Summary
Nous décrivons ici l’établissement et l’application d’une ligne de rapporteur de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (appelée αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous) pour l’évaluation de la reprogrammation cardiaque. Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) isolés de la souche de souris sont convertis en cardiomyocytes induits (iMC), ce qui permet une évaluation pratique et efficace de l’efficacité de la reprogrammation et de la maturation fonctionnelle des iMC via un flux de calcium (Ca2+).
Abstract
La reprogrammation cardiaque est devenue une thérapie potentiellement prometteuse pour réparer un cœur endommagé. En introduisant plusieurs facteurs de transcription, y compris Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), les fibroblastes peuvent être reprogrammés en cardiomyocytes induits (iCM). Ces iMC, lorsqu’ils sont générés in situ dans un cœur infarctus, s’intègrent électriquement et mécaniquement au myocarde environnant, entraînant une réduction de la taille des cicatrices et une amélioration de la fonction cardiaque. En raison de l’efficacité, de la pureté et de la qualité relativement faibles de la reprogrammation des iMC, la caractérisation des iMC reste un défi. Les méthodes actuellement utilisées dans ce domaine, y compris la cytométrie en flux, l’immunocytochimie et la qPCR, se concentrent principalement sur l’expression des gènes et des protéines spécifiques au cœur, mais pas sur la maturation fonctionnelle des iCM. Déclenchée par des potentiels d’action, l’ouverture de canaux calciques voltage-dépendants dans les cardiomyocytes entraîne un afflux rapide de calcium dans la cellule. Par conséquent, quantifier le taux d’afflux de calcium est une méthode prometteuse pour évaluer la fonction cardiomyocytaire. Ici, le protocole introduit une méthode pour évaluer la fonction iCM par flux de calcium (Ca2+). Une souche de souris αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a été établie en croisant des souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (appelée Myh6-Cre ci-dessous) avec des souris Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (appelées Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous). Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) de souris néonatales P0-P2 ont été isolés et cultivés in vitro, et une construction polycistronique de MGT a été introduite dans les NCF, ce qui a conduit à leur reprogrammation en iCM. Étant donné que seuls les iCM reprogrammés avec succès exprimeront le rapporteur GCaMP3, la maturation fonctionnelle des iCM peut être évaluée visuellement par flux Ca2+ avec microscopie à fluorescence. Par rapport aux NCF non reprogrammés, les NCF-iCM ont montré un flux transitoire de calcium significatif et une contraction spontanée, similaires aux CM. Ce protocole décrit en détail l’établissement de la souche de souris, l’isolement et la sélection des cœurs de souris néonatales, l’isolement NCF, la production de rétrovirus pour la reprogrammation cardiaque, l’induction iCM, l’évaluation du flux iCM Ca2+ à l’aide de notre ligne de rapporteurs, ainsi que l’analyse statistique et la présentation des données connexes. On s’attend à ce que les méthodes décrites ici fournissent une plate-forme précieuse pour évaluer la maturation fonctionnelle des iCM pour les études de reprogrammation cardiaque.
Introduction
L’infarctus du myocarde (IM) est une maladie grave dans le monde entier. Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans le monde et représentent environ 18,6 millions de décès en 20191,2. La mortalité totale des MCV a diminué au cours du dernier demi-siècle. Cependant, cette tendance a été ralentie, voire inversée, dans certains pays sous-développés1, ce qui nécessite des traitements plus efficaces des MCV. En tant que l’une des manifestations mortelles des MCV, l’IM représente environ la moitié de tous les décès attribués aux MCV aux États-Unis2. Au cours de l’ischémie, avec le blocage des artères coronaires et un apport limité en nutriments et en oxygène, le myocarde subit de graves changements métaboliques, altère la fonction systolique des cardiomyocytes (CM) et entraîne la mort de cm3. De nombreuses approches dans la recherche cardiovasculaire ont été explorées pour réparer les lésions cardiaques et restaurer la fonction du cœur blessé4. La reprogrammation cardiaque directe est apparue comme une stratégie prometteuse pour réparer le cœur endommagé et restaurer sa fonction5,6. En introduisant Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), les fibroblastes peuvent être reprogrammés en iCM in vitro et in vivo, et ces iCM peuvent réduire la zone cicatricielle et améliorer la fonction cardiaque7,8.
