Summary
Questo articolo presenta un protocollo passo-passo per l'impianto diretto della cannula nella cisterna magna dei maiali.
Abstract
Il sistema glinfatico è un sistema di rimozione dei rifiuti nel cervello che si basa sul flusso di liquido cerebrospinale (CSF) negli spazi perivascolari legati agli astrociti ed è stato implicato nella clearance di peptidi neurotossici come l'amiloide-beta. La compromissione della funzione glinfatica aggrava la patologia della malattia in modelli animali di malattie neurodegenerative, come l'Alzheimer, il che evidenzia l'importanza di comprendere questo sistema di clearance. Il sistema glinfatico è spesso studiato da cisterna magna cannulations (CMc), dove i traccianti vengono consegnati direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF). La maggior parte degli studi, tuttavia, sono stati condotti su roditori. Qui, dimostriamo un adattamento della tecnica CMc nei suini. Utilizzando CMc nei suini, il sistema glinfatico può essere studiato ad alta risoluzione ottica nel cervello vorencefalico e così facendo colma il divario di conoscenza tra roditori e glinfatici umani.
Introduction
Il liquido cerebrospinale (CSF) è un ultrafiltrato di sangue che si trova all'interno e intorno al sistema nervoso centrale (SNC)1,2. Oltre a dare galleggiabilità al cervello o assorbire forze meccaniche dannose, il liquido cerebrospinale svolge anche un ruolo fondamentale nella rimozione dei rifiuti metabolici dal SNC3. La rimozione dei rifiuti è facilitata dal sistema glinfatico recentemente caratterizzato che consente il flusso convettivo del liquido cerebrospinale attraverso il parenchima cerebrale attraverso gli spazi perivascolari (PVS), che circondano le arterie penetranti3,4,5. Questo processo ha dimostrato di dipendere dall'acquaporina-4 (AQP4), un canale d'acqua espresso principalmente sul fondo astrocitico, legato al PVS4,6. Lo studio del sistema glinfatico è ottenuto sia mediante imaging in vivo che ex vivo, utilizzando la microscopia ottica avanzata o la risonanza magnetica (MRI), a seguito dell'introduzione di un tracciante fluorescente / radioattivo o di un agente di contrasto nel CSF7,8,9,10,11.
Un modo efficace per introdurre un tracciante nel liquido cerebrospinale senza incorrere in danni al parenchima cerebrale è attraverso la cisterna magna cannulation (CMc)12,13. Una grande maggioranza di tutti gli studi glinfatici, finora sono stati condotti su roditori ed evitati nei mammiferi superiori a causa dell'invasività del CMc unita alla semplicità pratica di lavorare con un piccolo mammifero. Inoltre, i crani sottili dei topi consentono l'imaging in vivo senza la necessità di una finestra cranica e successivamente consentono un'estrazione cerebrale semplice11,14. Esperimenti condotti sull'uomo hanno prodotto preziosi dati macroscopici in vivo sulla funzione glinfatica, ma si sono basati su iniezioni intratecali di traccianti nella colonna lombare distale e, inoltre, utilizzano la risonanza magnetica che non produce una risoluzione sufficiente per catturare la microanatomia del sistema glinfatico7,15,16 . Comprendere l'architettura e l'estensione del sistema glinfatico nei mammiferi superiori è essenziale per la sua traduzione verso l'uomo. Al fine di facilitare la traduzione glinfatica all'uomo, è importante applicare tecniche che vengono eseguite nei roditori ai mammiferi superiori in modo da consentire confronti diretti del sistema glinfatico tra specie di crescente cognizione e complessità cerebrale17. Il cervello dei suini e quello umano sono ginencefalici, in possesso di una neuroarchitettura piegata, mentre i cervelli dei roditori sono lissencefalici, avendo così una differenza sostanziale tra loro. In termini di dimensioni complessive, i cervelli di maiale sono, anche, più paragonabili agli esseri umani, essendo 10-15 volte più piccoli del cervello umano, mentre i cervelli di topo sono 3.000 volte più piccoli18. Comprendendo meglio il sistema glinfatico nei grandi mammiferi, potrebbe essere possibile utilizzare il sistema glinfatico umano per futuri interventi terapeutici in condizioni come ictus, lesioni cerebrali traumatiche e neurodegenerazione. Il CMc diretto nei suini in vivo è un metodo che consente la microscopia ottica ad alta risoluzione del sistema glinfatico in un mammifero superiore. Inoltre, a causa delle dimensioni dei suini utilizzati, è possibile applicare sistemi di monitoraggio simili a quelli utilizzati negli interventi chirurgici umani rendendo possibile documentare e regolare strettamente le funzioni vitali al fine di valutare come queste contribuiscano alla funzione glinfatica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva europea 2010/63/UE e sono state approvate dal comitato etico per la ricerca animale di Malmö-Lund (Dnr 5.8.18-05527/2019) e condotte secondo le linee guida CODEX del Consiglio svedese della ricerca.
1. Preparazione
- Tracciante
- Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucosio, 26 mM NaHCO3; pH 7,4)
- A 500 μL di liquido cerebrospinale artificiale, aggiungere 10 mg di albumina da siero bovino (BSA) coniugato con Alexa Fluor 647 (BSA-647).
- Centrifugare a 5.000 x g per 5 min e utilizzare il surnatante.
- Cannula
- Collegare una siringa da 1 mL alla connessione Luer femmina della linea endovenosa (IV), rubinetto a 3 vie con estensione di 10 cm.
- Attaccare un ago da 18 G all'estremità maschile.
- Aprire il blocco di arresto a 3 vie per consentire la continuità dall'ago alla siringa.
- Sfoderare con cautela l'ago e aspirare circa 300 μL della soluzione salina nella linea IV.
- Rimuovere l'ago dalla soluzione salina e procedere all'introduzione in un po' d'aria per creare una piccola bolla d'aria (5-10 mm) nella linea IV.
- Posizionare l'ago nel tracciante e aspirare tutti i 500 μL del tracciante. La soluzione salina nella linea IV deve essere visibilmente separata da una bolla d'aria.
- Scartare l'ago e chiudere il blocco di arresto a 3 vie.
- Animale
- Sedare un suino mediante iniezione intramuscolare (i.m.) di tiletamina (3,75 mg/kg) e zolazepam (3,75 mg/kg) e dexmedetomidina (37,5 μg/kg). Aspetta che diventi incosciente.
- Preparare una linea endovenosa inserendo una cannula da 20 G nella vena dell'orecchio.
NOTA: Assicurarsi che la cannula sia in vena iniettando 5-10 ml di soluzione salina attraverso la cannula. Se la vena è stata persa, questo sarà evidente da un piccolo edema nel tessuto dell'orecchio. - Intubare il maiale per garantire che la frequenza respiratoria possa essere regolata durante l'intervento chirurgico.
NOTA: Garantire il successo dell'intubazione esercitando una pressione sul torace del maiale e confermare che l'aria forzatamente scaduta sta uscendo dal tubo di intubazione. - Collegare il tubo di intubazione a un ventilatore impostato su una frequenza respiratoria di 14 respiri / min.
- Collegare un pulsossimetro e un bracciale alla coda per monitorare la frequenza cardiaca (HR), la pressione sanguigna (BP) e la saturazione di ossigeno (sats). Inserire un termometro rettale per monitorare la temperatura interna.
- Preparare un sacchetto per flebo di ketamina (5 mg/kg/min), midazolam (0,25 mg/kg/min) e fentanil (2,5 μg/kg/min), in soluzione salina e iniziare a infondere attraverso la vena dell'orecchio a circa 2 gocce/s.
NOTA: Durante l'intervento chirurgico, potrebbe essere necessario aumentare o diminuire la velocità di infusione in base ai parametri vitali dell'animale. - Con il maiale in posizione prona, palpare la parte posteriore della testa e del collo dell'animale per individuare e contrassegnare la cresta occipitale e la colonna vertebrale delle prime vertebre toraciche e la base di ciascun orecchio.
- Disegna una linea retta tra la cresta e le vertebre lungo l'asse longitudinale. Disegna due linee dalla cresta alla base di ciascun orecchio seguendo la base del cranio (Figura 1A).
- Controlla che l'animale sia in un sonno profondo bloccando attentamente la coda e osservando l'assenza di un riflesso della coda.
NOTA: se l'animale è ancora riflessivo, la velocità di infusione dell'anestetico deve essere aumentata in modo incrementale fino a quando l'animale non presenta più un riflesso.
2. Chirurgia
NOTA: Durante tutto l'intervento chirurgico, è necessario avere almeno un assistente per aspirare il sanguinamento leggero e cauterizzare eventuali vasi recisi.
- Usando un bisturi con una lama # 21, fai un'incisione dermica lungo la linea longitudinale fino al muscolo.
- Estendere due incisioni dermiche perpendicolari più avanti lungo le spalle, lunghe 10-15 cm.
- Dalle creste occipitali, fare incisioni dermiche lungo la linea fino alla base di ciascun orecchio.
- Afferrando gli angoli della pelle formati sulla cresta occipitale con una pinza anatomica, separare accuratamente la pelle dal muscolo sottostante facendo scorrere leggermente la lama del bisturi sulla fascia, passando dal rostrale al caudale. Una volta che la pelle è stata resecata dopo ciascuna delle cinque incisioni, parti dei muscoli trapezio dovrebbero essere visibili.
- Fare un'incisione longitudinale con il bisturi, profondo circa 1 cm, dove il trapezio si riunisce sulla linea mediana.
NOTA: Quando si tagliano i muscoli, c'è una maggiore propensione al sanguinamento, quindi il cauterizzatore deve essere pronto. Se una nave più grande viene recisa, una persona dovrebbe comprimerla rapidamente con la garza, mentre l'altra persona usa il cauterizzatore. - Utilizzando una combinazione di pinze chirurgiche dritte e curve, eseguire una dissezione smussata lavorando lungo il taglio longitudinale nei muscoli. Questo separerà le pance del trapezio, così come il muscolo semispinalis capitus biventer sottostante.
- Tagliare tutte le fibre muscolari persistenti con un bisturi e continuare la dissezione smussata fino a quando semispinalis capitus complexus diventa visibile.
- Sever le origini dei muscoli trapezio e semispinalis capitus biventer lungo l'aspetto posteriore del cranio. Separarli con cura longitudinalmente con il bisturi eseguendo una dissezione smussata fino a quando il semispinalis capitus complexus è completamente visibile.
- Ritrarre i muscoli trapezio e semispinalis capitus biventer usando divaricatori auto-tratteninti.
- Dove le pance del semispinalis capitus complexus si uniscono nella linea mediana, fare un'incisione longitudinale con il bisturi profondo circa 1 cm.
NOTA: Essere consapevoli di eventuali ulteriori sanguinamenti qui. Il sanguinamento può essere gestito utilizzando una combinazione di tamponi di cotone e cauterizzazione. - Utilizzando una pinza chirurgica, eseguire una dissezione smussata lavorando lungo il taglio longitudinale tra le pance muscolari fino a quando l'aspetto dorsale dell'atlante (CI) è palpabile.
- Separare le origini dei muscoli semispinalis capitus complexus lungo l'aspetto posteriore del cranio e separarlo longitudinalmente dalle vertebre sottostanti mediante bisturi e dissezione smussata.
- Ritrarre i muscoli semispinalis capitus complexus usando un altro set di riavvolgitori auto-trattenitori.
- Usando un bisturi, rimuovere con cura il tessuto rimanente sovrastante la regione in cui l'atlante incontra la base del cranio.
