Summary
כאן אנו מציגים את מודל נגע הסחוס התוך-מפרקי הנגרם על ידי העמסה מחזורית של ברך החולדה, שנוצר על ידי 60 לחיצות מחזוריות מעל 20 N, וכתוצאה מכך נזק לסחוס הקונדילרי של הירך בחולדות.
Abstract
הפתופיזיולוגיה של דלקת מפרקים ניוונית ראשונית (OA) עדיין אינה ברורה. עם זאת, תת-סיווג ספציפי של OA בקבוצות גיל צעירות יחסית נמצא ככל הנראה בקורלציה עם היסטוריה של פגיעה בסחוס המפרקי ופגיעה ברצועות. מודלים כירורגיים של OA של הברך ממלאים תפקיד חשוב בהבנת ההתחלה וההתקדמות של OA פוסט טראומטי ומסייעים בפיתוח טיפולים חדשניים למחלה זו. עם זאת, מודלים לא כירורגיים נחשבו לאחרונה כדי למנוע דלקת טראומטית שעלולה להשפיע על הערכת ההתערבות.
במחקר זה פותח מודל של חולדות סחוס תוך-מפרקיות המושרה על-ידי העמסה מחזורית של דחיסה מחזורית in vivo , מה שאיפשר לחוקרים (1) לקבוע את הגודל, המהירות ומשך העומס האופטימליים שעלולים לגרום לנזק לסחוס המוקדי; (2) להעריך שינויים פתולוגיים מרחביים פוסט-טראומטיים בחיוניות כונדרוציטים; ו-(3) להעריך את הביטוי ההיסטולוגי של מולקולות הרסניות או מגינות המעורבות במנגנוני ההסתגלות והתיקון כנגד עומסי דחיסה של המפרקים. דו"ח זה מתאר את פרוטוקול הניסוי של נגע סחוס חדשני זה במודל של חולדה.
Introduction
באופן מסורתי, טרנסקציה של רצועה צולבת קדמית (ACL) או ערעור היציבות של המניסקוס המדיאלי נחשבו אופטימליים לחקר דלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית (PTOA) בחיות קטנות. בשנים האחרונות נעשה שימוש במודלים לא פולשניים של דחיסה מחזורית כדי לחקור PTOA. דגם זה תוכנן במקור כדי לחקור את תגובת העצם להעמסה מכנית1 ולאחר מכן שונה כמודל בעלי חיים לא ניתוחי עבור מחקרי PTOA 2,3,4,5,6. הרציונל הוא להתנגש בסחוס המפרקי על ידי הפעלת כוח חיצוני מחזורי, המעורר סדרה של תגובות דלקתיות. עם זאת, מודל זה הוחל רק על עכברים, ואת הגודל המתאים של העמסה על בעלי חיים גדולים יותר לא נדון.
בעיה נוספת עם המודל הקודם היא שהפרוטוקול בנפח גבוה כלל יותר מדי מחזורים, מה שגרם לעיבוי מוגזם של העצם התת-כונדרלית, תופעת לוואי לא רצויה, במספר דגימות7. לכן, פותחה שיטה חדשנית של דחיסה מחזורית עם הגודל המתאים לבעלי חיים גדולים ותופעת לוואי של העמסה נמוכה יותר8. המטרה הכוללת של המאמר הנוכחי היא לתאר את הפרוטוקול של מודל הדחיסה המחזורית הלא פולשנית בחולדות ולבחון את התוצאות המייצגות של ניוון הסחוס. הפרוטוקול הנוכחי יעזור לקוראים המעוניינים ביישום מודל הדחיסה המחזורית הלא פולשנית על חולדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול אושר על ידי ועדת המחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת קיוטו (מספר אישור: Med kyo 17616).
1. בצע דחיסה מחזורית in vivo על ברך החולדה
- לגרום להרדמה ניסיונית של בעלי חיים
- השרה הרדמה בחולדת Wistar בת 12 שבועות (256.8 ± 8.7 גרם) על ידי שאיפה של תמיסת איזופלורן 5% בתיבת ההרדמה.
- יש להזריק באופן תוך-צפקי תערובת של שלושה חומרי הרדמה9, כולל מדטומידין, מידזולם ובוטורפנול, במינון 2 מ"ג/ק"ג ממשקל גוף החולדה, ולגלח את האזור סביב מפרק ברך ימין. אשרו הרדמה מספקת על ידי חוסר רפלקס דוושה לצביטת בוהן.
- הר את החולדה המורדמת על מכשיר הקיבוע.