Bien que la reprogrammation cardiaque soit une stratégie prometteuse pour le traitement de l’IM, il reste un certain nombre de défis. Tout d’abord, l’efficacité, la pureté et la qualité de la reprogrammation ne sont pas toujours aussi élevées que prévu. L’incitation MGT ne peut atteindre que 8,4 % (cTnT+) ou 24,7 % (αMHC-GFP+) du total des FC à reprogrammer en iCM in vitro7, ou jusqu’à 35 % in vivo8, ce qui limite son application. Même avec plus de facteurs induits dans le système, tels que Hand29 ou Akt1 / PKB10, l’efficacité de la reprogrammation est encore à peine satisfaisante pour être utilisée en milieu clinique. Ainsi, d’autres études axées sur l’amélioration de l’efficacité de la reprogrammation sont nécessaires dans ce domaine. Deuxièmement, les caractéristiques d’intégrité électrique et de contraction des iCM sont importantes pour l’amélioration efficace de la fonction cardiaque, mais elles sont difficiles à évaluer. Actuellement, les méthodes d’évaluation largement utilisées dans le domaine, y compris la cytométrie en flux, l’immunocytochimie et la qPCR de l’expression de certains gènes clés des MC, sont toutes axées sur la similitude des iCM et des MC, mais ne sont pas directement liées aux caractéristiques fonctionnelles des iCM. En outre, ces méthodes ont des procédures relativement compliquées et prennent beaucoup de temps. Alors que les études de reprogrammation impliquent généralement un dépistage des facteurs de reprogrammation potentiels qui favorisent la maturation des iCM11, la reprogrammation cardiaque nécessite une méthode rapide et pratique basée sur la fonction iCM.
Les CM ouvrent les canaux ioniques calcium voltage-dépendants sur la cytomembrane au cours de chaque cycle de contraction, ce qui conduit à un afflux transitoire d’ions calcium (Ca2+) du liquide intercellulaire vers le cytoplasme pour participer à la contraction du myofilament. Un tel cycle d’afflux et d’outflux de Ca2+ est le trait fondamental de la contraction myocardique et constitue la fonction normale des CM12. Ainsi, une méthode qui détecte l’afflux de Ca2+ pourrait être un moyen potentiel de mesurer la fonction des CM et des cellules de type CM, y compris les iCM. De plus, pour les iCM, une telle méthode offre un autre moyen d’évaluer l’efficacité de la reprogrammation.
Des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI) ont été développés et largement utilisés pour indiquer les activités cellulaires, en particulier les potentiels d’action. Généralement, les GECI se composent d’un domaine de liaison Ca2+ tel que la calmoduline, et d’un domaine fluorescent tel que GFP, et GCaMP3 est un domaine avec une affinité et une intensité de fluorescence élevées. Le domaine de fluorescence de GCaMP3 sera activé lorsque la concentration locale de calcium est modifiée13. Dans cet article, une souche de souris qui exprime spécifiquement un rapporteur GCaMP3 dans les cellules Myh6+ est décrite. En introduisant le MGT dans les NCF isolés des nouveau-nés de cette souche, la reprogrammation peut être surveillée par fluorescence, que les iCM reprogrammés avec succès présenteront. Une telle souche de souris et une telle méthode fourniront une plate-forme précieuse pour étudier la reprogrammation cardiaque.
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Protocol
Toutes les procédures et pratiques expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan. Toutes les procédures et pratiques expérimentales impliquant la culture cellulaire doivent être effectuées BSL2 Biological Safety Cabinet dans des conditions stériles. Pour les procédures et les pratiques impliquant des virus, la ligne directrice sur l’élimination appropriée des cellules transfectées, des embouts de pipette et des tubes afin d’éviter le risque de dangers pour l’environnement et la santé a été suivie.
1. Établissement d’une souche de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (appelée Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) (Figure 1)
- Préparez respectivement la souche de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (009074 de laboratoire Jackson, appelée Myh6-Cre) et Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Souche de souris Hze/J (014538 de laboratoire Jackson, appelée Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3).
- Reproduisez chaque souche jusqu’à 8 semaines pour obtenir des souris adultes Myh6-Cre et Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, respectivement.
- Croisez les souris adultes Myh6-Cre et Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
REMARQUE: Configurez Myh6-Cre mâle / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 femelle ou vice versa. Il n’y a pas de différence significative entre leurs descendants. En règle générale, les souris femelles donneront naissance à 8 à 10 petits 19 à 21 jours après le croisement.
2. Isolement et sélection des cœurs de souris néonatales Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
- Obtenez des chiots P0-P2. Assurez-vous que 8 à 10 petits sont présents pour isoler 10 millions de NCF avec ce protocole.
- Anesthésie profonde des chiots par hypothermie. Placez les chiots dans un gant en latex et immergez-les jusqu’au cou dans de la glace pilée et de l’eau (2 °C - 3 °C).
- Désinfectez brièvement les chiots avec de l’éthanol à 75%.
- Sacrifiez les chiots par décapitation avec des ciseaux stériles.
- Faites une incision horizontale près du cœur, pressez le cœur, puis isolez-le en le séparant à la racine de l’aorte avec des ciseaux.
- Observez le cœur battre sous un microscope à fluorescence. Assurez-vous que les cœurs avec le génotype Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 montrent un flux de Ca2+ indiqué par GCaMP3 avec des battements cardiaques. Les autres génotypes ne montrent pas de fluorescence (Figure 2, Vidéo 1 et Vidéo 2).
3. Isolement des fibroblastes cardiaques néonatals (NCF)
REMARQUE: Pour cette partie, le protocole du Lab14 du Dr Li Qian a été adopté avec des optimisations mineures lorsqu’elles sont applicables à cette étude.
- Après avoir isolé les cœurs αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, coupez-les en quatre morceaux qui sont faiblement connectés. Lavez-les dans du DPBS glacé dans une plaque de 6 cm à fond plusieurs fois pour limiter la pollution des cellules sanguines dans les cellules isolées.
- Transférer les cœurs dans un tube conique de 15 mL.
- Digérer les cœurs avec 8 mL de trypsine-EDTA chaude à 0,25 % à 37 °C pendant 10 min.
- Jeter le surnageant de trypsine et ajouter 5 mL de collagénase chaude de type II (0,5 mg/mL) dans HBSS.
- Bien tourbillonner le mélange et incuber à 37 °C pendant 5 min.
- Après l’incubation, vortexez abondamment et laissez le tissu non digéré se déposer par gravité.
- Recueillir le surnageant dans un tube conique de 15 mL avec un milieu de fibroblaste froid (FB) de 5 mL (IMDM avec 20% FBS et 1% de pénicilline / streptomycine).
- Répétez les étapes 3.4-3.7 pour le tissu non digéré 4-5 fois.
- Rassemblez tous les surnageants et filtrez-les avec une passoire de 40 μm.
- Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans 10 mL de tampon de tri cellulaire activé magnétiquement (tampon MACS; 1x PBS avec 2 mM EDTA et 0,5% BSA).
- Déterminez le nombre de cellules viables en colorant le bleu trypan.
- Prélever 10 μL de cellules de 10 mL de suspension cellulaire à l’étape 3.11.
- Mélanger avec 10 μL de solution de bleu de trypan à 0,4% et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter le mélange à un hémocytomètre et déterminer le nombre de cellules viables. Les cellules mortes sont colorées en bleu, tandis que les cellules viables ne sont pas colorées.
- Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 °C et éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules avec 10 μL de microbilles thy1,2 dans 90 μL de tampon MACS réfrigéré pour moins de 10 millions de cellules viables. Ajoutez plus de perles proportionnellement s’il y a plus de 10 millions de cellules viables. Bien pipeter le mélange et incuber à 4 °C pendant 30-60 min.
- Ajouter 10 mL de tampon MACS et bien mélanger.
- Centrifuger à 200 x g pendant 5 min, jeter le surnageant.
- Répétez les étapes 3.15 à 3.16 une fois.
- Remettre en suspension les cellules et les billes avec 2 mL de tampon MACS.
- Installez un séparateur MACS dans le capot. Insérez une colonne LS dans le séparateur et équilibrez la colonne avec 3 mL de tampon MACS.
- Lorsque la colonne LS est équilibrée, passez les cellules à travers la colonne.
- Lavez la colonne LS avec 2 mL de tampon MACS trois fois.
- Retirez la colonne du séparateur, éluez-la avec 2 mL de tampon MACS trois fois, puis collectez l’élution dans un tube de 50 mL.
- Centrifuger à 200 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu FB.
- Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Diluer les cellules avec des milieux FB et ensemencer les cellules dans des plats ou des assiettes comme vous le souhaitez. Assurez-vous que la densité d’ensemencement cellulaire est d’environ 2-2,5 x 104 cellules / cm2 (optimisez la densité en fonction d’expériences individuelles). Assurez-vous que les fibroblastes attachés ont une forme ovale à ronde le deuxième jour après l’ensemencement (Figure 3).
4. Production d’un vecteur MGT polycistronique codant pour rétrovirus pour la reprogrammation cardiaque
- Maintenir Plat-E avec des milieux de culture Plat-E (DMEM complété par 10 % de FBS, 1 μg/mL de puromycine et 10 μg/mL de blasticidine) à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Le jour 1, divisez Plat-E en une plaque de 6 puits à environ 4-5 x 105 cellules / densité de puits.
- Le jour 2, Plat-E atteint généralement 80% de confluence. Transfectez les cellules avec les procédures suivantes. Ajustez le volume et la quantité de chaque élément présent ici en fonction de chaque puits dans une plaque de 6 puits.
- Diluer 2 μg de vecteur plasmidique d’expression rétrovirique polycistronique pMX-puro-MGT (Addgene 111809) à 500 ng/μL avec un tampon TE.
- Préparer le mélange de transfection en mélangeant 10 μL de lipofectamine avec 150 μL de milieu sérique réduit. Pipeter soigneusement pour bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. Veillez à éviter les bulles lors du pipetage.
- Pendant ce temps, préparez un mélange de plasmides en mélangeant le plasmide avec 150 μL de milieu sérique réduit. Pipeter soigneusement pour bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. Veillez à éviter les bulles lors du pipetage.
- Mélanger soigneusement les deux mélanges et incuber à température ambiante pendant 5 min. La solution peut sembler trouble.
- Ajouter le mélange goutte à goutte aux cellules à transfecter.
- Incuber les cellules à 37 °C pendant la nuit.
- Le jour 3, remplacez le milieu par un milieu de culture cellulaire complet frais dépourvu de puromycine et de blasticidine.
- Le jour 4, 48 h après la transfection, prélever le surnageant qui contient le rétrovirus et le stocker à 4 °C.
- Le jour 5, 72 h après la transfection, prélever le surnageant qui contient le rétrovirus.
- Filtrer à la fois le surnageant de 48 h et de 72 h avec un filtre de 0,45 μm, précipiter pendant la nuit à 4 °C en ajoutant 1/5 volume de solution de poly (éthylène glycol) (PEG) à 40 % pour obtenir une concentration finale de 8 % de PEG.
- Centrifuger à 4 000 x g pendant 30 min pour précipiter le virus.
REMARQUE: Le virus PEG8000 forme de petites précipitations blanches. - Remettre le virus en suspension avec un milieu iCM contenant 8 μg/mL de polybrene comme vous le souhaitez. Utilisez le rétrovirus immédiatement.
5. Reprogrammation des NCF en iCM avec une infection à rétrovirus codant pour MGT
- Cultiver ou passer des NCF avant l’infection virale.
REMARQUE: Habituellement, NCF peut être passé deux fois. - Le jour 0, ensemencez le NCF à la densité d’environ 1-2 x 104 cellules/cm2 en milieu FB.
- Le jour 1, remplacez le milieu de culture par un milieu contenant un virus pour chaque puits comme vous le souhaitez. Utilisez le virus d’un puits Plat-E dans une plaque de 6 puits pour infecter deux puits dans une plaque de 24 puits. Titrer le virus pour déterminer la concentration optimale du virus.
REMARQUE: Des virus contenant d’autres facteurs de reprogrammation d’intérêt pourraient être introduits avec le rétrovirus MGT. - Incuber à 37 °C pendant la nuit.
- Le jour 2, 24 heures après l’infection virale, remplacez le milieu contenant le virus par un milieu iCM ordinaire.
- Pour surveiller l’expression de GCaMP3, plaquez-la sous un microscope à fluorescence inversée. Sous 10x au canal GFP, observez la fluorescence basale légère GCaMP3 d’une partie des cellules dès le jour 5.
- Remplacez le support tous les 2-3 jours pendant la reprogrammation. Si nécessaire, effectuer une sélection positive pour les cellules infectées par le rétrovirus MGT en ajoutant 2 μg/mL de puromycine au milieu de culture pendant 3 jours et en le maintenant à 1 μg/mL.
REMARQUE : Introduire des produits chimiques d’intérêt (p. ex., IGF-1, MM589, A83-01 et PTC-209, appelés IMAP comme nous l’avons signalé précédemment15) ainsi qu’un changement moyen. - Après 14 jours d’infection, remplacez le milieu par un milieu B27 pour induire davantage la maturation de l’iCM.
6. Évaluation de l’efficacité de la maturation fonctionnelle et de la reprogrammation de l’iCM par flux Ca2+
REMARQUE: Ajouter 1 μM d’isoprotérénol aux cellules à évaluer avant l’évaluation, si nécessaire.
- Évaluez le flux de Ca2+ avec un microscope à fluorescence inversée à température ambiante.
- Dans le canal GFP, observez les cellules GCaMP3+ sous objectif 10x. Assurez-vous qu’il montre des battements de cellules spontanés dans le canal de champ lumineux.
- Sélectionnez au hasard trois champs sous 20x et enregistrez le flux Ca2+ des iMC pendant 3 min pour chaque champ.
REMARQUE: Ici, le flux Ca2+ a été synchronisé avec le battement spontané des cellules (Figure 4, Figure 5 et Vidéo 3, Vidéo 4, Vidéo 5, Vidéo 6, Vidéo 7, Vidéo 8). - Quantifiez manuellement les cellules avec un flux de Ca2 +.
7. Analyse statistique et présentation des données
- Analysez les différences entre les groupes à sens unique de l’analyse de variance (ANOVA) et effectuez les tests de comparaison multiples de Student-Newman-Keuls.
NOTE: Les résultats sont en moyenne ± S.E avec p < 0,05 considéré comme statistiquement significatif. Chaque expérience a été réalisée au moins trois fois.
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Representative Results
Le flux de travail expérimental pour générer la souche de souris Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 et la structure génique des souris transgéniques sont illustrés à la figure 1. Pendant que la souche de souris est établie, le cœur des chiots a été isolé et observé sous un microscope à fluorescence inverse pour confirmer le génotype. Les cœurs avec un génotype correct montrent un flux de Ca2+ synchronisé avec les battements, visualisé comme fluorescence GCaMP3, alors qu’aucune fluorescence n’a été observée dans les cœurs témoins (Figure 2, Vidéo 1 et Vidéo 2). Les NCF isolés se fixeront au puits dans les 2 heures et présenteront une forme ovale à ronde 1 jour après l’ensemencement (Figure 3). La maturité fonctionnelle et l’efficacité de reprogrammation des iCM ont été évaluées par flux Ca2+ 14 jours après l’introduction du MGT. Les cellules reprogrammées peuvent être évaluées au microscope à fluorescence pour mesurer le flux de Ca2+. Les cellules GCaMP3+ pourraient être trouvées dans les groupes IMAP et MGT, tandis que le groupe IMAP montre significativement plus de cellules GCaMP3+ et de cellules avec des modèles d’oscillation Ca2+ plus proches des CM normaux (Vidéos 3-8). Comme le montre la figure 4A, une cellule représentative du groupe IMAP avec oscillation Ca2+ montrera le changement de fluorescence GCaMP3 entre le maximum (panneau central) et le minimum (panneau droit), et l’oscillation Ca2+ de ces cellules est périodiquement modifiée (figure 4B). Après l’introduction de l’IMAP, le nombre de grappes battantes était significativement plus élevé que celui du groupe témoin, car le nombre de cellules GCaMP3+ avec flux de Ca2+ par champ de haute puissance (HPF, lentille d’objectif 20x) a augmenté dans le groupe traité par IMAP -medium (Figure 5).