- Posizionando un braccio sotto il collo dell'animale e un dito nella congiuntura dell'atlante e del cranio, solleva contemporaneamente la testa e fletti il collo mentre palpa con il dito per rivelare la cisterna magna usando l'altra mano.
NOTA: La cisterna magna è riconoscibile quando palpa come una forte struttura elastica con una piccola quantità di rimbalzo quando la pressione viene rilasciata con il dito.
3. Cannulazione e iniezione
NOTA: Anche questo passaggio richiede almeno due persone e viene eseguito con la testa dell'animale sollevata e il collo flesso.
- Assicurarsi che una persona elevi e fletti la testa e il collo dell'animale mentre l'altra palpa per la cisterna magna prendendo nota della sua posizione anatomica.
- Introdurre lentamente e con attenzione una cannula da 22 G attraverso la dura e nella cisterna magna ad angolo obliquo rispetto all'asse longitudinale.
NOTA: Non inserire la cannula troppo in profondità, in quanto ciò potrebbe causare danni al cervello. Sapere fino a che punto inserire la cannula viene con l'esperienza nel capire come ci si sente per la cannula perforare la dura. In sostanza, proprio come la dura è stata forata, la cannula è abbastanza profonda per un'iniezione tracciante di successo. Questa profondità è di circa 3-5 mm, ma differirà in base alle dimensioni o all'età dell'animale. Il successo della cannulazione dovrebbe essere immediatamente evidente attraverso la visualizzazione di un liquido cerebrospinale chiaro e pulsatile che sale sulla cannula. Per il miglior risultato, si raccomanda di praticare diverse cannulazioni in anticipo negli animali eutanasizzati per ottenere la comprensione del piercing durale. - Ritrarre l'ago dalla cannula e posizionare un cappuccio sulla serratura.
- In primo luogo, applicare la supercolla e un acceleratore in cui la cannula entra nel tessuto, seguita dall'applicazione del cemento dentale. Attendere 5 minuti affinché il cemento si indurisca.
- Rimuovere con cura il cappuccio dalla cannula e fissare alla cannula l'estremità maschio del rubinetto della linea IV precedentemente preparato con estensione di 10 cm, con il tracciante.
- Iniettare lentamente il tracciante a mano o utilizzando una micropompa per infusione ad una velocità di 100 μL/min. Rimuovere il rubinetto della linea IV a 3 vie con estensione di 10 cm e sostituirlo con il cappuccio. Il tracciante dovrebbe ora essere visibile pulsante alla base della cannula (Video supplementare 1).
NOTA: Se si inietta a mano, farlo fino a quando il tracciante è ancora visibile nell'albero della cannula, circa 1-2 mm sopra dove il cemento dentale copre l'albero. - Dopo l'iniezione, posizionare sacchi di sabbia sotto il collo per mantenere una certa flessione. La testa può quindi essere rilasciata e l'animale viene lasciato in posizione prona a riposo.
- Rilascia i riavvolgitori auto-trattenitori e posiziona i muscoli come giacevano prima. Riunire la pelle sui muscoli usando morsetti chirurgici per asciugamani.
- Coprire i morsetti per asciugamani e l'incisione con una garza e poi una coperta per limitare la perdita di calore.
- Lasciare circolare il tracciante per il tempo desiderato prima dell'eutanasia dell'animale per via endovenosa. Iniezione di pentobarbital (140 mg/kg). Confermare l'eutanasia dall'assenza di suoni cardiaci dopo l'auscultazione con uno stetoscopio.
4. Estrazione ed elaborazione del cervello
- Utilizzando un bisturi con 20 lame, estendere l'incisione dermica longitudinale dalla cresta occipitale a circa 7 cm sopra il naso.
- Riflettere la pelle sovrastante l'aspetto dorsale del cranio usando il bisturi.
