean & Concentrator-25 (Capped) Zymo ZYM-D4034-200TS
DTT SantaCruz Biotech sc-29089B
Econo-Pac Chromatography Columns Bio-Rad Laboratories 7321010
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich 03609-250G
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes VWR International / Eppendorf 525-0133
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap Falcon 352051
Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass Scilabware 9141173
FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System Promega L5001 optional
Folinic acid Sigma-Aldrich PHR1541
Glycerol Sigma-Aldrich G7757-1L
HEPES Gibco 15630-056
HiTrap Butyl HP Column GE Healthcare 28411005 purification of tag free ribosomes
IMAC Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare 17-0921-07
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
InstantBlue Expedeon ISB1L-1L
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside) Alfa Aesar B21149.03
Laemmli buffer (2x), sample buffer Sigma-Aldrich S3401-1VL
Lysogeny broth (LB) media AppliChem A0954
Magnesium acetate Sigma-Aldrich M0631
Magnesium chloride Honeywell Fluka 63020-1L
Nickel Sulfate Alfa Aesar 15414469
NTP ThermoFisher R0481
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) ThermoFisher F530S
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405-1KG
Potassium glutamate Sigma-Aldrich 49601
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit NEB E6800S
PURExpress Δ Ribosome Kit NEB E3313S
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent Bio-Rad Laboratories 5000205
Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units ThermoFisher 564-0020
RNaseA solution Promega A7973
SealPlate film Excel Scientific Z369659-100EA
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 6203
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid) Sigma-Aldrich 646547-10X1mL
Thickwall Polycarbonate Tube Beckman 355631
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T0699
Tris base ThermoFisher BP152-500
tRNA Roche 10109541001
Ultracentrifuge Optima L-80 Beckman purification of tag free ribosomes
Whatman GD/X syringe filters GE Whatman WHA68722504
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).
  2. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
  3. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  4. Gaut, N. J., Adamala, K. P. Reconstituting natural cell elements in synthetic cells. Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).
  5. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  6. Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. Improved cell-free RNA and protein synthesis system. PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).
  7. Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system. Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).
  8. Li, J., et al. Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system. Translation. 5 (1), Austin, Tex. 1327006 (2017).
  9. de Maddalena, L. L., et al. GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system. ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).
  10. Kuruma, Y., Ueda, T. The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins. Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).
  11. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  12. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), San Diego, Calif. 299-304 (2005).
  13. Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).
  14. Niwa, T., et al. Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system. Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).
  15. Shimizu, Y., Ueda, T. PURE technology. Methods in molecular biology. 607, Clifton, N.J. 11-21 (2010).
  16. Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. Directed evolution of glycopeptides using mRNA display. Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).
  17. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).
  18. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).
  19. Shepherd, T., et al. De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  20. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).
  21. Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).
  22. Gesteland, R. F. Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).
  23. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  24. Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system. Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).
  25. Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes. Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).
  26. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).
  27. Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. A partially self-regenerating synthetic cell. Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).

Tags

Bioengineering Utgave 172 cellefri transkripsjonsoversettelse PURE OnePot ren syntetisk biologi
OnePot PURE cellefritt system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grasemann, L., Lavickova, B.,… More

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE Cell-Free System. J. Vis. Exp. (172), e62625, doi:10.3791/62625 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter