Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

5-إيثينيل-2'-Deoxyuridine/فوسفو-هيستون H3 بروتوكول وضع العلامات المزدوجة لتحليل تطور دورة الخلية في الخلايا الجذعية العصبية Drosophila

Published: May 4, 2021 doi: 10.3791/62642
Automatic Translation
1,2, 1
1Cell Biology, University of Bern, 2Department of life sciences and medicine, University of Luxembourg

Summary

تحليل دورة الخلية مع 5-إيثيل-2'-deoxyuridine (EdU) وفوسفو-هيستون H3 (pH3) وضع العلامات هو إجراء متعدد الخطوات التي قد تتطلب التحسين واسعة النطاق. هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف جميع الخطوات لهذا الإجراء بما في ذلك تحليل الصورة وتحديد كميتها لتمييز الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة.

Abstract

في الجسم الحي تحليل تطور دورة الخلية يتم إجراؤها بشكل روتيني في الدراسات على الجينات التي تنظم الانقسام وتكرار الحمض النووي. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) وقد استخدمت للتحقيق في تطور النسخ المتماثلة / S-المرحلة, في حين استخدمت الأجسام المضادة ضد فوسفو-هيستون H3 للاحتفال نواة ميتوتيك والخلايا. ومن شأن الجمع بين كلا التسميتين أن يمكن من تصنيف مراحل G0/G1 (مرحلة الفجوة) و S (النسخ المتماثل) و M (mitotic) وأن يكون بمثابة أداة هامة لتقييم آثار الضربات المسقطة للجينات الميتوتيكية أو المسوخ الخالية على تطور دورة الخلية. ومع ذلك ، فإن الكواشف المستخدمة لوضع علامة على الخلايا الموسومة ب EdU لا تتوافق مع العديد من العلامات الثانوية الفلورية للأجسام المضادة. وهذا يعقد التثقين المناعي، حيث تستخدم الأجسام المضادة الثانوية الأولية والموسومة لوضع علامة على الخلايا الميتوتيكية الإيجابية لhH3. تصف هذه الورقة بروتوكولا تدريجيا لوضع العلامات المزدوجة ل EdU و pH3 في الخلايا الجذعية العصبية يرقات Drosophila ، وهو نظام يستخدم على نطاق واسع لدراسة العوامل الميتوتيكية. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير بروتوكول لتحليل الصورة وتحديد كميتها لتخصيص الخلايا المسماة في 3 فئات متميزة، G0/G1، S، S>G2/M (التقدم من S إلى G2/M)، ومراحل M.

Introduction

وتتألف دورة تقسيم الخلية من مرحلة G1 (مرحلة الفجوة الأولى)، ومرحلة متماثلة/S، ومرحلة G2 (مرحلة الفجوة الثانية)، ومرحلة M (ميتوتيك). يمر عبر هذه المراحل, الخلية يخضع لتغيرات جذرية في النسخ الخلوي, ترجمة, وإعادة تنظيم الآلات الهيكل الخلوي1,2. استجابة للإشارات التنموية والبيئية، قد تتوقف الخلايا مؤقتا عن الانقسام وتصبح هادئة (G0) أو تفرق وتتوقف نهائيا عن تقسيم3. سيناريوهات أخرى، مثل تلف الحمض النووي، قد يسبب التمايز المبكر أو موت الخلايا المبرمج3،4. تتم الاستجابة لمثل هذه الإشارات عن طريق نقاط التفتيش دورة الخلية، والتي تعمل كنظام مراقبة لضمان سلامة العمليات الخلوية الأساسية قبل أن تلتزم الخلية إلى المرحلة التالية من دورة التقسيم5. لذلك، تحتاج الدراسات على الجينات التي تنظم تكرار الحمض النووي ونقاط التفتيش والآلات الميتوتيكية إلى تحليل عيوب تطور دورة الخلية المحتملة التي قد تحدث في الخلايا المتحولة أو عند ضربة قاضية من هذه الجينات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التحليلات لاختبار الصحة العامة للخلايا وكذلك الاستجابات الخلوية للعلاج من المخدرات.

5-برومو-2'-deoxyuridine (BrdU) هو التناظرية التي يتم دمجها في الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل6. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع لتحديد الخلايا في مرحلة S. ومع ذلك ، تخضع الخلايا بعد ذلك لإجراءات تشبع الحمض النووي القاسية للسماح بالكشف عن BrdU من خلال استخدام الأجسام المضادة المضادة ل BrdU6. قد يؤدي هذا العلاج القاسي إلى تلف الأسطح الخلوية ومنع المزيد من توصيف العينة من خلال التخبز المناعي. دمج EdU والكشف اللاحق من قبل النحاس الحفاز، 'انقر رد فعل' مع صغيرة، نفاذية الخلية، الأصباغ azide الموسومة فلوريا يلغي الحاجة إلى إجراءات التشبع قاسية7. ولذلك، برزت هذه الطريقة كبديل عملي أكثر لإدراج BrdU.

وعلاوة على ذلك، وقد وصفت pH3 كعلامة موثوق بها لخلايا المرحلة ميتوتيك / M8. الهستون H3 هو بروتين الهستون الأساسية المرتبطة بالحمض النووي الذي يصبح الفوسفوريلات في جميع أنحاء المرحلة المتأخرة G2 إلى مرحلة M في وقت مبكر ويتم إزالة الفوسفوريلات قرب نهاية anaphase8. يمكن استخدام العديد من الأجسام المضادة التجارية للكشف عن pH3 باستخدام بروتوكولات الاحتواء المناعي القياسية. ولذلك فإن التلطيخ المزدوج ل EdU وpH3 سيمكن من اكتشاف الخلايا في مرحلة S وكذلك في مرحلة M. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا في مرحلة G1 وG2 في وقت مبكر لا وصمة عار إيجابية لأي من علامات.