Figure 1 : génération de la souche de souris Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3. Illustration de la génération de souches de souris Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 et de la structure génique des souris transgéniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Flux de Ca2+ du cœur battant. La fluorescence GCaMP3 a été synchronisée avec les battements cardiaques dans les cœurs Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 (panneau supérieur), tandis qu’aucune fluorescence n’a été observée dans les cœurs témoins (panneau inférieur). Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : NCF isolés fixés à une plaque de 6 puits. (A) NCF sous champ de faible puissance (LPF, objectif 10x, barre d’échelle = 100 μm). (B) NCF sous champ de puissance élevé (objectif 20x, barre d’échelle = 50 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Flux Ca2+ de cellules reprogrammées. (A) NCF traités IMAP reprogrammés en iMC sous canal GFP à champ de puissance élevé (objectif 20x). Le flux Ca2+ des iCM a été visualisé sous forme de fluorescence GCaMP3, dans laquelle les cellules avec un flux Ca2+ montrent un clignotement répété entre la fluorescence de base (Ca2+ min, panneau du milieu) et la fluorescence lumineuse (Ca2+ max, panneau de droite) synchronisée avec le battement. (B) Courbe de trace Ca2+ des cellules d’oscillation Ca2+ dans le groupe IMAP. Barre d’échelle = 50 μm. F/F0 : intensité de fluorescence relative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 Figure 5 : Évaluation du flux de Ca2+ sous milieu IMAP. Nombre de cellules GCaMP3+ avec flux Ca2+ par HPF 2, 3, 4 semaines après l’induction MGT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Un cœur battant isolé de chiots avec un génotype αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 sous lentille d’objectif à balayage (objectif 4x) dans le canal GFP. Le cœur est GCaMP3+ et clignote entre la fluorescence de base (Ca2+ min) et la fluorescence brillante (Ca2+ max) synchronisée avec les battements. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2 : Un cœur battant isolé de chiots avec un génotype de contrôle sous lentille d’objectif à balayage dans le canal GFP. Le cœur est GCaMP3- et ne montre pas de clignotement de fluorescence synchronisé avec les battements. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 3 : iMC dans le groupe IMAP sous LPF dans le canal BF (Bright Field). Une cellule avec des battements importants au centre du champ peut être vue. La vidéo 3 et la vidéo 4 se concentrent sur le même domaine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 4 : iMC dans le groupe IMAP sous LPF dans le canal GFP. Plusieurs cellules avec une fluorescence clignotante, y compris la cellule battante vue dans le canal BF peuvent être observées. La vidéo 3 et la vidéo 4 se concentrent sur le même domaine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 5 : iMC dans le groupe IMAP sous HPF dans le canal BF. Le centre du domaine de la vidéo 3 et de la vidéo 4 a été observé sous HPF. Une cellule avec des battements importants au centre du champ peut être observée. La vidéo 5 et la vidéo 6 se concentrent sur le même domaine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 6 : iMC dans le groupe IMAP sous HPF dans le canal GFP. La partie centrale du champ de la vidéo 3 et de la vidéo 4 a été observée sous HPF. Plusieurs cellules avec une fluorescence clignotante, y compris la cellule battante vue dans le canal BF peuvent être observées. La vidéo 5 et la vidéo 6 se concentrent sur le même domaine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 7 : iMC dans le groupe MGT sous HPF dans le canal BF. Contrairement aux cellules battantes significatives observées dans le groupe IMAP, il existe quelques cellules battantes sous le canal BF dans le groupe MGT, qui a une efficacité de reprogrammation plus faible. La vidéo 7 et la vidéo 8 se concentrent sur le même domaine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 8 : iMC dans le groupe MGT sous HPF dans le canal GFP. Plusieurs cellules avec une légère fluorescence clignotante peuvent être observées. La vidéo 7 et la vidéo 8 se concentrent sur le même domaine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
L’évaluation de la fonction iCM est nécessaire pour le domaine de la reprogrammation cardiaque. Dans ce manuscrit, le protocole décrit une souche de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J qui a été établie, comment utiliser les NCF isolés des souris néonatales dans cette souche pour la reprogrammation en iCM, et l’évaluation de la fonction iCM par flux Ca2+ . Il s’agit d’une méthode de novo pour évaluer la maturation fonctionnelle des iMC.