- הניחו את החולדה המורדמת שוכבת על בטנה על לוחית הבסיס (איור 1), כאשר ברך ימין מחוברת לחתיכת שרף קטנה עם חריץ קעור. מקמו את הגפה האחורית הימנית בתנוחות הארכת הירך, כיפוף הברך והארכת הקרסול, כאשר הברך מכופפת בטמפרטורה של כ-140 מעלות. התאימו את העקב של החולדה על החריץ בצורת טריז על המתקן הנייד.
- העבר את מכשיר הקיבוע למכשיר בדיקת הלחץ/מתיחה (ראה טבלת חומרים). לאחר שווידאתם שאין מגעים עם תא העומס, פתחו את תוכנת בקרת מכשיר בדיקת הלחץ/מתיחה (Table of Materials) ולחצו על כפתור הכיול . לאחר הכיול, חבר את החלק העליון של המסגרת לתא הטעינה בזהירות. כדי לשמור על מפרק הברך מחובר היטב למסגרת, הפעל את הידית הסיבובית בלוח התפעול הראשי הנייד באיטיות עד שהעומס מראש מגיע ל-5 N.
- בנה שיטת טעינה והגדר את בדיקת הדחיסה.
- בתפריט הראשי, לחץ על צור שיטה חדשה | תווית מערכת . הגדר את מצב הבדיקה למחזור, ואת סוג הבדיקה לדחיסה. לחץ על תווית החיישן ובחר בכרטיסייה בדיקה כדי לבדוק שהמגבלה היא בטווח של 60 N. בנוסף, בחר את הכרטיסייה קו ולבדוק כי המגבלה היא בתוך 500 מ"מ.
הערה: השלב לעיל יפסיק את הפעולה באופן מיידי אם יש תזוזה גדולה על נקודת הלחץ. - תחת תווית בקרת הבדיקה, בחר מקור הצמיחה כדי להתחיל את התוכנית הראשית עם קנה מידה מלא של 0.3%. מבין ארבעת המקטעים במחזור טעינה, הגדר את מהירות השבץ בשליטה בקטעים 1 st ו- 3 ל- 1 מ"מ לשנייה. הגדר את כוח הבדיקה המרבי בחלקהשני ל- 20 N, ואת כוח הבדיקה המינימלי בחלקהרביעי עד 5 N. הגדר את "משך ההחזקה" ל- 0.5 שניות עבור עומס השיא ו- 10 שניות עבור העומס המינימלי (איור 2).
הערה: מכיוון ששלב זה מגדיר כל מחזור, ודא שמשטחי המפרקים נמצאים במגע זה עם זה ונעים במהירות סבירה ושהתנועה נשמרת. - בכרטיסייה Pre-load בתחתית הדף, ודא שהאפשרות מופעל מסומנת, מהירות הסרת הסטייה מוגדרת ל- 100 מ"מ לדקה, והכוח המרבי הוא 5 N. בתווית 'דגימה', הגדר את החומר כמתכת.
הערה: הגדרות מפורטות אלה עשויות להיות ספציפיות עבור כל יצרן. - בתפריט הראשי, תחת הקטע בחר שיטה ובדיקה, בחר את השיטה שזה עתה נבנתה ולחץ על התחל כדי להתחיל בבדיקה.
הערה: הטבלה בתחתית מציגה את המדידות בפועל של עומס השיא והתזוזה. - הגדר את מספר המחזורים ל- 60.
הערה: כל סשן הטעינה כולל 60 מחזורים, שנמשכים כ-12 דקות. בקבוצת הביקורת, החולדות עברו 5 N טעינה מוקדמת במשך 12 דקות לפני הטעינה באותם תנאים.
- בתפריט הראשי, לחץ על צור שיטה חדשה | תווית מערכת . הגדר את מצב הבדיקה למחזור, ואת סוג הבדיקה לדחיסה. לחץ על תווית החיישן ובחר בכרטיסייה בדיקה כדי לבדוק שהמגבלה היא בטווח של 60 N. בנוסף, בחר את הכרטיסייה קו ולבדוק כי המגבלה היא בתוך 500 מ"מ.
- לאחר הטעינה, החזירו את החולדה לכלוב שלה ועקבו אחריה עד להחלמה מלאה. שמרו על לוח זמנים של 12-12 שעות בהיר-חושך בכלוב עם מספיק מקום ומזון עד ליביטום. לאחר תקופות הניסוי הנדרשות, להקריב את החולדות עם מנת יתר של תערובת של שלושת חומרי ההרדמה מוזרק תוך צפק או שאיפת פחמן דו חמצני לניתוח (1 h-8 שבועות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התקבלה תוצאה מייצגת של השינויים קצרי הטווח (1 שעות ו-12 שעות) בכדאיות הכונדרוציטים בדגימות שהיו נתונות להעמסה מחזורית של 20 N. כפי שניתן לראות באיור 3, מספר הכונדרוציטים המתים (פלואורסצנציה אדומה) עלה ב-12 שעות לאחר טראומה. לעומת זאת, מספר הכונדרוציטים החיים (פלואורסצנציה ירוקה) המשיך לרדת, כאשר חלק מהדגימות לא הכילו כונדרוציטים חיים באזור הפגוע.
היסטולוגיה הראתה שהסחוס המפרקי של ברכי החולדות שעברו העמסה דינמית של 20 N נפגע, ואזור נגע מוקדי אחד אושר בקונדיל הירך הלטרלי בכל הדגימות (איור 4). עם זאת, גודל הנגע לא גדל בהדרגה במהלך תקופת התצפית של 8 שבועות. ניתן היה לראות את הגבול שהתאים לממשק של הנגע והסחוס הלא מושפע באזור הפגוע.
איור 1: התקן הקיבוע מורכב מלוחית בסיס ומנגנון קיבוע. לצלחת הבסיס (אורך: 27.5 ס"מ, רוחב: 13 ס"מ) יש חריץ שרף קעור (אורך: 0.8 ס"מ, רוחב: 0.4 ס"מ) בצד האחורי כדי להכיל את מפרק הברך המכופף של החולדה. למנגנון הקיבוע יש חריץ בצורת טריז (רוחב חריץ: 1.5 ס"מ, עומק חריץ: 1 ס"מ) המאכלס את עקב החולדה, המקונן בלוח הבסיס בין שני מוטות מתכת. החלק העליון של מנגנון הקיבוע יהיה במגע ישיר עם תא העומס של מכשיר בדיקת הלחץ/מתיחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: פרופיל עומס למחזור טעינה אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הערכה מרחבית-טמפורלית של כדאיות כונדרוציטים באזור הנגע. לאחר ההקרבה, מפרק הברך נותח והופרד באמצעות מלקחיים קטנים ומספריים. פתרונות של כתמי קלצ'ין AM ו- EthD-1 הוכנו על ידי דילול הערכה המקורית (טבלת חומרים) בשעה 1:500 ו- 1:4,000 ב -5 מ"ל של PBS, בהתאמה. הדגימות דוגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. דגימות בקרה היו שקועות ב- PBS באותם תנאים. תמונות פלואורסצנטיות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (טבלת חומרים) באמצעות תעלות פלואורסצנטיות איזותיוציאנט (495 ננומטר/519 ננומטר) ופרופידיום יודיד (535 ננומטר/617 ננומטר). הכונדרוציטים החיוניים הציגו פלואורסצנטיות ירוקה, בעוד שתאים מתים הפגינו פלואורסצנטיות אדומה. בהשוואה לכונדרוציטים בדגימות בקרה (A), מספר הכונדרוציטים המתים על ברך החולדה הטעונה גדל בשעה אחת (B) ותפס את רוב האזור באזור הפגוע ב-12 שעות (C). פלואורסצנציה ירוקה ואדומה מייצגת את אזורי הכונדרוציטים החיים והמתים, בהתאמה. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: calcein AM = calcein acetoxymethyl ester; EthD-1 = אתידיום הומודימר-1; PBS= מלח עם מאגרי פוספטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: הכתמת ספרנין O מייצגת של קונדיל הירך בברך הטעונה. שקופית המציגה את החלקים הסגיטליים של קונדיל הירך הלטרלי, שהוכתמו בתמיסת ספרנין O/Fast Green והמטוקסילין. בהשוואה לבקרה, עוצמת הכתם של הספרנין O באזור הפגוע פחתה לאחר ההעמסה, ונצפה גבול (חץ) ברור של הסחוס העליון/הדחוס. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצור: w = שבוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לראשונה, הפרוטוקול הנוכחי מראה כיצד לבסס מודל של נגע סחוס הנגרם על ידי העמסה על קונדיל הירך הלטרלי בחולדות, בדומה למודל הנזק התוך-מפרקי במכרסמים קטנים יותר כמו העכבר2. עם זאת, פרוטוקול ההעמסה בעכברים גרם להיווצרות אוסטאופיטים חמורים ונגעים ברצועות צלב, מה שלא היה אידיאלי להערכת ההשפעות של דחיסה מחזורית. הפרוטוקול הנוכחי יצר נגע סחוס מוקדי בחולדות עם כוח העמסה נמוך בהרבה. הגדרות נכונות של שיטת הטעינה הן קריטיות עבור הפרוטוקול מכיוון שרק הגודל, המהירות ומשך הלחץ המתאימים יכולים להרוס את הסחוס מבלי לפגוע ברקמת העצם.