Drosophila الخلايا الجذعية العصبية أو الخلايا العصبية (NBs) تقدم نموذج الخلايا الجذعية تتميز جيدا حيث تنقسم الخلايا بشكل غير متماثل لإنتاج واحد متطابقة الذاتي تجديد NB وخلية الأم العقدة (GMC), الذي يقدر للتمايز9. بالإضافة إلى ذلك، العديد من الأدوات الوراثية والأجسام المضادة الخاصة NB جعل هذا النظام مناسبة للتلاعب الجيني والتصوير بالخلايا الحية. ونتيجة لذلك، استخدمت العديد من الدراسات NBs لدراسة الجينات التي تنظم الانقسامات غير المتماثلة وتحديد مصير الخلية9. توجد مجموعات متميزة من NBs في الدماغ المركزي (CB) والفص البصري (OL) في الدماغ اليرقات9؛ واستخدمت هيئة بناء الثقة في الدراسة الحالية. هذه اليرقات الإنستار الثالث CB NBs هي خلايا كبيرة مناسبة أيضا لدراسة العوامل التي تنظم تجميع المغزل الميتوتيكي. بروتوكول لتحليل عيوب تطور دورة الخلية سيكون أداة حيوية في مثل هذه الدراسات.

البروتوكولات التي نشرت في وقت سابق تستخدم مجموعات تجارية، مثل Click-iT EdU اليكسا فلور خلية انتشار كيت، والتي توفر العديد من مكونات التفاعل والأصباغ azide الموسومة مع مجموعة متنوعة من الأصباغ اليكسا فلور لدمج EdU والكشف10. ومع ذلك ، فإن الكواشف المزودة بهذه المجموعات غير متوافقة مع بعض العلامات الفلورية التي تستخدم في كثير من الأحيان مع الأجسام المضادة الثانوية. تم اختبار مجموعة الكشف عن EdU هذه (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit المزودة بصبغة أزيد فلور 647-المقترنة) في Drosophila الثالثة NBs اليرقات instar ، وجرت محاولة التلطيخ المشترك مع الأجسام المضادة ضد pH3 وميراندا ، وهي علامة ل NBs. وعلاوة على ذلك، استخدمت اليكسا فلور 568- أو Cy3 الموسومة الأجسام المضادة الثانوية للكشف عن وضع العلامات ميراندا على غشاء البلازما من NBs11. ومع ذلك، لم يلاحظ شدة الإشارة المتوقعة ونمط التلطيخ (النتائج غير المنشورة) مع هذه الأجسام المضادة الثانوية عندما تم إجراء التصبغ المناعي بعد الكشف عن EdU.

بالنسبة لدمج EdU ، يتطلب البروتوكول الذي وصفه Daul وزملاؤه تغذية اليرقات مع متوسط Kankel-White مختلط مع EdU وbroophenol blue (BPB)10. تتغذى اليرقات على EdU و BPB - ارتفعت المواد الغذائية ، والتي يمكن رؤيتها بلونها الأزرق عند الابتلاع في القناة الهضمية اليرقات. على الرغم من أن هذه الطريقة كانت تستخدم لدمج EdU في Mms19 فقدان الوظيفة(Mms19P) يرقات النجوم الثالثة ، إلا أن يرقات Mms19P لم تتغذى على ما يبدو حيث لم يتم اكتشاف أي لون أزرق في الأمعاء اليرقات (نتائج غير منشورة). تظهر يرقات Mms19P تشوهات تنموية شديدة وتعتقل في نهاية المطاف في المرحلة الثالثة من النجوم. قد يؤثر هذا بطريقة أو بأخرى على سلوك التغذية ليرقات النجوم الثالثة ويجعل بروتوكول تغذية EdU غير مناسب لمثل هذه الحالات.

بعد دراسة الأدبيات المتاحة والعمل على نطاق واسع على توحيد الخطوات الأساسية ، تم اقتراح نهج بديل لوضع العلامات المزدوجة EdU/pH3 في Drosophila NBs ، والتي لا تتطلب تغذية EdU إلى اليرقات. استخدمت دراسة سابقة تلطيخ ثنائي EdU/pH3 لتحليل دورة الخلية في NBs ، ولكنها لم تقدم بروتوكولا مفصلا4. وهذا يمثل عقبة لا داعي لها للمختبرات التي تحاول تنفيذ هذه الطريقة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تقييم توافق الكواشف المختلفة مع مجموعة أدوات EdU وإجراء المزيد من التحسين عملية تستغرق وقتا طويلا. تقدم هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة يغطي دمج EdU في أدمغة اليرقات المتشرذم والتبويب المناعي بالأجسام المضادة لpH3 ، يليه المجهر الكونفوج وتحليل الصورة لتخصيص NBs لأربع فئات متميزة: مرحلة G0/G1 ، مرحلة S ، S>G2 / M (التقدم من S إلى G2 / M) ، ومرحلة M. يتم تحديد الخطوات التي تحتاج إلى التحسين والنصائح المقدمة لتحليل الصور لمجموعات البيانات الكبيرة. بالإضافة إلى ذلك، يتم تحليل قراءات EdU/pH3 في NBs البرية من النوع ومقارنة مع MMS19P NBs، والتي تم الإبلاغ عنها مؤخرا لإظهار تأخير دورة الخلية11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكواشف والمخزونات للنقرة عليه EdU المقايسة

ملاحظة: راجع جدول المواد والجدول 1 للحصول على تفاصيل حول المجموعة والكواشف المزودة مع المجموعة.

  1. جلب قوارير إلى درجة حرارة الغرفة قبل إعداد الحلول.
  2. إعداد 10 MM EdU (المكون A) حل الأسهم بإضافة 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO، المكون C). تخلط جيدا وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد حل عمل من اليكسا فلور 647-azide (المكون B) عن طريق إضافة 70μL من DMSO (المكون C). تخلط جيدا وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  4. إعداد حل 1x من فوق iT EdU رد فعل العازلة (العنصر D) عن طريق خلط 4 مل من هذا الحل مع 36 مل من الماء deionized. تخزين الحل المتبقي في 2-6 درجة مئوية.
  5. جعل المخزون 10x (200 ملغ / مل) من فوق- iT EdU المضافة العازلة (المكون F) عن طريق إضافة 2 مل من الماء deionized. تخلط جيدا وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  6. تخزين Hoechst 33342 (المكون G) في 2-6 درجة مئوية. تخزين DMSO (المكون C) في مجفف عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب استخدام قفازات لمعالجة DMSO و Hoechst.

2. تشريح العقول اليرقات نجمة الثالثة ودمج EdU

ملاحظة: وقد وصف بروتوكول لتشريح الدماغ سابقا12. قبل البدء في التشريح، تأكد من إعداد كميات كافية من حلول EdU وPFA وذوبانها كما هو موضح في 2.6 و 3.1.

  1. إعداد 10x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) عن طريق إضافة 25.6 غرامنا 2HPO4.7H2 0،80 ز NaCl، 2 g KCl، و 2 ز KH2PO4 إلى 1 لتر من المياه deionized. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4، وإعداد حل 1x في الماء deionized بعد ذلك.
  2. إضافة شنايدرس تشريح المتوسطة (SM) إلى اثنين من المنخفضات المتتالية من الزجاج (3 أو 9) لوحة بقعة الزجاج الاكتئاب. إضافة 1x برنامج تلفزيوني للاكتئاب على التوالي المقبل.
  3. باستخدام زوج من ملقط، واختيار تجول يرقات نجمة الثالثة ومكان على الأنسجة مبللة مع برنامج تلفزيوني لتنظيف بقايا الطعام يطير. ضع اليرقة في الاكتئاب مع برنامج تلفزيوني ثم في الاكتئاب المتتالي مع SM.
  4. باستخدام زوج من ملقط ناعم ، قم بإزالة3/4 من الجزء السفلي من جسم اليرقة.
    1. أمسك بخطافات الفم اليرقة برفق مع زوج واحد من ملقط ، وأمسك بالقطعة في الطرف الآخر مع الزوج الآخر من ملقط.
    2. بدوره رأس اليرقات من الداخل الى الخارج عن طريق دفع الداخل خطاطيف الفم وتقشير في وقت واحد قبالة الأنسجة في الطرف الآخر.
  5. مراقبة الدماغ اليرقات مع أقراص التصوير المرفقة. إزالة الأنسجة الأخرى المرتبطة الدماغ، ونقل الدماغ إلى الاكتئاب على التوالي المقبل مع SM.
  6. قم بإذابة حل مخزون EDU 10 mM. إعداد حل 100 ميكرومتر عن طريق تخفيف هذا المخزون 10 mM في SM.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من هذا الحل EDU + SM 100 ميكرومتر في الاكتئاب آخر على لوحة Pyrex. احتضان ~ 5-10 تشريح العقول في 100 ميكرولتر من 100 μM EdU + SM حل لمدة 2 ساعة في 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: كما NBs تقسيم مرة واحدة في ~ 2 ساعة، ويهدف هذا البروتوكول لتحليل دورة خلية واحدة كاملة. فقط استخدام العقول سليمة لمزيد من الخطوات. تجاهل الأدمغة التالفة أثناء التشريح.

3. التثبيت و المناعة

  1. إعداد محلول paraformaldehydede (PFA) بنسبة 4٪ في غطاء الدخان.
    1. إضافة 4 غرام من مسحوق بارافورمالدهيد إلى 80 مل من برنامج تلفزيوني 1x في كوب وضعت على ستيرر المغناطيسي والحرارة إلى 60 درجة مئوية. لإذابة PFA، أضف بضع قطرات من 1 N NaOH. تحقق من درجة الحموضة، وضبط إلى 7.0 مع بضع قطرات من 1 M HCl إذا لزم الأمر.
    2. ضبط مستوى الصوت إلى 100 مل مع برنامج تلفزيوني 1x. Aliquot الحل PFA وتخزينها في 2-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر. أضف 0.3٪ من المنظفات غير الأيونية (انظر جدول المواد)إلى محلول PFA لتثبيت فعال للأنسجة الكبيرة مثل دماغ اليرقات.
  2. بعد دمج EdU، نقل الأدمغة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق 0.6 مل التي تحتوي على 4٪ PFA. احتضان في درجة حرارة الغرفة على نوتاتور لمدة 15 دقيقة. اضغط على الأنبوب الموجود على مقاعد البدلاء في المختبر حتى تستقر الأدمغة في أسفل الأنبوب.
  3. إزالة PFA وغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني + 0.3٪ المنظفات غير الأيونية (PBST) في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن كل غسل يدوم لمدة 10 دقائق على الأقل على نوتاتور. بعد غسل الماضي، وإزالة PBST، إضافة حل حجب (PBST + 5٪ ألبوم مصل البقر)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تمييع الأجسام المضادة ميراندا (1:250) والأجسام المضادة لpH3 (1:200) في PBST (كلا الأجسام المضادة في نفس الأنبوب). إزالة المخزن المؤقت حظر وإضافة الحل الأساسي للأجسام المضادة. حضانة بين عشية وضحاها في 2-6 درجة مئوية على نوتاتور.
    ملاحظة: ميراندا هو بروتين غشاء موجود على CB NBs. وهو يعمل على تحديد هذه الخلايا المستديرة الكبيرة في منطقة CB13.
  5. إزالة الحل الأساسي للأجسام المضادة وغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. تأكد من أن كل غسل يدوم لمدة 10 دقائق على نوتاتور في درجة حرارة الغرفة.
  6. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية عن طريق إضافة 1:500 المخفف اليكسا فلور 488 المضادة الأرنب واليكسا فلور 568 المضادة للفئران في PBST. إزالة برنامج تلفزيوني، وإضافة حل الأجسام المضادة الثانوية إلى العقول تشريح. حضانة بين عشية وضحاها في 2-6 درجة مئوية في الظلام، على نوتاتور، ويغسل 3 مرات مع PBST (الخطوة 3.5).

4. الكشف عن وحدة EDU، تلطيخ الحمض النووي، وتصاعد

  1. لإعداد كوكتيل الكشف عن EdU، اخلط المكونات (انظر الجدول 2)في أنبوب سعة 1.5 مل.
  2. بعد غسل الماضي (الخطوة 3.6)، وإزالة PBST، وإضافة كوكتيل الكشف EdU إلى العقول تشريح. احتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة على نوتاتور. غسل 2 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما، في الظلام.
  3. لتلطيخ الحمض النووي، تمييع Hoechst 33342 (المكون G) 1:2،000 في برنامج تلفزيوني لإعداد محلول 5 ميكروغرام / مل.
  4. إزالة PBST بعد غسل الثاني (الخطوة 4.2)، وإضافة 500 ميكرولتر من محلول Hoechst 5 ميكروغرام / مل إلى العقول تشريح. احتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة. إزالة Hoechst، ويغسل مرة واحدة مع PBST لمدة 10 دقيقة.
  5. اضغط على الأنبوب على مقاعد البدلاء المختبر، والسماح للأدمغة يستقر. إزالة برنامج تلفزيوني من الأنبوب، ولكن ترك وراءه فقط 50-100 ميكرولتر.
  6. قطع نهاية طرف ميكروبايت 200 ميكروبايت، ونقل بعناية العقول على شريحة زجاجية نظيفة. إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة من الشريحة عن طريق النشاف مع شرائط ورقة التصفية. يجب الحرص على عدم السماح للتصفية ورقة تلمس العقول.
  7. وضع قطرة من الماء للذوبان، غير الفلورية تصاعد المتوسطة على العقول، وتوجيه العقول بحيث الحبل العصبي البطني يواجه الشريحة، والفص مواجهة صعودا. ترتيب العقول في ملف واحد بحيث يكون من الأسهل لتصوير العقول بشكل متسلسل.
  8. ضع بلطف غطاء على رأس الأدمغة. ضع الشريحة عند 2-6 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يصلب المتوسط المتصاعد عند التخزين بين عشية وضحاها بحيث لا تكون هناك حاجة لختم الغطاء بطلاء الأظافر.

5. التصوير

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول المجهر المسح بالليزر وهدف الغمر الزيت المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. من برنامج الاستحواذ، حدد الهدف 63x.
  2. وضع قطرة من زيت الغمر على غطاء فوق العقول التي شنت فقط لجعله أسهل لتحديد موقع الأنسجة من خلال العدسة.
  3. باستخدام قناة DAPI / Hoechst 33342 ، ابحث عن الدماغ من خلال العدسة ، ثم انتقل إلى وضع الاستحواذ في البرنامج.
  4. قم بإعداد 4 قنوات لتصوير Hoechst 33342 (DNA) وأليكسا فلور 488 (pH3) وأليكسا فلور 568 (ميراندا) وأليكسا فلور 647 (EdU). استخدم أداة مساعد الصبغة، التي تقوم تلقائيا بإعداد ليزر الإثارة ومرشحات الانبعاثات للأصباغ المختارة.
  5. تعيين مجال الرؤية بحيث يشمل فص الدماغ بأكمله. صورة الحجم الكامل لفص الدماغ عن طريق الحصول على z-مداخن متباعدة 0.8 ميكرومتر عن بعضها البعض. تخزين كافة الصور من جلسة تصوير بتنسيق مكتبة *.lif.

6. تحليل الصور

ملاحظة: تصف الخطوات التالية تحليل الصور المكتسبة وكيفية فرز الخلايا إلى مرحلة G0/G1، ومرحلة S، وS>G2/M (التقدم من S إلى G2/M)، ومرحلة M باستخدام برنامج ImageJ.

  1. تحميل فيجي (فيجي هو ImageJ) من URL التالي: https://fiji.sc/. فتح فيجي، ثم اسحب وأسقط ملفات .lif في فيجي.
    ملاحظة: فيجي هو نسخة من ImageJ التي تأتي مثبتة مسبقا مع العديد من الإضافات14. سيؤدي نقل ملفات .lif إلى فيجي إلى فتح المكون الإضافي للتنسيقات الحيوية ، وهو أمر ضروري لمعالجة ملفات .lif. مطلوب أيضا المكونات الإضافية تنسيقات الحيوية لفتح ملفات الصور التي تم إنشاؤها من بعض العلامات التجارية المجهر الأخرى، على سبيل المثال، nd2 الملفات التي تم إنشاؤها من المجهر نيكون. يأتي هذا البرنامج المساعد مثبتة مسبقا مع فيجي.
  2. حدد مستعرض البيانات من علامة التبويب عرض المكدس، واستخدم المكدس الظاهري من علامة التبويب إدارة الذاكرة في المكون الإضافي للتنسيقات الحيوية.
    ملاحظة: ملفات Lif مع z-stacks من 8-10 العقول غالبا ما تكون 300-400 ميغابايت في الحجم. على أجهزة الكمبيوتر ذات ذاكرة الوصول العشوائي منخفضة، فتح عدد قليل من هذه الملفات يمكن أن تستنفد بسرعة ذاكرة الوصول العشوائي المتاحة على ImageJ ومنع أي معالجة الصور الأخرى. المكدس الظاهري هو "للقراءة فقط"، ولا يحتاج إلى ذاكرة وصول عشوائي عالية للمعالجة، وهو خيار مثالي لتحميل مجموعات البيانات الكبيرة على فيجي.
  3. مراقبة الصورة متعددة القنوات المعروضة في ImageJ. تغيير لون القنوات من شريط القوائم باستخدام أداة قنوات | | الصور. مراقبة NBs ميراندا المسمى كخلايا مستديرة كبيرة في منطقة CB.
  4. رسم منطقة الاهتمام (ROI) باستخدام أداة القطع الناقص على كل NB لتجنب عد NB مرتين.
    1. من شريط القائمة ImageJ، حدد تحليل أدوات | | مدير عائد الاستثمار. وضع علامة على كافة NBs في المقطع z الحالي، ثم اضغط t بعد وضع علامة على كل خلية.
  5. مرة واحدة يتم وضع علامة على جميع NBs في المقطع z الحالي، وتغيير القنوات إلى pH3 وEdU، وتحسب يدويا عدد NBs إيجابية EdU، NBs إيجابية الرقم 3، NBs تلطيخ إيجابي لكل من EdU وpH3، وNBs لا تلطيخ لكلا العلامات.
  6. ابحث عن NBs في المقاطع z اللاحقة، واحذف ROIs القديمة، وأضف ROIs جديدة لحساب NBs في مداخن مختلفة.
  7. إعداد جدول بيانات مع الأعمدة التالية: 1. EdU-pH3-: يمثل هذا المقطع الخلايا السالبة المزدوجة الموجودة في مرحلة G0/G1 من دورة الخلية; 2. EdU +: أدرجت الخلايا في هذه الفئة EdU وتخضع لتكرار الحمض النووي (S-المرحلة)؛ 3. EdU + pH3 +: أكملت هذه الخلايا ثنائية الإيجابية مرحلة S وتقدمت إلى مرحلة G2 أو M؛ 4. الرقم 3 +: هذه NBs تخضع للإصابة بالداء المتلازمي.
  8. حساب النسب المئوية من NBs موجودة في جميع الفئات 4 أعلاه لكل فص. قم بإعداد رسم بياني شريطي باستخدام برنامج جدول البيانات الذي يعرض البيانات المجمعة للحصول على نسب مئوية من NBs في كل فئة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدمت ثنائي الفصوص Drosophila الدماغ اليرقات نجمة الثالثة كنظام نموذجيلدراسةالعمليات الخلوية والإنمائية الأساسية 9 . وكان محور الدراسة الحالية لتقديم بروتوكول لتحليل تطور دورة الخلية في EDU- وHH3 المسمى NBs من منطقة CB (الشكل 1). وينقسم البنك المركزي إلى نوعين فرعيين هما النوع الأول والثاني، ويعرضان نمط التقسيم غير المتماثل المميز9. كل نوع I NB شعبة يولد NB، التي هي قادرة على التجديد الذاتي، وآخر GMC التي يقدر للتمايز9. في المقابل، نوع II NBs توليد العبور تضخيم، خلايا السلف العصبية غير ناضجة (INPs) التي تجديد الذاتي وتوليد 2 GMCs9. على الرغم من وجود مجموعة سكانية متميزة من NB في منطقة OL ، إلا أن هذه الدراسة ركزت على البنك المركزي الوطني ، وهي كبيرة ويمكن التعرف عليها بسهولة مع علامات خاصة بال NB.

لهذه الدراسة، تم استخدام ميراندا لتحديد وتحليل CB NBs (الشكل 2). على الرغم من ميراندا البقع أيضا مجموعات الخلايا الأخرى في OL، CB NBs يمكن التعرف عليها مع ميراندا نظرا لحجمها الكبير وموقع CB13. يمكن أيضا استخدام علامات أخرى أكثر تحديدا لتسمية CB NBs ، مثل Deadpan ، وهو عامل نسخ ينظم التجديد الذاتي ل NB. ومع ذلك ، حيث أن كلا من pH3 و EdU علامة الكروماتين ، تم استخدام علامة الغشاء ميراندا لتسهيل تصور وتحليل NBs ملحوظ مع pH3 و EdU. إن دمج وحدة EdU والكشف اللاحق والمزيد من التوصيف عن طريق التضمين المناعي وتحليل الصور هو إجراء معقد. من المهم توحيد كل خطوة لتحديد ظروف التلطيخ والتصوير المثلى. على الرغم من أن بعض التقارير المنشورة تقدم استراتيجيات وضع العلامات EdU/pH3، إلا أن هذه التقارير لا توضح خطوات التحسين وتحليل الصور. يلخص سير العمل الموضح في الشكل 1 الخطوات من دمج EdU حتى تحليل الصورة.

لقد قمنا مؤخرا بتوصيف جين Mms19 ، وهو مطلوب من قبل NBs للتقدم الميتوتيكي الطبيعي11. من خلال تحليلات التصوير بالخلايا الحية ، تبين أن NBs التي تفتقر إلى Mms19 وظيفية تستغرق ضعف مدة NBs البرية لإنهاء الانقسام. وقد انعكس ذلك بوضوح في تحليل EdU/pH3 حيث تبين أن نسبة أعلى بكثير من MMS19P NBs في المرحلة M بالمقارنة مع NBs البرية (الشكل 3A). التعبير عن Mms19::eGFP الانصهار البروتين في الخلفيةP Mms19 وقد تبين لانقاذ عيوب phenotypic11,15. هذا يرتبط بشكل جيد مع نتائج تحليل تطور دورة الخلية حيث تم إنقاذ نسبة الخلايا في المرحلة M إلى مستويات من النوع البري على Mms19::eGFP التعبير في الخلفيةP Mms19 ( الشكل3A، B).

Figure 1
الشكل 1:سير عمل مبسط للوسم المزدوج EdU/pH3. تم تشريح أدمغة يرقات النجوم الثالثة واحتضانها ب 100 ميكرومتر إدو لمدة 2 ساعة. في وقت لاحق، تم إصلاح أنسجة الدماغ مع PFA والمناعة الملطخة بالأجسام المضادة ضد ميراندا وpH3. تم الحصول على صور للأدمغة الملطخة على المجهر confocal ومعالجتها مع ImageJ / فيجي لتخصيص الخلايا لمراحل دورة الخلية المختلفة. الاختصارات: EdU = مع 5-إيثيل-2'-ديوكسيوريدين; pH3 = فوسفو-هيستون H3; PFA = بارافورمالديهايد; SM = شنايدرس تشريح المتوسطة; PBS = المالحة العازلة بالفوسفات؛ PBST = برنامج تلفزيوني + 0.3٪ المنظفات غير الأيونية. BSA = ألبوم مصل البقر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:تخصيص الخلايا إلى G1/G0؛ S; مراحل S>G2/M و M. تتقدم الخلايا خلال مراحل G1 و S و G2 و M لإكمال دورة خلية كاملة. تم وضع علامة CB NBs من أدمغة يرقات النجوم الثالثة الهائمة مع ميراندا (أحمر) ، EdU (رمادي) ، pH3 (أخضر) ، وتم تسمية الحمض النووي مع Hoechst 33342 (أزرق). تم تحليل NBs المسمى في ImageJ وخصصت ل4 مراحل متميزة على أساس ما إذا كانت ملطخة بشكل إيجابي ل (A) لا EdU ولا pH3 (G1/G0)،(B)فقط EdU (S المرحلة)،(C)كل من EdU و pH3 (S>G2/M)، و (D) فقط pH3 (M المرحلة). وترد هنا أمثلة على ال NBs الفردية فقط من العقول البرية من نوع. أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر. المختصرات: CB = الدماغ المركزي. NBs = الخلايا العصبية; EdU = مع 5-إيثيل-2'-ديوكسيوريدين; pH3 = فوسفو-هيستون H3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تأثير MMS19P على توزيع مرحلة دورة خلية NB. (أ)عند تحليل النوع البري (ث؛++) NBs، تم العثور على ~ 25٪ NBs لتكون في مرحلة M. ومع ذلك، ارتفعت هذه النسبة في MMS19P NBs إلى ما يقرب من 40٪. Mms19::eGFP التعبير في الخلفيةP Mms19 ومن المعروف لانقاذ الأنماط الظاهرية Mms19P، وكانت نسبة M المرحلة NBs في هذه الخلفية مماثلة لنوع البرية. (ب)تمت مقارنة النسب المئوية ل NBs في 4 فئات مختلفة مطابقة لمراحل دورة الخلية G1/G0 و S و S>G2/M و M عبر النوع البري؛ Mms19P, وMms19::eGFP, Mms19P الأنماط الجينية. وتختلف نسبة مراحل المرحلة M وG1/G0 اختلافا كبيرا في ال NBs P Mms19 بالمقارنة مع NBs البرية. في المقابل، فإن توزيع دورة الخلية من NBs في Mms19::eGFP، أدمغة Mms19P مماثلة لتلك الموجودة في النوع البري. تم حساب الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار كروسكال واليس وأعمدة متعددة مقارنة باستخدام اختبار دان بعد الاختبار؛ (P<0.001). وقد تم تعديل هذا الرقم من 11. الاختصارات: NBs = الخلايا العصبية؛ eGFP = بروتين فلوري أخضر محسن؛ WT = البرية من نوع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكاشف المبلغ/الحجم
EdU (المكون أ) 5 ملغ
اليكسا فلور 647 – أزيد (العنصر ب) قارورة واحدة
ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO، المكون C) 4 مل
انقر فوق iT EdU رد فعل المخزن المؤقت (العنصر D) 4 مل (حل 10x)
كبريتات النحاس (CuSO4، المكون E) 100 متر متر؛ قارورة واحدة
إضافة المخزن المؤقت ل Click-iT EdU (المكون F) 400 ملغ
هويشست 33342 (المكون G) 10 ملغم/مل في الماء، 35 ميكرولتر

الجدول 1: مكونات مجموعة أدوات EdU. المكونات المقدمة مع انقر iT EdU اليكسا فلور خلية انتشار كيت والمبالغ / وحدات التخزين ذات الصلة. اختصار: EdU = مع 5-إيثيل-2'-ديوكسيوريدين.

مكونات التفاعل وحدة التخزين (مل)
1x فوق iT رد فعل المخزن المؤقت (أعدت في الخطوة 1.4) 430
CuSO4 (المكون E) 20
اليكسا فلور 647 – أزيد (العنصر B, أعدت في الخطوة 1.3) 1.2
رد فعل المضافة العازلة (المكون F، أعدت في الخطوة 1.5) 50
إجمالي حجم الصوت ~ 500

الجدول 2: إعداد كوكتيل الكشف عن EdU. تم إعداد كوكتيل الكشف عن EdU عن طريق خلط الأحجام المشار إليها من مكونات المجموعة (تم إعدادها في القسم 2). اختصار: EdU = مع 5-إيثيل-2'-ديوكسيوريدين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إدراج EdU ورد الفعل اللاحق "انقر فوق" مع azide نفاذية الخلية يقدم مزايا عملية لهذه التقنية على طريقة BrdU المستخدمة في وقت سابق7. ومع ذلك ، يتم تحفيز رد الفعل هذا من قبل أيونات Cu(I) ، وقد تكون العديد من الأصباغ غير مستقرة في وجود هذا المحفز النحاسي ، كما ينصح بوضوح مصنع مجموعة Click-it EdU. عندما تم إجراء تجارب التثبيط المناعي بعد تنفيذ خطوة الكشف عن EdU ، لم يتم ملاحظة كثافة الإشارة المتوقعة مع صبغات القناة الحمراء ، أليكسا فلور 568 و Cy3. ومع ذلك ، عمل البروتوكول عندما تم الانتهاء من ردود الفعل المناعية قبل خطوة الكشف عن EdU. باستخدام هذا البروتوكول، تم استخدام أربع قنوات لتصور Hoechst، pH3، ميراندا، وEdU.