Plusieurs étapes critiques sont importantes pour réussir la reprogrammation et l’évaluation avec cette méthode. Tout d’abord, les NCF doivent être fraîchement préparés et en bonne santé après l’isolement. Une procédure rapide d’isolement cardiaque et de coupure est essentielle. Plus important encore, il est crucial de suivre le temps d’incubation pour éviter une digestion excessive et une réduction de la viabilité et de l’état des cellules. Deuxièmement, parmi toutes les procédures, l’efficacité de l’infection virale introduit souvent une grande variation dans les résultats. L’efficacité de l’infection virale est principalement influencée par deux facteurs. D’une part, le titre du virus doit être constant entre les différentes tentatives, ce qui nécessite une cohérence dans la quantité de plasmides transfectés et une condition et une densité cellulaires De Plat-E similaires. Les chercheurs qui suivent ce protocole devraient évaluer la densité et le temps d’ensemencement optimaux avant ces procédures. Le virus doit être utilisé immédiatement pour éviter l’atténuation du titre due à la sensibilité du virus aux cycles de gel-dégel. De plus, il est important de maintenir les CNC dans un état sain et une densité appropriée au moment de l’infection. Les chercheurs devraient connaître les caractéristiques de croissance des NCF. Bien que la variation de l’efficacité de la reprogrammation devrait être limitée, une surveillance fréquente pourrait être utile. Ce protocole peut être facilement modifié pour co-infecter les NCF avec différents virus ou les traiter avec des produits chimiques d’intérêt. Ainsi, il est applicable en tant que méthode universelle pour la recherche sur la reprogrammation cardiaque. Outre les points mentionnés ici, les problèmes courants avec cette méthode incluent une faible fluorescence observée après la reprogrammation. Cela peut être dû à plusieurs raisons. Tout d’abord, l’infection peut ne pas être aussi efficace que souhaité, ce qui entraîne une faible efficacité de reprogrammation et limite le nombre d’iCM. Deuxièmement, la condition d’exposition peut devoir être ajustée de manière optimale pour l’observation de la fluorescence GCaMP3 des iCM. L’utilisation de cardiomyocytes néonatals isolés chez les mêmes petits comme témoin positif aidera à identifier la raison potentielle.
Le flux de Ca2+ a été largement utilisé pour évaluer les activités cellulaires, y compris dans les cellules neuronales16, la glande mammaire17, les tissus adipeux18, etc. Dans cette étude, le flux de Ca2+ a été utilisé pour évaluer la maturation fonctionnelle des iMC. Auparavant, il a été rapporté que le flux de Ca2+ peut être mesuré par des produits chimiques spécifiques appelés colorants sensibles au calcium à petites molécules qui peuvent être utilisés pour évaluer la fonction des cellules reprogrammées19. Cependant, une telle méthode présente plusieurs limites: le produit chimique introduit dans les cellules peut avoir une toxicité potentielle et influencer les processus cellulaires, ce qui rend les résultats moins fiables que ceux obtenus avec la méthode présentée ici. En outre, le processus de coloration est compliqué et prend beaucoup de temps tout en empêchant d’autres évaluations de ces cellules. La méthode présentée ici, en revanche, surmonte ces limites. GCaMP3 est non invasif pour les cellules, ce qui minimise les influences sur les activités cellulaires et permet une évaluation plus approfondie des cellules. Étant donné que la fluorescence des iCM ne dépend que de leur identité, c’est-à-dire de l’expression de Myh6 et du changement de concentration local de Ca2+, la fluorescence du flux de Ca2+ des cellules devient visible tant que les NCF sont reprogrammés, ce qui permet une surveillance fréquente du processus de reprogrammation sans stratégie fastidieuse. Alors que le flux de Ca2+ peut être surveillé et enregistré facilement sous un microscope à fluorescence inversée, les battements répétés et l’activité électronique connexe à travers la membrane cellulaire, c’est-à-dire le flux de Ca2+, peuvent être quantifiés dans le temps20. Comme le montre la figure 4B, une telle quantification peut fournir plus d’informations sur la maturité des iCM et illustrer des structures plus détaillées du changement de flux ca2+ pendant la reprogrammation cardiaque.
Cette méthode présente plusieurs avantages. Tout d’abord, le flux de Ca2+ est exclusivement observé dans les iMC. Parce que Myh6 est très spécifique aux CM mais pas aux FC, seules les cellules reprogrammées avec succès exprimeront le rapporteur GCaMP3 et deviendront fluorescentes. Deuxièmement, le flux Ca2+ fournit un moyen d’évaluer la maturation fonctionnelle des iCM en plus de la méthode de surveillance de l’expression des gènes spécifiques à CM. En raison de la procédure expérimentale relativement longue et de la variation qui y est liée, la fonction des iCM n’est pas toujours acceptable pour une étude plus approfondie et une utilisation clinique potentielle. Alors que l’expression génique spécifique de CM ne révèle qu’une partie des caractéristiques de la cellule reprogrammée, le flux Ca2+ fournit un autre aspect du domaine de la reprogrammation cardiaque pour évaluer la qualité et l’efficacité de la cellule reprogrammée. De plus, la maturation fonctionnelle est davantage liée à la fonction cardiaque, ce qui peut être un meilleur indicateur pour évaluer l’efficacité. Les méthodes largement utilisées dans ce domaine comprennent la cytométrie en flux, une technique qui nécessite la digestion de la trypsine de tous les groupes cellulaires. Bien que la digestion puisse influencer les fonctions et les caractéristiques des cellules, elle introduit des variations dans le système, diminuant le potentiel de reproduction des résultats observés et évaluant davantage ces cellules. Par rapport à ces méthodes, la souche de souris transgénique montrée ici a limité l’influence potentielle des produits chimiques ou des procédures expérimentales nécessaires à l’évaluation. Avec ces avantages, cette souche de souris simplifie les procédures d’évaluation nécessaires à la reprogrammation cardiaque et améliore la reproductibilité des résultats dans ce domaine.
Cependant, il y a certaines limites à cette étude. Tout d’abord, l’établissement de la souche de souris prend beaucoup de temps. Les demandes de renseignements sur la souche de souris par des collègues dans ce domaine sont les bienvenues afin de raccourcir le temps nécessaire à l’établissement de la souche. Deuxièmement, la reprogrammation cardiaque vers les iCM avec ce protocole implique de multiples facteurs et étapes, qui introduisent une variation relativement élevée dans le système. La maîtrise de ce domaine aidera à surmonter ce problème. Enfin, étant donné que le GCaMP3 ne devient fluorescent que dans des conditions de flux Ca2+, la méthode d’évaluation actuelle ne peut pas être directement utilisée pour le FACS comme reprogrammation cardiaque avec la souche Myh6-GFP7. Cependant, bien que la souche actuelle ait des applications plus nombreuses et différentes par rapport à la souche Myh6-GFP, un tel inconvénient peut être surmonté.
Dans l’ensemble, comme le protocole l’a décrit ci-dessus, la souche de souris Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 et après évaluation de la maturation des iCM fournissent une stratégie pour surveiller l’ensemble du processus de reprogrammation cardiaque. Cette stratégie de mesure du flux Ca2+ médiée par GCaMP3 peut être réalisée dans des cellules vivantes sans nuire à la viabilité des cellules. Étant donné que la fluorescence GCaMP3 est déterminée par l’expression génique spécifique du myocarde, les données fluorescentes GCaMP3 acquises peuvent être quantifiées davantage pour révéler l’efficacité de la reprogrammation et l’activité des iCM.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous apprécions les efforts de Leo Gnatovskiy dans l’édition du texte anglais de ce manuscrit. La figure 1 a été créée avec BioRender.com. Cette étude a été soutenue par la subvention des National Institutes of Health (NIH) des États-Unis (1R01HL109054) au Dr Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
- Frangogiannis, N. G.
- Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
- Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036 (2016).
- Grant, A. O.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).
- Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).
- Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312 (2016).