NOTA: Esistono diversi modi per tagliare e rimuovere l'aspetto dorsale del cranio di maiale su base animale per animale. Quello che segue è la procedura che ha funzionato più spesso per questo esperimento. - Usando una sega compatta portatile, fai un taglio coronale nel cranio, circa 3 cm sopra le due grandi vene viste uscire dal cranio. Estendi a due ulteriori tagli verticali dai tagli coronali e altri due tagli ulteriori per riunire i tagli verticali nella linea mediana.
NOTA: Mantenere una presa salda della sega quando si effettuano i tagli ossei del cranio in quanto tenderà a tirarsi via al primo contatto con l'osso o il tessuto, che può portare a gravi lesioni. - Assicurarsi che i tagli del cranio attraversino l'intero spessore dell'osso seguendo con un martello e uno scalpello stretto (10 mm) a ciascuno dei tagli.
- Usando il martello, infine, colpisci uno scalpello largo (25-30 mm) nel taglio coronale. Con una persona che sostiene la testa, assicurati che l'altra persona applichi la leva sullo scalpello per aprire il cranio dorsale.
- Una volta rimosso il frammento del cranio dorsale, sezionare la dura madre sovrastante usando forbici chirurgiche curve.
- Utilizzare una spatola per separare il midollo spinale dal cervelletto all'aspetto rostrale. Quindi procedere a guidare la spatola sotto il cervello dalla parte anteriore, recidendo i bulbi olfattivi, la ghiandola pituitaria e i nervi cranici.
- Posizionare la spatola dietro il cervelletto e applicare una discreta quantità di pressione per rimuovere il cervello dalla cavità cranica, sollevandolo con cura una volta sciolto.
- Fissare immediatamente l'intero cervello mediante immersione tissutale in paraformaldeide al 4% durante la notte.
NOTA: Dopo questo passaggio, è possibile eseguire l'intera immagine cerebrale utilizzando uno stereoscopio (Figura 1E). - Il giorno dopo, prepara fette coronali del cervello usando un coltello da salmone e fissa le fette durante la notte mediante immersione tissutale in paraformaldeide al 4%.
- Infine, posizionare le fette in azide allo 0,01% in PBS per la conservazione a lungo termine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Una volta che il maiale è incosciente, viene palpato e la sua anatomia superficiale è segnata, a partire dalla cresta occipitale (OC) e lavorando verso le vertebre toraciche (TV) e ogni base auricolare (EB). È lungo queste linee che vengono fatte le incisioni dermiche (Figura 1A). I tre strati muscolari trapezio, semispinalis capitus biventer e semispinalis capitus complexus sono resecati e tenuti aperti da due serie di riavvolgitori auto-trattenibili per esporre la cisterna magna (CM) (Figura 1B). La testa viene quindi flessa per aprire lo spazio tra la parte posteriore del cranio e l'atlante e facilitare l'accesso al CM (Figura 1C). Una cannula da 18 G viene inserita con cura 3-5 mm nel CM e fissata in posizione sia da super colla che da cemento dentale (DC). Tracer può quindi essere iniettato a una velocità fissa. Una volta iniettato il tracciante, la linea IV e la siringa vengono sostituite con un cappuccio per cannula (Figura 1C-D). I muscoli vengono quindi rimessi nel luogo e il maiale viene coperto e tenuto caldo per il tempo in cui il tracciante viene fatto circolare. Dopo la circolazione, l'animale viene eutanasia e il cervello viene rapidamente rimosso. È possibile generare immagini macroscopiche cucite della superficie dorsale del cervello, che facilitano nel fornire informazioni dettagliate sui modelli di distribuzione del tracciante sulla superficie cerebrale dorsale attraverso i sulci e le fessure (Figura 1E). Immagini simili possono essere generate dalle superfici ventrali e laterali del cervello dove la distribuzione del tracciante può essere studiata nel lobo temporale (TL) e nella fessura laterale (LF) (Figura 1E). Uno stereoscopio può anche essere utilizzato per produrre immagini a ingrandimento più elevato della superficie cerebrale in cui è possibile vedere il tracciante nel PVS lungo le arterie (Figura 1F-G). Le sezioni macroscopiche del cervello coronale, spesse circa 8 mm, vengono tagliate usando un coltello da salmone e forniscono ulteriori informazioni sulla profondità della penetrazione del tracciante nella fessura interemisferica (IHS), nonché sulla distribuzione del tracciante sottocorticale in strutture come l'ippocampo (HPC) e lo striato (STR) (Figura 1H).
La colorazione immunoistochimica per AQP4 espressa a piedi terminali astrocitici, proteina acida gliale-fibrillare (GFAP) espressa attraverso gli astrociti e actina muscolare liscia (SMA) situata intorno alle arteriole ha mostrato che il tracciante localizzato sia all'interno del PVS che si sposta nel parenchima cerebrale (Figura 1I-M). La colorazione AQP4 e GFAP viene utilizzata per identificare gli astrociti e, più specificamente, i processi del piede astrocitario che formano la superficie esterna del PVS mentre la lectina e il GLUT-1 macchiano le cellule endoteliali che formano la superficie interna del PVS (Figura 1I-L). Effettuando queste macchie per definire i confini del PVS, è possibile quindi identificare il tracciante iniettato di CSF localizzato nello spazio PVS. Ciò supporta l'idea che il liquido cerebrospinale ottenga l'accesso al cervello ginencefalico attraverso un ampio trasporto PVS che facilita quindi l'afflusso glinfatico nel parenchima cerebrale. La colorazione SMA identifica le arterie e le arteriole legandosi alle cellule muscolari lisce presenti nelle pareti arteriose e può essere utilizzata per dimostrare che l'afflusso di PVS si verifica lungo le arterie rispetto alle vene, che costituisce la fisiologia di base della normale funzione glinfatica (Figura 1M).
Figura 1. Cisterna magna cannulation nei suini. (A) Suino preparato prima dell'inizio dell'intervento chirurgico e contrassegnato dove verranno eseguite incisioni dermiche a partire dalla cresta occipitale (OC), quindi posteriore alle vertebre toraciche (TV) e laterale a ciascuna base auricolare (EB). (B) Testa in posizione rilassata con i muscoli trapezius, semispinalis capitus biventer e semispinalis capitus complexus retratti, esponendo così la cisterna magna (CM). (C) Testa flessa manualmente per aumentare l'accesso al CM per la cannulazione e l'iniezione. (D) Immagine ravvicinata di una cannula inserita in CM dopo l'iniezione e fissata in posizione con il cemento dentale (DC). (E) Superfici cerebrali dorsali, ventrali e laterali, rispettivamente, dopo imaging fluorescente con immagini strutturali a luce bianca di accompagnamento. Le aree di interesse visibili su queste superfici includono la fessura interemisferica (IHS), il lobo temporale (TL) e la fessura laterale (LF). (F) Immagine strutturale a luce bianca dell'arteria e delle vene sulla superficie del cervello. (G) Immagine fluorescente di (F) che mostra la distribuzione del tracciante lungo l'arteria superficiale. (H) Le fette macroscopiche delle regioni cerebrali anteriori e posteriori mostrano dispersione e distribuzione del tracciante bidimensionale nelle fessure (LF, IHS) e nelle strutture sottocorticali come lo striato (STR) e l'ippocampo (HPC). (I-J). Immagini confocali che mostrano il tracciante nel PVS, delimitato da cellule endoteliali macchiate di lectina internamente e AQP4 sui processi del piede astrocitario esternamente. (K-L). Immagini confocali che mostrano il tracciante nel PVS, delimitato da cellule endoteliali internamente con processi del piede astrocitario colorati per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) visibile formando un confine esterno. (M) Immagine confocale che mostra il tracciante nel PVS intorno a un'arteriola macchiata per actina muscolare liscia (SMA) con tracciante visibile anche dentro e intorno, che circonda il parenchima cerebrale. CM, cisterna magna; DC, cemento dentale; EB, base auricolare; GFAP, proteina acida fibrillare gliale; HPC, ippocampo; IHS, fessura interemisferica; LF, fessura laterale; OLB, bulbo olfattivo; OC, cresta occipitale; STR, striato; TL, lobo temporale; TV, vertebre toraciche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1: Pulsazione del liquido cerebrospinale dopo l'iniezione del tracciante. Video ravvicinato della cisterna magna dopo l'iniezione del tracciante. Il tracciante blu è visibile nel collo della cannula che pulsa al ritmo del liquido cerebrospinale ed è indicativo di una cannulazione e di un'iniezione riuscite. Clicca qui per scaricare questo video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui, è descritto, un protocollo dettagliato per eseguire la cannulazione diretta della cisterna magna nei suini, compresa la preparazione necessaria, la procedura chirurgica, l'infusione del tracciante e l'estrazione del cervello. Ciò richiede qualcuno con esperienza e certificazione per lavorare con animali di grandi dimensioni. Se eseguito correttamente, ciò consente la consegna delle molecole desiderate con certezza direttamente nel liquido cerebrospinale, dopo di che una serie di diverse modalità avanzate di imaging della luce possono essere utilizzate per esplorare la distribuzione del liquido cerebrospinale e la funzione glinfatica ad alta risoluzione in un grande mammifero.
È importante notare che, sebbene questa sia la stessa procedura della cisterna magna cannulation nei roditori, è leggermente più impegnativa e richiede diverse ore di allenamento. Tale formazione include la manipolazione di grandi mammiferi in condizioni di laboratorio, una comprensione dell'anatomia e del sistema muscolo-scheletrico, in particolare nei suini, e un certo grado di competenza nell'uso di strumenti chirurgici. Una volta soddisfatti questi criteri, è possibile eseguire questa tecnica, che finora ha un tasso di successo del 100% rispetto a un tasso di successo dell'80-90% nei topi. Il punto più critico per eseguire correttamente la procedura è sollevare la testa e flettere il collo mentre si inserisce la cannula e si infonde il tracciante. Sebbene il tracciante sia stato iniettato qui a mano, è stato fatto in modo controllato di 100 μL al minuto. Nei topi vengono tipicamente iniettati 10 μL di tracciante e quando si confrontano direttamente le dimensioni del cervello ciò si tradurrebbe in circa 2 ml in un maiale da 50 kg6,11,18. Pertanto, l'iniezione di 500 μL di tracciante era in realtà un volume conservativo e non avrebbe dovuto produrre perturbances estesi in pressione intracranica (ICP). Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la funzione glinfatica perivascolare non è semplicemente un artefatto di aumenti transitori dell'ICP, ma persiste quando l'ICP viene mantenuto al basale utilizzando un metodo a doppia siringa rafforzando ulteriormente l'idea che questi risultati non riflettano artefatti di ICP19 alterato.
Questa non è l'unica tecnica che può essere utilizzata per eseguire CMc nei suini e, sebbene sia sostanzialmente più invasiva, sembra dare un'infusione tracciante più accurata. Un altro modo per eseguire CMc nei suini è sdraiarli su un fianco nella posizione di reclinazione laterale e andare in cieco con un ago spinale da 150 mm20. Sebbene questo fosse un metodo attraente a causa della sua minima invasività, il potenziale tasso di successo era percepito come inferiore. Poiché la parte posteriore della testa del maiale è piatta e CM si trova molto in profondità (10-12 cm) dalla superficie, l'ago spinale ha una lunga distanza da percorrere prima di penetrare nel CM, limitando così la certezza di una cannulazione riuscita. A parte la grande distanza dal CM, il diametro del CM stesso è solo di circa 10 mm, riducendo ulteriormente la possibilità di successo della cannulazione. Al contrario, utilizzando il metodo CMc diretto, è possibile visualizzare direttamente la cannulazione e quindi sapere con certezza che ha avuto successo e che gli agenti sono stati consegnati al liquido cerebrospinale e non sono fuoriusciti nei tessuti molli circostanti. Garantire il successo della cannulazione è importante per tali esperimenti a causa dell'elevato costo dei suini, della struttura chirurgica e dei traccianti fluorescenti, nonché per ridurre al minimo il numero di suini utilizzati.
I limiti di questo metodo, a parte l'invasività, è che il costo e il tempo scoraggiano molte ripetizioni rispetto ai roditori. Il primo intervento chirurgico effettuato ha richiesto circa 3 ore, ma attualmente viene eseguito in circa 45 minuti. Ciò rappresenta un significativo miglioramento del tempo, tuttavia, per eseguire una cannulazione in un topo, ci vogliono meno di 5 minuti per un ricercatore esperto, il che significa che il tempo effettivo dell'intervento chirurgico al raggiungimento della competenza è ancora 9 volte più lungo rispetto ai topi. Inoltre, il cervello grande significa che i tempi di circolazione del tracciante nel maiale sono più estesi, ad esempio 2-6 ore, mentre nei topi un tempo di circolazione standard è di 30 minuti. A parte l'alto costo del tracciante, necessario in grandi volumi per il maiale, il costo effettivo del maiale stesso così come la sua custodia, gli anestetici e il costo dell'utilizzo di una sala operatoria completa rendono il costo finale di questa procedura per un maiale 15 volte più costoso che in un singolo topo. Un'ulteriore sfida legata al tempo è il tempo impiegato per l'estrazione del cervello dopo la circolazione del tracciante. Rapporti precedenti hanno dimostrato che alcuni movimenti del tracciante attraverso il PVS persistono dopo l'eutanasia21. Ciò rende importante estrarre il cervello, il più rapidamente possibile, per ridurre al minimo eventuali effetti confondenti da questo fenomeno. Mentre l'estrazione del cervello del topo ammonta solo a pochi minuti, le estrazioni del cervello di maiale richiedono circa 15-20 minuti di tempo. Il cervello dovrebbe essere rimosso il più rapidamente possibile per limitare questo effetto, ma con lo spessore e l'architettura del cranio di maiale è difficile ridurre gli attuali tempi di estrazione.
Sebbene la cannulazione diretta renda la procedura abbastanza invasiva, la perdita di sangue complessiva è stata in media di soli 100 ml per intervento chirurgico, il che costituisce una perdita inferiore al 3% del volume totale del sangue. Inoltre, l'animale riceve un'infusione salina continua con gli anestetici e un'ulteriore linea ENDOVENOSa di lattato di Ringers, mitigando il rischio di ipovolemia.
Sono necessari studi futuri per esplorare la traduzione dei driver fisiologici glinfatici identificati nei topi, nonché la funzione glinfatica nei suini svegli o naturalmente addormentati per rimuovere l'impatto degli anestetici22,23. Al fine di studiare lo stato naturale di sonno o veglia, sarà necessario adattare il protocollo attuale in modo tale che il tracciante possa essere erogato con mezzi meno invasivi pur mantenendo un alto tasso di successo. Ciò potrebbe potenzialmente essere ottenuto effettuando iniezioni di CM nell'ambito della fluoroscopia tomografica computerizzata, che è stata precedentemente utilizzata per la puntura lombare nei suini24. Andando avanti, sarebbe di grande interesse combinare questa tecnica con manipolazioni genetiche del canale d'acqua AQP4 per comprendere il suo ruolo nella funzione glinfatica in un grande mammifero. Nell'esplorare l'intera estensione del sistema glinfatico in un grande mammifero, il campo si avvicina alla comprensione della funzione glinfatica negli esseri umani e di come potrebbe essere utilizzata terapeuticamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Knut and Alice Wallenberg Foundations, Hjärnfonden, Wenner Gren Foundations e dalla Crafoord Foundations.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M.
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, Clifton, N.J. (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I.
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D'Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