كانت الخطوة المثلى الأخرى في هذا البروتوكول هي امتصاص EdU عن طريق تشريح الأدمغة بدلا من تغذية طعام الذبابة ارتفعت EdU إلى اليرقات. كما دورة الخلية NB Drosophila الكامل يستمر لحوالي 2-2.5 ح16, امتصاص EdU من قبل العقول لمدة 2.5 ساعة كما هو الحال في هذا البروتوكول, تمكن من تتبع دورة خلية واحدة كاملة من NBs. الخلايا التي لا وصمة عار بشكل إيجابي إما لEdU أو pH3 هي الخلايا يستريح. في حالة وجود يرقة نجمية ثالثة تنقسم فيها NBs بنشاط ، من المرجح أن تكون هذه الخلايا المستريحة في مرحلة G1 من دورة الخلية. ومع ذلك ، من الجنينية المتأخرة إلى المراحل النجمية الثانية المبكرة ، تصبح NBs هادئةمؤقتا 17. في هذه المراحل التنموية المبكرة، من المرجح أن يمثل التلطيخ السلبي المزدوج مرحلة G0/quiescent.

يجب أن تلطخ NBs التي تخضع لتكرار الحمض النووي بشكل إيجابي ل EdU ، في حين أن الخلايا التي تقدمت من مرحلة S (دمج EdU) إلى مرحلة G2 أو M المتأخرة يجب أن تلطخ بشكل إيجابي لكل من EdU و pH3. ومع ذلك، فإن توصيف مرحلة G2 سيكون صعبا مع هذا البروتوكول لأن خلايا G2 المبكرة لا تلطخ بشكل إيجابي ل EdU أو pH3. ومع ذلك، فإن الخلايا التي أدرجت EdU وتقدمت إلى أوائل G2 سوف تلطخ أيضا بشكل إيجابي لEdU ويمكن أن تعقد تحليل مرحلة G2. العديد من الأدوية التي تمنع تكرار الحمض النووي تسبب توقف دورة الخلية في المرحلة S18,19,20. يمكن أن يكون هذا البروتوكول أداة مريحة لتحليل وتحديد تأثير العلاجات الدوائية مثل الخلايا المحظورة في مرحلة S لن تتقدم إلى المرحلة M وسيتم تقليل جزء من EdU ، خلايا pH3 ثنائية الإيجابية أو حتى غائبة في هذه الحالة.

في دراسة نشرت مؤخرا، قمنا بتقييم تأثير الجين Mms19 على تطور ميتوتيك في NBs11. من خلال التصوير بالخلايا الحية ، أظهرنا تأخيرا كبيرا في MMS19P NBs في تطور المرحلة M. في حين البرية من نوع NBs إكمال المرحلة M في ~ 10 دقيقة، استغرق Mms19P NBs حوالي ضعف الوقت لإنهاء المرحلةM-11. وبناء على ذلك، عكس هذا البروتوكول المزدوج للتسمية EdU/pH3 أيضا تأخيرا متقزما حيث لاحظنا ما يقرب من 1.5 ضعف عدد NBs الذي يلطخ بشكل إيجابي لpH3 في أدمغة Mms19P بالمقارنة مع الأدمغة البرية. وبالتالي فإن البيانات المستقاة من بروتوكول EdU هذا قابلة للمقارنة مع نتائج التصوير المباشر للخلايا الحية. على هذا النحو المباشر ، والنهج الحية الخلية تستغرق وقتا طويلا وتحتاج إلى التحسين واسعة النطاق ، ويمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء فحص أولي سريع من هذه المسوخ دورة الخلية لفهم العيوب في مراحل محددة. وبمجرد تحديد مرحلة من الاهتمام، يمكن بعد ذلك متابعة ذلك من خلال عمليات فحص مرئية مباشرة للخلايا.

يمكن أن تختلف مدة مراحل دورة الخلية بشكل كبير بين أنواع الخلايا المختلفة ومراحل النمو. على سبيل المثال، في تطوير الأجنة Drosophila، يؤدي خفض تنظيم kinases ميتوتيك في مدة طويلة من المرحلة S، بينما في الخلايا مقدر للتمايز، مثل النمس (موستيلا putorius furo) السلف العصبية الدماغ، ومدة المرحلة S قصيرة بشكل ملحوظ21،22. وبالتالي ينبغي تحسين وقت وضع العلامات على نبض EdU اعتمادا على طول مراحل S و G في نوع الخلية المحدد. كما تعتمد مدة نبض EdU على الأهداف التجريبية، على سبيل المثال، النبض القصير يكفي لقياس جزء الخلايا الموجودة حاليا في مرحلة S، في حين أن النبض الأطول يمكن من تحليل تطور الخلايا خلال مرحلة S.

التحسين واسعة النطاق من نبض EdU قد تسمح أيضا تقدير المرحلة S، كما ثبت بأناقة بيريرا وزملاؤه23. أظهر هؤلاء الباحثون طريقة جديدة قائمة على قياس التدفق الخلوي حيث تم تسمية خلايا HCT116 بالنبض مع EdU لفترات زمنية إضافية. أثبت المؤلفون أنه يتم الحصول على الحد الأقصى لكثافة الفلورسنت من EdU عندما يتطابق وقت النبض مع طول المرحلة S23. وعلاوة على ذلك، مكن تحليل التقدم الزمني للخلايا المسماة EdU أيضا من تحديد كمي لمهتي G1 و G2/M. على الرغم من أن البروتوكول الحالي لEdU/pH3 المزدوج التسمية تمكن من تحليل عيوب المرحلة S و M، فإنه ليس من الممكن لقياس المدة الدقيقة للمراحل مع هذا البروتوكول. البروتوكول الذي وصفه بيريرا وزملاؤه يمكن أن يكون بديلا مناسبا للمقاايسات التي تتطلب تحديد أطوال مرحلة دورة الخلية. قد يؤدي تكييف هذا البروتوكول مع وضع علامة pH3 إضافية أيضا إلى حساسية أعلى في الكشف عن خلايا المرحلة M.