הגדרת מגבלת התזוזה (שלב פרוטוקול 1.3.1) היא גם קריטית מכיוון שהיא עוצרת מיד את המכשיר במקרה של קרע ברצועה או אם החולדה מתעוררת מהרדמה במהלך הטעינה. העומס המרבי האופטימלי וגיל החולדה עדיין לא נקבעו. עם זאת, בניסויים המקדימים, עומס של יותר מ-50 N הביא להסתברות גבוהה לקרע ב-ACL בברכי החולדה. יתר על כן, המודל הנוכחי קשה להתרבות בחולדות מבוגרות יותר (בנות >36 שבועות), אולי בגלל הנוקשות של הסחוס בזמן הגדילה.
למרות שסף העומס ההרסני של חולדות צעירות יותר לא נקבע, ההערכה היא שמחקרים עתידיים צריכים לשמור על העומס המרבי מתחת ל-20 N כדי לבחון השפעות אנבוליות על הסחוס. ההיקף והלוקליזציה של אזור הנגע היו פשוטים יחסית להקמה, אפילו עבור אלה החדשים בתחום, כפי שהוערך על ידי נפח כונדרוציטים-ניווניים בכל דגימה, אשר עשוי להתמקד בהערכה שלאחר מכן של ההתערבות לאזור סחוס צר יחסית.
כתמים היסטולוגיים הראו כי היקף אזור הנגע היה יציב יחסית במהלך תקופת התצפית בת 8 השבועות. עם זאת, הציונים של מנקין הידרדרו ברציפות בעוד שציוני הכתמים המטריצה וחלוקת התאים עלו באזור הפגוע. יתר על כן, הייתה סטיית צבע ברורה בין השכבה האמצעית לסחוס ההסתיים, מה שהמחיש כי רק הסחוס מעל סימן הגאות הושפע מהדחיסה הבין-ארטיקולרית.
להיפך, מלבד פרפור קל בדגימות נדירות, שלמות הסחוס נותרה ברובה שלמה לאורך כל תקופת התצפית, השונה ממודלים מתקדמים של פגיעה ב-OA10. לכן, מודל לא ניתוחי עשוי להיות טוב יותר להערכת נגעים מוקדיים הנגרמים על ידי התנגשות בממשק הסחוס, הנפוצים יותר בפציעות ספורט. בעתיד, המודל הנוכחי ישמש להערכת ההשפעות של תרופות או פיזיותרפיה, כגון טיפול בהיפרתרמיה ופעילות אירובית משותפת, על נזק סחוס טראומטי. יתר על כן, אנבוליזם כונדרוציטים וקטבוליזם בתגובה לגירוי מכני מחזורי יכולים גם להיות מאומתים in vivo בבעלי חיים באמצעות מודל זה.
לפרוטוקול הנוכחי היו מספר מגבלות. ראשית, רק נגעי סחוס על קונדיל הירך לרוחב נחקרו. הנגע על השוקה לרוחב צריך להיות מוערך גם במחקרים עתידיים. שנית, החלק הפגוע של הסחוס המפרקי שנחקר בפרוטוקול הנוכחי לא היה האזור העיקרי נושא ההעמסה במהלך ההליכה. בשל ההטרוגניות של הסחוס, הנוקשות של הסחוס התוך-מפרקי עשויה להיות שונה מהחלק שנבחן במחקר הנוכחי. לפיכך, ממצאים אלה יכולים לשמש רק כאסמכתא. לבסוף, המודל לא הראה התקדמות משמעותית של ניוון הסחוס, שהוא תכונה חשובה של התפתחות OA. מחקרים נוספים יכולים לשלב ניתוחים פולשניים עם נגעים טעונים מראש כדי לבחון שינויים מרחביים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק JSPS KAKENHI (מספרים JP18H03129 ו- JP18K19739).
מחקר זה קיבל מימון גם מהברית למחקר והכשרה של שיקום רגנרטיבי (AR3T), הנתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם על שם יוניס קנדי שרייבר (NICHD), המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NINDS), והמכון הלאומי לדימות ביו-רפואי וביו-הנדסה (NIBIB) של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר P2CHD086843. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Autograph AG-X | Shimadzu Corp | N.A. | Precision Universal / Tensile Tester |
| Fluoview FV10i microscope | Olympus Corp | N.A. | A fully automated confocal laser-scanning microscope |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher Scientific Japan Inc | L3224 | A quick and easy two-color assay to determine viability of cells |
| TRAPEZIUM X Software | Shimadzu Corp | N.A. | Data processing software for Autograph AG-X |
References
- De Souza, R. L., et al. Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element. Bone. 37 (6), 810-818 (2005).
- Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model. Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).
- Wu, P., et al. Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets. Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).
- Poulet, B., et al. Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).
- Ko, F. C., et al. Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading. Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).
- Adebayo, O. O., et al. Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).
- Ko, F. C., et al. In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae. Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).
- Ji, X., et al. Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
- Iijima, H., et al. Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model. Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).