وبصرف النظر عن نهج EdU/pH3، تم استخدام طريقة مؤشر دورة الخلية القائمة على اليورانيوم(FUCCI) لدراسة تطور دورة الخلية في خلايا الثدييات وكذلك في أنسجة دروسوفيلا24،25. يستخدم هذا النظام اثنين من البروتينات الموسومة الفلورية، geminin و Cdt1، والتي تحتوي على زخارف لكل مكان محدد وتدهور بروتيسومال من قبل APC / C وSCFSkp2، على التوالي. كما APC / C نشطة فقط من نهاية الانقسام من خلال G1 وSCFSkp2 نشطة في مراحل S و G2، وتدهور دورة الخلية الخاصة مرحلة من geminin الموسومة فلوريا وCdt1 تمكن من تحديد دورة الخلية المرحلة24. طريقة معدلة قليلا 'يطير فوتشي' لأنسجة دروسوفيلا يعتمد، بدلا من ذلك، على الفلورسنت الموسومة سيكلين B و E2F1، والتي تتحلل من قبل APC / C (أثناء الانقسام) وCRL4Cdt2 (خلال بداية المرحلة S)، على التوالي25. دراسة سابقة تميز التمايز المبكر من NBs يرقات دروسوفيلا ردا على aneuploidy تحليل عيوب دورة الخلية من قبل كل من Fly-FUCCI وEdU/pH3 طرق4. Aneuploidy يحفز التمايز المبكر من NBs، وبالتالي، جزء كبير من NBs الخروج من دورة الخلية.

وقد انعكس ذلك بدقة في كل من Fly-FUCCI وEdU/pH3 البيانات4. ولذلك فإن البيانات التي يتم الحصول عليها من طريقة EdU/pH3 قابلة للمقارنة أيضا مع أساليب تتبع دورة الخلية الأخرى مثل Fly-FUCCI. Fly-FUCCI هي أداة قوية ، وجميع مخزونات الذبابة مع علامات الفلورسنت المدفوعة في كل مكان أو علامات تنصهر في المروجين خاصة بالأنسجة متوفرة من مراكز الأسهم. ومع ذلك ، فإن استخدام هذه البنى لتحليل عيوب دورة الخلية في المسوخ الفارغة أو مع ضربة قاضية siRNA ينطوي على إعادة التركيب الجيني لإنشاء مخزون ذبابة يحمل عناصر FUCCI ، أو محركات خاصة بالأنسجة ، أو طفرة محددة ، أو سيرنا ذات أهمية. ومن شأن هذه العملية أن تؤخر التجربة الفعلية لعدة أسابيع، في حين يمكن بسهولة تطبيق طريقة EdU/pH3 على خطوط الطيران ذات الخلفية الخالية الوراثية. بدلا من ذلك، بالنسبة للضربات القاضية siRNA، يمكن استخدام تقاطع خطوة واحدة بين مخزون السائق ومخزون سيرنا لتحليل EdU/pH3.

أحد عيوب هذا النهج هو خط أنابيب التصوير وتحليل الصور ، والذي ينطوي على التحديد الكمي اليدوي لعدد كبير من الخلايا من عدة عينات من الدماغ. في الآونة الأخيرة ، تم تقديم نهج قياس التدفق الخلوي كبديل عالي الإنتاجية لإجراء فحص تقليدي قائم على المجهر لتحليل دورة الخلية26. التحليل السريع لآلاف الخلايا في نفس الوقت مع هذا النهج مفيد، والقدرة على الكشف عن علامات متعددة تمكن من تحديد كمية أنواع الخلايا المحددة. على الرغم من أن هذا البروتوكول قابل للاستخدام بسهولة مع خطوط الخلايا المستزرعة ، إلا أنه قد يكون من الصعب تطبيقه على عينات الأنسجة الكبيرة مثل دماغ يرقات Drosophila. ومع ذلك ، تم نشر بعض البروتوكولات التي تصف تفكك أنسجة الدماغ وتحليل NBs اليرقات المعزولة عن طريق قياس التدفق الخلوي27،28. وقد تتيح نهج ابتكارية أخرى في هذا الاتجاه فرصا جديدة لتحليل دورة الخلايا عالية الإنتاجية في أنسجة دروسوفيلا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وقد أعلن صاحبا البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل بتمويل من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (منحة المشروع 31003A_173188؛ www.snf.ch) وجامعة برن (www.unibe.ch) إلى بكالوريوس العلوم. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات، والتحليل، وقرار نشر المخطوطة، أو إعدادها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) Bloomington stock center #15477 P-element insertion in the third exon of Mms19
 +; Mms19::eGFP, Mms19p Generated in house eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118 Bloomington stock center #3605 wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies Dilution
Rat anti-Miranda Abcam Ab197788 1/250
Rabbit anti-pH3 Cell Signaling 9701 1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3 Jackson Immuno 112-165-167 1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 Invitrogen A11077 1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A27034 1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium Polysciences Inc 18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 Thermo Fischer Scientific C10340
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fischer Scientific 21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V Merck 10735078001
Triton X-100 Fischer Scientific 9002-93-1 non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej) https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X) Leica microsystems
PRISM Graph pad software Version 5
Microsoft Excel Microsoft office 2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
  2. Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
  3. Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
  4. Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
  5. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  6. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  7. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  8. Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
  9. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  10. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
  11. Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
  12. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
  13. Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
  16. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
  17. Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
  18. Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
  19. Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
  20. Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
  21. Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
  22. Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
  23. Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
  24. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  25. Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
  26. Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
  27. Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
  28. Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).

Tags

علم الأحياء، العدد 171،
5-إيثينيل-2'-Deoxyuridine/فوسفو-هيستون H3 بروتوكول وضع العلامات المزدوجة لتحليل تطور دورة الخلية في الخلايا الجذعية <em>العصبية Drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chippalkatti, R., Suter, B.… More

Chippalkatti, R., Suter, B. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62642, doi:10.3791/62642 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter